JP2009519213A - IgEに結合する薬剤 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ヒトおよび動物におけるIgE活性化に関連する症状の治療のための方法および物質、そしてその活性化を調節できる薬剤に広く関係する。本発明の薬剤は、ダニ由来のIGBPMAポリペプチドを含むか、またはそれに関係する。
Description
発明の分野
本発明は、ヒトおよび動物におけるIgE活性化に関連する症状の治療のための方法および物質、並びにその活性化を調節可能な薬剤に広く関係する。
IgEは、アレルギー反応に関与する抗体のクラスである。これらの反応は、無害な抗原に応答してIgE抗体を生産した(アレルゲン感作)個体が、続いて同じアレルゲンに遭遇したときに生じる。アレルゲンは、曝露された組織においてIgE結合性肥満細胞の活性化を引き起こし、アレルギーを特徴づける一連の応答を導く。
発明の開示
本発明者は、免疫グロブリン結合活性について、ダニ(Rhipicephalus appendiculatus)唾液腺抽出物および唾液を解析し、そして驚くべきことに、ダニ唾液腺および唾液がIgE結合活性を有することを見いだした。
ダニ侵入に対する抗IgE応答が文献において議論されたことがなかったという理由で、これは驚くべきことである。実際、宿主の応答におけるIgEの役割はいくぶん不明確である。例えば、イヌ血清IgEレベルは、Rhipicephalus sanguineus侵入後に、顕著に上昇するが、ダニ抗唾液腺IgE量における変化は全く検出されなかった。著者らはこれを、他の無関係な抗原に対するIgE生産のために有益な免疫環境の、非特異的誘導として説明した(Szabo, Aoki et al. 2003)。IgE生産は、ロバにおけるAmblyomma cajennense侵入によっても誘導された(Szabo, Castagnolli et al. 2004)。Boophilus microplusによる度重なる侵入の後、ダニ感受性種の畜牛は、ダニ唾液腺抗原に対するIgG抗体レベルを減少させたが、ダニ唾液腺抗原に対するIgEレベルを上昇させた。これは、ダニ唾液成分が、ダニ感受性畜牛において、IgG応答を抑制したが、IgE応答を誘導したことを示す(Kashino, Resende et al. 2005)。著者らは、IgE抗体は防御性ではないと結論づけた。これはまた、Ixodes ricinusinfestations侵入が、マウスにおける全IgEの段階的な増加を伴ってTh2応答を極性化するという観察に一致する(Christe, Rutti et al. 1999; Christe, Rutti et al. 2000)。
医療上の用途
したがって、一面において、本発明が提供するのは、
(i)図1に示されるアミノ酸配列、
(ii) 図1に示されるアミノ酸配列の変異体であって、その中の少なくとも200、250、275、300、310の連続するアミノ酸と、少なくとも50、60、70、80、90、95または99%の同一性を共有する変異体、または
(iii) 図1に示されるアミノ酸配列の断片であって、その中に示される少なくとも150、200、250、275、300、310の連続するアミノ酸を有する断片
を含み、それぞれの場合において、IgE分子に結合可能なポリペプチドの、IgE活性化に関連する症状の治療のための医薬の製造における使用である。
本発明のポリペプチドは、IgEに結合可能であり、そして具体的にはIgEの定常領域上の一またはそれ以上の結合部位に対して結合可能であり(例えば、上で論じられたエフェクター細胞のIgE媒介活性化の抑制のため)すなわち、その結合は単に、IgEの可変領域に対する抗原の結合ではない。
結合活性は、当業者に知られるいずれかの方法を使用して確かめることができ、それは例えば以下の(例えばBIAcore装置の使用するSPL、またはIgEアフィニティクロマトグラフィを含む)方法である。結合親和性をスクリーニングするために使用されるIgE分子は、例えばヒト、ラット、マウス、ウサギまたはその他のIgEを生産する動物のいずれかから、得ることができる。活性をスクリーニングするために使用されるIgE分子の断片は、Fcおよび/またはF(ab’)2領域の全てまたは一部を含む(ただし単にIgE可変領域からなるものではない)。
(i)図1に示されるヌクレオチド配列、
(ii)図1に示されるコードヌクレオチド配列の変異体であって、その中の少なくとも600、750、825、900、930の連続するヌクレオチドと、少なくとも50、60、70、80、90、95または99%の同一性を共有する変異体、
(iii)図1に示されるヌクレオチド配列の断片であって、その中に示される少なくとも450、600、750、825、900、930の連続するヌクレオチドを有する断片
を含む、上記のポリペプチドをコードする核酸分子の、IgE活性化に関連する症状の治療のための医薬の製造における使用である。
変異体に関係する本発明の態様は、これからさらに詳しく議論される。
本発明の変異体IGBPMA分子(ポリペプチドおよびヌクレオチド)は以下のものであってもよい:
(i)例えば外部寄生生物、例えば本明細書において記載のようなダニまたは節足動物寄生虫のその他の種などから入手できる、新規で天然に存在する相同なIGBP分子。また含まれるのは、R. appendiculatus IGBPMAの天然の生物学的変異体(例えば、対立遺伝子変異または地理的変異)である。IGBP分子の好ましい供給源は、外寄生生物および特に、ただしこれらには限定されないが、吸血昆虫、およびダニ目の寄生虫、例えばサシバエ(biting fly)、ウシダニ(cattle tick)およびコダニ(mite)である。前記節足動物寄生虫の典型としては、例えばBoophilus、Amblyomma、Argas、Rhipicephalus、Hyalomma、Ornithodorus、Dermacentor、Ixodesの種のダニ;ハエ、特にハエウジ症のハエ、吸血ハエおよびサシバエ、例えばOestrus ovis、Gasterophilus spp、Chrysomyia spp、Calliphora spp、Hypodermaspp、Dermatobia spp、Cochliomyla spp、Stomoxys calcitrans、Hydrotaea irritans、Simulium spp、Lyperosia irritans、Haematobiaspp、Tabanus spp、Phlebotomus sppおよびGlossina sppなど、シラミ、例えばHaematopinus eurysternus、Linognathus vituli、Solenopotes capillatus、Linoanathus ovillusおよびMenacanthus spp;コダニ、例えばNotoedres spp、Demodex spp、Sarcoptesspp、Chorioptes spp、Psoreraates spp、Dermanyssus spp、Ornithonyssusspp、Otodectes sppおよびNotoedres sppなど;ノミ、例えばCtenocephalides canisおよびC. felis;ヒツジシラミバエ(ked)、例えばMelophagus ovinus、並びにClimex sppなどの虫が挙げられる。
二つのアミノ酸配列または二つの核酸配列のパーセント同一性は、目視による検査および数学的計算により測定可能であり、または、より好ましくは、その比較はコンピュータプログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。例として、好ましいコンピュータプログラムは、Genetics Computer Group (GCG; Madison, Wis.)Wisconsin package version 10.0 program、 ‘GAP’ (Devereux et al., 1984, Nucl. Acids Res. 12: 387)である。‘GAP’プログラムのための好ましい初期設定パラメータには、(1)ヌクレオチドのための単項比較マトリックス(unary comparison matrix)(同一性に対して1および非同一性に対して0の値を含む)のGCG実行、およびSchwartzとDayhoff編集の Atlas of Polypeptide Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979によって記載されたようなGribskovとBurgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986の加重アミノ酸比較マトリックス、またはその他の同等な比較マトリックス;(2)アミノ酸配列について、各ギャップに対して30のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対して1の追加ペナルティ、または核酸配列について、各ギャップに対して50のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対して3の追加ペナルティ;(3)最後のギャップに対してペナルティなし;および(4)長いギャップに対して最大ペナルティなし、が含まれる。
誘導体は、本明細書に開示のいずれかの配列を修飾することによって生産することができる。
(i)IGBPMAまたはその変異体であるポリペプチド、またはそれらをコードする核酸を提供する工程、
(ii)ポリペプチドの配列、またはそれをコードする核酸の配列を修飾する工程、および
(iii)修飾ポリペプチド(核酸が修飾される場合は、修飾核酸の発現産物)のIgE結合特性をアッセイする工程
を含む、前記方法である。
ホモログの同定
IGBPMAポリペプチドに対する抗体を使用して、本明細書において具体的に例示したものと構造的類似性を有するIgE結合性化合物をスクリーニングすることができる。適切な方法は、当業者においてよく知られている。
本明細書の以下において議論されるように、本発明はまた、IGBPMA模倣体、またはIGBPMA-IgE相互作用に基づいて同定されるその他の薬剤を提供する。
本発明がまた提供するのは、例えば、ヒトや動物において、本発明の治療剤の治療上有効量を投与することを含む、IgE活性化に関連する症状を治療するための方法である。
IGBPMAは、IgE結合特性を共有する機能的模倣体の供給源となり得る。そのような模倣体の同定および使用は、本発明のさらなる側面を形成する。
IGBPMA上のIgE結合部位は、当業者においてよく知られた方法によって、または下記の方法を使用することによって、同定可能である。
既知の標的特性を有する化合物から模倣体を設計する際に、一般的に取られるいくつかの工程がある。第一に、標的特性を決定する際に決定的および/または重要な化合物の特定部分を決定する。ペプチドの場合、これは、例えば各残基を順番に置換することによって、ペプチド中のアミノ酸残基を系統的に変化させることによって行うことができる。ペプチドのアラニンスキャンは、そのようなペプチドモチーフを絞り込むために、一般的に使用される。化合物の活性領域を成すこれらの部分または残基(この場合はIgE結合部位)は、その化合物の“ファーマコフォア”として知られる。
(i)上述のIGBPMAポリペプチドを提供する工程、
(ii)前記ポリペプチドに関わる立体構造情報および電荷情報(例えば、IgEの化学基と相互作用するポリペプチドの化学基の情報)を援用して、前記ポリペプチドの三次元モデルを作成する工程;および
(iii)前記立体構造情報および電荷情報に基づいて(例えば、ポリペプチドの(ii)において同定される化学基の相対的空間位置の同定、およびその空間位置中のいくつかまたは全ての化学基を含む分子模倣体の設計によって)、IgE結合薬剤を提供する工程
を含む、前記方法を提供する。
新規薬物の同定を導く薬学研究は、リード化合物が見つかる前と見つかった後の両方における、非常に多くの数の候補物質のスクリーニングを含む可能性があるということが、よく知られている。これは、薬学研究を非常に費用がかかり時間を必要とするものにする、一つの要因である。スクリーニング工程において助けとなる手段は、考慮に値する商業的重要性および実用性を持つことができる。
(i)IGBPMAポリペプチドおよびIgE上のIGBPMAポリペプチドの結合部位および推定IgE調節薬剤を寄せ集める工程;そして
(ii)例えばSPLまたはIgEアフィニティクロマトグラフィを使用して、IgE上の結合部位に対するIGBPMAポリペプチドの結合親和性を観察または測定する工程(ここで、SPLを使用して結合親和性を観察または測定する場合、ポリペプチドまたはIgE分子はセンサーチップ上に固定化されてもよい);
(iii)IgE上の結合部位に対するIGBPMAポリペプチドの結合親和性が、前記候補薬剤の非存在下でのIgE分子に対するポリペプチドの結合親和性と比較して、前記薬剤の存在下で
減少するかどうかを評価する工程;
が含まれる。
(i)推定薬剤を、IgE分子と接触させる工程;そして
(ii)IGBPMAポリペプチドの存在下および非存在下で、IgE分子に対する薬剤の結合親和性を観察し、または測定する工程(ここで、IgE分子に対する薬剤の結合親和性は、例えばSPLまたはIgEアフィニティクロマトグラフィを使用して、観察、または測定されてもよい);
(iii)前記推定薬剤の結合親和性が、IGBPMAからなるポリペプチドなどのポリペプチドのIgE分子に対する結合親和性と、同等またはより大きいかどうかを評価する工程;
が含まれる。
(a)IgE上の結合部位に固定化された、検出可能な(例えば標識された)IGBPMAまたはその変異体ポリペプチドを含む複合体に対して、サンプルを曝露する工程、
(b)いずれかの置換されたIGBPMAまたは変異体ポリペプチドを検出する工程
を含む、前記方法を提供する。
本発明における治療剤は、本明細書中に記載の方法において使用するための医薬組成物中に処方され得る。
本発明の治療剤の投与は、“予防有効量”または“治療有効量”(場合によっては、予防は治療とみなすことができるが)であることが好ましく、これは個々に対する利益を示すために適している。実際の投与量、並びに投与の速さおよび時間経過は、治療さているものの性質および重症度に依存し得る。例えば用量の決定などの、治療の処方は、一般開業医およびその他の医師の責任の範疇にあり、そして、治療される疾患、各患者の症状、送達の場所、投与の方法、および開業医に知られているその他の要素が典型的には考慮される。前述の技術および手順の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980中に見い出すことができる。本発明の核酸ベースの治療剤は、当該技術分野においてよく知られているような従来の遺伝子治療ベクターとともに使用してもよい(WO0159142参照)。
IgE活性化に関連する症状の治療において利用するために適合される治療剤の生産のための方法は、本発明のさらなる側面を形成する。
本明細書に引用の全参考文献の開示は、本発明を実行するために当業者によって使用され得る故に、ここにおいて特に本明細書における相互参照として援用される。
表1:三つの分析物:メスSGED6、オスSGED6、およびメス唾液D7についての相対結合活性(RBA)の推定を示す。
図2:ドーパミン刺激によって誘導されたダニ唾液分泌。
A.DA刺激後のオス(三角)およびメス(四角)の唾液分泌。X軸は、部分的に給餌されたメスおよび十分に給餌されたオスおよびメスの体重(mg)の平均値を表す。Y軸は、それぞれのダニによって分泌された唾液の平均体積(μl)を表す。エラーバーはSEM(n = 12〜40)を表す。
A:タンパク質ゲル(SDS-PAGE、非還元条件)は、オスダニSGED6中の全タンパク質プロフィールを示し、そしてIGBPMA(矢印による表示)が、IgGおよびIgEの両方に結合した主要なタンパク質であった。
レーン2および8:ローディング前のダニオスSGED6
レーン3:タンパク質-L-IgG(モルモット)カラムを通過するダニオスSGED6(サンプルは濃縮された)
レーン7および9:タンパク質-L-IgE(ラット)カラムを通過するダニオスSGED6(サンプルは濃縮された)
レーン4:モルモットIgG
レーン5および6:タンパク質-L-IgG(モルモット)カラムの溶出画分1および2
レーン10:ラットIgE
レーン11および12:タンパク質-L-IgE(ラット)カラムの溶出画分1および2
B.抗IGBP血清によるウェスタンブロッティング
レーン1:オスSGED6の全タンパク質。バンドは上からIGBPMA、-MB、-MC
レーン2:タンパク質-L-IgEカラムの溶出液。
A.タンパク質ゲル(SDS-PAGE、還元条件)
B.抗IGBP血清によるウェスタンブロッティング
レーン1〜12:rIGBPMA発現を誘導した各クローンの全E.coli細胞溶解物。レーン3中に表されるクローン(No. F6)が、後の全ての実験のために選択された。
レーン14:MWマーカー。
図8:タンパク質ゲル(SDS-PAGE、還元条件)はリフォールディング後の精製可溶性rIGBPMAを示す
レーン1:MWマーカー
レーン2:rIGBPMA発現の誘導後のE.coli(クローン No. F6)の不溶性画分(6 M 尿素抽出物)中の全タンパク質
レーン3:TBS中の精製可溶性rIGBPMA、矢印はrIGBPMAを示す。
アフィニティカラム(タンパク質-L-IgE)および対照カラム(タンパク質-Lのみ)由来サンプルのタンパク質ゲル(SDS-PAGE、非還元条件)
A.ヒトIgE
レーン3〜7:アフィニティ(タンパク質-L-IgE)カラム
レーン8〜12:対照(タンパク質-Lのみ)カラム
レーン1:ヒトIgE
レーン2:精製rIGBPMA(矢印の表示)
レーン3および8:ローディングされたrIGBPMA
レーン4および9:溶出前の最後の洗浄画分
レーン5および10:1回目溶出画分
レーン6および11:2回目溶出画分
レーン7および12:3回目溶出画分
M:MWマーカー
B.ラットIgE
レーン1〜5:対照(タンパク質-L)カラム
レーン6〜10:アフィニティ(タンパク質-L-IgE)カラム
レーン1および6:カラム上にローディングされたBSA(点線の矢印)を伴う精製rIGBPMA(実線の矢印)
レーン2および7:溶出前の最後の洗浄画分
レーン3および8:1回目溶出画分
レーン4および9:2回目溶出画分
レーン5および10:3回目溶出画分。
矢印1が開始を示し、矢印2がrIGBPMA注入の完了を示す
曲線A:約4000 RUの固定化されたFc(ヒト)断片を加えたフローセル4
曲線B:約5000 RUの固定化されたBSAを加えたフローセル2
曲線C:約5000 RUの固定化されたF(ab)2(ウサギ)断片を加えたフローセル3
曲線D:リガンドを固定化していないブランクとしてのフローセル1。
図12:IgEおよびIgGに対するrIGBPMAの結合の比較
曲線A:IgE
曲線B:IgG
曲線C:BSA。
材料および方法
ダニおよびモルモット
R. appendiculatusの当研究室のコロニーは、ダニで処理されたことのないDunkin Hartlyモルモットの刈られた背中を全齢に給餌することによって、維持される(Jones et al., 1988)。十分に給餌される(engorgement)メスは、遅い給餌段階を経て、次いで給餌のおよそ6日目に速い給餌段階に切り替わり、その間、メスは餌の血全体の約90%を吸う(結果は示さず)。交配およびそれに続くオス-メス共給餌(male-female co-feeding)が、メス給餌のおよそ5日目に起こる(Wang, Henbest & Nuttall, 1999)。Ig結合実験において使用された全てのダニは、脱皮後3ヶ月を超えた成虫であった。成虫の20ペアが、唾液腺解剖のために6日間、および唾液収集のために7日間、3匹のモルモットのそれぞれを給餌された。
実施例1において、部分的に給餌された成虫ダニは、それらの宿主から引き剥がされ、水道水で3回すすがれ、次いで唾液腺のために解剖された。唾液腺抽出物(SGE)は、Tris-HCl緩衝生理食塩水(TBS: 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM CaCl2, 20 mM MgCl2,および0.5 % Triton-X100, pH 7.0)中で、50匹のダニの対を成す腺から調製され、そして以前の記載のように保存した(Wang & Nuttall, 1995b)。オスSGEおよびメスSGEは、Bio-Radタンパク質アッセイキット(Bio-Rad)を使用して測定した場合、タンパク質濃度がそれぞれ1 mg/mlおよび2 mg/mlになるまで希釈された。
精製免疫グロブリン(モルモット IgG, Sigma; ラット組み換えIgE, Serotech; ヒトIgG Fc, ICN; およびウサギIgG F(ab’)2, ICN)は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS; 20 mMリン酸, 130 mM NaCl, pH 7.2)中に1 mg/mlとなるように溶解された。BIAcore(商標登録)2000(BIAcore AB)の内蔵表面調製ウィザードが、カップリングpH 4.5(10 mM酢酸)での標準アミンカップリング化学(BIAcore(商標登録)2000 Instrument HandbookおよびBIAapplication Handbook中に記載されるように)を使用する、10,000レゾナンスユニット(RU)の標的レベルで、センサーチップCM5(カルボキシメチルデキストランでコーティングされたBIAcore ABチップ)上に免疫グロブリンを固定化するために使用された。CM5チップのデキストラン層は、平らなバイオセンサー表面から離れた親水性環境を提供することによって、タンパク質相互作用を測定するために伝導性である。センサーチップ中の4つのフローセルのそれぞれの上に:(A)モルモットIgG、(B)ラットIgE、(C)ヒトFc断片、または(D)ウサギF(ab’)2断片が固定化された。フローセルは、100μlのグリシン緩衝生理食塩水(GBS, 100 mMグリシン, 150 mM NaCl, pH 2.6)で一度洗浄され、次いで5μl/minの流速で100μlのTBSによって洗浄され、そして使用前に4℃で一晩保存された。
全ての実験は室温(25℃)で行われた。全てのフローセルに、100μlのダニSGE(メスまたはオス)または50μlのメス唾液を、5μl/minの流速で注入した。各実験の後、フローセルを25μl GBS(pH 2.6、上記参照)で洗浄して、結合したダニの物質(分析物)を取り除き、そしてフローセル表面上に遊離免疫グロブリンを再生させ、その後、次のサンプルが試験される前に、200μl TBS(pH 7.0、上記参照)で洗浄された。
タンパク質-L結合アガロース(Sigma)が、0.1 mlカラムを作るために使用された。100マイクロリットルのモルモットIgG(Sigma, TBS中1 mg/ml)またはラットIgE(1 mg/ml, Serotech)が、カラム上でプレインキュベートされた。カラムは、カラム体積の10倍を超える量のTBSを使用して洗浄された。200μlのオスダニSGE(D6)は、カラム上にローディングされ、28℃で1時間、蠕動ポンプによって再循環された。カラムは、1 mlのTBSで5回洗浄され、次いで0.1 mlのGBS(100 mMグリシン, 150 mM NaCl, pH 2.6)で3回溶出された。溶出液中のタンパク質は、20%(W/V)の終濃度のトリクロロ酢酸(TCA)中で沈殿され、冷アセトンで洗浄され、SDSサンプルバッファー(非還元, Invitrogen)中に再溶解され、2分間煮沸され、そしてSDS-PAGE(10%トリシン, プレキャストゲル系, Invitrogen)によって試験された。結果のゲルは、以前の記載にあるように、クマシーブリリアントブルーで染色されるか、またはウェスタンブロッティングのためにニトロセルロース上に移された(Wang and Nuttall, 1995a)。
30匹の6日給餌オスダニの全RNAは、Qiagen RNA抽出キットを使用して0.1 mlの水の中に抽出された。全長IGBPMAコーディング配列は、プライマー(IGBPMA-1, nt 7-39 nt, AF001868; およびIGBPMA-R1, nt 917-945の逆向き鎖かつ相補鎖, AF001868, 5'AGTGCGGCCGCTCCCTTGACGTTACCGGACTTGAGGTCTA3')を使用する、RT-PCRによって増幅された。RT-PCR産物は、pGEM-Tベクター(Promega)中にクローニングされ、そしてABIの技術によって両方向から全ての配列が読まれた。得られた配列は、GCGパッケージ中のBESTFITを使用してGenBankのIGBPMA参照配列(AF001868)と比較された。
プライマー(IGBPMA-R1およびIGBPMA-F1, 5'AGTTCTAGACATATGAAATACGAAGTGTACACAGGGCGCGGGGT3', nt 76-104, AF001868)を使用して、全ての配列が読まれた新しいクローン由来の配列をコードする、5’末端短縮IGBPMA(ダニSGE中に検出されたIGBPMAの成熟型)を増幅した。PCR産物は、C末端6-Hisタグの融合を伴うインフレームで、pET23ベクター(Novagen)中にクローニングされ、そしてBL21(DE3)E.coli宿主細胞に形質転換するために使用された。12のクローンの全細胞可溶化物は、SDS-PAGEとその後に続く抗IGBPMA血清によるウェスタンブロッティングによって、誘導後のrIGBPMA発現が試験された(Wang and Nuttall, 1995a)。大量生産において、シングルコロニー(Clone No F6)が、200 rpmの振盪速度で、37℃で一晩、100 ml液体LB培地(Ampr)中で培養された。一晩培養された培地は、1000 mlの事前に温められた新しい液体LB培地(Ampr)に添加され、そして一晩培養された培地と同じ条件下で、OD6000.4〜0.6まで4時間育てられた。組み換えIGBPMA(rIGBPMA)の発現は、37℃、200 rpmで、終濃度0.4 mMのIPTGを添加して7時間培養することによって誘導された。
HisBindキット(Novagen)および推奨法(Novagen)が、rIGBPMAの精製のために使用された。BugBuster solution(Novagen)を使用した抽出後、500 ml培養液由来の不溶性rIGBPMAは、6 M尿素を含む16 ml HisBind Bufferによって抽出され、そして1 ml Ni2+充填HisBindカラム上に固定化され、そして6 M尿素を含む10×1 mlのHisBind Washing Bufferで洗浄された。rIGBPMAのリフォールディングは、室温で少なくとも10×1 mlのHisBind washing Bufferで尿素を洗い流すことによって、HisBindカラム中で実行された。rIGBPMAの可溶性画分は、3×1 mlのHisBind Elution Bufferで溶出された。溶出液は、50μlに濃縮され(Vivaspin 6, VivaScience)、次いでTBS中に5 mlに希釈され、そしてバッファー条件を変えるために前記工程を3回繰り返し、次いで-70℃で保存された。
rIGBPMAは、解凍後に、13000 rpm 10分間遠心され、そして上清のIg結合活性が試験された。IgG結合活性は、以前の記載のようにヒト-IgG結合アガロース(Sigma)を使用して測定された(Wang and Nuttall, 1995a)。ヒト-IgE(Serotech)およびラット-IgE(Serotech)に対する結合活性は、前述のようにタンパク質-Lアフィニティカラムを使用して測定された。Sepharose-6B(Sigma)およびIgE無しのタンパク質-Lアガロースは、それぞれIgGおよびIgE系に対する対照カラムとして使用された。高濃度(10 mg/ml)ストック由来のウシ血清アルブミン(BSA)は、タンパク質-L-IgEカラム上にローディングされる前に、精製可溶性rIGPBPAに添加され、rIGBPMAのカラム特異性を確認した。アフィニティカラムからの溶出液は、前述のようにSDS-PAGEによって試験された。非特異的結合/凝集を取り除くために、rIGBPMA上清は、タンパク質-L-IgEアフィニティカラム上にローディングされる前に、短いSepharose-6B(Sigma)カラムを通され、次いでタンパク質-Lカラムに通された。
方法は前述の通りであるが、5,000レゾナンスユニット(RU)の標的レベルが使用された。センサーチップ中の4つのフローセルのそれぞれの上に:セル1, ブランク; セル2, BSA(〜5000 RU); セル3, ウサギF(ab’)2断片(〜5000 RU); およびセル4, ヒトFc断片(〜4000 RU)が固定化された。フローセルは、使用の前に、30μlの20 mM HClで1回洗浄され、それに続いて少なくとも100μlのTBSで洗浄された。30μlのrIGBPMA(TBS中に1 mg/ml)が、10μl/minの流速で、1-2-3-4の順番で全てのフローセルにわたって流れに注入された。
30分の収集期間にわたって、メスによって分泌される唾液の体積は、約75 mgの閾値まで体重に比例し、その閾値以上ではダニ一匹あたり約10μlに維持された(図2A)。オス由来の唾液体積はメスの10分の1〜100分の1であったが、オス唾液のタンパク質濃度は、メスのものと比べて顕著に大きかった(図2B)。
29 kDのタンパク質が、オスSGED6から、タンパク質-L-IgG(モルモット)アフィニティカラムおよびタンパク質-L-IgE(ラット)アフィニティカラムによって主要バンドとして単離された(図6A)。主要バンドは、ウェスタンブロッティングにおいて、IGBPMAに対して産生された抗血清によって認められた(図6B)。他のダニIgG結合タンパク質(すなわちIGBPMBおよびIGBPMC)は、IgEアフィニティカラムの溶出液中では検出されなかった。
ダニ唾液腺に由来する組み換えタンパク質(rIGBPMA, GenBank受入番号AF001868)は、前述のようにE.coli中で生産された。rIGBPMA精製中の全工程において内毒素を含まない水を使用することによって、精製rIGBPMA中の内毒素レベルを約50 EU/mgまで減らすことができる。そのようなrIGBPMAが従来法(例えばCouillin et al. "Arthropod-Derived Histamine-Binding Protein Prevents Murine Allergic Asthma" The Journal of Immunology, 2004, 173: 3281-3286参照)によってrIGBPMAのBALB/cマウスにおけるアレルギー性喘息に対する効果を試験された際、rIGBPMAは、マウス一匹あたり50μgおよび10μgの低用量で、オボアルブミン(OVA)感作(免疫化)マウスにおける、メタコリンに対するアレルギー性気道過敏症(AHR)を抑制した(図11参照)。
精製ヒトIgE(Serotech)、モルモットIgG(Sigma)、およびBSA(Sigma)は、カップリングpH 4.5(10 mM酢酸)での標準アミンカップリング化学(BIAcore(商標登録)2000 Instrument HandbookおよびBIAapplication Handbook中に記載されるように)を使用する、5,000レゾナンスユニット(RU)の標的レベルで、BIAcore(商標登録)2000(BIAcore AB)の表面調製ウィザードによって、センサーチップCM5(カルボキシメチルデキストランでコーティングされたBIAcore ABチップ)上に固定化された。センサーチップ中の4つのフローセルのそれぞれの上に:セル1、ブランク;セル2、BSA(4810 RU);セル3、IgG(5004 RU);およびセル4、IgE(5780 RU)が固定化された。フローセルは、使用の前に30μlの20 mM HClで一回洗浄され、それに続いて100μlのTBSで洗浄された。50μlのrIGBPMA(TBS, 50 mM Tris, 20 mM CaCl2, 20 mM MgCl2, 100 mM NaCl, pH 7.0中に1 mg/ml)が、5μl/minの流速で、全てのフローセルにわたって、流れに注入された。
Claims (26)
- (i)図1に示されるIGBPMAアミノ酸配列、
(ii)図1に示されるアミノ酸配列の変異体であって、その中の少なくとも200、250、275、300、310の連続するアミノ酸と、少なくとも50、60、70、80、90、95または99%の同一性を共有する変異体、または
(iii)図1に示されるアミノ酸配列の断片であって、その中に示される少なくとも150、200、250、275、300、310の連続するアミノ酸を有する断片
を含み、それぞれの場合において、IgE分子に結合可能なポリペプチドである薬剤の、IgE活性化に関連する症状の治療のための医薬の製造における使用。 - 変異体が、図1に示される全長IGBPMAアミノ酸配列と特定水準の同一性を共有する、請求項1に記載の使用。
- 変異体が、外部寄生生物から得られる相同免疫グロブリン結合タンパク質である、請求項1に記載の使用。
- 変異体が、人工誘導体である、請求項1に記載の使用。
- 変異体が、切断型変異体である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用。
- 変異体が、一方または両方の末端で、非天然の連続する配列によって伸長された、請求項4に記載の使用。
- 変異体が、化学修飾された、請求項4に記載の使用。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸である薬剤の、IgE活性化に関連する症状の治療のための医薬の製造における使用。
- 核酸が
(i)図1に示されるIGBPMAヌクレオチド配列、
(ii)図1に示されるコードヌクレオチド配列の変異体であって、その中の少なくとも600、750、825、900、930の連続するヌクレオチドと、少なくとも50、60、70、80、90、95または99%の同一性を共有する変異体、
(iii)図1に示されるヌクレオチド配列の断片であって、その中に示される少なくとも450、600、750、825、900、930の連続するヌクレオチドを有する断片
を含む、請求項8に記載の使用。 - 前記変異体が、図1に示される全長IGBPMAヌクレオチド配列と特定水準の同一性を共有する、請求項9に記載の使用。
- IgE結合ポリペプチドまたは調節ポリペプチドである薬剤を生産する方法であって、
(i)図1に示されるIGBPMAであるポリペプチド、または外部寄生生物から得られる相同免疫グロブリン結合タンパク質、またはそれらをコードする核酸を提供する工程、
(ii)ポリペプチドの配列、またはそれをコードする核酸を修飾する工程、
(iii)前記修飾ポリペプチドのIgE結合特性、または前記修飾核酸の発現産物であるポリペプチドのIgE結合特性を解析する工程
を含む、前記方法。 - IgE結合因子または調節因子である薬剤を提供する方法であって:
(i)請求項1〜6のいずれか一項のポリペプチドを提供する工程、
(ii)前記ポリペプチドに関わる立体構造情報および電荷情報を取り込んだ、前記ポリペプチドの三次元モデルを作成する工程、
(iii)前記立体構造情報および電荷情報に基づくIgE結合因子または調節因子を提供する工程
を含む、前記方法。 - 薬剤を合成する工程およびIgE分子に結合するその薬剤の能力を確認する工程をさらに含む、請求項12に記載の方法。
- IgE結合因子または調節因子である薬剤をスクリーニングする方法であって、同等の反応条件下での、請求項1〜7のいずれか一項の検出可能なポリペプチドの、IgEまたはその定常領域の全体または一部によって提供される、IgE上にあるポリペプチドの結合部位に対する結合を、推定薬剤の存在下および非存在下で比較する工程、および前記結合を変化させる薬剤を選択する工程を含む、前記方法。
- (i)ポリペプチドとIgE上の結合部位とを寄せ集める工程;そして
(ii)IgE上の結合部位に対するポリペプチドの結合親和性を観察し、または測定する工程、
(iii)推定薬剤の非存在下でのIgE上の結合部位に対するポリペプチドの結合親和性と比較して、推定薬剤の存在下でのIgE上の結合部位に対するポリペプチドの結合親和性が減少するかどうかを評価する工程
を含む、請求項14に記載の方法。 - (i)推定薬剤を、IgE上の結合部位と接触させる工程;そして
(ii)ポリペプチドの存在下および非存在下で、IgE上の結合部位に対する推定薬剤の結合親和性を観察し、または測定する工程、
(iii)推定薬剤の結合親和性が、IgE上の結合部位に対するポリペプチドの結合親和性と同等か、またはそれより大きいかどうかを評価する工程
を含む、請求項14に記載の方法。 - サンプル中の推定IgE結合因子の存在または量を検出する方法であって:
(a) IgEまたはその定常領域の全体または一部によって提供される、IgE上の結合部位に固定化された請求項1〜7のいずれか一項の検出可能なポリペプチドを含む複合体に対してサンプルを曝露する工程、
(b)前記ポリペプチドのいずれかの置換を検出する工程
を含む、前記方法。 - 請求項11〜16のいずれか一項の方法によって生産または提供される薬剤の、IgE活性化に関連する症状の治療のため医薬の製造における使用。
- 治療または医薬が、前記薬剤と併用し、IgE活性化に関連する症状の治療において使用するための追加の薬剤をさらに含む、請求項1〜10および18のいずれか一項に記載の方法。
- 治療上の有効量の、請求項1〜10のいずれか一項の薬剤、または請求項11〜16のいずれか一項方法によって生産または提供される薬剤を投与すること含む、IgE活性化に関連する症状の治療の方法。
- IgE活性化に関連する症状がアレルギー性症状である、請求項1〜10または18〜20のいずれか一項に記載の使用または方法。
- 請求項1〜10のいずれか一項の薬剤、または請求項11〜16のいずれか一項の方法によって生産または提供される薬剤を含む、吸引可能な形態の組成物。
- 薬剤が、粒径0.5〜10μmの乾燥粉末の形態である、請求項22に記載の組成物。
- 請求項22または請求項23に記載の組成物、および同様のものを必要とする患者に対して吸引により薬剤を送達するのための送達手段を含む、キット。
- 送達手段が、液体噴霧器;エアロゾルベースの定量吸引器;または乾燥粉末拡散器から選択される、請求項24に記載のキット。
- IgE活性化に関連する病気の治療において使用するために適合化された治療薬を生産するのための方法であって、実質的に内毒素を含まず、組み換えによって生産される、請求項1〜6のいずれか一項のポリペプチドである薬剤を生産することを含む、前記方法。
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