JP4005126B2

JP4005126B2 - 新規な外部寄生生物唾液タンパク質及びそのようなタンパク質を収集する装置

Info

Publication number: JP4005126B2
Application number: JP51271896A
Authority: JP
Inventors: アール．フランク、グレン; ウハンター、シャーリー; ウォレンフェルス、リンダ
Original assignee: ヘスカコーポレイション
Priority date: 1994-10-07
Filing date: 1995-10-06
Publication date: 2007-11-07
Anticipated expiration: 2015-10-06
Also published as: CA2201482A1; MX9702529A; EP0784682A1; WO1996011271A1; TW472062B; CA2201482C; DE69532964D1; DE69532964T2; JP2007181463A; EP0784682B1; AU3895195A; NZ331212A; NZ295573A; AU703794B2; JPH10508467A; ATE265530T1

Description

発明の分野
本発明は、外部寄生生物唾液タンパク質を単離するための新規な生成物及び方法、並びに動物のアレルギー性皮膚炎を検出及び／又は処置するための新規な生成物及び方法に関する。
発明の背景
外部寄生生物（ectoparasite）、特にノミ、の刺し傷は、動物での過敏な応答の原因となり得る。特に、ノミの刺し傷に対する過敏な応答は、ノミアレルギー性皮膚炎（Flea Allergy dermatitis：ＦＡＤ）と呼ばれる疾患において現れる。過敏症とは、ある化合物に以前に被曝したことのある動物が、次の被曝の際にその化合物に対してアレルギー応答を示す反応性の変化した状態をいう。過敏な応答には、Ｉ型、II型、III型及びIV型過敏症が挙げられる。I型過敏症は、アレルゲンが、肥満細胞の表面上のＦｃレセプターに結合したＩｇＥの架橋を誘導する、ＩｇＥ仲介性過敏症として記載されている。この架橋により、肥満細胞の脱顆粒が起きる。II型過敏症は、抗体が細胞表面アレルゲンに結合して補体の活性化により細胞破壊にいたる、抗体仲介性細胞傷害性過敏症として記載されている。III型過敏症は、アレルゲン−抗体複合体が種々の組織に沈着し炎症応答を誘導する、免疫複合体仲介性過敏症として記載されている。遅延型過敏反応（delayed hypersensitive reaction）にはIV型過敏症が含まれ、それは、Ｔリンパ球（すなわちＴ細胞）が、細胞性崩壊を仲介するマクロファージ若しくは細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させるサイトカインを放出する、細胞仲介性過敏症として記載されている。
I型過敏応答は通常、アレルゲン性化合物、通常は可溶性アレルゲン、への被曝後約２〜３０分後に起こる。II型及びIII型応答はアレルゲン性化合物への被曝後約２〜８時間後に起こり得る。あるいは、遅延型過敏応答では、アレルゲン性化合物に対する動物によるアレルギー性応答は、代表的には、その化合物への被曝の約２４〜約７２時間後に現れる。この２４時間の遅延の間に、その物質が位置した領域に単核細胞が侵入する。侵入物は、リンパ球、単球、マクロファージ、及び好塩基性細胞を含み得る。単球若しくはマクロファージを活性化して、組織の損傷を引き起こす酵素（例えば、プロテアーゼ）を分泌させるリンホカイン（例えば、インターフェロン−γ）が生成される。
即時型及び／又は遅延型過敏症の症状を誘導する外来性化合物を、本明細書中でアレルゲンという。用語「アレルゲン」は、主に、アレルギー性応答を引き起こし得る外来性化合物をいう。この用語は用語「抗原」と、特に即時型及び／又は遅延型過敏症の症状を誘導することができる外来性化合物に関して、交換可能に用いることができる。アレルゲンに対する動物の感受性に影響を及ぼす因子は、遺伝的成分及び／又はアレルゲンに対する環境性被曝を含み得る。動物は、動物が過敏になっているアレルゲンの反復注射によりアレルゲンに対して脱感作され得る。
ＦＡＤは、即時型及び遅延型過敏症の両方を現し得る。代表的には、ＦＡＤに対して感受性の動物における即時型過敏症応答には、ノミの刺し傷の部位での膨疹形成があげられる。そのような膨疹はかさぶたを伴って紫色に変色し、それは遅延型過敏症の代表である。ノミに刺されたことに対する過敏な応答は、遺伝的な素因を有する動物並びにノミに刺されることに以前に曝されることによって感受性にされた動物において起こり得る。
ＦＡＤの効果的な処置は、達成が不可能ではなかったとしても、困難であり続けている。ノミが特有の地域内の約１５％のネコ及びイヌがＦＡＤに苦しんでおり、その頻度は年々増大してきている。地理的な領域では、効果的なノミの制御は全ての動物の処置を必要とする。研究者らが提案した一つの処置は、ノミアレルゲンを用いる動物の脱感作に関する。しかし、ノミアレルゲンの信頼性があり規定された調製物が、そのような処置には必要である。
本発明の新規な処方物が発見されるまでは、ＦＡＤの原因であるノミアレルゲンは、はっきりと規定されていなかった。全ノミ抗体調製物を用いてＦＡＤの動物の診断及び脱感作を行ってきていたのである（Benjamini et al., 1960, pp.214-222, Experimental Parasitology, Vol.10; Keep et al., 1967, pp.425-426 ,Australian Veterinary Journal, Vol.43; Kristensen et al., 1978, pp.414-423, Nord. Vet-Med, Vol.30; Van Winkle, 1981, pp.343-354, J. Amer. Animal Hosp. Assoc., Vol.17; Haliwell et al., 1987, pp.203-213, Veterinary Immunology and Immunopathology, Vol.15; Green et al., 1993, pp.69-74, Parasite Immunology, Vol.15）； Opdebeeck et al.によるPCT公開第WO93/18788号；及びVan Winkle, pp.343-354,1981, J. Am. Anim. Hosp .Assoc., Vol.32。しかし、市販の全ノミ抽出物は予測不能であり、したがってその有用性は限られたものである。
以前の研究者たちは、ノミの唾液に含まれる産生物がＦＡＤに関与し得ること、及びそのような産生物を単離する方法も示唆してきた：Benjamini et al., 1963, pp.143-154, Experimental Parasitology, Vol.13; Young et al., 1963, pp.155-166, Experimental Parasitology 13, Vol.13 ; Michaeli et al., 1965, pp.162-170, J.Immunol., Vol.95 ; 及びMichaeli et al., 1996, pp.402-406, J.Immunol., Vol.97。しかし、これらの研究者たちは、ノミの唾液のアレルゲン性因子は分子量が６キロダルトン（kD）未満のハプテンであると特徴づけていた。それらがタンパク質ではないということは、それらを強酸（例えば、６Nの塩酸）若しくは熱に被曝させた場合に分解に対して感受性ではないことが見い出されたことによっても支持されている。特定の低分子量のアレルゲン性因子のいくつかもまた、高度に蛍光性の芳香族画分であると特徴づけられた（Young et al．，同書）。更に、それらの研究者たちによる研究は、そのような因子がアレルゲン性であるためには、アジュバント及び／又は担体（例えば、コラーゲン若しくは経口分泌物（oral secretion）を収集するために用いられる膜の一部）と結びつけられている必要があることを示した。また、ノミの唾液因子の収集を記載した方法は困難でありかつ予測不能であった。そのうえ、これらの方法によって単離された因子には、代表的には、ノミ由来の物質、ノミを飼育するために用いたそれらの培養培地、若しくは皮膚系の膜が混入していた。
したがって、動物内で過敏症応答を誘導し得るノミ唾液アレルゲンをより明確に規定する必要性が今も残っている。更に、ＦＡＤに罹っているか、若しくはＦＡＤを有している動物の脱感作に有用なアレルゲンの予測可能で安価な調製物を提供する実質的に純粋なノミ唾液アレルゲンを収集する方法を開発する必要性が今も残っている。
発明の概要
本発明は、一つの実施態様において、少なくとも１つの単離された外部寄生生物唾液タンパク質を含む処方物に関する。この処方物において、上記外部寄生生物唾液タンパク質は、アミノ酸配列の少なくとも一部分を含む。このアミノ酸配列において、その一部分は、厳格な条件下で、ノミ唾液抽出物、ＦＳ−１、ＦＳ−２及び／又はＦＳ−３に存在するノミ唾液タンパク質をコードする核酸分子とハイブリダイズし得る核酸分子によってコードされる。好ましいノミ唾液タンパク質には、fspA、fspB、fspC1、fspC2、fspD1、fspD2、fspE、fspF、fspG1、fspG2、fspG3、fspH、fspI、fspJ1、fspJ2、fspK、fspL1、fspL2、fspM1、fspM2、fspN1、fspN2及び／又はfspN3が挙げられる。更に、この処方物のノミ唾液タンパク質は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54及び／又はSEQ ID NO:56によって示されるアミノ酸配列の少なくとも一部分を含み得る。
本発明の別の実施態様は、少なくとも１つの単離された外部寄生生物唾液タンパク質を含む処方物を含む。この処方物において、上記外部寄生生物唾液タンパク質は、少なくとも一部分のアミノ酸配列を含み、このアミノ酸配列において、前記部分は厳格な条件下で、図２においてタンパク質ピークとして示されるノミ唾液タンパク質をコードする核酸分子とハイブリダイズし得る核酸分子によってコードされている。
本発明の１つの局面は、外部寄生生物唾液産生物を含む処方物を包含し、前記処方物は、Tris-グリシンSDS-PAGEにかけた場合、図１Ｂのレーン１３及び／又は図１Ｂのレーン１４に示されるような分画プロフィールを有する。
本発明の更に別の実施態様は、実質的に混入物質を含まない少なくとも１つの単離された外部寄生生物唾液産生物を含む処方物を包含する。この処方物は以下の工程を包含するプロセスによって生成される：（ａ）外部寄生生物を有する唾液収集装置内の収集手段上の外部寄生生物唾液産生物を収集する工程であって、上記装置は（ｉ）チャンバーに操作可能に連結されたハウジングであって、上記チャンバーは、上記ハウジングよりも暖かい周囲温度（ambient temperature）を有し、それにより上記ハウジングと上記チャンバーとの間の温度の差異を形成し、上記ハウジングは外部寄生生物を保持することができる、及び（ii）上記ハウジングと上記チャンバーとの間のインターフェイス、このインターフェイスは、（（a））上記装置内に保持された外部寄生生物によって沈積された唾液産生物の少なくとも一部を収集し得る手段、及び（（b））混入物質が上記収集手段に接触するのを実質的に妨げることができる障壁手段であって、ここで、上記温度の差異が上記ハウジング内に保持された外部寄生生物を引きつけ、上記障壁手段及び収集手段によって給餌し、それにより唾液産生物を上記収集手段上に沈積するよう試みる；及び（ｂ）前記唾液産生物を前記収集手段から抽出して前記処方物を入手する工程。本発明はまた、実質的に混入物を含まないノミ唾液産生物を含有する処方物を生成するそのような装置及びそのような装置の利用もまた包含する。
本発明のもう一つの局面は、厳格な条件下で、ノミ唾液抽出物、ＦＳ−１、ＦＳ−２及び／又はＦＳ−３に存在するノミ唾液タンパク質（fspA、fspB、fspC1、fspC2、fspD1、fspD2、fspE、fspF、fspG1、fspG2、fspG3、fspH、fspI、fspJ1、fspJ2、fspK、fspL1、fspL2、fspM1、fspM2、fspN1、fspN2及び／又はfspN3が挙げられるがこれらに限定されない）をコードする遺伝子とハイブリダイズし得る単離された核酸分子に関する。特に、上記核酸分子は、厳格な条件下で、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52若しくはSEQ ID NO:55の核酸配列とハイブリダイズし得る。本発明はまた、組換え分子若しくは本発明の核酸分子を有する組換え細胞も包含する。
本発明はまた、少なくとも１つの外部寄生生物唾液タンパク質を生成する方法に関し、以下の工程（ａ）厳格な条件下で、ノミ唾液抽出物、ＦＳ−１、ＦＳ−２及び／又はＦＳ−３に存在するノミ唾液タンパク質をコードする遺伝子とハイブリダイズし得る少なくとも１つの核酸分子で形質転換された細胞を培養して上記タンパク質を生成する工程；及び（ｂ）上記外部寄生生物唾液タンパク質を回収する工程、を包含する。
本発明の別の局面は、外部寄生生物唾液産生物若しくはそのミメトープ（mimetope）に選択的に結合し得る抗体を包含する。
本発明の更に別の局面は、本明細書中に開示された任意の処方物を含むアレルギー性皮膚炎の処置のための治療用組成物を包含する。特に、この治療用組成物は、ノミアレルギー性皮膚炎、蚊アレルギー性皮膚炎、及び／又はCulicoidesアレルギー性皮膚炎の処置のために有用である。更に、治療用組成物に含まれる特定のノミ唾液タンパク質は、以下のノミ唾液タンパク質の内の少なくとも１つの少なくとも一部分を含む：fspE、fspF、fspG1、fspG2、fspG3、fspH、fspI、fspJ1、fspJ2、fspK、fspL1、fspL2、fspM1、fspM2、fspN1、fspN2及び／又はfspN3。本発明はまた、アレルギー性皮膚炎に対して宿主動物を脱感作する方法も包含し、その方法にはその動物に治療用組成物を投与する工程が含まれる。
本発明は、更に、動物がアレルギー性皮膚炎に対して感受性であるか、若しくはそれを有しているかをテストするための検定キットにも関する。このキットは：（ａ）本明細書中に開示された処方物；及び（ｂ）上記動物がアレルギー性皮膚炎に対して感受性であるか、若しくはそれを有しているかを決定するための手段であって、ここでこの手段には、動物がアレルギー性皮膚炎に対して感受性であるか、若しくはそれを有しているかを同定するための上記処方物の利用が含まれる。
本発明によれば、動物がアレルギー性皮膚炎に対して感受性であるか若しくはそれを有しているかを同定するためにある方法を用いることができ、この方法は：（ａ）その動物上のある部位に本発明の処方物を投与する工程及びその動物上の別の部位に、陽性対照溶液及び陰性対照溶液からなる群から選択されるコントロール溶液を投与する工程；及び（ｂ）上記処方物の投与に起因する反応を、コントロール溶液の投与に起因する反応と比較する工程、を包含する。上記動物は、上記処方物に対する反応が、少なくとも陽性対照溶液に対する反応と同じくらい大きい場合に、アレルギー性皮膚炎に対して感受性であるか、若しくはそれを有していると決定される。上記動物は、上記処方物に対する反応が、陰性対照溶液に対する反応とほぼ同じくらいの大きさである場合に、アレルギー性皮膚炎に対して感受性でないか、若しくはそれを有していないと決定される。特に、この方法により、即時型過敏症及び／又は遅延型過敏症を検出することができる。
また本発明によれば、動物でのアレルギー性皮膚炎の指標となる抗体の存在を測定することにより、ある方法をアレルギー性皮膚炎に対して感受性であるか、若しくはそれを有している動物を同定するために用いることができる。この方法は：（ａ）本発明の処方物を、上記動物由来の体液と、その処方物と抗体（その体液中に存在するならば）との免疫複合体の形成に十分な条件下で、接触させる工程；及び（ｂ）形成された免疫複合体の量を測定する工程、ここで、上記免疫複合体の形成はその動物がアレルギー性皮膚炎に対して感受性であるか、若しくはそれを有していることの指標となる。特に、上記方法は、動物での即時型過敏症の指標としてのＩｇＥ抗体を検出するために用いることができる。
本発明はまた、アレルギー性皮膚炎の処置を処方するための方法も包含し：（ａ）アレルギー性皮膚炎に対して感受性であるか、若しくはそれを有している動物を、本発明の処方物を含むin vivo若しくはin vitro検定によって同定する工程；及び（ｂ）本発明の処方物を上記動物に投与する工程を含む処置を処方する工程、を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１Ａは、還元１６％Tris-グリシンSDS-PAGEによるノミ唾液タンパク質の分析を示す。
図１Ｂは、還元１６％Tris-グリシンSDS-PAGEによるノミ唾液タンパク質、ＦＳ−１及びＦＳ−２の分析を示す。
図１Ｃは、還元１６％Tris-グリシンSDS-PAGEによるfspNの分析を示す。
図２は、高速液体クロマトグラフィーを用いるノミ唾液タンパク質の分析を示す。
図３は、エンドプロテイナーゼAsp-Nで消化したfspHタンパク質のタンパク分解性フラグメントの逆相ＨＰＬＣ分析によって得られたピークを示す。
図４Ａは、本発明のノミ唾液収集装置の断面を示す。
図４Ｂは、本発明のノミ唾液収集装置の吹き出し口（b1ow-out）を示す。
図５は、ノミ感受性にされたイヌへの種々のノミ唾液タンパク質処方物の注射の１５分後に生成された膨疹の相対的なサイズを示す。
図６は、ノミ感受性にされたイヌへの種々のノミ唾液タンパク質処方物の注射の６時間後の膨疹の相対的硬化（induration）を示す。
図７は、ノミ感受性にされたイヌへの種々のノミ唾液タンパク質処方物の注射の６時間後の膨疹の相対的紅斑を示す。
図８は、ノミ感受性にされたイヌへの種々のノミ唾液タンパク質処方物の注射の２４時間後の膨疹の相対的硬化を示す。
図９は、ノミ感受性にされたイヌへの種々のノミ唾液タンパク質処方物の注射の２４時間後の膨疹の相対的紅斑を示す。
図１０は、ノミ感受性にされたイヌの血清中の抗ノミ唾液ＩｇＥ抗体を測定したELISAの結果を示す。
図１１Ａ及び１１Ｂは、ノミ感受性にされたイヌの血清中の抗ノミ唾液ＩｇＥ抗体及びそれらを持たない心糸状虫が感染したイヌを測定したELISAの結果を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、外部寄生生物に対する動物のアレルギー性皮膚炎を診断及び処置するための新規な生成物及び方法を包含する。本発明は、外部寄生生物によって引き起こされるアレルギーの診断及び処置に有用な、混入物（例えば、血液タンパク質、糞便物質（fecal material）及び幼虫培養培地）を十分に持たない外部寄生生物の唾液産生物の独特な処方物を提供するという点で特に有利である。更に、本発明は、別の活性、例えば、ノミが、宿主のノミに対する耐性を与えるか及び／又は中和するする能力において重要な活性、を有する外部寄生生物唾液産生物を含み、このような産生物は、凝固活性、抗凝血活性、プロテアーゼ活性、ホスホリパーゼ活性、プロスタグランジン活性、抗補体活性、他の免疫抑制活性、ホスファターゼ活性、アピラーゼ活性、血管作用（vasoactive）活性、及び／又は抗炎症活性を有する。ノミ唾液産生物には、例えば、プロテアーゼ類が含まれるがこれに限定されず、このプロテアーゼ類は、別の器官に由来するノミによって逆流（regurgitate）する。別の器官には、例えば、中腸（midgut）があるがこれに限定されない。
本発明はまた、外部寄生生物唾液産生物を、実質的に混入物を含まずに、再現性があり効果的に単離する装置及び方法を提供するという点で特に有利である。
本発明によれば、外部寄生生物は宿主動物の皮膚を通って付着して生育する外部生存寄生体（external living parasite）である。外部寄生生物は、宿主動物に依存して生きる寄生体及び摂餌のために一時的に動物に付着する寄生体を含む。また、本発明によれば、外部寄生生物唾液とは、外部寄生生物が温度の差異に反応して摂餌を試みようとするとき（例えば、本発明の装置内に存在するとき）に外部寄生生物の口から放出される物質をいう。外部寄生生物唾液は、外部寄生生物唾液産生物を含む。本発明の外部寄生生物産生物は、本発明の収集手段（以下に詳細に記載する）に結合した外部寄生生物唾液部分を含み、本明細書中では外部寄生生物成分という。同様に、外部寄生生物唾液産生物はまた本発明の収集手段から抽出した外部寄生生物唾液部分をも含み、本明細書中では外部寄生生物抽出物という。外部寄生生物唾液抽出物には、例えば、本明細書中に記載された任意の方法を用いて単離することができる外部寄生生物唾液タンパク質が含まれる。本発明の外部寄生生物唾液抽出物はまた、別の外部寄生生物唾液産生物、例えば、プロスタグランジン及び別の薬理学的に活性な分子、をも含み得る。
本発明の１つの実施態様は、アレルギー性皮膚炎に対して感受性であるか、若しくはそれを有している（すなわち、罹患している）動物の診断及び／又は処置に用い得る外部寄生生物唾液産生物を含む処方物である。本発明の外部寄生生物唾液産生物を用いて診断及び／又は処置する好ましいタイプのアレルギー性皮膚炎には、ノミアレルギー性皮膚炎、Culicoidesアレルギー性皮膚炎及び蚊アレルギー性皮膚炎が挙げられる。本発明の外部寄生生物唾液産生物を用いて診断及び／又は処置する好ましいタイプのアレルギー性皮膚炎は、ノミアレルギー性皮膚炎である。本明細書中で用いられるように、アレルギー性皮膚炎に感受性の動物とは、アレルギー性皮膚炎を発症する遺伝的素因のある動物、及び／又は抗原への再被曝によってアレルギー症状を起こし、そのことが例えば、その動物を観察するか若しくはその動物によるその抗原に対する抗体産生を測定することによって認められる、抗原で感作された動物をいう。同様に、アレルギー性皮膚炎に対して感受性の動物には、無症状の（subclinical）アレルギー性皮膚炎を有する動物が含まれる。無症状のアレルギー性皮膚炎とは、動物を観察するだけではアレルギー症状を検出し得ない状態（すなわち、疾患の顕現が、罹患しているが皮膚炎ではない動物の抗外部寄生生物唾液タンパク質抗体の存在を含み得る）をいう。例えば、無症状のアレルギー性皮膚炎は、本発明のin vivo若しくはin vitro検定（以下に詳細に記載する）を用いて検出され得る。アレルギー性皮膚炎を有する動物という場合、その動物を観察するだけで、及び／又は本発明のin vivo若しくはin vitro検定（以下に詳細に記載する）を用いることによって検出され得るアレルギー症状を示している動物を含む。
本発明の１つの実施態様は、１以上の単離された外部寄生生物唾液タンパク質を含む処方物である。本発明によれば、単離されたタンパク質は、その天然の環境から取り出されたタンパク質である。例えば、単離された外部寄生生物唾液タンパク質は、その天然の供給源から取得され得るか、組換えＤＮＡ技術を用いて生成され得るか、若しくは化学的に合成され得る。本明細書中で用いられるように、単離された外部寄生生物タンパク質は、完全長外部寄生生物唾液タンパク質若しくはそのようなタンパク質の任意の相同体、例えば、アミノ酸が欠失した（例えば、ペプチドのような、そのタンパク質の短縮型）、挿入された、逆位された（inverted）、置換された、及び／又は誘導体化された（例えば、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリスチル化、プレニル化、パルミチン酸化（palmitation）、アミド化、及び／又はグリコシルホスファチジルイノシトールの付加による）、外部寄生生物唾液タンパク質であり得る。外部寄生生物唾液タンパク質の相同体は、その相同体をコードする核酸配列が、天然の外部寄生生物唾液タンパク質アミノ酸配列をコードする核酸配列に対して（すなわちこの配列と）、厳格な条件下で、ハイブリダイズできる、天然の外部寄生生物唾液タンパク質アミノ酸配列に十分類似したアミノ酸配列を有するタンパク質である。本明細書中で用いられるように、厳格なハイブリダイゼーション条件とは、その条件下で、オリゴヌクレオチドを含む核酸分子を用いて類似の核酸分子を同定する、標準的なハイブリダイゼーション条件をいう。そのような標準的な条件は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Haarbor Labs Press,1989に開示されている。本発明のタンパク質相同体の最小サイズは、対応する天然のタンパク質をコードする相補的な核酸分子配列と安定なハイブリッドを形成し得る核酸分子によってコードされるのに十分なサイズである。このように、そのようなタンパク質相同体をコードする核酸分子のサイズは、核酸組成及びその核酸分子と相補的な配列との間の相同体のパーセント、並びにハイブリダイゼーション条件それ自体（例えば、温度、塩濃度、及びホルムアミド濃度）に依存する。そのような核酸分子の最小サイズは、もしその核酸分子がＧＣリッチならば、代表的には少なくとも約１２〜約１５ヌクレオチドの長さであり、もしその核酸分子がＡＴリッチならば、代表的には少なくとも約１５〜約１７塩基の長さである。このように、本発明の外部寄生生物唾液タンパク質相同体をコードするのに用いられる核酸分子の最小サイズは、約１２〜約１８ヌクレオチドの長さである。実用的な限界は別にして、そのような核酸分子の最大サイズには制限はない。この最大サイズの核酸分子は、遺伝子の一部、遺伝子の全部、若しくは多重遺伝子（multiple genes）、若しくはそれらの一部を含み得る。同様に、本発明の外部寄生生物唾液タンパク質相同体の最小サイズは、約４〜約６アミノ酸長であり、好ましいサイズは、完全長、多価（すなわち、１を超えるドメインを有する融合タンパク質で、そのそれぞれのドメインが機能を有する）、若しくはそのようなタンパク質の機能的部分を所望するかどうかに依存する。
外部寄生生物唾液タンパク質相同体は、外部寄生生物唾液タンパク質をコードする天然の遺伝子の対立遺伝子変化の結果であり得る。天然の遺伝子とは、天然に最も頻繁に見いだされる形態の遺伝子をいう。外部寄生生物唾液タンパク質相同体は、例えば無作為な若しくは標的化した変異誘発を行う伝統的な若しくは組換えＤＮＡ技術を用いる、タンパク質をコードする遺伝子の直接的な改変（しかしそれに限定されない）を含む当該分野で公知の技術を用いて生成され得る。
本発明の好ましい外部寄生生物唾液タンパク質（それらの相同体を含む）は、外部寄生生物の刺し傷に起因するアレルギー性皮膚炎を検出及び／又は処置をすることができる。好ましい外部寄生生物唾液タンパク質相同体は、天然の外部寄生生物唾液タンパク質相対物に対して過敏症応答を誘発し得る少なくとも１つのエピトープを含む。外部寄生生物唾液タンパク質相同体はまた、そのタンパク質の天然の形態に対して動物を過敏症にし得るエピトープをも含み得る。外部寄生生物唾液タンパク質相同体が、アレルギー性皮膚炎に対して感受性であるか若しくはそれを有している動物の過敏症を、検出及び／又は処置する（すなわち、例えば、脱感作により免疫調整若しくは免疫調節を行う）能力は、当業者に公知の技術によりテストすることができる。このような技術は、以下に詳述する皮膚テスト及び免疫吸収（Immunoabsorbent）検定を含む。本発明の別の好ましい外部寄生生物唾液タンパク質は、その外部寄生生物の摂餌及び生存にとって重要な活性を含む別の活性を有する。
１つの実施態様において、本発明の処方物は、単離された外部寄生生物唾液タンパク質の少なくとも一部を有するタンパク質を含むことができる。本発明によれば、”外部寄生生物唾液タンパク質の少なくとも一部”とは、厳格な条件下で、本発明の全長外部寄生生物唾液タンパク質をコードする核酸分子とハイブリダイズし得る核酸分子によってコードされる外部寄生生物唾液タンパク質の一部をいう。好ましい外部寄生生物唾液タンパク質の一部は、外部寄生生物の刺し傷が原因のアレルギー性皮膚炎の検出及び／又は処置に有用である。別の好ましい部分は、ノミの摂餌及び生存に重要な活性を有する。本発明の外部寄生生物唾液タンパク質の部分の適切なサイズは、本発明の外部寄生生物唾液タンパク質相同体に関して開示したようなサイズである。
当業者には明らかなように、本発明は、全ての外部寄生生物に適用することを意図している。本発明の処方物は、いかなる外部寄生生物の唾液産生物をも包含し得る。本発明の好ましい外部寄生生物は、それから唾液産生物（タンパク質を含む）を単離するか、及び／又はそれからその後組換え若しくは合成により生成され得るタンパク質を同定し、それには蛛形類（arachnids）、昆虫類及びヒル類（leeches）が含まれる。唾液産生物をそれから取得するより好ましい外部寄生生物には、ノミ（flea）；Ixodidae科の硬ダニ（hard tick）（例えば、Ixodes及びAmblyomma）並びにArgasidae科の軟ダニ（soft tick）（例えば、O．parkeri及びO．turicataのようなOrnithodoros）を含むダニ；小虫（midge）（例えば、Culicoides）、蚊、スナバエ（sand fly）、ブラックフライ（black fly）、アブ（horse fly）、ツノサシバエ（horn fly）、メクラアブ（deer fly）、ツェツェバエ（tsetse fly）、サシバエ（stable fly）、ハエウジ病を引き起こすハエ（myiasis-causing fly）及び刺すブユ（biting gnat）のような飛ぶ昆虫（fly）；アリ；クモ、シラミ；ダニ（mite）；南京虫（bed bug）及びオオサシガメ（kissing bug）のような、シャーガス病を有する半翅類を含む、半翅類（true bug）が挙げられる。より一層好ましい外部寄生生物唾液産生物は、ノミ、蚊、小虫、スナバエ、ブラックフライ、ダニ、及びRhodniusの唾液産生物を含み、更に一層好ましいのはノミ、蚊、及びCulicoides由来の産生物である。
本発明の特に好ましい処方物は、ノミ唾液タンパク質を含む。好ましいノミ唾液産生物は、Ctenocephalides、Xenopsylla、Pulex、Tunga、Nosopsyllus、Diamanus、Ctopsyllus、及びEchidnophagaノミに由来する産生物であり、Ctenocephalides canisノミ及びCtenocephalides felisノミが更に一層好ましい。例示のため、以下の実施態様の多くはノミ唾液タンパク質について検討する。ノミ唾液タンパク質のそのような検討は、どのような方法においても、本発明の範囲を限定することを意図しない。
一つの実施態様において、本発明の処方物は、混入物質を実質的に含まない。混入物質は、例えば、外部寄生生物の糞便物質、外部寄生生物が以前に摂取した食物由来の血液タンパク質（例えば、フェチュイン、フェリチン、アルブミン、ヘモグロビン及び他の大きな血液タンパク質）、角皮（cuticular）屑、及び外部寄生生物の幼虫培養培地（例えば、血液、マウス用食物及び砂）を含む。本明細書中で用いられるように、混入物を実質的に持たない処方物は、更に精製を行わなくても望ましくない副作用を起こすことなく診断薬若しくは治療薬として用いることができる処方物である。好ましくは、混入物質を実質的に持たない処方物は、約５０％未満の混入物質を含み、より好ましくは約１０％未満の混入物質を含み、そしてより一層好ましくは、約５％未満の混入物質を含む。このように、本発明の処方物は、好ましくは少なくとも約５０％のノミ唾液産生物を含み、より好ましくは少なくとも約９０％ノミ唾液産生物を含み、そしてより一層好ましくは少なくとも約９５％のノミ唾液産生物を含む。実質的に混入物を持たない本発明の処方物は、いかなる血液混入物若しくはノミ中腸含有物をも有さない処方物を含み得る。実質的に混入物を持たない処方物は、以下に詳述する本発明の唾液収集装置を用いて取得することができる。
混入物質を実質的に持たない処方物は、当業者に公知の代表的な方法により同定することができる。例えば、混入物の存在は：（１）処方物をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）に負荷して分析する；（２）処方物を種々のクロマトグラフィー技術により分析する；（３）特定の混入物に結合し得る抗体を用いて処方物をスクリーニングする、例えば、イムノブロット若しくは酵素免疫検定技術；（４）処方物をキャピラリー電気泳動により分析する；若しくは（５）ヘモグロビンを検出する検定を用いて処方物をスクリーニングする、ことによって同定することができる。
本発明の処方物の一つの実施態様は、Tris-グリシンSDS-PAGEによる測定で、好ましくは１４％ポリアクリルアミドゲルを用い、当該分野で標準の技術を用いて分離される、約６kD〜約６５kDの範囲の分子量を有する少なくとも１以上のノミ唾液タンパク質を含む。好ましい処方物は、約６kD〜約５５kDの範囲の分子量を有する１以上のノミ唾液タンパク質を含む。より好ましい処方物は、図１に示される溶出（若しくは移動）パターンを有する１以上のタンパク質を含む。
別の実施態様においては、本発明の処方物は、Tris-グリシンSDS-PAGEによって測定され当該分野で標準的な方法を用いて分離される、約４０kD〜約３００kDの範囲の分子量を有する少なくとも１以上のノミ唾液タンパク質を含む。そのような処方物中に含まれるノミ唾液タンパク質の５０％以上は、約４０kD〜約５５kDの範囲の分子量を有し、fspNと類似しているようである。より好ましい処方物は、図１に示される溶出（若しくは移動）パターンを有する１以上のタンパク質を含む。
別の実施態様においては、本発明の処方物は、塩基性の等電点若しくはｐＩ値を有する１以上のノミ唾液タンパク質を含む。等電ｐＨ値若しくはｐＩ値とは、分子が正味の電荷を持たず電場で移動しないｐＨ値をいう。本発明の好ましい処方物は、少なくとも約ｐＩ８．５、より好ましくは少なくとも約ｐＩ９．０のｐＩ値を有するタンパク質を含む。ノミ唾液タンパク質であるfspHは、例えば、約ｐＩ８．５〜約ｐＩ９．６の範囲のｐＩ値を有し、ノミ唾液タンパク質がそれから回収されるノミ集団における対立遺伝子変化のため不均質であることを示し得る。
更に別の実施態様において、本発明の処方物は、本発明の収集手段から溶出した１以上のノミ唾液産生物の少なくとも一部分を含む。そのような処方物の例は、ノミ抽出物ＦＳ−１、ＦＳ−２及びＦＳ−３を含む。このＦＳ−１、ＦＳ−２及びＦＳ−３ノミ唾液抽出物は、実施例２に詳細に記載する方法に従って生成される。本発明によれば、用語ＦＳ−１ノミ唾液抽出物、ＦＳ−２ノミ唾液抽出物若しくはＦＳ−３ノミ唾液抽出物は、それぞれ用語ＦＳ−１ノミ唾液産生物混合物、ＦＳ−２ノミ唾液産生物混合物若しくはＦＳ−３ノミ唾液産生物混合物と交換可能に用いることができる。
ＦＳ−１ノミ唾液抽出物は、（ａ）還元１６％Tris-グリシンSDS-PAGEにかけた場合、図１Ｂ、レーン１３に示されるようなバンドとして移動するタンパク質；及び（ｂ）逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけた場合、図２に示されるピークのように移動するタンパク質の混合物を含む。図２のピークは、ＦＳ−１に含まれるタンパク質が、下記に詳述する本発明の唾液収集装置を用いて収集され、更に、その収集したタンパク質が、５％〜６３％のアセトニトリル若しくは５．６％〜７０％の溶媒Ｂを流速０．８ｍｌ／分で用いてC4 HPLCカラムを通すことによりタンパク質のピークに分離され、ここで、溶媒Ａは、水中の約０．１％のＴＦＡであり、溶媒Ｂは、９０％アセトニトリル中の約０．０８５％ＴＦＡである、場合に得られる。図２に関して、ピークは、ピークＡ、ピークＢ、ピークＣ、ピークＤ、ピークＥ、ピークＦ、ピークＧ、ピークＨ、ピークＩ、ピークＪ、ピークＫ、ピークＬ、ピークＭ、及びピークＮを意味し、そのように示される。このようなピークに含まれるノミ唾液タンパク質（若しくはタンパク質フラグメント）は、fspA、fspB、fspC、fspD、fspE、fspF、fspG、fspH、fspI、fspJ、fspK、fspL、fspM及びfspNという。ピークは、図２で印を付けた領域をいい、ピークが必ずしもただ一つのタンパク質（若しくはタンパク質フラグメント）を含むわけではないことを留意すべきである。上記で言及したピークに含まれるタンパク質の、例えば、アミノ酸配列決定若しくはSDS-PAGEゲル電気泳動によるさらなる分析は、fspCがfspC1及びfspC2という少なくとも２つのタンパク質を含み、fspDがfspD1及びfspD2という少なくとも２つのタンパク質を含み、fspGがfspG1、fspG2、及びfspG3という少なくとも３つのタンパク質を含み、fspJがfspJ1及びfspJ2という少なくとも２つのタンパク質を含み、fspLがfspL1及びfspL2という少なくとも２つのタンパク質を含み、fspMがfspM1及びfspM2という少なくとも２つのタンパク質を含み、fspNがfspN1、fspN2及びfspN3という少なくとも３つのタンパク質及び／又はタンパク質フラグメントを含むことを示した。少なくとも部分アミノ酸配列が、多くのノミ唾液タンパク質に関して得られ、例えば、SEQ ID NO:1（fspAのＮ−（アミノ）末端部分アミノ酸配列）、SEQ ID NO:2（ほとんどのfspHタンパク質を表す、Ｎ−末端から始まるアミノ酸配列）、SEQ ID NO:3（fspHのエンドプロテイナーゼAsp-NフラグメントのＮ−末端部分アミノ酸配列、fspHeと称する）、SEQ ID NO:4（fspHのエンドプロテイナーゼAsp-NフラグメントのＮ−末端部分アミノ酸配列、fspHhと称する）、SEQ ID NO:5（fspHのエンドプロテイナーゼAsp-NフラグメントのＮ−末端部分アミノ酸配列、fspHjと称し、これはfspHのＮ−末端部分アミノ酸配列も示す）、SEQ ID NO:6（fspIのＮ−末端部分アミノ酸配列）、SEQ ID NO:7（fspJ1のＮ−末端部分アミノ酸配列）、SEQ ID NO:8（fspJ2のＮ−末端部分アミノ酸配列）、SEQ ID NO:9（fspL1のＮ−末端部分アミノ酸配列）、SEQ ID NO:10（fspL2のＮ−末端部分アミノ酸配列）、SEQ ID NO:11（fspN1のＮ−末端部分アミノ酸配列）、SEQ ID NO:12（fspN2のＮ−末端部分アミノ酸配列）、SEQ ID NO:13（fspN3のＮ−末端部分アミノ酸配列）、SEQ ID NO:14（fspHのＮ−末端部分アミノ酸配列）、SEQ ID NO:25（SEQ ID NO:24によって示された核酸配列の翻訳物で、fspIに相当）、SEQ ID NO:26（fspIの見かけの完全長翻訳産物）、SEQ ID NO:27（fspBのＮ−末端部分アミノ酸配列）、SEQ ID NO:28（fspG1のＮ−末端部分アミノ酸配列）、SEQ ID NO:29（fspG2のＮ−末端部分アミノ酸配列）、SEQ ID NO:30（fspG3のＮ−末端部分アミノ酸配列）、SEQ ID NO:31（fspNのエンドプロテイナーゼAsp-NフラグメントのＮ−末端部分アミノ酸配列、fspN（100-101）と称する）、SEQ ID NO:33（PfspH₈₀と名付けた、fspHに対応するnfspH₂₄₂と名付けた部分核酸配列（SEQ ID NO:32という）の翻訳産物）、SEQ ID NO:35（PfspI₁₅₅と名付けた、fspIに対応するnfspI₅₉₁と名付けた部分核酸配列（SEQ ID NO:34という）の翻訳産物）、SEQ ID NO:51（PfspN（A）₁₇₂と名付けた、fspNタンパク質のnfspN（A）₆₄₆と名付けた部分核酸配列（SEQ ID NO:50という）の翻訳産物）、SEQ ID NO:53（PfspN（B）₁₅₃と名付けた、fspNタンパク質のnfspN（B）₆₁₂と名付けた部分核酸配列（SEQ ID NO:52という）の翻訳産物）、SEQ ID NO:54（PfspN（A）と名付けたfspNタンパク質の、見かけのＮ−末端部分アミノ酸配列で、PfspN（A）₅₆という）、及びSEQ ID NO:56（nfspN（A）₁₁₉₇と名付けたfspN3の見かけの完全核酸配列（SEQ ID NO:55という）の見かけの完全長翻訳産物で、PfspN（A）₃₉₈と名付けた）などがある。各々のタンパク質をどのようにして特徴づけたかは実施例２及び３に記載する。
ＦＳ−２ノミ唾液抽出物は、還元１６％Tris-グリシンSDS-PAGEにかけた場合、図１Ｂ、レーン１４及び１５に示されるようなバンドとして移動するタンパク質の混合物を含む。
ＦＳ−１、ＦＳ−２及びＦＳ−３ノミ唾液抽出物を入手する溶出プロトコールののち、さらなる目的のノミ唾液産物が収集手段の上に残るということは本発明の範囲内である。また、本発明の処方物は、他の技術を用いる溶出により、例えば、より高濃度の溶出液を用いることによって、収集手段から取り出されるノミ唾液産生物をも含み得ることも本発明の範囲内である。
別の実施態様において、本発明の処方物は、少なくとも一部の外部寄生生物唾液タンパク質相同体を含み、この相同体は、唾液抽出物ＦＳ−１、ＦＳ−２及びＦＳ−３に含まれる少なくとも１つの産生物の少なくとも一部と、好ましくは、少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、そして更に一層好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸相同体（比較領域内の同一性）を有する。好ましい相同体は、fspA、fspB、fspC1、fspC2、fspD1、fspD2、fspE、fspF、fspG1、fspG2、fspG3、fspH、fspI、fspJ1、fspJ2、fspK、fspL1、fspL2、fspM1、fspM2、fspN1、fspN2及びfspN3の１以上のタンパク質の少なくとも一部と、好ましくは、少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、そして更に一層好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸相同体を有する外部寄生生物唾液タンパク質の部分を含む。同様に、以下のアミノ酸配列の１つの少なくとも１部を有するタンパク質もまた含まれる：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54及び／又はSEQ ID NO:56。
好ましい実施態様においては、本発明の処方物は、本発明の外部寄生生物唾液タンパク質相同体の少なくとも一部を含み、この相同体は、唾液抽出物ＦＳ−１、ＦＳ−２若しくはＦＳ−３に含まれる産生物の少なくとも一部をコードする核酸分子と、少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、そして更に一層好ましくは少なくとも約８５％の相同体を有する核酸分子によってコードされる。好ましい外部寄生生物産生物相同体は、以下の１以上のタンパク質の少なくとも一部をコードする核酸分子と少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、そして更に一層好ましくは少なくとも約８５％の相同体を有する核酸分子によってコードされる：fspA、fspB、fspC1、fspC2、fspD1、fspD2、fspE、fspF、fspG1、fspG2、fspG3、fspH、fspI、fspJ1、fspJ2、fspK、fspL1、fspL2、fspM1、fspM2、fspN1、fspN2及びfspN3。
更に別の実施態様において、本発明の処方物は、エンドプロテイナーゼAsp-Nによって消化された場合、タンパク質分解フラグメントを生成し、逆相HPLCにかけた場合には図３に示されるピークと共に移動するタンパク質を含む。逆相HPLCは、A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing, PT Matsudaira ed.,Academic Press, San Diego,CAにおいてStone et al., Enzymatic Digestion of Proteins and HPLC Peptide Isolatonによって開示された方法（すなわち、Narrowbore手法：vydac C18逆相、300A、5μmサポート；流速０．２ml／分；溶媒Ａは、水中の０．６％ＴＦＡそして溶媒Ｂは、水中の８０％アセトニトリル中に０．０５２％ＴＦＡ；試料は２％Ｂで注入；２％Ｂで保持後の勾配は６０分間にわたって２％〜３７．５％Ｂ、３０分間にわたって３７．５％〜７５％Ｂ、１５分間にわたって７５％〜９８％Ｂ；そして２１４nmで検出）を用いて行った。そのようなタンパク質の例は、fspHであり、ESMSによって検出された場合、分子量約８６１３±６ダルトンという特性を有する。本発明の特に好ましい処方物は、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:14、若しくはSEQ ID NO:33によって示されるアミノ酸配列を有するfspHタンパク質を含む。
好ましい実施態様においては、本発明の処方物は、下記のアミノ酸配列（標準的な一文字のアミノ酸コードを用いる）の少なくとも一部を有する（すなわち含む）少なくとも１つの単離されたタンパク質を含み得る：

（SEQ ID NO:1；fspAのＮ−末端部分配列を示す）。
本発明の処方物はまた、下記のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する少なくとも１つの単離されたタンパク質をも含み得る：

（SEQ ID NO:2；fspHのほぼ完全なＮ−末端配列を示す）。
本発明の処方物はまた、下記のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する少なくとも１つの単離されたタンパク質をも含み得る：

（SEQ ID NO:14；fspHのＮ−末端部分配列を示す）。
本発明の処方物はまた、下記のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する少なくとも１つの単離されたタンパク質をも含み得る：
ＤＳＫＨＣＹＣＥＡＰＹＳ
（SEQ ID NO:3；fspHeのＮ−末端部分配列を示す）。
本発明の処方物はまた、下記のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する少なくとも１つの単離されたタンパク質をも含み得る：

（SEQ ID NO:4；fspHhのＮ−末端部分配列を示す）。
本発明の処方物はまた、下記のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する少なくとも１つの単離されたタンパク質をも含み得る：
ＤＲＲＶＳＫＴＣＱＳＧ
（SEQ ID NO:5；fspHjのＮ−末端部分配列を示す）。
本発明の処方物はまた、下記のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する少なくとも１つの単離されたタンパク質をも含み得る：

（SEQ ID NO:6；fspIのＮ−末端部分配列を示す）。
本発明の処方物はまた、下記のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する少なくとも１つの単離されたタンパク質をも含み得る：
ＮＳＨＥＰＧＮＴＲＫＩＲＥＶＭＤＫＬＲＫＱＨＰ
（SEQ ID NO:7；fspJ1のＮ−末端部分配列を示す）。
本発明の処方物はまた、下記のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する少なくとも１つの単離されたタンパク質をも含み得る：
ＥＩＫＲＮＳＨＥＰＧＮＴＲＫＩＲＥＶＭＤＫＬＲＫＱＨＰ
（SEQ ID NO:8；fspJ2のＮ−末端部分配列を示す）。
本発明の処方物はまた、下記のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する少なくとも１つの単離されたタンパク質をも含み得る：

（SEQ ID NO:９；fspL1のＮ−末端部分配列を示す）。
本発明の処方物はまた、下記のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する少なくとも１つの単離されたタンパク質をも含み得る：
ＸＬＸＲＮＤＫＥＰＧＮＴＲＫＩＲＥＶＭＤＫ
（SEQ ID NO:10；fspL2のＮ−末端部分配列を示す）。
本発明の処方物はまた、下記のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する少なくとも１つの単離されたタンパク質をも含み得る：
ＮＤＥＬＫＦＶＦＶＭＡＫ
（SEQ ID NO:11；fspNIのＮ−末端部分配列を示す）。
本発明の処方物はまた、下記のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する少なくとも１つの単離されたタンパク質をも含み得る：
ＸＤＥＬＫＦＶＦＶＭＡＫＧＰＳＸＱＡＸＤＹＰＣ
（SEQ ID NO:12；fspN2のＮ−末端部分配列を示す）。fspN1及びfspN2は類似性を有しているようであるが、Ｎ−末端部分配列が、同一でない場合、これら２つのタンパク質は、Tris-グリシンSDS-PAGEにかけた場合に異なって移動し、それらが異なるタンパク質であることが示唆され、それはおそらくそれらのタンパク質の一つのＣ−末端短縮化及び／又はグリコシレーションのような翻訳後修飾が原因であることを留意すべきである。
本発明の処方物はまた、下記のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する少なくとも１つの単離されたタンパク質をも含み得る：
ＥＬＫＦＶＦＡＴＡＲＧＭＳＨＴＰＣＤＹＰ
（SEQ ID NO:13；fspN3のＮ−末端部分配列を示す）。
本発明の処方物はまた、下記のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する少なくとも１つの単離されたタンパク質をも含み得る：

（SEQ ID NO:27；fspBのＮ−末端部分配列を示す）。
本発明の処方物はまた、下記のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する少なくとも１つの単離されたタンパク質をも含み得る：
ＤＲＲＶＳＫ
（SEQ ID NO:28；fspG1のＮ−末端部分アミノ酸配列を示す）。
本発明の処方物はまた、下記のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する少なくとも１つの単離されたタンパク質をも含み得る：
ＳＫＭＶＴＥＫＸＫＳＧＧＮＮＰＳＴＫＥＶＳＩＰ
（SEQ ID NO:29；fspG2のＮ−末端部分アミノ酸配列を示す）。
本発明の処方物はまた、下記のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する少なくとも１つの単離されたタンパク質をも含み得る：
ＥＶＳＩＰＳＧＫＬＴＩＥＤＦＸＩＧＮＨＱ
（SEQ ID NO:30；fspG3のＮ−末端部分アミノ酸配列を示す）。
本発明の処方物はまた、下記のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する少なくとも１つの単離されたタンパク質をも含み得る：

（SEQ ID NO:33；fspHに対応する、SEQ ID NO:32によって示される核酸配列の翻訳産物を示す）。
本発明の処方物はまた、下記のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する少なくとも１つの単離されたタンパク質をも含み得る：

（SEQ ID NO:25；fspIに対応する、SEQ ID NO:24によって示される核酸配列の翻訳産物を示す）。
本発明の処方物はまた、下記のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する少なくとも１つの単離されたタンパク質をも含み得る：

（SEQ ID NO:26；fspIの見かけの完全長翻訳産物を示す）。
本発明の処方物はまた、下記のアミノ配列の少なくとも一部を有する少なくとも１つの単離されたタンパク質をも含み得る：

（SEQ ID NO:35；fspIに対応する、SEQ ID NO:34によって示される核酸配列の翻訳産物を示す）。
本発明の処方物はまた、下記のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する少なくとも１つの単離されたタンパク質をも含み得る：
ＤＩＥＮＩＫＫＧＥＧＱＰＧＡＰＧＧＫＥＮＮＬＳＶＬ
（SEQ ID NO:31；fspNのエンドプロテイナーゼAsp-NフラグメントのＮ−末端部分アミノ酸配列を示し、PfspN（100-101）と称する）。
本発明の処方物はまた、下記のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する少なくとも１つの単離されたタンパク質をも含み得る：

（SEQ ID NO:51；fspNタンパク質に対応する、SEQ ID NO:50によって示される核酸配列の翻訳産物を示す）。GenBankに報告されたアミノ酸配列とSEQ ID NO:51のアミノ酸配列との比較は、SEQ ID NO:51がヒト前立腺酸ホスファターゼ（prostatic acid phosphatase）と約２８％同一であることを示している。
本発明の処方物はまた、下記のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する少なくとも１つの単離されたタンパク質をも含み得る：

（SEQ ID NO:53；fspNタンパク質に対応する、SEQ ID NO:52によって示される核酸配列の翻訳産物を示す）。GenBankに報告されたアミノ酸配列とSEQ ID NO:53のアミノ酸配列との比較は、SEQ ID NO:53がヒト前立腺酸ホスファターゼと約３０％同一であることを示している。
本発明の処方物はまた、下記のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する少なくとも１つの単離されたタンパク質をも含み得る：

（SEQ ID NO:54；fspNタンパク質のＮ−末端部分アミノ酸配列を示す）。
本発明の処方物はまた、SEQ ID NO:56のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する少なくとも１つの単離されたタンパク質をも含み得、SEQ ID NO:56は、SEQ ID NO:55によって示される核酸配列の見かけの全長翻訳産物を示し、明らかにfspN3タンパク質に対応する。GenBankに報告されたアミノ酸配列とSEQ ID NO:56のアミノ酸配列との比較はSEQ ID NO:56がヒト前立腺酸ホスファターゼと約３０％同一であることを示している。
本発明の外部寄生生物唾液タンパク質は、唾液抽出物ＦＳ−１、ＦＳ−２若しくはＦＳ−３に含まれるタンパク質の少なくとも一部、及び好ましくは下記の唾液タンパク質の少なくとも一部の完全長タンパク質、ハイブリッドタンパク質、融合タンパク質、多価タンパク質、及び短縮型相同体であるタンパク質、若しくはタンパク質分解生成物であるタンパク質を含むがこれらに限定されないということが理解されるはずである：fspA、fspB、fspC1、fspC2、fspD1、fspD2、fspE、fspF、fspG1、fspG2、fspG3、fspH、fspI、fspJ1、fspJ2、fspK、fspL1、fspL2、fspM1、fspM2、fspN1、fspN2及び／又はfspN3。同様に、以下のアミノ酸配列のうちの一つの少なくとも一部を有するタンパク質もまた含まれる；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54及び／又はSEQ ID NO:56。本明細書中で用いられるように、用語ハイブリッドタンパク質とは２つの異なるタンパク質から生成された単一のタンパク質をいう。
前述のSEQ ID NOは実施例に開示された方法に従って推定したアミノ酸配列を表す。アミノ酸配列決定技術は完全にエラーがないというわけではないので前述のSEQ ID NOは、本発明の外部寄生生物唾液タンパク質の最良の、見かけのアミノ酸配列を示すということを留意すべきである。更に、前述のSEQ ID NOにおいて見られる変化もまた、少なくとも部分的には対立遺伝子変化が原因であり得る。この理由は、配列決定されるタンパク質がノミの集団から誘導されたものだからである。
本発明によれば、本発明の処方物は、翻訳後修飾を受けたノミ唾液タンパク質を含み得る。そのような修飾は、例えば、グリコシル化を含み得る。グリコシル化はＮ−結合及び／又はＯ−結合オリゴサッカライドの付加を含み得る。本発明のタンパク質の翻訳後修飾は、即時型若しくは遅延型過敏症応答において、エピトープがそのタンパク質に対してアレルギー性応答を誘導する能力に寄与し得るということが理解される。
本発明の別の実施態様は、厳格な条件下で、本発明の外部寄生生物唾液タンパク質をコードする外部寄生生物唾液タンパク質遺伝子とハイブリダイズし得る単離された核酸分子である。本発明によれば、単離された核酸分子は、その天然の環境から取り出された（すなわち、ヒトの操作の対象となった）核酸分子である。このように、「単離された」とは、どの程度核酸分子が精製されているかを反映するものではない。単離された核酸分子はＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡのいずれかの誘導体を含み得る。
本発明の単離された核酸分子は、その遺伝子と安定なハイブリッドを形成し得る、全体の（すなわち完全な）遺伝子若しくはそれらの一部として、天然の供給源から入手され得る。本明細書中で用いられるように、ある物の「少なくとも一部」という句は、少なくともその物の機能的な側面を持つのに十分なその物の量をいう。例えば、本明細書中で用いられるように、核酸配列の少なくとも一部とは、厳格なハイブリダイゼーション条件下で、対応する遺伝子と安定にハイブリッドを形成し得る核酸配列の量をいう。本発明の単離された核酸分子はまた、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅、クローニング）若しくは化学合成を用いて生成し得る。単離された外部寄生生物唾液タンパク質核酸分子は、天然の核酸分子及びそれらの相同体を含み、それは、天然の対立遺伝子変種及び改変された核酸分子を含むがそれらに限定されない。この改変された核酸分子は、そのような改変によってその核酸分子が本発明の外部寄生生物唾液タンパク質をコードする能力若しくは厳格な条件下で天然の核酸分子単離物と安定なハイブリッドを形成する能力を実質的に妨げないような方法で、ヌクレオチドが挿入、欠失、置換及び／又は逆位されている。
本発明の単離された核酸分子は、本発明の少なくとも１つの外部寄生生物唾液タンパク質をコードする核酸配列を含み得、そのようなタンパク質の例が本明細書中に開示される。「核酸分子」という句は主に物理的な核酸分子をいい、そして「核酸配列」という句は主にその核酸分子上のヌクレオチドの配列をいうが、これら２つの句は、特に、外部寄生生物唾液タンパク質をコードし得る核酸分子若しくは核酸配列に関しては、交換可能に用いることができる。これまでに開示してきたように、本発明の外部寄生生物唾液タンパク質は、全長外部寄生生物唾液タンパク質コード領域、それらの部分を有するタンパク質、及び他の外部寄生生物唾液タンパク質相同体を含むがこれらに限定されない。
本発明の外部寄生生物唾液タンパク質は、ポリタンパク質をコードする完全長核酸配列によってコードされ得るということが理解される。このポリタンパク質は、唾液中に見られる多数のタンパク質に翻訳後にプロセスされ得る。本明細書中で用いられるように、外部寄生生物唾液タンパク質遺伝子は、天然の外部寄生生物唾液タンパク質に関与する全ての核酸配列、例えば、その遺伝子によってコードされる外部寄生生物唾液タンパク質の生成を制御する調節領域（例えば、転写制御領域、翻訳制御領域、若しくは翻訳後制御領域があるがこれらに限定されない）並びにそのコード領域を含む。本発明の核酸分子は単離された天然の外部寄生生物唾液タンパク質核酸分子若しくはその相同体であり得る。本発明の核酸分子は、１以上の調節領域、完全長若しくは部分コード領域、又はそれらの組合せを含み得る。本発明の外部寄生生物唾液タンパク質核酸分子の最小サイズは、厳格なハイブリダイゼーションの条件下で対応する天然の遺伝子と安定なハイブリッドを形成し得る最小のサイズである。
外部寄生生物唾液タンパク質核酸分子相同体は、当業者に公知の多くの方法（例えば、Sambrook et al.,前出、を参照）を用いて生成され得る。例えば、核酸分子は、伝統的な変異誘発技術及び部位特異的変異誘発のような組換えＤＮＡ技術、変異を誘発するための核酸分子の化学的処理、核酸フラグメントの制限酵素消化、核酸分子の連結、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅、及び／又は核酸配列の選択した領域の変異誘発、オリゴヌクレオチド混合物の合成、及び核酸分子の混合物の「構築」のための混合物群の連結、及びそれらの組合せ、を含むがこれらに限定されない種々の方法を用いて改変され得る。核酸分子相同体は、核酸によってコードされるタンパク質の機能（例えば、相同体がアレルギー性皮膚炎の動物内のアレルギー反応を誘発する能力若しくは相同体が抗凝血物質として作用する能力）についてのスクリーニングによって、及び／又は厳格な条件下での単離された外部寄生生物唾液タンパク質核酸とのハイブリダイゼーションによって、改変された核酸分子の混合物から選択され得る。
本発明の一つの実施態様は、唾液抽出物ＦＳ−１、ＦＳ−２若しくはＦＳ−３に含まれる、ノミ唾液産生物の少なくとも一部をコードし得る外部寄生生物唾液タンパク質核酸分子、若しくはその相同体（例えば、他の外部寄生生物の唾液産生物）である。ここで、ＦＳ−１は、ＨＰＬＣにかけられた場合、ピークＡ、ピークＢ、ピークＣ、ピークＤ、ピークＥ、ピークＦ、ピークＧ、ピークＨ、ピークＩ、ピークＪ、ピークＫ、ピークＬ、ピークＭ、及び／又はピークＮに分離する。好ましい核酸分子は、下記の１以上のタンパク質の少なくとも一部をコードし得る：fspA、fspB、fspC1、fspC2、fspD1、fspD2、fspE、fspF、fspG1、fspG2、fspG3、fspH、fspI、fspJ1、fspJ2、fspK、fspL1、fspL2、fspM1、fspM2、fspN1、fspN2及びfspN3、若しくはこれらの相同体。同様に、好ましい核酸分子は、下記の１以上のアミノ酸配列の少なくとも一部を有するタンパク質をコードする核酸分子であるが、それらに限定されない：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54及び／又はSEQ ID NO:56、若しくはこれらの相同体。
本発明の好ましい核酸分子は、厳格な条件下で、唾液抽出物ＦＳ−１、ＦＳ−２若しくはＦＳ−３に含まれる、ノミ唾液産生物若しくはその相同体（例えば、別の外部寄生生物の唾液産生物）の少なくとも一部をコードする核酸とハイブリダイズし得る。唾液抽出物ＦＳ−１、ＦＳ−２若しくはＦＳ−３に含まれる、ノミ唾液産生物若しくはその相同体（例えば、別の外部寄生生物の唾液産生物）の少なくとも一部をコードする核酸配列の対応する領域と、少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、更に好ましくは少なくとも約８５％、そしてより一層好ましくは少なくとも約９５％の相同体を有する核酸配列を含む外部寄生生物唾液タンパク質核酸分子もまた好ましい。特に好ましい核酸配列は、下記の１以上のタンパク質の少なくとも一部をコードする核酸配列と、少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、更に好ましくは少なくとも約８５％、そしてより一層好ましくは少なくとも約９５％の相同体を有する核酸配列である：fspA、fspB、fspC1、fspC2、fspD1、fspD2、fspE、fspF、fspG1、fspG2、fspG3、fspH、fspI、fspJ1、fspJ2、fspK、fspL1、fspL2、fspM1、fspM2、fspN1、fspN2及びfspN3。同様に、下記の１以上のアミノ酸配列の少なくとも一部をコードする核酸配列と、少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、更に好ましくは少なくとも約８５％、そしてより一層好ましくは少なくとも約９５％の相同体を有する核酸分子もまた好ましい：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54及び／又はSEQ ID NO:56。
このような核酸分子は、完全長タンパク質、ハイブリッドタンパク質、融合タンパク質、多価タンパク質若しくは短縮型フラグメントをコードする完全長遺伝子及び／又は核酸分子であり得る。本発明のより好ましい核酸分子は、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、若しくはSEQ ID NO:55によって示される核酸配列を有する単離された核酸分子を含む。SEQ ID NO:20は、ノミ唾液タンパク質fspHをコードする見かけの遺伝子の約６０ヌクレオチドを含む核酸配列であり、fspHのコード領域の約２５％を含む。SEQ ID NO:24は、ノミ唾液タンパク質fspIをコードする見かけの遺伝子の約５７３ヌクレオチドを含む核酸配列であり、SEQ ID NO:25で示される約１４９アミノ酸をコードする。fspIの全翻訳産物は、見かけ上約１５８アミノ酸であり、SEQ ID NO:26と表される。SEQ ID NO:32は、ノミ唾液タンパク質fspHをコードする見かけの遺伝子の２４２bpの核酸配列であり、SEQ ID NO:33で示される約８０アミノ酸のタンパク質をコードする。SEQ ID NO:34は、ノミ唾液タンパク質fspIをコードする見かけの遺伝子の５９１bpの核酸配列であり、SEQ ID NO:35で示される約１５５アミノ酸のタンパク質をコードする。SEQ ID NO:50は、fspNノミ唾液タンパク質をコードする見かけの遺伝子の６４６bpの核酸配列であり、SEQ ID NO:51で示される約１７２アミノ酸のタンパク質をコードする。SEQ ID NO:52は、fspNノミ唾液タンパク質をコードする見かけの遺伝子の６１２bpの核酸配列であり、SEQ ID NO:53で示される約１５３アミノ酸のタンパク質をコードする。SEQ ID NO:55は、fspN3をコードする見かけの遺伝子の１１９７bpの核酸配列であり、SEQ ID NO:56で示される約３９８アミノ酸のタンパク質をコードする。
本発明の外部寄生生物唾液タンパク質の核酸配列を知ることにより、当業者は、その核酸分子のコピーを作製すること、並びに外部寄生生物唾液タンパク質をコードする遺伝子の別の部分の核酸分子（例えば、翻訳開始部位及び／又は転写及び／又は翻訳制御領域を含む核酸分子）、及び／又は外部寄生生物唾液タンパク質核酸分子相同体を入手することが可能になる。本発明の外部寄生生物唾液タンパク質のアミノ酸配列を知ることにより、当業者は、そのような外部寄生生物唾液タンパク質をコードする核酸配列をクローン化することが可能になる。更に、所望の外部寄生生物唾液タンパク質核酸分子は、適切な発現ライブラリーを、本発明の外部寄生生物唾液タンパク質に結合する抗体を用いてスクリーニングすること；適切なライブラリー若しくはＤＮＡをスクリーニングするために、本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いる従来のクローニング技術；及び本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる適切なライブラリー、あるいはＲＮＡ若しくはＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡを用いることができる）のＰＣＲ増幅を含む種々の方法で入手し得る。ノミ唾液タンパク質核酸分子を単離するために、好ましいｃＤＮＡライブラリーは、餌を与えられていないノミ全体（unfed whole flea）、餌を与えられたノミ全体、餌を与えられたノミ中腸、餌を与えられていないノミ中腸、及びノミ唾液腺から作製されたｃＤＮＡライブラリーを含む。遺伝子をクローン化しそして増幅する技術は、例えば、Sambrook et al.、前出、に開示されている。実施例の節は、本発明のノミ唾液タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列の単離の実施例を含む。
本発明はまた、唾液抽出物ＦＳ−１、ＦＳ−２若しくはＦＳ−３に含まれる、ノミ唾液産生物若しくはその相同体（例えば、他の外部寄生生物の唾液産生物）の少なくとも一部をコードする本発明の他の核酸分子、好ましくはより長い核酸分子の相補的領域と、厳格な条件下で、ハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドである核酸分子をも含む。好ましいオリゴヌクレオチドは、下記の１以上のタンパク質の少なくとも一部をコードし得る核酸分子と、厳格な条件下でハイブリダイズし得る：fspA、fspB、fspC1、fspC2、fspD1、fspD2、fspE、fspF、fspG1、fspG2、fspG3、fspH、fspI、fspJ1、fspJ2、fspK、fspL1、fspL2、fspM1、fspM2、fspN1、fspN2及びfspN3、若しくはこれらの相同体。同様に、特定の好ましいオリゴヌクレオチドは、下記の１以上のアミノ酸配列の少なくとも一部を有するタンパク質をコードし得る核酸分子と、ハイブリダイズし得る：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54及び／又はSEQ ID NO:56、若しくはこれらの相同体。特定の好ましいオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:55によって表される核酸配列を含む核酸分子若しくはこれらの相補物とハイブリダイズし得る。
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、若しくはいずれかの誘導体であり得る。このようなオリゴヌクレオチドの最小サイズは、所定のオリゴヌクレオチドと本発明のもう一つの核酸分子上の相補的な配列との間に安定なハイブリッドを形成するのに必要とされるサイズである。最小サイズの特性を本明細書中に開示する。このオリゴヌクレオチドのサイズは、本発明によるオリゴヌクレオチドの使用に十分でなければならない。本発明のオリゴヌクレオチドは、さらなる核酸分子を同定するためのプローブとして、核酸分子を増幅若しくは伸張するためのプライマーとして、若しくは、例えば、外部寄生生物による唾液タンパク質の発現を阻害する治療的応用を含むがこれらに限定されない種々の応用に用いることができる。このような治療的応用は、例えば、アンチセンス−、三重鎖形成−、リボザイム−、及び／又はＲＮＡ薬剤−を基礎にした技術におけるそのようなオリゴヌクレオチドの使用を包含する。したがって、本発明は、そのような技術を一つ以上用いることにより、外部寄生生物唾液タンパク質の生成を妨げるそのようなオリゴヌクレオチド及び方法を包含する。
本発明はまた、組換えベクターを含み、この組換えベクターは、宿主細胞内に本発明の核酸分子を送達し得る任意のベクターに挿入された本発明の外部寄生生物唾液タンパク質核酸分子を含む。このようなベクターは、異種核酸配列、すなわち、天然では本発明の外部寄生生物唾液タンパク質核酸分子に隣接して見いだされることはない核酸配列を含む。このベクターは、ＲＮＡ若しくはＤＮＡのいずれかであり得、原核細胞性若しくは真核細胞性のいずれかであり得、そして代表的にはウイルス若しくはプラスミドである。組換えベクターは、本発明の外部寄生生物唾液タンパク質核酸分子のクローニング、配列決定、及び／又は他の操作に用いることができる。組換えベクターの一つのタイプを、本明細書中では組換え分子といい、以下により詳細に記載するが、本発明の核酸分子の発現に用いることができる。好ましい組換えベクターは、形質転換された細胞内で複製が可能なものである。
本発明の組換えベクターに含まれる好ましい核酸分子は、唾液抽出物ＦＳ−１、ＦＳ−２若しくはＦＳ−３に含まれる少なくとも１つのノミ唾液産生物若しくはそれらの相同体（例えば、他の外部寄生生物の唾液産生物）の少なくとも一部をコードする核酸分子である。組換えベクターに含まれる特に好ましい核酸分子は、下記の１以上のタンパク質の少なくとも一部をコードし得る：fspA、fspB、fspC1、fspC2、fspD1、fspD2、fspE、fspF、fspG1、fspG2、fspG3、fspH、fspI、fspJ1、fspJ2、fspK、fspL1、fspL2、fspM1、fspM2、fspN1、fspN2及びfspN3、若しくはこれらの相同体。同様に、下記の１以上のアミノ酸配列の少なくとも一部を有するタンパク質をコードする核酸分子もまた含まれる：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54及び／又はSEQ ID NO:56、若しくはこれらの相同体、及びSEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52及び／又はSEQ ID NO:55によって表される核酸配列の少なくとも一部を含む核酸分子。
一つの実施態様において、本発明の単離された外部寄生生物唾液タンパク質は、そのタンパク質を生成するのに効果的な条件下でそのタンパク質を発現し得る細胞を培養する工程、及びそのタンパク質を回収する工程によって生成される。培養する好ましい細胞は、外部寄生生物唾液タンパク質を発現し得る組換え細胞であり、この組換え細胞は、宿主細胞を本発明の１以上の核酸分子で形質転換することにより生成される。核酸分子の細胞への形質転換は、核酸分子をその細胞に挿入し得る任意の方法により達成し得る。形質転換技術は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、及びプロトプラスト融合を含むがそれらに限定されない。組換え細胞は、単細胞のままであってもよいし、あるいは組織、器官、若しくは多細胞生物へ生育していてもよい。形質転換された本発明の核酸分子は、染色体外に留まっていてもよいし、あるいは形質転換された（すなわち、組換え）細胞の染色体内の１以上の部位に、それらが発現される能力を保持するように組み込まれることもできる。宿主細胞を形質転換するのに用いられる好ましい核酸分子は、唾液抽出物ＦＳ−１、ＦＳ−２、若しくはＦＳ−３に含まれる、ノミ唾液産生物若しくはそれらの相同体（例えば、別の外部寄生生物の唾液産生物）の少なくとも一部をコードする核酸分子を含む。宿主細胞を形質転換するのに用いられる特に好ましい核酸分子は、本発明の組換えベクターに含まれ、本明細書中に開示される。
形質転換のための適切な宿主細胞は、形質転換可能で、導入される外部寄生生物唾液タンパク質を発現することができる任意の細胞を含む。したがってこのような細胞は、少なくとも１つの本発明の核酸分子で形質転換後、本発明の外部寄生生物唾液タンパク質を産生することができる。宿主細胞は、形質転換されていない細胞であっても、又は既に少なくとも１つの核酸分子で形質転換されている細胞であってもよい。本発明の適切な宿主細胞は、細菌、真菌（酵母を含む）、昆虫、動物及び植物細胞を含んでよい。好適な宿主細胞は、細菌、酵母、昆虫及び哺乳動物細胞を含み、細菌（例えばE.coli（大腸菌）及び昆虫（例えばスポドプテラ（Spodoptera））細胞が特に好適である。
組換え細胞は、好適には宿主細胞を、各々、１つ以上の転写制御配列を含有する発現ベクターに機能的に結合された本発明の１つ以上の核酸分子を含む、１つ以上の組換え分子で形質転換することにより産生される。機能的に結合されたという句は、宿主細胞に形質転換されるとき、核酸分子が発現できるように発現ベクターに核酸分子を挿入することを意味する。本明細書で使用されるとき、発現ベクターは、宿主細胞を形質転換することができ、特定の核酸分子を発現させることができる、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターである。好適には、この発現ベクターはまた、宿主細胞中で複製することができる。発現ベクターは、原核又は真核生物であってよく、典型的にはウイルス又はプラスミドである。本発明の発現ベクターは、本発明の組換え細胞（細菌、真菌、昆虫、動物、及び／又は植物細胞を含む）内で機能する（すなわち、遺伝子発現を指令する）任意のベクターを含む。このようものとして、本発明の核酸分子は、プロモーター、オペレーター、リプレッサー、エンハンサー、終結配列、複製の開始点のような調節配列、及び組換え細胞と融和性であり、かつ本発明の核酸分子の発現を制御する他の調節配列を含有する発現ベクターに機能的に結合させることができる。本明細書で使用されるとき、転写制御配列は、転写の開始、伸長、及び終結を制御することができる配列を含む。特に重要な転写制御配列は、転写の開始を制御する、プロモーター、エンハンサー、オペレーター及びリプレッサー配列のような配列である。適切な転写制御配列は、本発明の少なくとも１つの組換え細胞内で機能することができる任意の転写制御配列を含む。このような種々の転写制御配列が、当業者には知られている。好適な転写制御配列は、細菌、酵母、蠕虫、昆虫及び哺乳動物細胞中で機能する、例えば、tac、lac、trp、trc、oxy-pro、omp/lpp、rrnB、バクテリオファージラムダ（λ）（例えば、λｐ_L及びλｐ_R並びにこのようなプロモーターを含む融合物）、バクテリオファージＴ７、Ｔ７ｌａｃ、バクテリオファージＴ３、バクテリオファージＳＰ６、バクテリオファージＳＰ０１、メタロチオネイン、アルファ接合因子（alpha mating factor）、ピキア（Pichia）アルコールオキシダーゼ、アルファウイルスサブゲノムプロモーター（例えばシンドビス（Sindbis）ウイルスサブゲノムプロモーター）、バキュロウイルス、ヘリオチス・ゼア（Heliothis zea）昆虫ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０、レトロウイルスのアクチン、レトロウイルスのロングターミナルリピート（long terminal repeat）、ラウス肉腫ウイルス、熱ショック、リン酸及び硝酸転写制御配列、並びに原核又は真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列を含むが、これらに限定されない。これらに追加して適切な転写制御配列は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びにリンホカイン−誘導性プロモーター（例えば、インターフェロン又はインターロイキンにより誘導可能なプロモーター）を含む。本発明の転写制御配列はまた、外部寄生生物唾液タンパク質をコードするＤＮＡ配列に本来結合している天然の転写制御配列も含む。
本発明の発現ベクターはまた、発現した外部寄生生物唾液タンパク質を、このタンパク質を産生する細胞から分泌させることのできる分泌シグナル（すなわち、シグナルセグメント核酸配列）を含有してもよい。適切なシグナルセグメントは、外部寄生生物唾液タンパク質シグナルセグメント、又は本発明の外部寄生生物唾液タンパク質（融合タンパク質を含む）の分泌を指令することができる任意の異種性シグナルセグメントを含む。好適なシグナルセグメントは、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、インターフェロン、インターロイキン、成長ホルモン、組織適合性及びウイルスエンベロープ糖タンパク質シグナルセグメントを含むが、これらに限定されない。
本発明の発現ベクターはまた、融合タンパク質としての本発明の挿入された核酸分子の発現を引き起こす融合配列を含有してもよい。本発明の外部寄生生物核酸分子の一部として融合配列を含むと、核酸分子によりコードされるタンパク質の産生、貯蔵及び／又は使用の間の安定性が増強される。更には、融合セグメントは、外部寄生生物唾液タンパク質の精製を単純化する（例えば、生じた融合タンパク質の、親和性クロマトグラフィーを利用した精製を可能にする）ための道具として機能することができる。適切な融合セグメントは、目的の機能（例えば、安定性の向上及び／又は精製の道具）を有する任意の大きさのドメインであってよい。１つ以上の融合セグメントを使用することは、本発明の範囲内である。融合セグメントは、外部寄生生物唾液タンパク質のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端に結合することができる。融合セグメントと外部寄生生物唾液タンパク質との間の結合は、外部寄生生物唾液タンパク質の直接の回収ができるように開裂を受けやすく構築することができる。好適には融合タンパク質は、外部寄生生物唾液タンパク質のカルボキシル末端及び／又はアミノ末端に結合した融合セグメントを含むタンパク質をコードする融合核酸配列で形質転換した組換え細胞を培養することにより産生される。
本発明の組換え分子は、形質転換すべき細胞内で核酸分子の発現を有効に調節することができる少なくとも１つの任意の転写制御配列に、機能的に結合された少なくとも１つの前述の任意の核酸分子を含んでよい分子である。好適な組換え分子は、唾液抽出物のＦＳ−１、ＦＳ−２、又はＦＳ−３に含有されている、ノミの唾液産生物又はその相同体（例えば、他の外部寄生生物の唾液産生物）の少なくとも一部をコードする１つ以上の核酸分子を含む。組換え分子に含まれる特に好適な核酸分子は、本発明の組換えベクターに含まれる分子として本明細書に開示されている分子である。
本発明の組換え細胞は、本発明の少なくとも１つの任意の核酸分子で形質転換された任意の細胞を含む。好適な組換え細胞は、唾液抽出物のＦＳ−１、ＦＳ−２、及び／又はＦＳ−３に含有されている、ノミの唾液産生物又はその相同体（例えば、他の外部寄生生物の唾液産生物）の少なくとも一部をコードする少なくとも１つの核酸分子で形質転換された細胞である。好適な組換え細胞は、fspA、fspB、fspC1、fspC2、fspD1、fspD2、fspE、fspF、fspG1、fspG2、fspG3、fspH、fspI、fspJ1、fspJ2、fspK、fspL1、fspL2、fspM1、fspM2、fspN1、fspN2及びfspN3の１つ以上のタンパク質又はその相同体の、少なくとも一部をコードすることができる少なくとも１つの核酸分子で形質転換されている。このようなものとして、１つ以上の下記アミノ酸配列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO 54及び／又はSEQ ID NO:56、あるいはこれらの相同体の少なくとも一部を有するタンパク質をコードする核酸分子、並びにSEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52及び／又はSEQ ID NO:55で表される核酸配列の少なくとも一部を含む核酸分子も含まれる。特に好適な組換え細胞は、少なくとも１つの前述の核酸分子で形質転換されたE.coliを含む。
組換えＤＮＡ法の使用により、例えば、宿主細胞内の核酸分子のコピー数、これらの核酸分子が転写される効率、生じた転写物が翻訳される効率、及び翻訳後修飾の効率を操作することにより、形質転換された核酸分子の発現を改善できることは当業者には理解されるであろう。本発明の核酸分子の発現を増大させるのに有用な組換え法は、高コピー数のプラスミドへの核酸分子の機能的な結合、１つ以上の宿主細胞染色体中への核酸分子の組み込み、プラスミドへのベクター安定性配列の付加、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換又は修飾、翻訳制御シグナル（例えば、リボソーム結合部位、シャイン−ダルガーノ（Shine-Dalgarno）配列）の置換又は修飾、宿主細胞のコドンの使用法に対応するための本発明の核酸分子の修飾、転写物を不安定にする配列の削除、及び発酵中組換えタンパク質産生から組換え細胞増殖を一時的に分離する制御シグナルの使用を含むが、これらに限定されない。本発明の発現した組換えタンパク質の活性は、生じたタンパク質を断片化、修飾、又は誘導体化することにより改善することができる。
本発明により、組換え細胞は、本発明の外部寄生生物唾液タンパク質を産生させるのに有効な条件下でこのような細胞を培養し、そのタンパク質を回収することにより、このようなタンパク質を産生するために使用することができる。タンパク質を産生するのに有効な条件は、適切な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨ及びタンパク質産生が可能な酸素条件を含むが、これらに限定されない。適切な、又は有効な培地とは、本発明の細胞を培養するとき、外部寄生生物唾液タンパク質を産生することができる任意の培地を意味する。このような培地は、典型的には同化性炭水化物、窒素及びリン酸源、並びに適切な塩類、鉱物、金属及び他の栄養物（例えばビタミン）を含む水性培地である。この培地は、複合栄養を含んでもよいし、又は規定最少培地であってもよい。
本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクター（バッチ、供給−バッチ（fed-batch）、細胞再循環、及び連続発酵槽を含むが、これらに限定されない）で培養することができる。培養はまた、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイタープレート、及びシャーレでも実施することができる。培養は、組換え細胞に適切な温度、ｐＨ及び酸素含量で行われる。このような培養条件は、当業者には十分にその専門技術の範囲内である。
産生に使用されるベクター及び宿主系により、生じる外部寄生生物唾液タンパク質は、組換え細胞内に残るか；発酵培地中に分泌されるか；E.coliの細胞周辺腔のような、２つの細胞膜の間の空隙中に分泌されるか；又は細胞若しくはウイルス膜の外表面に保持されるかのいずれかである。「タンパク質を回収する」という句は、タンパク質を含有する全発酵培地を単に集めることを意味し、分離又は精製という追加の工程を包含する必要はない。本発明の外部寄生生物唾液タンパク質は、種々の標準的タンパク質精製法（例えば、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング及び示差的可溶化（differential solubilization）であるが、これらに限定されない）を使用して精製することができる。
外部寄生生物唾液タンパク質は、好適には「実質的に純粋な」形で回収される。本明細書で使用されるとき、「実質的に純粋な」とは、治療用組成物又は診断用としてこのタンパク質を有効に使用することができる純度を意味する。例えば、本発明の組換え細胞から単離される外部寄生生物唾液タンパク質の投薬を受けた動物は、このタンパク質と混合された混入物からの実質的な毒性を示してはならない。
実質的に混入物質を含まない外部寄生生物唾液産生物は、本発明の唾液収集装置を使用して単離することができる。本発明の唾液収集装置は、容器内に保持された外部寄生生物の摂餌を刺激し（すなわち、摂餌を引き起こし）、これにより唾液（混入物質とは別々に集められる）を放出させるように設計されている。
外部寄生生物は温血宿主動物に付着し、そこから摂餌する。本明細書で使用されるとき、宿主動物とは、外部寄生生物がそこから又はそこで摂餌することができる動物を意味する。理論によって拘束されるわけではないが、ノミのような外部寄生生物は、宿主の暖かい皮膚と周囲の大気の間の温度差を、その外部寄生生物が感知することができるように熱受容体を有すると考えられている。温度の差が、外部寄生生物に暖かい表面からの（すなわち、暖かい動物の皮膚からの）摂餌を刺激する（すなわち、摂餌を引き起こす）。また、運動、振動及び暗闇も外部寄生生物は感知することができ、これにより、外部寄生生物の摂餌が促進されると考えられている。外部寄生生物は、動物の皮膚をその口器で貫通（口器はその位置に留まる）して摂餌し、一方で外部寄生生物は唾液を分泌して摂餌を助長している。摂餌中、外部寄生生物は血液タンパク質及び糞便のような汚染物を放出することができる。
本発明の唾液収集装置は、ハウジングに保持される外部寄生生物に、チャンバーからの摂餌をさせるか、又はそれを促進する、装置のチャンバーとハウジングの間の温度差が維持されるような、チャンバーとハウジングを含む。このような装置に居る外部寄生生物が本発明により摂餌を試みるとき、この節足動物は唾液を放出し、唾液中のタンパク質及び他の産生物が、実質的に混入物質を含まずに単離されるようにこの唾液が収集される。実質的に混入物質を含まない唾液を収集するために、本発明の装置はまた、混入物質を捕捉する表面とは別の表面に唾液を捕捉するための収集手段を含む。
本発明の唾液収集装置は、本明細書に開示されるような任意の外部寄生生物からの唾液を収集するのに使用することができる。本発明の外部寄生生物は、外部寄生生物の侵襲に感受性の種々の脊椎動物を含むが、これらに限定されない任意の動物（すなわち、宿主動物）で摂餌することができる。好適な宿主動物は、哺乳動物及び鳥類を含む。更に好適な宿主動物は、ネコ、イヌ、ヒト、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ヤギ、アライグマ、クロアシイタチ、ラット及びオポッサム、並びに他のペット、経済的な食用動物及びペットや経済的な食用動物に寄生するノミの宿主である動物を含む。特に好適な宿主動物は、ネコとイヌである。
唾液を収集するための本発明の特に好適な外部寄生生物は、任意の適切な種のノミを含む。好適なノミは、ネコとイヌに寄生することができるノミを含む。下記の理由から、最初の血液の餌を未だ摂っていない新たに孵化したノミ（すなわち、サナギ状態から出現したばかりの）が好適である：なぜならば、新たに出現したノミは、未だ最初の血液の餌を摂っておらず、このようなノミは摂餌を試みるからである。新たに出現したノミは未だ血液の餌を摂っていないため、また、血液を摂ったノミほど多くの混入物質を放出しない。新たに出現したノミは、少なくとも１回の血液の餌を摂ったノミよりも、血液の餌なしに長く生存する。本発明の装置では、摂餌したノミも使用することができることに注意されたい。
当業者には、本発明の唾液収集装置が、任意の外部寄生生物から唾液を収集するのに有用であることが明白であろう。説明の目的で、本発明のノミの唾液収集装置が以下に詳細に記載される。このような説明は、本発明の範囲を何ら限定するものではない。ノミからの唾液を収集するための方法に直接基づいて他の外部寄生生物からの唾液を収集することは、当業者の技術の範囲内である。
本発明の１つの実施態様は、チャンバーとハウジングの間に温度差が維持されるように、インターフェースに機能的に接続されたチャンバーとハウジングを含む、唾液収集装置である。インターフェースは、摂餌を試みるために、ノミの口器が収集手段の前に障壁手段を貫通するように配置された、収集手段と障壁手段を含む。チャンバーとハウジングの間の温度差は、インターフェースを通して摂餌を試み、そして収集手段に唾液産生物を沈積するように、ハウジング内に保持されたノミを誘引するのに適切な温度の差である。収集手段と障壁手段の相対位置により、混入物質は障壁手段に沈積する。
本発明のノミの唾液収集装置は、ハウジングを含む。ハウジングは、構造を支持し、かつ保持手段に接続することができる、ノミを保持することができる任意の物質からなってよい。ハウジングは好適には、当業者に通常使用される洗浄及び／又は滅菌工程に耐えることのできる物質で作られる。このようなものとして、ハウジングは再使用することができる。本発明の好適なハウジング物質は、プラスチック、金属、ゴム、木及びガラス物質並びにこのような物質の組合せを含むが、これらに限定されない。更に好適なハウジング物質は、プラスチック及び金属物質を含むが、プラスチック物質が更になお好適である。好適なプラスチック物質は、プレキシガラス、テフロン、ナイロン及びポリカーボネートを含む。特に好適なプラスチック物質は、プレキシガラス、又は他の耐久性のある破損抵抗性で、好適には容器の中のノミが見えるように透明のプラスチックである。
本発明により、本発明のハウジングの大きさは、ハウジングが、過密になることなく目的数のノミを支持することができるような大きさである。ハウジングの表面積及び容量は両方とも重要である。ハウジングの大きさは、ハウジング内に保持されるノミの数により変化させうる。好適には、ハウジングの大きさは、ハウジング当たり約１，０００匹〜約６，０００匹のノミを約７２時間、更に好適にはハウジング当たり約２，０００匹〜約５，０００匹のノミを約７２時間、そして更に好適にはハウジング当たり約３，０００匹〜約４，０００匹のノミを約７２時間、維持するのに十分な大きさである。
本発明のハウジングの適切な高さは、摂餌しながら動きまわる空間をノミに与えるのに十分な高さである。ノミのハウジングの高さは、好適には約１．０センチメートル（cm）〜約３．０cm、更に好適には約１．５cm〜約２．５cm、そして更に好適には約１．８cm〜約２．２cmである。
本発明のハウジングの形は、ハウジングに入っているノミが摂餌するのに適切な少なくとも１つの平らな表面を有する任意の形であってよい。本発明のハウジングは、好適には円筒形、４つ以上の側面を有する箱形、半ドーム形、又は半円筒形である。特に好適な形は、短い円筒形である。
本発明の好適なハウジングの直径は広範に変化してよい。例えば、過密になることなくハウジング中に入れられるノミの数により、異なる直径の容器を使用することができる。本発明の丸いハウジングの内径は、好適には約４．０cm〜約５．５cm、更に好適には約４．５cm〜約５．５cm、そして更に好適には約５．０cmである。
本発明により、ハウジングの大きさ、形、高さ、及び直径は、ハウジング内に保持される節足動物の大きさ及び数に依存して、異なる外部寄生生物について変化させることができる。
本発明により、ハウジングは、保持手段及び交換手段に機能的に接続される。本明細書で使用されるとき、「機能的に接続される」とは、本発明の唾液収集装置の部分を、ノミが装置内に保持され、収集手段に唾液を沈積することができるように結合することを意味する。本発明の保持手段は、ノミの口器により貫通可能である。本発明の保持手段は、ノミを保持するのに適切で、これを通してノミが摂餌できる（すなわち、保持手段は、ノミの口器により貫通可能である）任意の物質又は物質の組合せからなっていてよい。このようなものとして、保持手段は、ノミの口器が貫通するために十分なほど大きい（すなわち、十分大きい）が、ここに保持されるノミの損失を有効に防止するために十分なほど小さい（すなわち、十分小さい）開口部を有する物質からなっていてよい。好適な保持手段は、約０．２５ミリメートル（mm）〜約０．５０mmの開口部を有し、更に好適には約０．３０mm〜約０．５０mmの開口部を有し、そして更に好適には約０．３５mm〜約０．４５mmの開口部を有する物質よりなっている。当業者は、開口部の大きさを装置のハウジング内に保持される外部寄生生物の型により変化させることができることに気付くであろう。例えば、特に小さい外部寄生生物（例えばシラミであるが、これに限定されない）は、より小さい開口部を有する保持手段を必要とする。逆に、その口器を宿主動物に接着させる外部寄生生物である硬ダニの保持手段は、好適には約１mmの範囲の大きな開口部を必要とする。
保持手段として使用するための好適な物質は、金属網、ナイロン網、プラスチックフィルム、布及びこのような物質の組合せを含むが、これらに限定されない。更に好適な保持手段は、ナイロン網及び金属網を含み、そして更に好適な保持手段は、ナイロン網を含む。この収集装置は、種々の保持手段により改装することができる。好適な保持手段は再使用可能なものである。
本発明の交換手段は、ハウジングの内部環境とハウジングの外部環境の間の、ガス、湿度及び熱の交換を可能にすることにより、ハウジング内のノミにとって許容しうる環境を維持することができる、任意の物質又は物質の組合せよりなってよい。ハウジングは、異なるガス、湿度及び熱透過性を有する異なる交換手段により改装することができる。本明細書で使用されるとき、ガスという用語は、ノミの生存に必要な任意の大気中のガスを意味し、二酸化炭素、酸素、及び窒素を含むが、これらに限定されない。ガスはまた、呼気作用を含む代謝の気体産物又は糞便からのガスのような、本発明のハウジング内に維持される間にノミにより産生される気体産物をも意味する。
本発明の交換手段は、ガス、熱及び湿度が漏出するためには十分に大きいが、ノミの損失を有効に防止するためには十分に小さい開口部を有する物質よりなる。好適な交換手段は、約０．１０ミリメートル（mm）〜約０．４５mmの開口部を有し、更に好適には約０．１０mm〜約０．３０mmの開口部を有し、そして更に好適には０．１３mm〜約０．１５mmの開口部を有する物質よりなる。
交換手段として使用すべき好適な物質は、金属網、ナイロン網、プラスチック、布及びこのような物質の組合せを含むが、これらに限定されない。更に好適な交換手段は、ナイロン網、金属網、及びこのような物質の組合せを含み、そして更に好適な交換手段は、ナイロン網を含む。好適な交換物質は再使用可能なものである。
本発明により、装置はハウジングに機能的に接続されたチャンバーを含む。本発明のチャンバーは、ハウジング内に保持されたノミによる装置の収集手段への唾液の沈積を促進する、装置のハウジングとチャンバーの間の温度差を作るのに適切な内部温度を維持することができる。好適なチャンバーはまた、装置内に入っている外部寄生生物の生存に適切な内部湿度レベルを維持することができる（例えば、外部寄生生物の脱水を防止するのに適している）。本発明のチャンバーはまた、実施例に詳述されるような人工摂餌システムに取付けることができる。チャンバーは、チャンバー内の適切な温度と湿度レベルを維持することができる任意の物質からなってよい。チャンバーは、好適には、当業者に通常使用されている洗浄又は滅菌工程に耐えることができる物質から作られる。このようなものとして、チャンバーは再使用することができる。本発明の好適なチャンバー物質は、ガラス、プラスチック、金属、ゴム、及び木、並びにこのような物質の組合せを含むが、これらに限定されない。更に好適なチャンバー物質は、ガラス及びプラスチック物質を含み、ガラス物質が更になお好適である。
本発明により、本発明のチャンバーの大きさは、装置の収集手段にノミが唾液を沈積するのを刺激するために適切な温度レベルを維持することができるような大きさである。チャンバーの大きさは、チャンバー内に入れられるブロッティング物質（下記に詳述される）の量、チャンバーに取付けられる収集手段の直径、あるいはこのチャンバーが、実施例に詳述されるような人工摂餌システムに取付けられるかどうかにより変化させることができる。好適には、本発明のチャンバーの高さは、ブロッティング物質がノミの生存に適切なチャンバー内の湿度レベルを維持するように、適切な量のブロッティング物質をチャンバーに入れるのに十分な高さである。チャンバーの高さは、好適には約１．０cm〜約７．０cm、更に好適には約２．０cm〜約６．０cm、そしてより一層好適には約３．０cm〜約５．０cmである。
本発明により、チャンバーの形は、本発明のインターフェースを取付けることのできる少なくとも１つの開放末端を有する任意の形であってよい。本発明のチャンバーは、好適には両方が開放端の円筒形か、又は一方が開放端の円筒形である。特に好適な形は、両方が開放端の円筒形である。
本発明の好適なチャンバーの直径は広範に変化させることができる。例えば、チャンバーに取付けられるインターフェースの直径又はチャンバーに取付けられるハウジングの直径により、異なる直径のチャンバーを使用することができる。本発明のチャンバーの内径は、好適には約２．０cm〜約６．５cm、更に好適には約３．０cm〜約５．５cm、そしてより一層好適には約４．０cm〜約４．５cmである。
本発明のチャンバーは、チャンバー内の湿度レベルをノミの生存に適切に維持するのに適切なブロッティング手段を含有してもよい。適切な湿度レベルを維持するための方法は、以下に詳述される。本発明のチャンバーは、食物又は水を含有してもよいが、好適には湿気があり（すなわち、湿っているが、濡れてはいない）、食物を含有しない。
本発明の唾液収集装置はインターフェースを含む。本発明のインターフェースは、実質的に混入物質を含まない唾液産生物を収集することができる手段を含む。このようなものとして、本発明のインターフェースは、ノミの口器により貫通可能であるが、ノミが摂餌を試みるときに分泌されるノミの唾液産生物とは別に、混入物質（例えば、血液及び糞便）を保持することができる。本発明のインターフェースは、唾液産生物を収集する手段、及び混入物質と収集される唾液産生物の間の障壁を作る手段を含む。
本発明の収集手段は、インターフェースを通して摂餌を試みる保持されたノミにより沈積（すなわち、分泌）される唾液タンパク質の少なくとも一部を収集（すなわち、吸着）することができる任意の物質からなっていてよい。更には、本発明の収集手段は、インターフェースを通して摂餌を試みるノミにより沈積される唾液タンパク質の他の唾液成分を収集することができる。この収集手段は、唾液産生物をこの収集手段に結合できるだけでなく、適切な溶離液（すなわち、抽出剤）に暴露することにより収集手段から溶出（すなわち、抽出）することができるものである。このようなものとして、本発明の好適な収集手段物質は、唾液成分がこのような物質から容易に溶出するため、疎水性であって低い結合能を有する物質を含む。本発明の収集手段の物質はまた、ノミの口器により貫通できる必要がある。
本発明の好適な収集手段は、ナイロン、ニトロセルロース、誘導体化ＣＭ、誘導体化ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、紙、ポリスルホン、セルロースエステル、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）及びポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜を含むが、これらに限定されない。特に好適なアニオン交換膜の収集手段物質は、ＤＥ−８１クロマトグラフィー紙（これは、ワットマン社（Whatman,・Inc.）、クリフトン（Clifton）、ニュージャージー州から入手することができる）を含む。特に好適な収集手段物質は、ＰＶＤＦを含む。好適なＰＶＤＦ収集手段物質は、デュラポア（Durapore）（登録商標）を含む。
本発明の収集手段の形は、この収集手段が取付けられるチャンバーの形により変化させることができる。収集手段の好適な形は、丸い形又は４つ以上の側面を有する箱様の形を含む（丸い形が、更に好適である）が、これらに限定されない。
本発明の収集手段の大きさも、この収集手段が取付けられるチャンバーの大きさにより変化させることができる。収集手段の大きさは、好適にはチャンバーの開放端よりも大きく、こうして収集手段がチャンバー中に移行するのを防止する。収集手段の大きさは、好適には直径約２．２cm〜約６．５cm、更に好適には約３．２cm〜約５．７cm、そして更に好適には約４．２cm〜約４．７cmである。
本発明の唾液収集装置は、実質的に混入物質を含まない外部寄生生物の唾液の収集を可能にする新規な障壁手段を提供する。本発明の障壁手段は、混入物質が収集手段に接触するのを実質的に防止する（すなわち、ノミの糞便や血液産物が収集手段を通り抜けるのを実質的に防止する）ことができるが、またノミの口器により貫通することができ、障壁手段の唾液の通過を可能にすることができる、任意の物質であってよい。好適には、本発明の障壁手段物質の厚さは、ミクロンの厚さである。本発明の好適な障壁手段物質は、非常に薄いプラスチック、テフロン、布、紙、パラフィン及び蝋物質を含むが、これらに限定されない。本発明の更に好適な障壁手段物質は、延伸したプラスチックを含み、非常に薄く（すなわち、機械及び／又は手により延伸できる限り薄く）延伸した、サランラップ（Saran Wrap）（登録商標）及び特にパラフィルム（Parafilm）（登録商標）が更になお好適である。
本発明の障壁手段の大きさは、この障壁手段が取付けられるチャンバーの大きさにより変化させることができる。障壁手段の大きさは、好適には本発明のチャンバーの側面を延長してチャンバーに固定することができるように十分に大きい。障壁手段の大きさは、障壁手段が、例えば、人工摂餌システムに取付けられるチャンバーを含有する唾液収集装置の能力を妨害しないように十分に小さい。
本発明により、収集手段と障壁手段は、このような装置のハウジング内に保持されるノミが、障壁手段と収集手段の両方を貫通して、収集手段に唾液を沈積することができるように、唾液収集装置のチャンバーに機能的に接続される。本発明の収集手段は、好適には障壁手段によりチャンバーのある部位に除去可能に取付けられる。収集手段と障壁手段の好適な取付け部位は、ハウジングで連結するように設計されたチャンバーの部分である。収集手段と障壁手段の更に好適な取付け部位は、チャンバーの開放端である。
本発明の唾液収集装置はまた、ブロッティング手段を含んでもよい。本発明のブロッティング手段は、装置内の湿度をノミの生存に適するように維持することができ、このようなものとして、装置にノミが保持されている期間液体を保持することができる。このようなものとして、ブロッティング手段は、任意の適切な吸収剤物質である。好適なブロッティング手段は、天然及び合成スポンジ、発泡体、紙、布、及びアガロースを含む。更に好適なブロッティング手段物質は、スポンジ及び紙を含み、濾紙が更になお好適である。特に好適な実施態様において、１片以上のＶＷＲブロッティングパッド（VWR Blotting Pads）＃３２０（VWR・Scientific、デンバー、コロラド州から利用可能）をブロッティング手段としている。
上述のように、本発明の唾液収集装置は、装置のハウジングとチャンバーの間の温度差を維持することができる。本発明の装置内の適切な温度差は、装置内に保持されるノミを刺激して装置のインターフェースを貫通させて収集手段に唾液を沈積させる温度差を含む。本発明のチャンバー内の好適な温度は、約２０℃〜約４５℃の範囲であり、一方本発明のハウジング内の好適な温度は、約５℃〜約３５℃の範囲である。好適な実施態様において、チャンバー内の温度は、約３５℃〜約４０℃の範囲であり、ハウジング内の温度は、約１０℃〜約３０℃の範囲である。特に好適なチャンバー温度は、約３５℃〜約３７℃の範囲であり；そして特に好適なハウジングチャンバー温度は、約２０℃〜約２７℃である。
外部寄生生物の生存は、湿度に影響されうる。このようなものとして、本発明の装置のハウジング内の湿度レベルは、その中に保持されている外部寄生生物の生存を維持するのに適切なレベルである。本発明の装置内の適切な相対湿度レベルは、装置内に入っている外部寄生生物により変化させることができる。本明細書で使用されるとき、相対湿度とは、沈殿が生じる大気中の水蒸気の最大量に比較した大気中の水蒸気の量を意味する。このように、相対湿度は、パーセント湿度として表され、ここで１００％湿度は、大気中の水蒸気の飽和を表す。本発明のチャンバー内の好適な湿度レベルは、約５０％〜約１００％の範囲であり、一方本発明のハウジング内の好適な湿度レベルは、約４０％〜約６０％の範囲である。好適な実施態様において、チャンバー内の湿度レベルは、約５０％〜約９４％の範囲であり、そしてハウジング内の湿度レベルは、約５０％である。
本発明の別の実施態様では、ノミを誘引するため色の対比を使用する。例えば、本発明の収集装置の少なくとも１つの表面は、ノミを誘引して装置のインターフェースを貫通させるのに十分に暗い色であってもよい。理論にによって拘束されるわけではないが、ノミは、暗さから明るさを感知することができ、好適には暗い表面に向かって摂餌する傾向にあると考えられている。したがって本発明により、チャンバーはハウジングよりも暗くして、ノミをチャンバーとハウジングの間のインターフェースに誘引することができる。適切な暗い色は、黒から明褐色の範囲の色を含み、好適には黒である。
本発明の収集装置の好適な実施態様を図４Ａ及び４Ｂに図示する。唾液収集装置（２）はハウジング（４）とチャンバー（６）に分離できる。本発明の唾液収集装置（２）の断面図を図４Ａに示す。図４Ａ及び４Ｂに関して、ハウジング（４）は、第１部分（８）と第２部分（１０）を有する開放端の円筒形である。ハウジング（４）の第２部分（１０）は、外径（１２）と内径（１４）を有する。交換手段（１６）は、ハウジング（４）の第１部分（８）の一方の末端に機能的に取付けられ、そして保持手段（１８）は、第１部分（８）と、第２部分（１０）の外径（１２）及び内径（１４）との間の、第１部分の反対側の末端で取付けられる。交換手段（１６）及び保持手段（１８）は、ノミが逃げるのを防止するように取付けられる。ハウジング（４）の第１部分（８）への交換手段（１６）と保持手段（１８）の取付け方法は、ゴムのり、にかわ、テープ、はんだ及びアラルダイトを含むが、これらに限定されない。好適な取付け方法は、ゴムのりである。
唾液収集装置（２）のチャンバー（６）は、頂部末端（２０）と底部末端（２２）を有する開放端円筒形を有する。頂部末端（２０）は、実施例に詳述されるような人工摂餌システムにチャンバー（６）を取付けることを可能にする適切な直径を有する。底部末端（２２）は、滑り込み嵌合（sliding fit）を提供するようにハウジング（４）にこの底部末端（２２）を可逆的に取付けることができるような適切な直径を有する。底部末端（２２）は、収集手段（２４）に覆われている。収集手段（２４）は、チャンバー（６）の底部末端（２２）の内周よりも大きな直径を有し、これにより収集手段（２４）がチャンバー（６）の内部空間（２６）に移行するのを防止している。好適には、収集手段（２４）の直径は、チャンバー（６）の底部末端（２２）の外周よりは大きくない。収集手段（２４）は、分離可能な接続を提供するように底部末端（２２）に接続することができ、これにより収集手段（２４）から唾液産生物を回収するための、唾液収集装置（２）からの収集手段（２４）の取り外しを楽にしている。
チャンバー（６）の底部末端（２２）に取付けられた収集手段（２４）は、障壁手段（２８）に覆われる。この障壁手段（２８）は、ノミにより沈積される混入物質が収集手段（２４）に接触するのを防止するシールが形成されるように、チャンバー（６）に機能的に接続される。障壁手段（２８）は、分離可能な接続を提供するようにチャンバー（６）に接続することができる。好適には、障壁手段（２８）は、パラフィルム（登録商標）のような延伸可能なプラスチック物質であり、これをチャンバー（６）の底部末端（２２）に接触している収集手段（２４）にわたって可能な限り薄く延伸され、そして更にチャンバー（６）の側壁（３０）に沿って、チャンバー（６）の頂部末端（２０）に向かって延伸される。障壁手段（２８）は更に、ゴムシール（３２）を使用してチャンバー（６）の側壁（３０）に固定することができる。ゴムシール（３２）は、チャンバー（６）の側壁（３０）に接する障壁手段（２８）の部分を分離可能に接続し、これにより、更にチャンバー（６）及びチャンバー（６）環境内のシールに収集手段（２４）を固定する。
ブロッティング（吸収剤）物質は、チャンバー（６）の底部末端（２２）の内部空間（２６）に置いて、ブロッティング手段（３４）を形成することができる。このブロッティング手段（３４）は、１つ以上の別々のブロッティングパッド（例えば、数片のブロッティング物質）からなっていてよい。好適には、ブロッティング手段（３４）は、４７mmの高さのチャンバー（６）に入れられる場合約２．０mm厚〜約１５．０mm厚（乾燥時）であり、更に好適には４７mmの高さのチャンバー（６）に入れられる場合約２．２mm厚〜約１２．５mm厚（乾燥時）であり、そして更に好適には４７mmの高さのチャンバー（６）に入れられる場合約２．４５mm厚〜約１０．０mm厚（乾燥時）である。特に好適な実施態様において、ブロッティング手段（３４）は、約２〜６片のＶＷＲブロッティングパッド（VWR Blotting Pads）＃３２０、好適には約３〜５片のＶＷＲブロッティングパッド（VWR Blotting Pads）＃３２０からなっている。ブロッティング手段（３４）の直径は、チャンバー（６）の内部側壁（３６）に接触するように選択される。ブロッティング手段（３４）は、好適にはチャンバー（６）に湿度を与えるために十分に前もって濡らされるが、ブロッティング手段（３４）から液が垂れるほどには濡らさない。ブロッティング手段（３４）はチャンバー（６）の頂部末端（２０）に向かって収集手段（２４）の側面に並置される。ブロッティング手段（３４）は、分離可能に収集手段（２４）に直接接触させてもよい。
チャンバー（６）はハウジング（４）から可逆的に分離可能である。チャンバー（６）は、滑り込み、スナップ留め又はねじ込みのような任意の可逆的に保証された方法でハウジング（４）に相互接続することができる。好適には、チャンバー（６）は、ハウジング（４）に滑り込ませてゴムバンドを用いて固定される。
チャンバー（６）の相対的な高さは、ハウジング（４）に対して種々に変化させることができる。典型的には、チャンバー（６）の高さはハウジング（４）よりも大きい。好適には、チャンバー（６）の高さは、約１．０cm〜約７．０cm、更に好適には約２．０cm〜約６．０cm、そして更に好適には約３．０cm〜約５．０cmの範囲である。ハウジング（４）の高さは、好適には約１．０cm〜約３．０cm、更に好適には約１．５cm〜約２．５cm、そして更に好適には約１．８cm〜約２．２cmの範囲である。
本発明の１つの実施態様は、本発明の装置を使用する外部寄生生物からの唾液産生物の収集方法である。このような方法は、混入物質を実質的に含まない、唾液タンパク質を含む外部寄生生物の唾液の単離を可能にするため、特に有利である。このようなものとして、本方法は、例えば外部寄生生物唾液タンパク質を性状解析するために、並びに診断及び治療用途のために外部寄生生物唾液タンパク質を単離するために使用することができる。
本方法の１つの実施態様は、（ａ）装置のハウジング内に外部寄生生物を含む唾液収集装置内の収集手段に外部寄生生物唾液産生物を収集し；そして（ｂ）溶液により収集手段から収集された外部寄生生物唾液産生物を抽出（すなわち、溶出）して抽出産物含有溶液を形成する工程を含む。このような抽出された溶液は、本発明の処方物として直接使用することができるか、あるいは本明細書に詳述されるような分画及び／又は精製の更なる工程により本発明の別の処方物を形成することができる。このような抽出された溶液の例は、ＦＳ−１、ＦＳ−２及びＦＳ−３を含む。
本発明により、外部寄生生物を含有する唾液収集装置は、チャンバーとハウジングの間に、装置内に保持されている外部寄生生物により沈積される唾液産生物の少なくとも一部を収集することができる収集手段と、混入物質が収集手段に接触するのを実質的に防止することができる障壁手段とよりなる、インターフェースを有する。装置内に入れられた外部寄生生物は、チャンバーとハウジングの間に温度差が存在するような条件下で維持される；すなわち、チャンバー内の高い温度がハウジング内に保持されている外部寄生生物を誘引して障壁手段と収集手段を貫通させ、そして収集手段に唾液産生物を沈積するように、この装置のチャンバーは、外部寄生生物を含有するハウジングの温度よりも高い温度を有する。
１つの実施態様において、唾液産生物を収集する方法は、本発明の装置に収集手段を配置する前に本発明の収集手段を前もって濡らすことを含む。本発明に適した前もって濡らす溶液は、唾液産生物が抽出工程（すなわち、適切な溶媒に暴露されるとき）の間にも抽出することができるように、唾液産生物の吸着（すなわち、収集）を促進することができる。本発明の適切な前もって濡らす溶液は、外部寄生生物に対して非毒性で、生理的ｐＨを有する任意の緩衝液を含む。適切な緩衝液の例は、リン酸緩衝化生理食塩水、水、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸緩衝化生理食塩水）、ＴＥＳ緩衝液（トリス−ＥＤＴＡ緩衝化生理食塩水）、トリス緩衝液及びＴＡＥ緩衝液（トリス−酢酸−ＥＤＴＡ）を含む。好適な前もって濡らす溶液は、５０U/mlペニシリン及び５０μg/mlストレプトマイシンを含有する滅菌水を含む。
唾液産生物を収集するために使用される装置がブロッティング手段を含む場合、そのブロッティング手段は、チャンバーにブロッティング手段を配置する前か後のいずれかに加湿する必要がある。好適な加湿溶液は、水、リン酸緩衝化生理食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＴＥＡ緩衝液及びＴＥＳ緩衝液を含むが、これらに限定されない。更に好適な加湿溶液は、水並びに５０U/mlペニシリン及び50μg/mlストレプトマイシンを含む。本発明により、ブロッティング手段はチャンバー内の湿度を生成するために十分に加湿されるが、装置内に保持される外部寄生生物がそこから飲むことができるように液体が垂れるほどではない。好適な実施態様において、直径約４．０cmで約２．５mm厚のブロッティング手段は、約２．３ミリリットル（ml）の加湿溶液で加湿される。
１つの実施態様において、前もって決められた数の外部寄生生物が、本発明の装置のハウジング中に導入される。ハウジング内に導入すべき外部寄生生物の数は、ハウジングの大きさにより変化させることができ、本発明の収集手段に唾液を沈積する外部寄生生物の能力を妨げない数でなければならない。
本発明の好適な実施態様において、ノミが本発明の装置に加えられる。ハウジングに導入されるノミの適切で好適な数は前に開示されている。特に、新たにサナギ状態から孵化したノミが使用される。このようなノミは、Wadeら,pp 186-190, 1988, J. Med Entomol., vol 25に記載されたように出現させることができる。好適には、このようなノミは血液の餌を未だ摂っていないものである。ノミを水槽に入れて真空下でハウジング内に吸引することにより、装置内にノミを入れることができる。動物の毛、及び乾燥組織のような、ノミの維持に適した追加の選択可能な成分を容器に添加することができる。
好適な実施態様において、装置のハウジングにノミの入った本発明の少なくとも１つの装置を、本明細書に開示されるような人工摂餌システムに取付ける。この装置は、ノミが収集手段を貫通しながら唾液を放出し続ける限り、この摂餌システムに取付けられたままでよい。好適には、ノミは、約１２時間〜約１２０時間、更に好適には約２４時間〜約９６時間、そして更に好適には約７２時間（ノミは基本的に、およそこの時間で唾液を分泌するのを停止するため）、この摂餌システムに取付けられた装置内で維持される。本発明の方法により、バイオラッド・ブラッドフォード測定法（Bio-Rad Bradford assay）（バイオラッド（Bio-Rad）、ハーキュリーズ（Hercules）、カリフォルニア州から入手可能）を使用して測定するとき、好適には少なくとも約８０マイクログラム（μg）、更に好適には少なくとも約９０μg、そして更に好適には少なくとも約２００μgのノミの唾液タンパク質を、約１０⁶匹のノミ−時間から収集することができる。
本発明により、外部寄生生物唾液産生物は、好適には溶出した産物の機能的活性が維持される形で、本発明の収集手段から唾液産生物を抽出することができる溶媒を使用して抽出することができる。ノミの唾液タンパク質の機能的活性が、例えば維持されないならば、当業者に知られている方法を使用して機能性を回復するためにタンパク質を再生することは本発明の範囲内である。適切な抽出溶媒は、リン酸緩衝化生理食塩水、塩化ナトリウムを含有するリン酸緩衝化生理食塩水、アセトニトリル中のＴＦＡ、カオトロピック剤、界面活性剤、有機物、塩類又はそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。好適な抽出溶媒は、リン酸緩衝化生理食塩水、塩化ナトリウムを含有するリン酸緩衝化生理食塩水、アセトニトリル及びアセトニトリル中のＴＦＡを含む。更に好適な抽出溶媒は、リン酸緩衝化生理食塩水中の１M・ＮａＣｌ、５０％アセトニトリル中の０．１％・ＴＦＡ、１２．８％アセトニトリル及び５０％アセトニトリルを含む。タンパク質及び他の産物を収集手段から溶出するための適切な抽出時間は、実施例に詳述される。
本発明の収集手段から抽出された唾液タンパク質の更なる精製は、抽出された産物を含有する溶液を分画して分離したピークのフラクションを得て、残りのフラクションを実質的に含まない少なくとも１つのピークフラクションを回収して外部寄生生物唾液タンパク質の処方物を得ることにより行うことができる。好適な実施態様において、本発明の抽出された唾液産生物に含まれるタンパク質は、ＨＰＬＣ精製により抽出してピークフラクションを得ることにより更に分割される。特に好適な実施態様において、本発明の抽出された唾液タンパク質は、ＨＰＬＣにより更に分割して図２に示されるピークフラクションを得る。このようなタンパク質の抽出と分割に関する詳細は、実施例に示される。
本発明により、本発明の少なくとも１つの外部寄生生物唾液産生物又はそのミメトープ（mimetope）を含む処方物は、アレルギー性皮膚炎に感受性の又は同皮膚炎の動物を同定するために使用することができる。
本発明により、「ミメトープ（mimetope）」とは、本発明の単離された外部寄生生物唾液産生物のその機能（例えば、抗凝血、抗補体、血管拡張、プロテアーゼ、酸ホスファターゼ、あるいはアレルギー性皮膚炎に感受性の又は同皮膚炎の動物の過敏症を検出及び／又は治療する機能）を果たす能力を模倣することができる任意の化合物を意味する。ミメトープは、分解に対する感受性が低下しているが、目的の活性はなお保持しているように修飾されたペプチドであってもよい。ミメトープの他の例は、炭水化物に基づく化合物、脂質に基づく化合物、核酸に基づく化合物、天然有機化合物、合成で誘導した有機化合物、抗イディオタイプ抗体及び／又は触媒的抗体、あるいはその断片を含むが、これらに限定されない。本発明のミメトープはまた、アレルゲン及び／又は抗原活性を有する外部寄生生物唾液産生物の非タンパク質部分を含んでもよい（例えば、外部寄生生物唾液タンパク質に結合した炭水化物部分）。ミメトープは、例えば外部寄生生物を摂餌させる能力を代替できる化合物、あるいは外部寄生生物の噛み傷から生じるアレルギー性皮膚炎を検出及び／又は治療することができる化合物に関する、合成化合物のライブラリーのスクリーニングにより得ることができる。ミメトープはまた、例えば、合理的薬剤設計により得ることができる。合理的薬剤設計において、本発明の化合物の三次元構造を、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）又はＸ線結晶解析により解析することができる。次にこの三次元構造を使用して、例えばコンピュータモデル作成により、可能性あるミメトープの構造を予測することができる。次に、例えば化学合成、組換えＤＮＡ法により、又は天然資源（例えば、植物、動物、細菌及び真菌）からミメトープを単離することにより、予測されたミメトープ構造を生成することができる。
本発明の１つの実施態様は、ある動物が外部寄生生物唾液産生物に対して過敏症かどうかを検出することができるin vivo試験である。本発明のin vivo試験は、最初にある動物が外部寄生生物唾液産生物に対して過敏症であるかどうかを決定し、次にある動物が特定の外部寄生生物唾液成分、特に外部寄生生物唾液タンパク質に過敏症であるかどうかを決定するために使用することができる。本発明のin vivo過敏症試験は、アレルギー性皮膚炎に感受性の又は同皮膚炎の動物を同定するために特に有用である。本発明のin vivo過敏症試験は、ＦＡＤに感受性の又はＦＡＤの動物を同定するために更に有用である。本発明の適切なin vivo過敏症試験は、少なくとも１つの外部寄生生物唾液産生物又はそのミメトープを含有する有効量の処方物を投与（例えば、皮内注入又は皮膚表面のひっかき）することからなる皮膚試験であってよいが、これに限定されない。本発明の皮膚試験を実施するための方法は、当業者には既知であり、本明細書で簡単に開示される。
In vivo皮膚試験に使用するために適した処方物は、外部寄生生物唾液成分（すなわち、本発明の収集手段に収集され吸収されたまま残っている唾液産生物、外部寄生生物唾液抽出物、及び１つ以上の単離された外部寄生生物唾液タンパク質）を含む。好適な処方物は、抽出物及び１つ以上の単離されたタンパク質を含む。
本発明の皮膚試験に使用するための外部寄生生物唾液産生物の適切な量は、試験に使用される産物のアレルゲン性、及び産物が送達される部位により、広い範囲で変化させることができる。本発明の皮膚試験に使用するための外部寄生生物唾液産生物の適切な量は、その産物に対するアレルギー反応から生じる検出可能な膨疹又は硬化（硬度）のような、反応を形成することができる量を含む。本発明の皮膚試験に使用するための外部寄生生物唾液抽出物又はタンパク質の好適な量は、約１ナノグラム（ng）〜約５００マイクログラム（μg）、更に好適には約５ng〜約３００μg、そして更に好適には約１０ng〜約５０μgの外部寄生生物唾液抽出物又はタンパク質の範囲である。このような量が、投与される抽出物及び／又はタンパク質のアレルゲン性により変化することは、当業者には理解されるところである。
本発明により、本発明の外部寄生生物唾液産生物は、免疫増強剤（例えば、以下に詳細に定義される本発明の担体又はアジュバント）と一緒に合わせることができる。しかし、本発明の新規な面は、本発明の外部寄生生物唾液産生物が、免疫増強剤の非存在下で過敏性応答を誘導することができることである。
本発明の皮膚試験は、更に動物への対照溶液の投与を含む。対照溶液は、陰性対照溶液及び／又は陽性対照溶液を含んでよい。本発明の陽性対照溶液は、動物に投与されると過敏性応答を誘導することが知られている有効量の少なくとも１つの化合物を含有する。陽性対照溶液として使用するための好適な化合物は、ヒスタミンを含むが、これに限定されない。本発明の陰性対照溶液は、動物に投与されるとき過敏性応答を誘導しないことが知られている溶液を含んでよい。このようなものとして、陰性対照溶液は、本質的に過敏性応答を誘導できない化合物を含む溶液、又は単に処方物を調製するために使用される生理食塩水のような緩衝液であってよい。好適な陰性対照溶液の例は、フェノール化リン酸緩衝化生理食塩水（グリアラボラトリーズ杜（Greer Laboratories）、ルノワール（Lenoir）、ノースカロライナ州）である。
本発明の１つ以上の処方物に対する動物の過敏症は、動物への１つ以上の実験試料及び対照試料の投与から生じる反応（例えば、膨疹の大きさ、硬化又は硬度；当業者に知られている方法を使用して）を測定し、そして１つ以上の対照溶液の投与から生じる反応と実験試料に対する反応を比較することにより、評価することができる。皮内注入の好適な装置は、個別のシリンジを含む。ひっかきのための好適な装置は、同時に多くの試料を投与することができる装置を含む。動物の過敏症は、本発明の処方物の投与から生じる反応が、陰性対照の投与から生じる反応よりも大きいどうかを測定し、かつ／又は本処方物の投与から生じる反応が、陽性対照溶液の投与から生じる反応と少なくともほぼ同じ大きさであるかどうかを測定することにより、評価することができる。このようなものとして、もし実験試料が、動物への陽性対照試料の投与により生成する膨疹の大きさと同等かそれ以上の反応を起こすならば、その動物は実験試料に対して過敏症である。逆に、もし実験試料が、動物への陰性対照試料の投与により生成する反応と同様な反応を起こすならば、その動物は実験試料に対して過敏症ではない。
動物の過敏症の評価のための好適な膨疹の大きさは、直径が約１６mm〜約８mm、更に好適には約１５mm〜約９mm、そして更に好適には約１４mm〜約１０mmの範囲である。
好適には、動物が、本発明の処方物に対する即時型過敏性応答を示すことができるか又はできないかは、試料の投与の約２分〜約３０分後、更に好適には試料の投与の約１０分〜約２５分後、そして更に好適には試料の投与の約１５分後に膨疹の大きさを測定することにより決定される。
好適には、動物が、本発明の処方物に対する遅延型過敏性応答を示すことができるか又はできないかは、試料の投与の約１８時間〜約３０時間後、更に好適には試料の投与の約２０時間〜約２８時間後、そして更に好適には試料の投与の約２４時間後に硬化及び／又は紅斑を測定することにより決定される。遅延型過敏性応答はまた、当業者には既知の方法を使用して直前に規定された時間投与部位の細胞浸潤の程度を測定することによるなどの他の方法を使用して測定することができる。
好適な実施態様において、本発明の皮膚試験は、動物の所定の部位に、ノミの唾液抽出物（すなわち、本発明の収集手段から抽出されたノミの唾液産生物）又は少なくとも１つの本発明のノミの唾液タンパク質を含む有効量の処方物を皮内注入して、同じ動物の異なる部位に有効量の対照溶液を皮内注入することからなる。好適には多くの処方物の同時評価を可能にする、多くの部位に同時に複数の試料を送達することができる装置を使用することは、当該分野の技術の範囲内である。１つの好適な処方物は、本発明により収集されたノミの唾液産生物からなる。同じく好適な処方物は、組換えにより産生された１つ以上のノミの唾液タンパク質を含む処方物である。
本発明の皮膚試験で使用するための適切なノミの唾液産生物は、ＦＳ−１、ＦＳ−２、及び／又はＦＳ−３、並びにＦＳ−１、ＦＳ−２、及び／又はＦＳ−３から単離することができる少なくとも１つのノミの唾液産生物の少なくとも一部を含む。皮膚試験で使用するための好適なノミの唾液産生物は、ＦＳ−１、ＦＳ−２、ＦＳ−３、及び／又はfspA、fspB、fspC1、fspC2、fspD1、fspD2、fspE、fspF、fspG1、fspG2、fspG3、fspH、fspI、fspJ1、fspJ2、fspK、fspL1、fspL2、fspM1、fspM2、fspN1、fspN2及びfspN3の１つ以上のタンパク質、又はその相同体の少なくとも一部を含む。皮膚試験で使用するための更に好適なノミの唾液産生物は、ＦＳ−１、ＦＳ−２、ＦＳ−３、及び／又はfspE、fspF、fspG1、fspG2、fspG3、fspH、fspI、fspJ1、fspJ2、fspK、fspL1、fspL2、fspM1、fspM2、fspN1、fspN2及びfspN3の１つ以上のタンパク質の少なくとも一部を含む。そして更に好適な皮膚試験で使用するためのノミの唾液産生物は、ＦＳ−１、ＦＳ−２、ＦＳ−３、及び／又はfspG1、fspG2、fspG3、fspH、fspM1、fspM2、fspN1、fspN2及びfspN3の１つ以上のタンパク質の少なくとも一部を含む。このような処方物は、イヌにＦＡＤを誘導することができるものとして実施例の項に示される。好適な陽性対照試料は、ヒスタミンからなる試料であってよい。好適な陰性対照試料は、希釈剤からなる試料であってよい。
本発明の皮膚試験を使用する外部寄生生物唾液タンパク質に対する過敏症に関して試験するために適切で好適な動物は、本明細書に開示される。本発明の皮膚試験で試験するのに特に好適な動物は、イヌ、ネコ及びウマを含み、イヌ及びネコが更に好適である。
本発明の別の実施態様は、免疫複合体が生成し検出できるように、抗体を含有することが推定される溶液を、外部寄生生物唾液産生物を含有する溶液と接触させることにより、１つ以上の本発明の外部寄生生物唾液産生物に結合することができる抗体の存在を検出することができるin vitroの免疫吸収剤試験である。このように、本発明のin vitro免疫吸収剤試験は、ある動物が以前に外部寄生生物唾液抗原に暴露されたことがあり、そのため外部寄生生物唾液抗原への更なる暴露に対して過敏症であるかもしれないことを証明することにより、アレルギー性皮膚炎に感受性であるか又は同皮膚炎の動物を同定するのに、特に有用である。
本発明により、本発明のin vitro過敏症試験は、（ａ）本発明の処方物と動物からの体液とを、この処方物と（もし存在すれば）体液中の抗体との間の免疫複合体の形成に十分な条件下で接触させ；そして（ｂ）形成された免疫複合体の量を測定する（ここで、免疫複合体の形成は、この動物がアレルギー性皮膚炎に感受性であるか又は同皮膚炎であることを示す）ことからなる免疫吸収剤試験であってよいが、これに限定されない。この免疫吸収剤試験は、体液中のＩｇＥ抗体の検出（これにより動物の即時型過敏症を示す）に特に有用である。形成された免疫複合体の量の測定は、検出法により分離の工程を含んでもよい。免疫吸収剤測定法は、種々のプロトコールであってよく、そして当業者はこれを組み上げることができる。
本発明の好適な免疫吸収剤試験は、固体基質の１部分以上を１つ以上の本発明の外部寄生生物唾液産生物又はそのミメトープでコーティングし、そしてその（又は別の）固体基質の他の１部分以上を適切な量の本発明の陽性及び／又は陰性対照溶液でコーティングする第１の工程よりなる。本発明の好適な固体基質は、ＥＬＩＳＡプレート、ディップスティック、放射免疫測定法プレート、アガロースビーズ、プラスチックビーズ、免疫ブロット膜及び紙を含むが、これらに限定されない；更に好適な固体基質は、ＥＬＩＳＡプレート、ディップスティック又は放射免疫測定法プレートを含み、ＥＬＩＳＡプレートとディップスティックが更になお好適である。本明細書で使用されるとき、ディップスティックとは抗体が結合できる表面を有する任意の固体物質を意味し、このような固体物質は試験管に挿入できるスティック様の形を有する。本発明のin vitro過敏症試験で使用するために適切で好適なノミの唾液産生物は、本発明の皮膚試験について開示されたものと同じである。
本発明の好適なin vitro過敏症試験の第２の工程は、コーティングされた基質を、アレルギー性皮膚炎に感受性の動物からの血清、血漿又は全血のような体液に、外部寄生生物唾液産生物に結合することができる体液中に含有される抗体が、基質に結合したそのような産物に結合して免疫複合体を形成できるように、接触させることよりなる。次に過剰の体液及び抗体を基質から洗いだす。体液中のＩｇＥ抗体が測定される好適な実施態様において、体液は、体液中に存在する少なくとも幾つかの他のアイソタイプのイムノグロブリン及び／又はアルブミンのような他のタンパク質を除去するために前処理してもよい。そのような除去は、体液をプロテインＧのような物質と接触させてＩｇＧ抗体を除去すること、及び／又は体液を、例えばコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ−Ａ）に暴露することにより体液の他の成分からＩｇＥ抗体を親和性精製することを含むが、これらに限定されない。
本発明の好適なin vitro過敏症試験の第３の工程は、基質に結合した免疫複合体を、外部寄生生物に対してアレルギー性の動物により生成されるアレルギー関連抗体の重鎖に結合することができる二次抗体又は他の化合物のような、免疫複合体に結合することができる化合物と、その化合物が免疫複合体に結合できるように接触させることからなる。好適な結合性化合物は、ＩｇＥ抗体の重鎖に結合することができる二次抗体を含むが、これに限定されない。試験される好適な動物は本明細書に開示される。免疫複合体に結合することができる化合物は、通常体液からの抗体に結合した化合物の量が測定できる標識を付けられている。このような標識は、放射活性標識、基質との接触により着色反応を起こすことのできる酵素、蛍光標識、化学発光標識、発色標識又はもう１つの化合物により結合することの可能な化合物を含むが、これらに限定されない。好適な標識は、フルオレセイン、放射性同位体、アルカリホスファターゼ、ビオチン、アビジン、又はペルオキシダーゼを含むが、これらに限定されない。
本発明の好適なin vitro過敏症試験の第４の工程は、当業者に既知の方法を使用する、固体基質に結合した検出可能な標識の量を測定することよりなる。基質に結合した体液からの抗体の量を、１層以上の二次抗体又は他の結合性化合物を使用して測定できることは、本発明の範囲内である。例えば、未標識の二次抗体が血清抗体に結合することができ、次にこの未標識二次抗体を標識三次抗体により結合させることができる。
過敏症の動物は、体液の試料を使用した免疫複合体形成のレベルを、対照試料を使用した免疫複合体形成のレベルと比較することにより同定される。免疫複合体とは、抗体とそのリガンド（すなわち、抗原）とからなる複合体を意味する。このようなものとして、免疫複合体は陽性対照試料を使用して形成し、陰性対照試料では形成しない。このようなものとして、体液試料が、陽性対照試料を使用した免疫複合体の形成と同等かそれ以上の免疫複合体形成を引き起こせば、その体液をとった動物は、基質に結合した外部寄生生物唾液産生物に過敏症である。逆に、体液試料が、陰性対照試料を使用した免疫複合体形成と同程度の免疫複合体形成を引き起こせば、その体液をとった動物は、基質に結合した外部寄生生物唾液産生物に過敏症ではない。
本発明の１つの実施態様は、アレルギー性皮膚炎に感受性の又は同皮膚炎の動物の同定に有用なキットである。本明細書で使用されるとき、疑わしい動物とは試験される動物である。本発明のキットは、本発明の処方物、及び動物がアレルギー性皮膚炎に感受性又は同皮膚炎であるかどうかを決定するための手段（ここで、処方物はアレルギー性皮膚炎に感受性の又は同皮膚炎の動物を同定するために使用される）よりなる。動物が、アレルギー性皮膚炎に感受性又は同皮膚炎であるかどうかを決定するための手段は、上に詳述された本発明のin vivo又はin vitro過敏症試験を含む。本発明のキットは、更に本明細書に開示されたような少なくとも１つの対照溶液を含む。
本発明の好適なキットは、免疫測定法を実施するために有用な要素からなる。本発明のキットは、１つ以上の実験試料（すなわち、本発明の処方物）及び少なくとも１つの前もって包装されたディップスティックに結合した１つ以上の対照試料、並びに試験動物の体液に含有される抗体と、ディップスティックに結合したタンパク質の間の免疫複合体形成を検出するための必要な手段（例えば、上に詳述されるような、標識二次抗体又は他の結合性化合物、並びにこのような標識を分解するために必要な任意の溶液）を含んでよい。このキットが単に本発明の処方物からなってよく、そして検出手段を別の方法で提供しうることは、本発明の範囲内である。
本発明の代替となる好適なキットは、皮膚試験を実施するために有用な要素よりなる。本発明のキットは、１つ以上の実験試料及び／又は１つ以上の対照試料を含有する、少なくとも１つの前もって包装されたシリンジと針の装置からなっていてよい。
２つ以上の異なるin vivo及び／又はin vitro試験を診断目的に組合せで使用することができることは、本発明の範囲内である。例えば、外部寄生生物唾液アレルゲンに対する動物の即時型過敏症は、動物の体液中の外部寄生生物唾液アレルゲンに特異的なＩｇＥ抗体を検出することができるin vitro免疫吸収剤試験を使用して試験することができる。外部寄生生物唾液アレルゲンに対して遅延型過敏症を示す多くの動物はまた、アレルゲンに対する即時型過敏症をも示すが、アレルゲンに対する遅延型過敏症を示す少数の動物は、アレルゲンに対する即時型過敏症は示さない。このような場合には、ＩｇＥ特異的in vitro試験からの陰性結果後、本発明のin vivo試験を使用して外部寄生生物唾液アレルゲンに対する動物の遅延型過敏症を試験することができる。
本発明の別の面は、アレルギー性皮膚炎に感受性の又は同皮膚炎の動物を、本発明の処方物で治療することを含む。本発明による、治療という用語は、外部寄生生物の噛み傷に対する動物による過敏性応答の調節を意味しうる。調節は、例えば、動物の過敏性応答に関与する細胞の免疫調節、あるいは、例えば唾液酵素の抗凝固活性を阻害して、そして動物の皮膚に貫通して摂餌する節足動物の能力を障害することによる、動物にアレルゲンを導入する外部寄生生物の能力の改変を含む。免疫調節は、典型的には免疫応答に関与する分子（例えば、抗体、抗原、主要組織適合分子（ＭＨＣ）及びＭＨＣ分子と同時反応性の分子）の活性を調節することを含む。特に、免疫調節は、過敏性応答に関与する細胞の炎症性応答、免疫抑制、及び免疫寛容を引き起こす抗原：抗体相互作用の調節を意味する。免疫抑制とは、例えば、免疫応答に関与する特定の細胞を殺すことにより免疫応答を阻害することを意味する。免疫寛容とは、免疫応答に関与する特定の細胞をアネルギー化する（すなわち、抗原に対するＴ細胞の反応性を減少させる）ことにより免疫応答を阻害することを意味する。動物を治療するのに適切で好適な外部寄生生物は、本明細書に開示される。特に好適な本発明の処方物は、ＦＡＤを治療するために使用される。
本発明の１つの実施態様は、有効に動物に投与されるとき、外部寄生生物からの噛み傷により伝達されるアレルゲン性成分に次に暴露されるときの動物による過敏性応答を遮断するため（すなわち、阻害、低下又は実質的に防止するため）の、動物の免疫応答を免疫調節する（すなわち、動物を免疫調節する）ために有用な治療用組成物である。このような治療用組成物は、外部寄生生物唾液産生物に過敏症であることが知られている動物及び外部寄生生物唾液産生物に対する過敏性応答に感受性の動物を免疫調節するために有用である。
本発明の１つの実施態様は、本発明の外部寄生生物唾液産生物に対する免疫応答を阻害することができる脱感作性化合物を含む治療用組成物である。このような脱感作性化合物は、ブロッキング化合物、寛容原及び／又はサプレッサー化合物を含む。ブロッキング化合物は、炎症性応答を引き起こしうる抗原：抗体相互作用を調節することができる化合物からなり、寛容原は、動物を免疫寛容化することができる化合物であり、そしてサプレッサー化合物は、動物を免疫抑制することができる。本発明の脱感作性化合物は、可溶性であるか、又は膜に結合していてもよい。膜に結合した脱感作性化合物は、細胞、リポソーム、平面膜又はミセルを含む生体膜に結合していてもよい。本発明の可溶性脱感作性化合物は、（１）マスト細胞のＩｇＥ：抗原媒介性脱顆粒化をブロックすることによりＩ型過敏症反応を阻害し；（２）細胞の補体分解を引き起こすＩｇＧ：抗原複合体形成をブロックすることによりIII型過敏症反応を阻害し；そして（３）マクロファージによるサイトカイン分泌のヘルパーＴ細胞刺激をブロックすることによりIV型過敏症反応を阻害するために有用である。本発明の膜に結合した脱感作性化合物は、（１）細胞の補体分解を引き起こす細胞の表面上のＩｇＧ：抗原複合体形成をブロックすることによりII型過敏症反応を阻害し；（２）免疫細胞内のＩｇＧが調節するシグナル伝達をブロックすることによりII型過敏症反応を阻害し；そして（３）抗原提示細胞を細胞毒性Ｔ細胞が殺すのをブロックすることによりIV型過敏症反応を阻害するために有用である。
本発明の脱感作性化合物はまた、脱感作性化合物に、外部寄生生物唾液産生物に対する過敏性応答に関与する特異的な細胞を標的とさせることの可能なリガンド分子に共有結合することができる。脱感作性化合物を結合させる適切なリガンドは、例えば、イムノグロブリン分子、サイトカイン、レクチン、異種アレルゲン、ＣＤ８分子又は主要組織適合分子（例えば、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスII分子）の少なくとも一部を含む。脱感作性化合物に結合させるのに好適なイムノグロブリン分子の好適な部分は、免疫細胞特異的な表面分子に結合することができる可変領域、及び免疫細胞のＦｃ受容体に結合することができる定常領域（特にＩｇＥ定常領域）を含む。好適なＣＤ８分子は、少なくともＣＤ８のα鎖の細胞外機能性ドメインを含む。免疫細胞とは、免疫応答に関与する細胞、特にＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスII分子を有する細胞を意味する。好適な免疫細胞は、抗原提示細胞、Ｔ細胞及びＢ細胞を含む。
１つの実施態様において、本発明の治療用組成物は、本発明の外部寄生生物唾液産生物、又はそのミメトープを含む。好適な治療用組成物は、外部寄生生物唾液抽出物又は少なくとも１つの本発明の外部寄生生物唾液産生物（好適にはタンパク質）若しくはそのミメトープからなる処方物を含む。
ノミのアレルギー性皮膚炎を治療するための適切な本発明の治療用組成物は、ノミの唾液抽出物、及び少なくとも１つのノミの唾液産生物（好適にはタンパク質）又はそのミメトープを含む他の処方物を含む。好適な治療用組成物は、ＦＳ−１、ＦＳ−２及び／又はＦＳ−３、並びにＦＳ−１、ＦＳ−２及び／又はＦＳ−３から単離することができる少なくとも１つのノミの唾液産生物の少なくとも一部を含む。このようなものとして、治療用組成物としての使用に好適な処方物は、ＦＳ−１、ＦＳ−２、ＦＳ−３、及び／又はfspA、fspB、fspC1、fspC2、fspD1、fspD2、fspE、fspF、fspG1、fspG2、fspG3、fspH、fspI、fspJ1、fspJ2、fspK、fspL1、fspL2、fspM1、fspM2、fspN1、fspN2及びfspN3又はその相同体の１つ以上のタンパク質の少なくとも一部を含む。治療用組成物としての使用に更に好適なノミの唾液抽出物は、ＦＳ−１、ＦＳ−２、ＦＳ−３、及び／又はfspE、fspF、fspG1、fspG2、fspG3、fspH、fspI、fspJ1、fspJ2、fspK、fspL1、fspL2、fspM1、fspM2、fspN1、fspN2及びfspN3の１つ以上のタンパク質の少なくとも一部を含む。治療用組成物としての使用に更になお好適なノミの唾液抽出物は、ＦＳ−１、ＦＳ−２、及び／又はfspG1、fspG2、fspG3、fspH、fspM1、fspM2、fspN1、fspN2及びfspN3の１つ以上のタンパク質の少なくとも一部を含む。
別の実施態様において、治療用組成物は、適切な賦形剤と一緒になった本発明の外部寄生生物産物を含んでよい。本発明の治療用組成物は、治療される動物が許容しうる賦形剤中に処方することができる。好適な賦形剤は、その細胞が刺激されて免疫応答を開始又は増強することができるように、動物のアレルギー応答に関与する細胞が結合できる形に本発明の産物を維持することができる。このような賦形剤の例は、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス液、及び他の生理学的平衡塩類水溶液を含む。不揮発性油、ゴマ油、オレイン酸エチル、又はトリグリセリドのような非水性担体も使用することができる。他の有用な処方物は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランのような粘性増強剤を含有する懸濁液を含む。賦形剤はまた、等張性及び化学安定性を増強する物質のような、少量の添加物を含有してもよい。緩衝液の例は、リン酸緩衝液、重炭酸緩衝液及びトリス緩衝液を含み、一方保存料の例は、チメロサール、ｍ−又はｏ−クレゾール、ホルマリン及びベンジルアルコールを含む。標準的な処方物は、注入可能な液体であるか、又は適切な液体にとって注入用の懸濁液若しくは溶液とすることのできる固体であってよい。このため、非液体処方物において、賦形剤は、投与前に滅菌水又は生理食塩水を添加することができる、デキストロース、ヒト血清アルブミン、保存料などであってよい。
別の実施態様において、本発明の治療用組成物はまた、担体又はアジュバントを含んでもよい（しかし、本発明の唾液産生物の利点は、投与のためにアジュバント及び／又は担体を必要としないことであることは理解されたい）。アジュバントは典型的には、一般に特異的な抗原に対する動物の免疫応答を増強する物質である。適切なアジュバントは、フロイントアジュバント；他の細菌細胞壁成分；アルミニウムに基づく塩類；カルシウムに基づく塩類；シリカ；ポリヌクレオチド；トキソイド；血清タンパク質；ウイルスコートタンパク質；他の細菌由来の調製物；ガンマインターフェロン；ハンターのタイターマックスアジュバント（Hunter's Titermax adjuvant）（バックセル（Vaxcel）（登録商標）社、ノークロス（Norcross）、ジョージア州）のようなブロックコポリマーアジュバント；リビ（Ribi）アジュバント（リビ・イムノケム・リサーチ社（Ribi ImmunoChem Research, Inc.）、ハミルトン、モンタナ州から入手可能）；及びキルＡ（Quil・A）（スーパーフォス・バイオセクター社（Superfos Biosector A/S）、デンマークから入手可能）のようなサポニンとその誘導体を含むが、これらに限定されない。
担体は典型的には、治療される動物中の治療用組成物の半減期を増大させる化合物である。適切な担体は、ポリマー性放出制御処方物、生物分解性インプラント、リポソーム、細菌、ウイルス、油、エステル、及びグリコールを含むが、これらに限定されない。
本発明の１つの実施態様は、本発明の治療用組成物を動物の血流中に徐々に放出することができる放出制御処方物である。適切な放出制御処方物は、生体適合性（生物分解性を含む）ポリマー、他のポリマー性マトリックス、カプセル、ミクロカプセル、微粒子、ボーラス調剤、浸透圧ポンプ、拡散装置、リポソーム、リポスフェア（lipospheres）、及び経皮送達システムを含むが、これらに限定されない。本発明の他の放出制御処方物は、動物に投与されると、インシトゥーで固体又はゲルを形成する液体を含む。
本発明はまた、組換えウイルス粒子の治療用組成物も含む。このような組成物は、ウイルスコートにパッケージされて投与後動物中で発現しうる本発明の組換え分子を含む。好適にはこの組換え分子は、パッケージングが欠損している。アルファウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、及びレトロウイルスに基づくウイルス粒子を含むが、これらに限定されない、多くの組換えウイルス粒子を使用することができる。好適な組換え粒子ウイルスは、アルファウイルス（例えばシンドビスウイルス）、ヘルペスウイルス及びポックスウイルスに基づくウイルスである。組換えウイルス粒子ワクチンを産生し使用する方法は、１９９３年２月８日出願の「組換えウイルス粒子ワクチン（Recombinant Virus Particle Vaccines）」という発明の名称の米国特許出願08/015/414号に開示されており、これはその全体が引用により本発明に組み込まれる。
動物に投与されると、本発明の組換えウイルス粒子治療用組成物は、免疫化された動物の細胞に感染し、外部寄生生物の噛み傷により引き起こされるアレルギー性皮膚炎から動物を保護することができる保護タンパク質又はＲＮＡ核酸分子の産生を指令する。例えば、本発明の１つ以上の外部寄生生物唾液タンパク質をコードする核酸分子を含む組換えウイルス粒子は、外部寄生生物唾液アレルゲンに対する動物の寛容化を引き起こすプロトコールにより投与される。
本発明の治療用組成物は、タンパク質分解を起こさない従来法（例えば、濾過）により滅菌するか、かつ／又は凍結乾燥することができる。
本発明の治療用組成物は、本明細書に記載されるような外部寄生生物の侵襲に感受性の任意の動物に投与することができる。本発明の治療用組成物を有効に投与するための許容しうるプロトコールは、個々の投薬量のサイズ、投薬回数、投薬の頻度、及び投与の様式により変化させることができる。このようなプロトコールの決定は、当業者であれば達成することができる。有効用量とは、外部寄生生物唾液アレルゲンに対する過敏症に対して動物を治療することができる用量を意味する。有効用量は、例えば、使用される治療用組成物、組成物が由来する節足動物、及び投与を受ける動物の大きさと型により変化させることができる。外部寄生生物唾液アレルゲンに対して動物を免疫調節するための有効用量は、外部寄生生物唾液アレルゲンに対して動物の過敏性応答を軽減することができる時間にわたって投与される用量を含む。例えば、初回寛容化用量は、過敏症動物に投与されると最小限の過敏性応答を引き起こす本発明の治療用組成物の量であってよい。２回目の寛容化用量は、初回用量よりも多量の同じ治療用組成物であってよい。有効寛容化用量は、動物が外部寄生生物の噛み傷に対して過敏性応答をしないように動物を寛容化するのに必要な、上昇する濃度の治療用組成物であってよい。動物を脱感作するための有効用量は、動物が外部寄生生物の噛み傷に対して過敏性応答をするのをブロックするために十分な、ある濃度の本発明の治療用組成物であってよい。有効脱感作用量は、過敏症動物に投与されると、最小限の過敏性応答を引き起こす治療用組成物の濃度を有する繰り返し用量を含んでよい。
適切な単回用量は、適切な時間で１回以上投与されるとき、外部寄生生物唾液アレルゲンに対する過敏症に対して動物を治療することができる用量である。例えば、外部寄生生物唾液産生物、又はミメトープ治療用組成物の好適な単回用量は、動物の体重１キログラム当たり約０．５ng〜約１ｇの治療用組成物である。この治療用組成物による更なる治療は、元の投与の約１時間〜１年後に投与することができる。この治療用組成物による更なる治療は、好適には動物がもはや外部寄生生物に対する過敏性応答から保護されなくなったときに投与される。特定の投与用量及び投与計画は、上述のパラメーターに基づき当業者には展開することができる。投与の様式は、皮下、皮内、静脈内、鼻内、経口、経皮及び筋肉内経路を含んでよいが、これらに限定されない。
本発明の治療用組成物は、外部寄生生物の噛み傷に対する動物の過敏症を調節することができる他の化合物と組合せて使用することができる。例えば、過敏性応答に関与する細胞の機能を調節することができる化合物、全身性薬剤又は抗炎症剤（例えば、抗ヒスタミン剤、抗ステロイド剤、抗炎症剤、及びＩｇＥからＩｇＧへのイムノグロブリン重鎖のクラススイッチを行わせる薬剤）のようなアレルギー反応を低下させる化合物により動物を治療することができる。過敏性応答に関与する細胞の機能を調節するのに有用な適切な化合物は、抗ヒスタミン剤、クロモリンナトリウム（cromolyn sodium）、テオフィリン、シクロスポリンＡ、アドレナリン、コルチゾン、細胞のシグナル伝達を調節することができる化合物、アデノシン３’，５’−サイクリックリン酸（ｃＡＭＰ）活性を調節することができる化合物、並びにＩｇＥ若しくはＩｇＥ特異的Ｆｃ受容体からのペプチド、ＩｇＥ若しくはＩｇＥ特異的Ｆｃ受容体からのペプチドに特異的な抗体、又はＦｃ受容体に対するＩｇＥの結合をブロックすることができる抗体のような、ＩｇＥ活性をブロックする化合物を含むが、これらに限定されない。
本発明は別の面で、本発明の処方物を使用する、アレルギー性皮膚炎に感受性の又は同皮膚炎の動物のための治療法を処方するための方法を含む。ノミのアレルギー性皮膚炎の治療法を処方するための好適な方法は、例えば、（１）動物の１つの部位に少なくとも１つの本発明のノミの唾液抗原、又はそのミメトープを含有する有効量の処方物（適切で好適な処方物は本明細書に開示される）を皮内注入し；（２）動物の第２の部位に有効量の対照溶液を皮内注入し；（３）処方物の注入により生じた膨疹の大きさを測定して、対照溶液の注入により生じた膨疹の大きさと比較することにより、その動物がノミのアレルギー性皮膚炎であるかどうかを評価し；そして（４）ノミのアレルギー性皮膚炎の治療法を処方することからなる。
ノミのアレルギー性皮膚炎の治療法を処方する代替となる好適な方法は、（１）試験される動物から入手した体液の試料の第１の部分を、少なくとも１つのノミの唾液抗原、又はそのミメトープを含有する有効量の処方物（適切で好適な処方物は、本明細書に開示される）と接触させて第１の免疫複合体溶液を形成し；（２）陽性対照抗体を接触させて第２の免疫複合体溶液を形成し；（３）第１及び第２の免疫複合体溶液中の免疫複合体形成量を測定して比較することにより、その動物がノミのアレルギー性皮膚炎であるかどうか評価し；そして（４）ノミのアレルギー性皮膚炎の治療法を処方することからなる。本明細書に開示される外部寄生生物唾液産生物処方物を使用して、他の外部寄生生物により引き起こされるアレルギーの治療法を処方するために同様の方法を使用できることに注意されたい。
本発明の別の面は、本発明の処方物を使用して、アレルギー性皮膚炎に感受性の又は同皮膚炎の動物をモニターするための方法を含む。本発明のin vivo及びin vitro試験は、アレルギー性皮膚炎の治療前及び後にアレルギー性皮膚炎について動物を試験するために使用することができる。ノミのアレルギー性皮膚炎の治療をモニターするための好適な方法（この方法はまた、他の外部寄生生物アレルギーの治療をモニターするために適用することができる）は、（１）動物の１つの部位に少なくとも１つのノミの唾液産生物、又はそのミメトープを含有する有効量の処方物（適切で好適な処方物は本明細書に開示される）を皮内注入し；（２）動物の第２の部位に有効量の対照溶液を皮内注入し；そして（３）処方物の注入により生じた膨疹の大きさを測定して、対照溶液の注入により生じた膨疹の大きさと比較することにより、その動物がノミの唾液抗原に対して脱感作されているかどうかを決定することからなる。
ノミのアレルギー性皮膚炎の治療をモニターするための代替となる好適な方法（これは、他の外部寄生生物のアレルギーの治療をモニターするために適用することができる）は、（１）試験される動物から入手した体液の試料の第１の部分を、少なくとも１つのノミの唾液産生物又はそのミメトープを含有する有効量の処方物（適切で好適な処方物は、本明細書に開示される）と接触させて第１の免疫複合体溶液を形成し；（２）陽性対照抗体を接触させて第２の免疫複合体溶液を形成し；そして（３）第１及び第２の免疫複合体溶液中の免疫複合体形成量を測定して比較することにより、その動物がノミの唾液抗原に対して脱感作されているかどうか決定することからなる。
本発明はまた、外部寄生生物唾液産生物、又はそのミメトープに選択的に結合することができる抗体を含む。本明細書ではこのような抗体は、抗外部寄生生物唾液産生物抗体と呼ばれる。本明細書で使用されるとき、「選択的に結合する」という用語は、外部寄生生物唾液産生物及びそのミメトープに優先的に結合するこのような抗体の能力を意味する。特に、本発明は、ノミの唾液産生物に選択的に結合することができる抗体を含む。結合は、免疫ブロット測定法、免疫沈降測定法、酵素免疫測定法（例えばＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法、免疫蛍光抗体測定法及び免疫電子顕微鏡法を含む、当業者に知られている種々の方法を使用して測定することができる；例えば、Sambrookらの同文献を参照のこと。
本発明の抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体であってよい。本発明の抗体は、抗体を得るために使用されるタンパク質又はミメトープの少なくとも１つのエピトープに選択的に結合することができる、一本鎖抗体を含む、抗体断片及び遺伝子を改変した抗体のような機能的な同等物を含む。好適な抗体は、外部寄生生物唾液タンパク質、又はそのミメトープに応答して生じる。更に好適な抗体は、本発明の収集手段から溶出される外部寄生生物唾液タンパク質の少なくとも一部を有する、少なくとも１つの外部寄生生物唾液タンパク質、又はそのミメトープに応答して生じる。更になお好適な抗体は、唾液抽出物ＦＳ−１、ＦＳ−２及び／又はＦＳ−３に含まれる、少なくとも１つのノミの唾液産生物、又はその相同体（例えば、他の外部寄生生物の唾液産生物）に応答して生じる。抗体を生成させる更に好適な外部寄生生物唾液タンパク質は、fspA、fspB、fspC1、fspC2、fspD1、fspD2、fspE、fspF、fspG1、fspG2、fspG3、fspH、fspI、fspJ1、fspJ2、fspK、fspL1、fspL2、fspM1、fspM2、fspN1、fspN2及びfspN3の１つ以上のタンパク質又はその相同体の少なくとも一部を含む。好適には、本発明の抗体は、本発明のノミの唾液産生物に対して約１０³M^-1〜約１０¹²M^-1の単一部位結合親和性を有する。
本発明の抗体を産生する好適な方法は、動物に有効量の外部寄生生物唾液産生物又はそのミメトープを投与して抗体を産生させて、その抗体を回収することを含む。規定された産物又はミメトープに対して生じた抗体は、このような抗体が、診断測定法において妨害を、又は治療用組成物に使用されると副作用を引き起こすかもしれない他の物質に対する抗体が実質的に混入していないため、有利である。
本発明の抗体は、本発明の範囲内である種々の使用可能性を有する。例えば、このような抗体は、（ａ）アレルギー性皮膚炎から動物を保護するために、動物を受動免疫化するためのワクチンとして、（ｂ）試験キットの陽性対照として、及び／又は（ｃ）タンパク質と他の混入物の混合物から目的の外部寄生生物唾液産生物を回収するための道具として使用することができる。
以下の実施例は、説明の目的で提供されるものであって、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
実施例
実施例１
この実施例は、本発明の唾液収集装置を用いるノミ唾液タンパク質の収集を記載している。
唾液収集装置は、以下のように準備した。
図４Ａ及び４Ｂを参照して、唾液収集装置（２）のチャンバー（６）の内径（直径約４７mm）に合うＶＷＲブロッティングパッド＃３２０（VWR, Denver, Co）の約４片を含む加湿装置（３４）が、準備された。このブロッティングパッドは、予備湿潤溶液（ペニシリン５０単位／ml及びストレプトマイシン５０μg/mlを含む滅菌水、Sigma, St.Louis, Moから入手しうる）の十分な量を用いて予備湿潤されて、ブロッティングパッドは、湿らせられたが、しずくのたれる湿りではなかった。予備湿潤されたフィルターは（３４）は、唾液収集装置（２）のチャンバー（６）の底部末端（２２）の内側に置き、ろ紙はチャンバー（６）の底部末端（２２）すぐ内側に置かれた。
デュラポア（登録商標）膜（Millipore, Bedford, MAから入手しうる）を含む収集手段（２４）を、唾液収集装置（２）のチャンバー（６）の外径（直径約４８mm）に合うように切断した。デュラポア（登録商標）膜（２４）を、上記の予備湿潤溶液を用いて予備湿潤した。デュラポア（登録商標）膜（２４）は、チャンバー（６）の底部末端（２２）のすぐ外側に置かれ、デュラポア（登録商標）膜（２４）は、チャンバー（６）の底部末端（２２）の外側の縁に接触させ、かつ湿潤ろ紙にも接触させた。延伸パラフィルム（登録商標）（American National Can（登録商標），Greenwich, CTから入手しうる）（２８）の一片を含む障壁手段が、収集手段（２４）及びチャンバー（６）の底部末端（２２）を覆い、チャンバー（６）の側壁（３０）まで引き伸ばされた。ラバーシール（３２）（すなわち、Ｏ−リング）は、パラフィルム（登録商標）の上に置かれ、それにより収集手段（２４）を越えて側壁（３０）までパラフィルム（登録商標）を更にしっかり締めつけ、チャンバー（６）環境を封止した。
収集装置（２）は、予め組み立てられ、次いでチャンバー（６）の頂部末端（２０）は、Wade et al.,（前出）により記載されているように熱及び湿度源として作用することができる人工の供給システムに取り付けられた。人工の供給システムは、貫通して開けられた孔を有するプレキシグラスの棚で水平に上の区画と下の区画に分けられた大きなプレキシグラスの箱（４０cm×４０cm×４０cm）から成り立つ。収集装置（２）は、孔に挿入され、装置（２）のチャンバー（６）は、上の区分の棚の上に置かれ、ハウジング（４）は下の区分の棚の下に置かれた。装置（２）は、棚に置かれた金属フックに取りつけられたゴムバンドを取りつけることにより棚にしっかりと止められている。棚の上のどのような孔も、ゴム栓を用いて閉じられ、下の区分の環境から上の区分の環境を隔離している。上の区分は、２個の水の受け皿、送風機及び加熱台を含んでいる。水の受け皿は、送風機が、受け皿に向き合うように置かれている。装置（２）は、人工供給システムに保持されているが、送風機は、連続的に送風され、それにより上の区分と収集装置（２）のチャンバー（６）を通して熱及び湿度を循環させる。そのようにして、チャンバー（６）中の相対湿度は、約９４％湿度に維持され、温度は約３７℃に維持されている。
約３，０００〜５，０００の新たに発生させた無給餌のCtenocephalides felisノミを収集装置（２）のハウジング（４）に加えた。このノミを、先ず約７５リットル（２０ガロン）のガラス水槽に集めた。次いで、このノミは、真空チャンバーの上部の交換手段（１６）のナイロンメッシュを有するハウジング（４）の端部を置き、かつノミを水槽からタイゴン（tygon）チューブを通してハウジング（４）の中へ吸い込むことにより、収集装置（２）のハウジング（４）へ移動させた。ハウジング（４）は、次いでハウジング（４）の中にノミを閉じ込めるために保持手段（１８）のナイロンメッシュで覆われた。チャンバー（６）の底部末端（２２）は、次いでハウジング（４）に置かれ、パラフィルム（登録商標）（２８）及び保持手段（１８）のナイロンメッシュが並べて置かれた。収集装置（２）が、人工給餌システムに取り付けられたとき、ハウジング（４）内の周囲温度は約２７℃に維持されたが、一方チャンバー（６）の周囲温度は約３７℃に維持された。ハウジング（４）の相対湿度は、プレキシグラスの棚で下の区分を閉じることにより約５０％に維持された。
一つに実験において、ノミ唾液産生物は、デュラポア（登録商標）膜（２４）上で集められ、膜を０．１％Coomassie blue stain中に２０分間浸し、膜を５０％メタノール中で脱染色し、次いで膜を空気乾燥することにより可視化した。膜に沈積したタンパク質は、その青色によって検出された。
別の実験として、ノミ唾液産生物が、ノミを収集装置に入れた後、０〜２４時間、２４〜７２時間及び７２〜１２０時間の間収集された。２４時間、７２時間及び１２０時間の時点で、収集装置（２）に取りつけられたデュラポア（登録商標）膜を取りはずし、新しい予備湿潤されたデュラポア（登録商標）膜を同じ装置に取りつけた。ブロッティングパッドは、デュラポア（登録商標）膜（２４）が新しく取り替えられたとき、上記の予備湿潤溶液を用いて予備湿潤された。ノミ唾液産生物は、それぞれの膜をそれぞれの時点で別々に５０％アセトニトリルと１％ＴＦＡ溶液を含む溶液に室温で一晩浸し、溶液中に溶離されたノミ唾液産生物を含むノミ唾液産生物混合物を得るために攪拌することにより、デュラポア（登録商標）膜から抽出された。ノミ唾液産生物を含む混合物は、回収され、ペレットを形成するように乾燥するまで凍結乾燥された。それぞれの時点からそれぞれのデュラポア（登録商標）膜から溶離されたノミ唾液タンパク質の特性及び量は、Sambrook et al.,前出により記載されているものと同様な手法を用いて、１４％トリス−グリシンSDS-PAGEを還元することにより測定された。得られたタンパク質パターンは、上記の手法を用いてゲルをCoomassie blue stainで染色することにより可視化された。膜上に集められた唾液タンパク質の量は、ノミが７２時間を越えて収集装置にいる場合には、減少した。
実施例２
本発明の、ＦＳ−１、ＦＳ−２及びＦＳ−３ノミ唾液抽出物を集める標準手順は、以下のように実施された。ノミ唾液産生物は、ノミ唾液抽出物ＦＳ−３を除いて、実施例１に記載した方法を用いて収集膜上で７２時間収集され、収集膜は、Whatmann, Inc., Clifton, NJから入手しうるＤＥ−８１クロマト紙であった。
Ａ．ノミ唾液抽出物ＦＳ−１及びＦＳ−２：
ノミ唾液産生物は、それぞれの時点のそれぞれの膜を、別々に５０％アセトニトリルと０．１％ＴＦＡを含む第一の溶媒に８時間浸すことにより、デュラポア膜（登録商標）（２４）から抽出された。溶離されたノミ唾液産生物を含む初めの混合物は、回収され、乾燥するまで凍結乾燥され、そ参れにより最初のペレットを形成した。次いで、同じ膜は、５０％アセトニトリルと１％ＴＦＡを含む第二の溶媒に室温で一晩攪拌しながら浸漬され、第二の溶媒に溶離したノミ唾液産生物を含む混合物を得た。この第二の混合物は、この第二の抽出物から回収され、乾燥するまで凍結乾燥され、第二のペレットを形成させた。
二つの凍結乾燥工程から回収された二つのペレットは、１２．８％アセトニトリルを含む第三の溶媒と混合され、この溶媒中に溶解させられたノミ唾液産生物が、回収された。非溶解物質は、再度１２．８％アセトニトリルと混合され、その溶媒に溶解された更なるノミ唾液産生物が、回収された。この二つの混合物は、抽出物ＦＳ−１を得るために混合された。
第二の可溶化工程の後の非溶解物質残留物は、次いで抽出物ＦＳ−２を得るために残留物質を可溶化させる５０％アセトニトリルと混合した。
少なくとも一つの実験で得られたＦＳ−１及びＦＳ−２ノミ唾液に含まれたノミ唾液タンパク質の特性及び量は、以下の方法により測定された。それぞれの抽出物は、真空下での蒸発により濃縮され、１６％トリス−グリシンSDS-PAGEを、Sambrook et al.,前出により記載された技術と同様の技術を用いて還元することにより評価した。そのような標準方法を用いて、デュラポア（登録商標）膜から溶離されたＦＳ−１又はＦＳ−２の約１０μgが、１６％トリス−グリシンポリアクリルアミドゲル上に載せられ、還元条件下で電気泳動に付された。このゲルを、Coomassie blueで染色し、乾燥した。
結果が、図１Ｂに示されている。ＦＳ−１は、図１Ｂのレーン１３に示され、ＦＳ−２は、図１Ｂのレーン１４及び１５に示されている。ＦＳ−１は、以下の分子量を有すると評価されたタンパク質を含むことが見い出された：９kD、１１kD、１２kD、１５kD、２２kD、４８kD、５０kD、５３kD、８０kD、１２４kD、１３０kD、１８９kD及び２０１kD。８０kD及びそれを越えるそれらのタンパク質は、より低い分子量バンドよりも更に弱い。ＦＳ−２は、以下の分子量を有するタンパク質を含むことが見い出された：４７kD、４９kD、５２kD、５７kD、６４kD、７１kD、８８kD、９６kD、９７kD、１３０kD、１６１kD、１７５kD、１８９kD、２２２kD、２３５kD及び３０２kD。４７kD、４９kD及び５２kDのバンドは、より高い分子量を有するバンドよりも明瞭であった。この結果は、ＦＳ−２に含まれているタンパク質の実質的な部分が、fspN1、fspN2及び／又はfspN3であることを示唆している。
タンパク質濃度は、Bio-Rad Bradfordアッセイ（Bio-Rad, Hercules, CAから入手しうる）を用いて測定された。この結果は、タンパク質の約７５０μgが、ＦＳ−１抽出物の約３．６６×１０⁷ノミ時間（７２時間での５．０８×１０⁵ノミ）で、集められ、タンパク質の約２．３５mgが、ＦＳ−２抽出物中の３．６６×１０⁷ノミ時間で集められることができることを示している。
Ｂ．ノミ唾液抽出物ＦＳ−３：
ＦＳ−３ノミ唾液抽出物を生成するためのノミ唾液産生物は、収集膜（２４）がＤＥ−８１クロマト紙であったことを除いて、ＦＳ−１及びＦＳ−２が集められた方法と同様な方法で集められた。ノミ唾液産生物は、ＤＥ−８１膜から、それぞれの時点のそれぞれの膜を別々にリン酸塩緩衝塩溶液中の１M ＮａＣｌを含む溶媒に８時間浸すことにより抽出された。この産生物は、ＦＳ−１及びＦＳ−２のために開示されたような標準手法を用い溶媒から回収された。
ＦＳ−３ノミ唾液抽出物の分析は、少なくとも１次ゲル電気泳動に基づいて、ＦＳ−３が、ＦＳ−１及びＦＳ−２で見い出されたタンパク質のようなタンパク質を含むように見えることを示した。ＦＳ−３のSDS-PAGEパターンは、例えばＦＳ−３抽出物中の高分子量タンパク質の量を増大させるように見えることを除いて、ＦＳ−１のパターンに非常に似ている。ＦＳ−３ノミ唾液抽出物は、当技術での標準技術を用いて、抗凝血活性を有することも示された；例えばDunwiddle et al., 1991, Thrombosis Research 64,787-794; Ribeiro et al., 1990, Comp. Biochem. Physiol. 95, 215-218; Ribeiro et al., 1990, Br.J.Pharmacol. 101, 932-936; Ribeiro et al., 1987, Exper. Parasitol. 64, 347-353; Cupp et al., 1994, Am. J.Trop. Med. Hyg. 50, 241-246; Garcia et al., 1994, Exper. Parasitol. 78, 287-293参照。ＦＳ−３抽出物は、Sigmaにより供給される技術のような当技術での標準技術を用いて、Sigmaの酸ホスフォターゼアッセイキットにより、酸ホスフォターゼ活性を表すことも示された。
実施例３
この実施例は、本発明の唾液収集装置を用いて集めたノミ唾液タンパク質のＨＰＬＣによる特性決定を記載している。
ＦＳ−１ノミ唾液抽出物は、実施例２に記載されたように、約１４０，０００ノミから７２時間で集められた。ＦＳ−１中に含まれているタンパク質は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）の標準技術を用いて分析された。具体的には、このタンパク質は、１５cm×０．４６cmＣ４カラム上を、水中の０．１％ＴＦＡ（溶媒Ａ）から９０％アセトニトリル中の０．０８５％ＴＦＡ（溶媒Ｂ）までの勾配を用いて１分当たり０．８mlの流速で通された。したがって、この勾配は、１５分で約５．６％溶媒Ｂであり、７５分で約１００％溶媒Ｂであった。
この結果が、図２に示されている。約１４の主要タンパク質画分が、分析された。それぞれのピークの回収は、ピーク当たり約５μg〜１０μgであった。このピークは、図２に示すように、ピークＡ、ピークＢ、ピークＣ、ピークＤ、ピークＥ、ピークＦ、ピークＧ、ピークＨ、ピークＩ、ピークＪ、ピークＫ、ピークＬ、ピークＭ及びピークＮと標識され、それぞれ、タンパク質組成物fspA、fspB、fspC1及びfspC2、fspD1及びfspD2、fspE、fspF、fspG1、fspG2、fspG3、fspH、fspI、fspJ1及びfspJ2、fspK、fspL1及びfspL2、fspM1及びfspM2、並びにfspN1、fspN2及びfspN3を表す。
それぞれのＨＰＬＣピークからの試料は、実施例１で記載された方法を用いてトリスグリシンSDS-PAGEゲルにより分析された。結果を図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃに示す。図１Ａ及び１Ｂに示されたタンパク質は、１６％トリスグリシンSDS-PAGEゲルにより分析され、図１Ｃに示されたタンパク質は、１４％トリスグリシンSDS-PAGEゲルにより分析された。タンパク質マーカーは、図１Ａのレーン１、図１Ｂのレーン２及び図１Ｃのレーン１に示されている。別のレーンは、以下のように唾液組成物試料を示している。

図１Ａを参照して、以下のノミ唾液タンパク質（バンドとして示される）が、観察された：ピークＡ及びピークＢ試料での約１０kDの明瞭なバンド；Ｃ１として示されるピークＣ試料での約６kDの明瞭なバンド及び９kDのやや明瞭でないバンド；Ｃ２として示されるピークＣでの約７kDの明瞭なバンド；Ｄ１として示されるピークＤ試料での約７kDの明瞭なバンド及び８kDのやや明瞭でないバンド；Ｄ２として示されるピークＤ試料での約８kDの明瞭なバンド及び９kDのやや明瞭でないバンド；ピークＥ及びＦ試料での８kDの明瞭なバンド及び約７kDのやや明瞭でないバンド；ピークＧ試料での約９kDの明瞭なバンド並びに約７kD及び１０kDのやや明瞭でないバンド．図１Ｂを参照して、以下のノミ唾液タンパク質が、観察された：ピークＨ試料での約９kDの明瞭なバンド及び約１２kDのやや明瞭でないバンド；ピークＩ試料での約２１kDの明瞭なバンド並びに約７kD、９kD、１２kD、１４kD及び７０kDのやや明瞭でないバンド；ピークＪ試料の約１４kD及び２１kDの明瞭なバンド並びに約１１kD及び１７kDのやや明瞭でないバンド；ピークＫ試料の約１４kD及び１５kDの明瞭なバンド並びに約１２kD、１８kD及び２１kDのやや明瞭でないバンド；ピークＬ試料の約１５kDの明瞭なバンド；Ｍ１として示されるピークＭ試料の約１１kD、１２kD及び２１kDの明瞭なバンド並びに約１５kD、１７kD、２２kD及び３７kDのやや明瞭でないバンド；Ｍ２として示されるピークＭ試料の約３６kDの明瞭なバンド並びに約１１kD、２１kD及び２２kDのやや明瞭でないバンド。図１Ｃを参照して、ピークＮ試料中の、約４２kD、４３kD及び４４kDの明瞭なバンド並びに約３２kDのやや明瞭でないバンドが検出された。
実施例４
この実施例は、単離され、ＨＰＬＣ精製されたノミ唾液タンパク質のアミノ酸配列分析を記載している。
アミノ（Ｎ−）末端アミノ酸配列分析は、当業者に知られている標準手法を用いて、実施例３に記載したＨＰＬＣ分離のノミ唾液タンパク質のいくつかで実施された（例えば、Geisow et al., 1989, in Protein Sequencing: A Practical Approach, JBC Findlay and MJ Geisow（eds.）, IRL Press, Oxford, England, pp.85-98; Hewick et al., 1981, J.Biol. Chem., Vol. 256, pp.7990-7997参照）。
ノミ唾液タンパク質ｆｓｐＡのＮ末端部分アミノ酸配列（これは、図２のピークＡとして移動した）は、標準一文字コードで表現して、
ＹＧＫＱＹＳＥＫＧＧＲＧＱＲＨＱＩＬＫＫＧＫ
ＱＹＳＳＫＩＬＤＬ
Ｓ
Ｒ
であると決定された。このｆｓｐＡのＮ末端部分アミノ酸配列は、SEQ ID NO:1と表示されている。配列エラー（すなわち、アミノ酸の誤同定）が存在しうるいくつかの位置での異種混成又は唾液タンパク質が集められたノミ母集団での対立変異が存在することに注意すべきである。指示位置での別のアミノ酸のいずれかを見いだすことが明らかに起こりうる。
fspBのノミ唾液タンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列（これは、図２のピークＢとして移動した）は、Ｓ／ＱＧＫＱＹＳＥＸＧ／ＳＫと決定され、SEQ ID NO:27と表示された。
このアミノ酸配列は、ノミ唾液タンパク質ｆｓｐＡから得たＮ末端部分アミノ酸配列と本質的に同じか、又は少なくともその一部分であった。
ピークＧタンパク質の配列分析は、そのピークに三個のタンパク質（ここで、fspG1、fspG2及びfspG3に対応する）の存在を示した。約９kDの分子量を有するノミ唾液タンパク質fspG1は、ＤＲＲＶＳＫのＮ末端部分アミノ酸配列を有し、SEQ ID NO:28と表示された。Ｎ末端部分アミノ酸配列は、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及びSEQ ID NO:14で示されているように、fspHの配列と同一である。約７kDの分子量を有するノミ唾液タンパク質fspG2は、ＳＫＭＶＴＥＫＸＫＳＧＧＮＮＰＳＴＫＥＶＳＩＰのＮ末端部分アミノ酸配列を有し、SEQ ID NO:29と表示された。約６kDの分子量を有するノミ唾液タンパク質fspG3は、ＥＶＳＩＰＳＧＫＬＴＩＥＤＦＸＩＧＮＨＱのＮ末端部分アミノ酸配列を有し、SEQ ID NO:30と表示された。SEQ ID NO:30とSEQ ID NO:29の比較は、fspG2の最後の５個のアミノ酸がfspG3のＮ末端でのそれらと同一であるので、fspG3はfspG2のタンパク質分解的分解生成物でありうることを示している。
ノミ唾液タンパク質fspH（これは、図２のピークＨに移動していた）のＮ末端部分アミノ酸配列は、ＤＲＲＶＳＫＴＸＱＳＧＧＫＩＱＳＥＸＱＶＶＩＫＳＧＱＨ／ＹＩＬＥＮＹＸＳＤＧＲであると決定され、本明細書でSEQ ID NO:14と表示された。ヒスチジン及びチロシンは、アミノ酸位置２７で同等にあるようであった。
ノミ唾液タンパク質fspHは、内部のアミノ酸配列を得るためにタンパク質分解的開裂にも付された。特に、fspHは、当技術の標準方法を用いて、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ（Boehringer Mannheim Biochemica, Indianapolis, INから入手しうる）で開裂された。消化されたタンパク質は、次いでStone et al.（前出）により記載された方法を用いてＨＰＬＣにより分析された。得られた結果は、図３に示されている。３個のタンパク質分解断片が、単離され、ここでfspHe、fspHh及びfspHjとして対応されている。
fspHeのＮ末端部分アミノ酸配列は、ＤＳＫＨＣＹＣＥＡＰＹＳであると決定され、SEQ ID NO:3と表示された。fspHhのＮ末端部分アミノ酸配列は、ＤＧＲＮＮＮＮＰＣＨＬＦＣＭＲＥＣＲＳＧＮＧＧＣＧＮＧＧＲＴＲＰＤＳＫＨＣであると決定され、SEQ ID NO:4と表示された。fspHjのＮ末端部分アミノ酸配列は、ＤＲＲＶＳＫＴＣＱＳＧであると決定され、SEQ ID NO:5と表示された。SEQ ID NO:5〜SEQ ID NO:14の比較は、fspHjは、fspHのＮ末端断片であることを示した。
SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及びSEQ ID NO:5を並べることにより、fspHのＮ末端から出発して、以下のアミノ酸配列が、推論された：ＤＲＲＶＳＫＴＣＱＳＧＧＫＩＱＳＥＸＱＶＶＩＫＳＧＱＨ／ＹＩＬＥＮＹＸＳＤＧＲＮＮＮＮＰＣＨＬＦＣＭＲＥＣＲＳＧＮＧＧＣＧＮＧＧＲＴＲＰＤＳＫＨＣＹＣＥＡＰＹＳ。このアミノ酸配列は、SEQ ID NO:2と表示され、この配列を有するタンパク質の分子量は約８，６００kDであるので、ほとんどのfspHを表すと思われる。
ノミ唾液タンパク質fspI（これは、図２のピークＩとして移動した）のＮ末端部分アミノ酸配列は、ＥＤＩＷＫＶＮＫＫＸＴＳＧＧＫＮＱＤＲＫＬＤＱＩＩＱＫＧＱＱＶＸＸＱＮＸＸＫであると決定され、本明細書ではSEQ ID NO:6と表示された。
ピークＪタンパク質の配列分析は、本明細書でfspJ1及びfspJ2として示される、ピークの２個のタンパク質の存在を示した。ノミ唾液タンパク質fspJ1のＮ末端部分アミノ酸配列は、ＮＳＨＥＰＧＮＴＲＫＩＲＥＶＭＤＫＬＲＫＱＨＰであると決定され、本明細書でSEQ ID NO:7と表示された。ノミ唾液タンパク質fspJ2のＮ末端部分アミノ酸配列は、ＥＩＫＲＮＳＨＥＰＧＮＴＲＫＩＲＥＶＭＤＫＬＲＫＱＨＰであると決定され、本明細書でSEQ ID NO:8と表示された。SEQ ID NO:7及びSEQ ID NO:8で表されるタンパク質は、実施例１に記載されているSDS-PAGEにより別々に分析されなかった。SEQ ID NO:7とSEQ ID NO:8の比較は、fspJ1がfspJ2のＮ末端で見られた初めの４個のアミノ酸を欠くことを除いて、fspJ1のＮ末端部分アミノ酸配列はfspJ2の配列に非常に似ているように見えることで、fspJ1は、fspJ2の端を切ったものでありうることを示唆している。
ピークＬタンパク質の配列分析は、ここでfspL1及びfspL2として示されるピークの２個のタンパク質の存在を示した。２個のタンパク質、すなわちfspL1とfspL2が存在することは、ピークＬを０．１３％ヘプタフルオロ酪酸（溶媒Ａ）及び９０％アセトニトリル中の０．１％ヘプタフルオロ酪酸（溶媒Ｂ）を以下の傾斜処方（８０分：３０％溶媒Ｂから７０％溶媒Ｂ）によるＣ４逆相クロマトグラフィに付すことにより示された。ＨＰＬＣ分離されたfspL1のＮ末端部分アミノ酸配列は、ＮＤＫＥＰＧＮＴＲＫＩＲＥＶＭＤＫＬＲＫＱＡＱＰＲＴＤＧＱＲＰＫＴＸＩＭであると決定され、SEQ ID NO:9と表示された。fspL2のＮ末端部分アミノ酸配列は、ＸＬＸＲＮＤＫＥＰＧＮＴＲＫＩＲＥＶＭＤＫであると決定され、SEQ ID NO:10と表示された。SEQ ID NO:9とSEQ ID NO:10の比較は、fspL1がＮ末端でfspL2よりも４個のアミノ酸が短いことを除いて、fspL1及びfspL2は類似したタンパク質であることを示している。
実施例３に記載したようにSDS-PAGEによるピークＮに含まれているタンパク質の分析は、３個の異なるバンドを示した。このバンドは、ノミ唾液タンパク質fspN1、fspN2及びfspN3と表示された。fspN1のＮ末端部分アミノ酸配列は、ＮＤＥＬＫＦＶＦＶＭＡＫであると決定され、SEQ ID NO:11と表示された。fspN2のＮ末端部分アミノ酸配列は、ＸＤＥＬＫＦＶＦＶＭＡＫＧＰＳＸＱＡＸＤＹＰＣであると決定され、SEQ ID NO:12と表示された。fspN3のＮ末端部分アミノ酸配列は、ＥＬＫＦＶＦＡＴＡＲＧＭＳＨＴＰＣＤＹＰであると決定され、SEQ ID NO:13と表示された。SEQ ID NO:11とSEQ ID NO:12の比較は、fspN1及びfspN2が同一のＮ末端配列を共有していることを示唆している。fspN1とfspN2は、SDS-PAGEに付した場合に異なって移動するので、多分より長いＣ末端ドメインを有する１個のタンパク質のためか及び／又は後翻訳的改質のためにこの２個のタンパク質は異なる相同体であるようである。SEQ ID NO:11及びSEQ ID NO:12に対するSEQ ID NO:13の比較は、fspN3は、内部配列変化を有するfspN1及びfspN2の相同体であってよいことを示唆している。
ピークＮのノミ唾液タンパク質は、内部アミノ酸配列データを得るために、タンパク質分解的開裂に付された。特に、ピークＮのタンパク質は、当技術の標準方法を用いて、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ（Boehringer Mannheim Biochemica, Indianapolis, Inから入手しうる）で開裂された。消化されたタンパク質は、次いでStone et al.（前出）により記載された方法を用いてＨＰＬＣにより分析され、前述したように配列化された。ピークＮのノミ唾液タンパク質（断片fspN（１００−１０１）と名づけた）のＮ末端部分アミノ酸配列は、ＤＩＥＮＩＫＫＧＥＧＱＰＧＡＰＧＧＫＥＮＮＬＳ／ＬＶＬと決定され、本明細書でSEQ ID NO:31と表示された。
実施例５
この実施例は、ピークＨに含まれているタンパク質の別の特性分析を記載している。
ピークＨに含まれているタンパク質の等電的ｐＨを決定するために、そのピークに存在するタンパク質が、当業者に知られている等電点電気泳動の技術を用いて分析された；例えば、O'Farrell, 1975, J.Biol.Chem., Vol. 250, pp. 4007-4021を参照。ピークＨに含まれているタンパク質のｐＩ値は、約ｐＩ８．５から約ｐＩ９．６の範囲である約ｐＩ９である。
ピークＨに含まれているタンパク質の分子量は、ＥＳＭＳにより決定された。ＥＳＭＳの方法は、Fisons VG quattro-SQマススペクトロメーターで実施された。質量範囲は、１００〜２，０００m/zに対して測定された。注入速度は、１分当たり４μlで実施された。円錐電圧は、４５ボルトで行われた。注入試料は、５０％アセトニトリル中の０．１％ギ酸をμl当たり約１００pモルのタンパク質濃度で含んだ。この結果は、ピークＨが、明らかに８，６１８±６ダルトンの分子量を有するすべてのタンパク質の母集団を含むことを示している。
実施例６
この実施例は、ノミ唾液タンパク質fspH及びfspIの少なくとも部分をコードする核酸配列の単離を記載している。
Ａ．ノミライブラリーの説明
給餌及び非給餌ノミｃＤＮＡライブラリーは、標準方法により調製した。要約すると、約３，０００〜４，０００給餌ノミ及び非給餌ノミの同数が、別々に集められ、ドライアイス冷却のすりばち／きね中に置かれ、そして微粒子に粉砕された。粉砕したノミからのＲＮＡは、グアニジンチオシアナート法を用いて直接抽出し、セシウムクロリド傾斜媒体中で遠心分離により調製された（例えば、Sambrook et al.,前出参照）。セシウムクロリド精製のゼラチン質ＲＮＡペレットが、集められ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含む滅菌ＴＥ緩衝液（１０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６及び１mMＥＤＴＡ）に溶解させた。
この溶解されたペレットは、３M酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２最終濃度０．２mM及び残留ＣｓＣｌを除くために無水エタノールの２倍容量の添加により沈殿させた。全ＲＮＡ量は、ファーストトラック（FastTrack）（登録商標）キット（方法と共に、InVitron Corp., San Diego, CAから入手しうる）を用いてｍＲＮＡを多くするために分画された。
単離された全ノミｍＲＮＡは、ｃＤＮＡ合成及び分子クローニングのために直接に用いられた。ｃＤＮＡ合成及び分子クローニングの方法は、Lambda Zap-cDNA合成キット（登録商標）（Stratagene, Inc., La Jolla, Caから入手しうる）で供給される方法であった。以下は、包装された全プラーク形成単位（ＰＦＵ）の指示された数を有して調製されたノミｃＤＮＡライブラリーの表である：（ａ）ライブラリーＣ（約２．５×１０⁶ＰＦＵ）及びライブラリーＨ（約１．３×１０⁶ＰＦＵ）に対応する二つの全給餌ノミｃＤＮＡ発現ライブラリー；（ｂ）全ノミ非給餌ｃＤＮＡ発現ライブラリー（約１．３×１０⁶ＰＦＵ）；（ｃ）給餌及び非給餌ノミから集められた約６，０００の唾液腺から調製されたノミ唾液腺ｃＤＮＡ発現ライブラリー（約１．５×１０⁶ＰＦＵ）；及び（ｄ）約５，０００の単離された中腸から調製されたノミ中腸ｃＤＮＡ発現ライブラリー（約２．３×１０⁶）。
Ｂ．ｆｓｐＨをコードする核酸分子の単離
ノミ唾液タンパク質fspHの一部をコードする核酸分子は、実施例６Ａに記載されたノミ唾液腺ｃＤＮＡ発現ライブラリーを用いて同定された。
縮重合成オリゴヌクレオチドプライマーは、fspHのために演繹されたアミノ酸（実施例４参照）から設計された。SEQ ID NO:2の約３８〜５１の残基に広がるfspHの領域に相当する３個の合成オリゴヌクレオチドが、合成された：プライマー１、SEQ ID NO:2の約３８〜約４４のアミノ酸残基に相当する「センス」プライマーは、核酸配列５’ＡＡＴ（Ｃ）ＡＡＴ（Ｃ）ＡＡＴ（Ｃ）ＡＡＴ（Ｃ）ＣＣＴ（ＧＡＣ）ＴＧＴ（Ｃ）ＣＡ３’を有し、SEQ ID NO:15と表示される。プライマー２、SEQ ID NO:2の約４６〜約５１のアミノ酸残基に相当する「アンチセンス」プライマーは、核酸配列５’ＣＡＣ（Ｔ）ＴＣＣ（ＴＡＧ）ＣＴ（Ｇ）ＣＡＴＧ（Ａ）ＣＡＧ（Ａ）ＡＡ３’を有し、SEQ ID NO:16と表示される。プライマー３、SEQ ID NO:2の約４３〜約４８のアミノ酸残基に相当する「センス」プライマーは、核酸配列５’ＴＧＴ（Ｃ）ＣＡＴ（Ｃ）Ｔ（Ｃ）ＴＧ（ＡＴＣ）ＴＴＴ（Ｃ）ＴＧＣ（Ｔ）ＡＴＧ−３’に相当し、SEQ ID NO：１７と表示される。４番目のプライマー、プライマー４（ｆｓｐＨのカルボキシル領域、すなわちSEQ ID NO：２の約６９〜７６のアミノ残基に広がる領域に相当する）が、合成された。プライマー４、アンチセンスプライマーは、核酸配列５’ＧＧＡ（ＣＧＡ）ＧＣＴ（Ｃ）ＴＣＡ（Ｇ）ＣＡＡ（Ｇ）ＴＡＡ（Ｇ）ＣＡＡ（Ｇ）ＴＧＴ（Ｃ）ＴＴ’３’を有し、SEQ ID NO:18と表示される。
ノミ唾液腺ライブラリーからの断片のＰＣＲ増幅は、標準手法を用いて行われた。ＰＣＲ増幅生成物は、プライマー１及びSEQ ID NO:19と表示されたＭ１３前進ユニバーサル標準プライマー５’ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３’の組み合わせを用いて生成された。得られたＰＣＲ増幅生成物は、プライマー３とプライマー４を用いて組み合わせたＰＣＲ増幅に用いられた。得られたＰＣＲ増幅生成物、nfspH₁₀₁と表された１０１個のヌクレオチド断片は、InVitrogen, Corp., TA（登録商標）クローニングベクターへクローン化（InVitrogen, Corp.により供給された手法）し、標準手法を用いるＤＮＡ配列分析に付された。得られた核酸配列は、SEQ ID NO：２０として示された：
ＴＴＧＴＣＡＣＴＴＴＴＴＴＴＧＴＡＴＧＡＧＡＧＡＡＴＧＣＡＧＧＴＣＡＧＧＡＡＡＣＧＧＣＧＧＴＴＧＣＧＧＡＡＡＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡＣＡＡＧＡＣＣＴＧＡＴＴＣＧＡＡＧＣＡＣＴＧＣＴＡＴＧＣ
（プライマー誘導配列は、下線部分である）
内部の非プライマー誘導された配列の６０個のヌクレオチドは、fspHの２０個のアミノ酸、SEQ ID NO:2の番号として約４８〜約６８に相当する領域をコードする。
標準手法を用いて、核酸分子nfspH₁₀₁は、完全長、又は大きな部分のfspHタンパク質に相当するタンパク質をコードする核酸分子を単離するためのプローブとして用いることができる。
ｃ．fspIをコードする核酸分子の単離
実施例４に開示されたfspH（SEQ ID NO:6）のアミノ酸配列は、縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲ増幅プライマー合成の組として用いられた。縮重プライマー５、SEQ ID NO:6の約１〜約８の残基に相当するセンスプライマーは、核酸配列５’ＧＡＡ（Ｇ）ＧＡＴ（Ｃ）ＡＴＴ（ＣＡ）ＴＧＧＡＡＡ（Ｇ）ＧＴＴ（ＣＡＧ）ＡＡＴ（Ｃ）ＡＡ３’を有し、SEQ ID NO:21と表示される。縮重プライマー６、SEQ ID NO:6の約１１〜約１８の残基に相当するセンスプライマーは、核酸配列５’ＡＣＴ（ＣＧＡ）ＴＣＴ（ＣＧＡ）ＧＧＴ（ＣＧＡ）ＧＧＴ（ＣＧＡ）ＡＡＡ（Ｇ）ＡＡＴ（Ｃ）ＣＡＡ（Ｇ）ＧＡ３’を有し、SEQ ID NO:22と表示される。
プライマー５及び６は、ＰＣＲ増幅生成物を生成させるために、ベクタープライマーＢＳＫＸ（５’ＴＴＧＧＧＴＡＣＣＧＧＧＣＣＣＣＣＣＣＴ３’、SEQ ID NO:23）及びSEQ ID NO:19と表示されているＭ１３プライマーとの組み合わせで用いられた。
ＰＣＲ生成物は、InVitrogen TA（登録商標）ベクターにクローン化され、ＤＮＡ配列分析に付された。分析され、nfspI₅₇₃と名づけられた一個のクローン化生成物は、fspIのために決定された部分アミノ酸配列に、少なくとも部分的に相当する５７３−ヌクレオチドを含んでいた。nfspI₅₇₃のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:24として表される。SEQ ID NO:24の翻訳は、SEQ ID NO:25と表示される、以下の最長の読みとり枠を与える。
fspI（SEQ ID NO:6）の部分Ｎ末端配列と、核酸配列SEQ ID NO:24から演繹されたタンパク質配列SEQ ID NO:25を組み合わせて、fspIのための見かけの完全長アミノ酸配列を得ることができる。
実施例７
この実施例は、ノミ唾液タンパク質fspH及びfspIの最少部分をコードする核酸配列の単離を記載している。
Ａ．fspHをコードする核酸分子の増幅
実施例６Ｂのカルボキシル末端ＰＣＲ生成物（SEQ ID NO:20）から決定されたＤＮＡ配列は、２個の非縮重合成相同体プライマーを合成するために用いられた：プライマー７は、５’ＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＴＴＣＴＣＴＣＡＴＡＣ３’を有し、SEQ ID NO:38と表示され、プライマー８は、５’ＡＧＧＴＣＴＴＧＴＣＣＴＴＣＣＴＣＣＧＴＴＴＣＣＧＣＡ３’を有し、SEQ ID NO:39と表示された。プライマー８は、SEQ ID NO:40と表示されたＭ１３逆プライマー５’ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ３’との組み合わせで、標準技術を用いて実施例６Ａにおいて上述した唾液腺ｃＤＮＡ発現ライブラリーの分画からのfspH遺伝子の５’末端部分を増幅するために用いられる。得られたＰＣＲ生成物は、ゲル上で明瞭に見られないけれども、［³²Ｐ］−放射性標識化プローブとしてプライマー７を用いてサザンハイブリダイゼーションにより単一生成物として同定された。明瞭に見うるエチジウムブロミド染色ＰＣＲ生成物が、プライマー７及びSEQ ID NO:41と表示されたベクターＴ３プライマー、５’ ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧ３’を利用する組み合わせＰＣＲ反応を行うことにより得られた。約４００−bp生成物は、１％アガロースゲル上で明瞭に見ることができ、［³²Ｐ］標識縮重プライマー１（SEQ ID NO:15）とハイブリダイゼーション陽性であった。
fspH₂₄₂と名づけられた、fspHの４００−bp生成物の、部分的な、２４２−bp、ヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:32として表される。SEQ ID NO:32の翻訳は、SEQ ID NO:33と表示されるfspH₈₀と名づけられたアミノ酸配列を与える。
Ｂ．fspIをコードする核酸分子の増幅
二個の別のプライマーが、実施例６Ａに記載されたようにして調製されたノミ唾液腺ライブラリーからのfspIタンパク質ｃＤＮＡ配列を単離するために製造された。単離方法は、ノミ唾液腺ライブラリーのＰＣＲ反復及びＰＣＲ生成の生成物に対するプローブハイブリダイゼーションを用いた。ノミ唾液腺ライブラリー（ミニライブラリー）のフラクションでＰＣＲの反復は、最終プラークの取り上げ及び［³²Ｐ］標識プローブとハイブリダイゼーションによる同定の前に、２００プラーク形成単位（ＰＦＵ）においてほぼ１に、クローン化されたfspIタンパク質ｃＤＮＡの発生頻度をせばめた。
SEQ ID NO:24に基づく２個のプライマーが、用いられた：プライマー９は、５’ＧＣＡＡＡＧＧＴＴＡＴＡＧＡＧＧＡＧＣＴＴＧ３’を有し、SEQ ID NO:42と表示され、そしてプライマー１０は、５’ＡＧＣＴＴＴＣＣＡＴＣＡＣＡＴＣＣＡＧＣ３’を有し、SEQ ID NO:43と表示された。このプライマーは、唾液腺ミニライブラリーをスクリーニングするためのマーカー配列として用いられる２６８bp（プライマーを含む）の内部ＰＣＲのＤＮＡ配列を生成した。唾液腺ミニライブラリーの最終スクリーニングは、標準方法を用いて４個の［³²Ｐ］標識プライマー；プライマー５、SEQ ID NO:21、プライマー６、SEQ ID NO:22、プライマー８、SEQ ID NO:42及びプライマー１０、SEQ ID NO:43、のプールで行われた。この技術で同定された、nfspI₅₉₁と名づけられた核酸分子は、標準方法を用いて配列化され、SEQ ID NO:34を得た。得られたSEQ ID NO:34の翻訳は、nfspI₁₅₅と名づけられたタンパク質のためのSEQ ID NO:35と表示されるアミノ酸配列を与えた。このアミノ酸配列は、SEQ ID NO:35がアミノ末端にアミノ酸配列ＥＤＩを含まないことを除いて、SEQ ID NO:26と類似であり、そしてSEQ ID NO:35は位置７に「Ｃ」含むが、一方SEQ ID NO:26は、相当する位置に「Ｌ」を含む。
実施例８
この実施例は、ノミアレルギーに敏感な動物でのノミアレルギー皮膚炎を誘導する本発明の処方物の活性を示している。
実施例２及び３に記載された単離されたノミ唾液タンパク質が、ノミアレルギーに感受性の動物でのノミアレルギー皮膚炎を誘導しうるかどうかを決定するために、皮膚試験が、感受性にされたイヌで行われた。６頭のイヌが、Gross, et al., 1985, Veterinary Pathology, Vol. 22, pp. 78-71の方法を用いて、ノミに感受性にさせられた。要約すると、イヌは各々、複数のチャンバーに入れられた約２５のC. filesノミに曝露され、チャンバー内のノミに対して１週間間隔で約１５分間実験イヌ上で摂餌を行った。この６頭のイヌは、以下の期間に感受性にさせられた：イヌ２０８０１０９は、１９９３年８月３１日から１９９４年６月７日まで３８回ノミに曝された。イヌ２０８２１０１は、１９９３年１２月１４日から１９９４年６月７日まで２２回ノミに曝された。イヌ２０８２１２８は、１９９３年８月３１日から１９９４年５月２４日まで２０回ノミに曝された。イヌＢＦＱ２は、１９９４年３月１５日から１９９４年７月１２日まで１７回ノミに曝された。イヌＣＰＯ２は、３月１５日から１９９４年６月７日まで１２回ノミに曝された。イヌＣＱＱ２は、１９９４年３月１５日に１回ノミに曝された。
皮膚試験は、１９９４年７月２１日の朝に行われた。これらのイヌは、外側の胸郭／腹部領域で剃られ、その領域に本発明の種々な処方物及び対照溶液を皮内的に注射された。注射当たりの全容量は、フェノール化塩溶液中で希釈された処方物及び対照の５０マイクロリットル（μl）であった。それぞれのイヌは、表１に示された注射を受けた。

これらの研究において、fspJ1及びfspJ2は、fspJとして一緒に投与された；fspL1及びfspL2は、fspLとして一緒に投与された；fspN1、fspN2及びfspN3は、fspNとして一緒に投与されたことに留意すること。Ａ、Ｂ、Ｃ１、Ｃ２、Ｄ１、Ｄ２、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ１、Ｍ２及びＮは、それぞれノミ唾液タンパク質fspA、fspB、fspC1、fspC2、fspD1、fspD2、fspE、fspF、fspG、fspH、fspI、fspJ、fspK、fspL、fSpM1、fspM2及びfspNとして示されていることに留意すべきである。この陰性の対照は希釈剤（ＮＣ）を含み、陽性の対照はGreer抗原（ＧＲ）及びヒスタミン（ＨＩＳ）を含む。用いられたGreer抗原の量は、製造者（Greer Laboratories, Inc., Lenoir, NC）により与えられた情報に従い、重量／容量（ｗ／ｖ）で決定した。用いられたヒスタミンの量は、供給者のラベル（Greer Laboratories, Inc., Lenoir, NCから入手しうる）により与えられた情報により決定した。
Ａ．注射位置での虫刺傷跡寸法の比較
すべての注射部位は、客観的（ｏｂｊ）に１５分でミリメーター（mm）で測定され、０〜４の尺度で主観的（ｓｕｂｊ）に評価された。主観的評価は、Ohio State University, Columbus,OHでのKenneth W. Kwochka, D.V.M., Diplomat ACVD, （American College of Veterinary Dermatologists）により実施された。表２〜７は、それぞれのイヌで得られた結果を示している。＃は、それぞれの試料に与えられた指示の数を示している；抗原は、試料を示している。Inj1、Inj2及びInj3は、３回の注射を示し、ＮＡは、「適用せず」を示す。

対照として、ノミに慣れていない２頭のイヌ（すなわち、ノミに曝されていないイヌ）が、感受性にされたイヌに注射された同じ試料の単回の反復物で試験された。これらのイヌは、ＷＡＮＵ及びＷＢＣＥとして示されされている。注射後１５分での客観的及主観的虫刺傷跡寸法測定を、表８及び９に示す。

試験された６頭の感受性イヌからのそれぞれのノミ唾液抗原に対して得られた平均的な主観的評価が、計算され、図５に要約されている。この結果は、実施例２及び３に記載されたように製造されたノミ唾液産生物は、感受性イヌでの即時過敏応答を誘導することのできる少なくとも１個のアレルギー性タンパク質を含む。特に、ＦＳ−１及びＦＳ−２に対応するノミ唾液抗原の混合物の注射は、実質的な虫刺傷形成をもたらした。ノミ唾液タンパク質fspE、fspF、fspG、fspH、fspI、fspJ、fspK、fspL、fspM1、fspM2及びfspNは、また実質的な虫刺傷形成をもたらした。ノミ唾液タンパク質fspA、fspB、fspC1、fspC2、fspD1及びfspD2は、試験したイヌに依存して、もしあったとしても、最小のアレルギー応答を示した。fspHを含む試料は、他のノミ唾液タンパク質と比較した場合、最大の虫刺傷形成をもたらした。
＊Ｂ．注射位置での硬化及び紅斑の程度の比較
虫刺傷寸法に加えて、硬化及び紅斑の量についても、それぞれの注射部位で測定した。ノミ唾液抗原の注射により生成した硬化は、６時間及び２４時間で主観的評価により測定された。そのような主観的硬化測定は、Kenneth W. Kwochka, D.V.M.により実施された。更に、それぞれの注射部位での紅斑の量は、Kenneth W. Kwochka, D.V.M.により主観的に評価された。
６時間での主観的評価により測定された硬化及び紅斑の量は、以下の感受性イヌでの以下の処方を除いて、感受性イヌ及び対照のイヌのそれぞれで陰性であった。イヌ２０８２１０１へのＦＳ−１の投与は、２か所の注射部位での１の平均硬化評価を与えたが、紅斑を与えなかった。イヌ２０８２１０１へのfspLの投与は、硬化を与えなかったが、１か所の注射部位で１の紅斑評価を与えた。イヌ２０８２１０１へのfspM1の投与は、硬化を与えなかったが、１か所の注射部位で３の紅斑評価を与えた。イヌ２０８２１０１へのＦＳ−２の投与は、硬化を与えなかったが、３か所の注射部位で１．３３の紅斑評価を与えた。イヌ２０８２１２８へのfspHの投与は、硬化を与えなかったが、３か所の注射部位で平均２の紅斑評価を与えた。イヌ２０８２１２８へのfspIの投与は、２か所の注射部位で平均１の硬化評価を与え、平均１の紅斑評価を与えた。イヌ２０８２１２８へのfspJの投与は、３か所の注射部位で平均１の硬化評価を与え、平均１の紅斑評価を与えた。イヌ２０８２１２８へのＦＳ−２の投与は、硬化を与えなかったが、３か所の注射部位で平均２の紅斑評価を与えた。
イヌＢＦＱ２へのＦＳ−１の投与は、３か所の注射部位で、平均２の硬化評価及び平均２の紅斑評価を与えた。イヌＢＦＱ２へのfspNの投与は、２か所の注射部位で、平均１の硬化評価及び平均２の紅斑評価を与えた。イヌＢＦＱ２へのＦＳ−２の投与は、２か所の注射部位で、平均１の硬化評価及び平均２の紅斑評価を与えた。
イヌＣＰ０２へのＦＳ−１の投与は、２か所の注射部位で、平均２．５の硬化評価を与えたが、紅斑は与えなかった。イヌＣＰＯ２へのfspGの投与は、硬化を与えなかったが、３か所の注射部位で平均２の紅斑評価を与えた。イヌＣＰＯ２へのfspHの投与は、硬化を与えなかったが、２か所の注射部位で１の紅斑評価を与えた。イヌＣＰＯ２へのＦＳ−２の投与は、硬化を与えなかったが、３か所の注射部位で２の紅斑評価を与えた。
試験された６頭の感受性イヌからのそれぞれのノミ唾液抗原で得られた硬化の主観的な平均評価が、計算され、図６に要約されている。試験された６頭の感受性イヌからのそれぞれのノミ唾液抗原で得られた紅斑の主観的な平均評価が、計算され、図７に要約されている。
ノミに感受性の５頭のイヌ及び２頭の対照のイヌでの２４時間の結果の主観的評価により測定された硬化及び紅斑の量は、以下の感受性イヌでの以下の処方を除いて、陰性であった。
イヌ２０８２１０１へのfspIの投与は、３か所の注射部位で、１の硬化評価及び平均１の紅斑評価を与えた。イヌ２０８２１０１へのfspJの投与は、３か所の注射部位で、平均１の硬化評価及び平均１の紅斑評価を与えた。イヌ２０８２１０１へのfspM1の投与は、３か所の注射部位で、平均１の硬化評価及び平均３の紅斑評価を与えた。イヌ２０８２１０１へのfspNの投与は、３か所の注射部位で、平均１の硬化評価及び平均２の紅斑評価を与えた。イヌ２０８２１０１へのＦＳ−２の投与は、３か所の注射部位で、平均３の硬化評価及び平均４の紅斑評価を与えた。
イヌＢＦＱ２へのＦＳ−１の投与は、３か所の注射部位で、平均１の硬化評価及び平均１の紅斑評価を与えた。イヌＢＦＱ２へのＦＳ−２の投与は、１か所の注射部位で、１の硬化評価及び１の紅斑評価を与えた。
イヌＣＰＯ２へのＦＳ−１の投与は、１か所の注射部位で、２の硬化評価及び１の紅斑評価を与えた。イヌＣＰＯ２へのfspIの投与は、３か所の注射部位で、平均１の硬化評価及び平均１の紅斑評価を与えた。イヌＣＰＯ２へのＦＳ−２の投与は、３か所の注射部位で、平均１の硬化評価及び平均２の紅斑評価を与えた。
イヌＣＱＱ２へのGreer抗原の投与は、硬化を与えなかったが、３か所の注射部位で、平均１の紅斑評価を与えた。イヌＣＱＱ２へのＦＳ−１の投与は、１か所の注射部位で、１の硬化評価及び１の紅斑評価を与えた。イヌＣＱＱ２へのfspI、fspJ、fspM1又はfspM2の投与は、硬化を与えなかったが、３か所の注射部位で、平均１の紅斑評価を与えた。イヌＣＱＱ２へのfspNの投与は、１か所の注射部位で、１の硬化評価及び１の紅斑評価を与えた。イヌＣＱＱ２へのＦＳ−２の投与は、３か所の注射部位で、平均１の硬化評価及び平均２の紅斑評価を与えた。
試験された６頭の感受性イヌからのそれぞれのノミ唾液抗原で得られた硬化の主観的な平均評価が、計算され、図８に要約されている。試験された６頭の感受性イヌからのそれぞれのノミ唾液抗原で得られた紅斑の主観的な平均評価が、計算され、図９に要約されている。
この結果は、実施例２及び３に記載のようにして調製したノミ唾液タンパク質処方物の少なくともいくつかは、感受性イヌでの遅延過敏応答を誘導することができる少なくとも１個のアレルギー性タンパク質を含むことを示している。ＦＳ−１及びＦＳ−２に対応するノミ唾液タンパク質の混合物の注射は、少なくとも２４時間で実質的な硬化と紅斑を誘導した。更に、ノミ唾液タンパク質試料fspI、fspJ、M1及びfspNは、少なくとも２４時間で硬化と紅斑を誘導するに十分にアレルギー性であった。ノミ唾液タンパク質試料fspL及びfspM2は、２４時間で実質的なレベルの硬化を誘導したが、紅斑のレベルは十分ではなかった。
上記及び図５〜９に示された両方の結果は、本発明のノミ唾液タンパク質処方物は、感受性イヌでの過敏応答を誘導するに十分にアレルギー性であること示した。多くの試料が、即時過敏応答及び遅延過敏応答の両方を誘導した。
実施例９
この実施例は、実施例８に記載されたイヌでの選択された病変から取り出された組織の組織病理学により、実施例２及び３で単離された多くのノミ唾液タンパク質の過敏応答誘導能力を示している。
イヌ１頭当たり二つの組織試料が、実施例８に記載したそれぞれの感受性イヌから取り出された。ノミに曝されていないイヌは、生体組織検査法は実施されなかった。組織試料が取り出された選択部位は、下記表１０に示されている。生体組織検査は、リドカインの皮下注射の後４mm生体組織検査打ち抜き（punch）で行われた。生体組織検査は、Dr .David M. Getzy, DVM, Diplomat ACVP（American College of Veterinary Pathologists）at the Colorado Veterinary Diagnostic Laboratory（College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Colorado State University, Fort Collons,Co）により行われ、かつ理解されている。

病変の二つのタイプが、試験した組織試料に見い出された。病変タイプＡは、表面皮膚の脈管周囲方向の中程度の数の肥満細胞を有する穏和な表面皮膚浮腫を示す。脈管内皮は、穏和な反応性肥大を示した。好中球の最小数は、同様にこの領域で注目されていた。病変タイプＣは、好酸球が重篤度を緩和するに穏やかであることを除いて、病変タイプＡで記載されたそれらに類似である病変を示しているが、好中球及び肥満細胞は重篤度において穏和である。
０〜５の尺度で、病変は等級１から重篤の等級４の範囲である。標本のいくつかは、主として肥満細胞性炎症、脈管周囲浸潤、浮腫及び最小数の他の細胞性成分を有していた。他の部分は、肥満細胞及び好中球が少ない好酸球性炎症性浸潤を示した。しかしながら、これらの病変の重篤度は、いくつかの領域で変化しうるものであり、それは表皮内の好酸性膿胞形成及び表面皮膚のコラーゲン生理的組織変性を進行させた。
この組織試料は、表面の周囲脈管／周囲付属器官、肥満細胞及び好酸性、皮下皮膚炎の存在を示した。試験されたすべてのスライド標本での病変は、常にアレルギータイプＩの過敏反応を有していた。
実施例１０
この実施例は、イヌで実施された皮膚試験によりノミアレルギー応答を皮膚炎に本来感受性である動物にアレルギーを誘導するための、実施例２及び３に記載されたタンパク質の能力を示している。これらの反応は、ノミアレルギー皮膚炎の診断のための現在の標準、Greer Whole Flea Extract（Greer Laboratories, Inc., Lenoir, NC）を用いて得られた反応に比較された。更に、反応の特異性を決めるために、試験結果は、正常な皮膚を有する対照イヌの母集団及びノミアレルギー皮膚炎以外のかゆみ性皮膚疾患のイヌの母集団から得られた結果と比較された。
３群のイヌが、この研究に用いられた：（１）臨床的徴候、診断時点でノミの存在及びGreer Whole Flea Extractへの陽性の即時又は遅延反応により決定された本来的にノミアレルギー皮膚炎の１０頭のイヌ；（２）限定されないが、アトピー、食品アレルギー皮膚炎、膿皮症、脂漏症及び他の寄生虫過敏反応を含む非ノミ関連かゆみ性皮膚炎の１０頭のイヌ；及び（３）正常皮膚かつ慢性皮膚疾患の病歴をもたない１０頭のイヌ。これらのイヌは、あらゆる種、年齢又は性のイヌであった。これらは、Ohio state University Veterinary Teaching Hospital, Columbus, Ohioの病院の母集団から集められた。全てのイヌは、この研究に参加するためにオーナーの同意書を持っていた。
全ての試験及び主観的評価は、Kenneth W. Kwochka, D.V.M., Diplomat ACVD, （American College of Veterinary Dermatologists), in the Dermatology Examination Room at the Veterinary Teaching Hospital, College of Veterinary Medicine, The Ohio State University, Columbus, Ohioにより行われた。試験された全てのイヌは、左側の胸部の前側腹部で試験された。イヌは、皮膚試験の前に静脈内的に直接に投与された標準用量のキシラジンとアトロピンを用いて試験のために沈静化された。グルココルチコイド、抗ヒスタミン、又は他の非ステロイドの抗炎症薬剤は、試験前少なくとも３週間用いられなかった。試験領域は、＃４０電気バリカンの刃で穏やかに刈られ、注射部位は消えない黒のフェルトマーカーペンでしるしをつけた。２２の部位にしるしをつけた。２列の１０個の点及び１列の２点。皮内注射は、それぞれのしるしの上と下の両方で全部で４４の部位に以下の順序で行われた：
列１：陰性対照−ヒスタミン−Greer−Greer−ノミ唾液−ノミ唾液−Ａ−Ａ−Ｂ−Ｂ
列２：Ｃ１−Ｃ１−Ｃ２−Ｃ２−Ｄ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ２−Ｅ−Ｅ
列３：Ｆ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｈ−Ｈ−Ｉ−Ｉ−Ｊ−Ｊ−
列４：Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｍ１−Ｍ１−Ｍ２−Ｍ２−Ｎ−Ｎ
列５：ＦＳ−２−ＦＳ−２
列６：陰性対照−ヒスタミン
それぞれの部位は、滅菌希釈剤（Neg.cont.）、１／１００，０００、W/Vヒスタミンホスファート（ヒスタミン）。Greer全ノミ抽出物（Whole Flea Extract）（Greer）、全ノミ唾液（ノミ唾液）、又は個々の唾液タンパク質フラクション（fspA、（A）；fspB、（B）；fspC1、（C1）；fspC2、（C2）；fspD1、（D1）；fspD2、（D2）；fspE、（E）；fspF、（F）；fspG、（G）；fspH、（H）；fspI、（I）；fspJ、（J）；fspK、（K）；fspL、（L）；fspM1、（M1）；fspM2、（M2）；fspN、（N）及びFS-2（FS2）の５０μlで皮内的に注射された。すべての注射は、Neg.cont．と同じ滅菌希釈剤で希釈された。
皮膚反応は、注射後１５分及び２４時間に、主観的及び客観的に観察された。オーナーは、２４時間観察のためにVeterinary Teachig Hospitalへかれらのイヌを返すことを求められた。主観的評価は、虫刺傷寸法に基づいて０、１＋、２＋、３＋及び４＋の尺度で評価された。客観的評価は、ミリメーターで測定された虫刺傷径に基づくものであった。
皮膚反応の比較
Ａ．ＦＡＤイヌ：
Greerに陽性である１０頭のイヌのうち、７頭（７０％）は、ノミ唾液（ＦＳ）に陽性であった。ＦＳに陰性であった３頭のイヌは、すべて唾液タンパク質に反応しなかった。更に、１５分でＦＳに陰性の３頭のイヌは、２４時間ではすべてのものに陰性であった。ＦＳに陽性の７頭のイヌが用いられ、５分の反応を要約したものが、下記の表１１に示されている。

即時反応の重篤度が抗炎症の治療を必要としたので、ＦＳ陽性の７頭のイヌのうち４頭が、２４時間で評価されることができなかった。ＦＳ陽性の残りの３頭は、２４時間での要約に用いられ、下記の表１２に示されている。

Ｂ．正常なイヌ
３頭のイヌが、皮膚試験抗原への即時反応をある程度有していた。２４時間の遅延反応に陽性であるイヌはいなかった。即時（１５分）の主観的結果の要約は、下記の表１３に示されている。

それぞれのイヌのコメント：
イヌ＃１：Greer ３＋、ＦＳ３＋、Ｎ２＋、ＦＳ２４＋
イヌ＃２：Greer ３＋
イヌ＃３：ＦＳ３＋
Ｃ．非ＦＡＤかゆみ症のイヌ
６頭のイヌが、皮膚試験抗原への即時反応をある程度有していた。即時（１５分）の主観的結果の要約は、下記の表１４に示されている。

それぞれのイヌのコメント：
イヌ＃１：ＦＳ２＋、Ｍ１３＋、Ｍ２３＋、Ｎ３＋、ＦＳ２３＋
長時間ノミに暴露されたアトピー性イヌ
イヌ＃２：ＦＳ４＋、Ｇ４＋、Ｍ１４＋、Ｍ２３４＋、Ｎ３＋
長時間ノミに暴露されたアトピー性イヌ
イヌ＃３：ＦＳ４＋、Ｍ２２＋
長時間ノミに暴露されたアトピー性イヌ
イヌ＃４：Ｎ３＋
長時間ノミに暴露されたアトピー性イヌ
イヌ＃５：Greer ４＋
慢性外耳炎
イヌ＃６：Greer ４＋
一般的なダニ（ダニ症）
イヌ＃１、＃２及び＃３はすべてその後クリニックへ返され、ＦＡＤであると診断され、Greerに陽性であった。
３頭のイヌが、皮膚試験抗原への即時反応をある程度有していた。遅延（２４時間）の主観的結果の要約は、下記の表１４に示されている。

それぞれのイヌのコメント：
イヌ＃３：Greer ２＋
長時間ノミに暴露されたアトピー性イヌ
イヌ＃４：Greer ２＋
長時間ノミに暴露されたアトピー性イヌ
イヌ＃６：Greer ３＋、ＦＳ３＋、ＦＳ３＋、Ｎ３＋、ＦＳ２３＋
一般的なダニ（ダニ症）
陽性の皮膚試験結果での最良のものに関連するノミ唾液のフラクションを決定するために、人工的に感受性にさせたイヌ及び臨床的に診断されたＦＡＤイヌ（これらは、ＦＳに対して２＋又はそれ以上である）（全部で１２頭；５頭が人工的に感受性にされ、７頭は臨床的にＦＡＤ陽性と診断された）の全てのデータは、試験抗原への応答に従い、表示された。即時（１５分）主観的結果は下記の表１６に、遅延（２４時間）主観的結果は、下記表１７に示されている。

これらの研究の結果は、ほとんどの実質的応答が、フラクションｆｓｐＧ、ｆｓｐＨ、ｆｓｐＭ１、ｆｓｐＭ２及びｆｓｐＮから得られることを示している。
実施例１１
以下の実施例は、バクテリア及び昆虫細胞中でのｆｓｐＩタンパク質の発現を示している。
Ａ．E.coli中でのノミタンパク質ｆｓｐＩの発現
ｆｓｐＩの５００ｂｐＤＮＡ断片は、核酸分子ｎｆｓｐ₅₉₁から、プライマー１１、核酸配列５’ＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＡＡＧＴＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＴＧＴＡＣ３’（下線部分は、BamHI部位である）を有するセンスプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅され、SEQ ID NO:36と表示され；プライマー１２、核酸配列５’ＴＡＡＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＴＴＴＴＧＧＴＣＧＡＣＡＡＴＡＡＣ３’を有するアンチセンスを用いて、ＰＣＲ増幅され、SEQ ID NO:37と表示された。ＰＣＲ生成物、約５３５ヌクレオチドの断片、ｎｆｓｐＩ₅₃₅と名付けられたものは、BamHI制限エンドヌクレアーゼで消化され、ゲル精製され、次いでBamHIで消化されＣＩＰ処理され組み換え分子ｐＨｉｓ−ｎｆｓｐＩ₅₃₅を生成させる発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＢ（InVitrogen Corp.から入手しうる）へサブクローン化された。
この組み換え分子は、組み換え細胞E.coliＨＢ：ｐＨｉｓ−ｎｆｓｐＩ₅₃₅及びE.coliＢＬ：ｐＨｉｓ−ｎｆｓｐＩ₅₃₅を形成するように、ＨＢ１０１（BRL, Gaithersburg, MDから入手しうる）及びＢＬ２１（Novagen, Madison, WIから入手しうる）成分細胞の両方へ形質転換された。この組み換え細胞は、０．１mg/mlアンピシリン及び０．１％グルコースを含む富化バクテリア成長培地中３２℃で培養された。細胞が、約０．４−０．５のＯＤ₆₀₀に達したとき、発現はイソプロピルＢ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）０．５mMの添加により誘導され、細胞は３２℃で２時間培養された。
融合タンパク質ＰＨＩＳ−ＰｆｓｐＩ₁₅₅を含む組み換え細胞溶解物の、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウエスタンイムノブロット分析は、Ｔ７Ｔａｇモノクロナール抗体（InVitrogenn Corp．から入手しうる）又はウサギ抗ＦＡＤ抗血清（＃Ａ３３８１）（実施例２に記載されたように製造されたノミ唾液を含むニトロセルロース膜でウサギを免疫することにより、Paravax, Inc. in Fort Collins, Co,により製造された）のどちらかを用いて、標準手法により達成された。抗原／抗体反応は、アルカリホスフォターゼ抱合抗マウス又は抗ウサギ抗体を用いて比色酵素反応により検出された。２８ｋＤタンパク質は、両方の第一の抗体と共に誘導された溶解物のイムノブロットで検出された。
Ｂ．昆虫細胞中でのノミ唾液タンパク質ｆｓｐＩの発現
核酸分子ｎｆｓｐＩ₄₇₅は、以下のプライマー（それは、バキュロウイルスベクターを用いて昆虫細胞中で容易に発現するように設計されている）を用いてｆｓｐＩ核酸分子からＰＣＲ増幅された：センスプライマー１３（下線部分はBamHI部位）は、５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＡＡＴＡＴＧＣＧＧＧＡＣＡＴＣＴＧＧＡＡＡＧＴＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＴＧＴＡＣＡＴＣ３’であり、SEQ ID NO:44と表示され；アンチセンスプライマー（下線部分はXbaI部位である）、５’ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＧＧＴＣＧＡＣＡＡＴＡＡＣＡＡＡＡＣ３’であり、SEQ ID NO:45と表示された。ＰＣＲ生成物は、BamHI及びXbaIで消化され、約４７５ｂｐＤＮＡ断片は、切り取られ、アガロースゲルから精製された。
核酸分子ｎｆｓｐＩ₄₇₅は、BamHI及びXbaIで消化されたｐＶＬ１３９３ベクター（InVitrogenn Corp．から入手しうる）に結合され、組み換え分子ｐＶＬ−ｎｆｓｐＩ₄₇₅を生成させた。
この組み換え分子は、組み換え細胞S.frugiperda：ｐＶＬ−ｎｆｓｐＩ₄₇₅を形成させるために、直線形にされたバキュロウイルスＤＮＡを有するS.frugiperda Ｓｆ９へ形質転換された。この組み換え細胞は、組み換えウイルスを製造するために、標準手法で培養された。このトランスフェクション上清は、ウエスタンブロット分析により、また２３ｋＤタンパク質（それは、ウサギ抗ＦＡＤ抗血清（＃Ａ３３８１）と反応する）を含むことが見い出された。
実施例１２：
この実施例は、ｆｓｐＮ中のノミ唾液タンパク質の少なくとも部分をコードする核酸配列の単離、及びヒトプロスタン酸（prostatic acid）ホスファターゼに関連する特性を記載している。
実施例６Ａに既に記載されたノミ唾液腺及び全摂餌ノミｃＤＮＡライブラリーは、ノミ唾液タンパク質の集められた混合物に対して開発された新しいニュージランド白ウサギ抗血清（例えば、このウサギは、１回以上ノミ唾液タンパク質を集めるための収集膜として用いられるニトロセルロースの粉砕物で１回以上免疫され、次いでデュロポアフィルターから溶離されたノミ唾液タンパク質抽出物で１回以上免疫されている）を用いて、イムノスクリーニングされた。用いられたこのイムノスクリーニングプロトコルは、ピコブルー（登録商標）イムノスクリーニングキットの指示マニュアル（Stratagene, Inc.から入手しうる）に記載されているものである。イムノスクリーニングのためのｃＤＮＡ発現ライブラリー、すなわちｃＤＮＡクローンの発現及びイムノスクリーニングのための膜へのラムダファージプラークを移行させるための方法は、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キットの指示マニュアル（Stratagene, Inc.,La Jolla, Calforniaから入手しうる）に記載されている。
４０の免疫陽性のクローンが、スクリーニングから選択された。一つの免疫陽性のクローンは、唾液腺ｃＤＮＡライブラリーから誘導され、他の３９の免疫陽性のクローンは、全給餌ノミｃＤＮＡライブラリーから誘導された。初めのｆｓｐＮタンパク質ｃＤＮＡ配列（ｎｆｓｐＮ（Ａ）及びｎｆｓｐＮ（Ｂ）と名づけられている）は、全給餌ノミｃＤＮＡライブラリーから単離され、その初めのイムノスクリーニングから来ている。
ｎｆｓｐＮ（Ａ）及びｎｆｓｐＮ（Ｂ）の部分核酸配列は、SEQ ID番号で表される。それぞれの配列は、ｃＤＮＡ遺伝子コード領域のカルボキシル末端のほぼ半分、及び及びポリ（Ａ）領域に至る３’非翻訳領域を表す。ｎｆｓｐＮ（Ａ）₆₄₆と名づけられているｎｆｓｐＮ（Ａ）核酸分子のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:50と表示されている。SEQ ID NO:50の翻訳は、SEQ ID NO:51と表示されるアミノ酸配列を有するＰｆｓｐＮ（Ａ）₁₇₂と名づけられたタンパク質を与える。ｎｆｓｐＮ（Ｂ）₆₁₂と名づけられているｎｆｓｐＮ（Ｂ）核酸分子のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:52と表示されている。SEQ ID NO:52の翻訳は、SEQ ID NO:53と表示されるアミノ酸配列を有するＰｆｓｐＮ（Ｂ）₁₅₃と名づけられたタンパク質を与える。
更に、ＰｆｓｐＮ（Ａ）₅₆と名づけられ、SEQ ID NO:54と表示される、ｎｆｓｐＮ（Ａ）の核酸配列から演繹された見かけのＮ末端アミノ酸配列が、決定された。ＰｆｓｐＮ（Ａ）₅₆（すなわち、（SEQ ID NO:54）のアミノ酸配列は、ｆｓｐＮ１（SEQ ID NO:11）、ｆｓｐＮ２（SEQ ID NO:12）及びｆｓｐＮ３（SEQ ID NO:13）のために得られたＮ末端アミノ酸配列と類似であるが、同一ではない。理論によって拘束されているわけではないが、ノミ唾液に見い出されているｆｓｐＮファミリー（それはアレルギー性変異又はノミゲノムでの多重遺伝子のためでありうる）が存在していると思われる。
核酸分子ｎｆｓｐＮ（Ａ）₆₄₆及びｎｆｓｐＮ（Ｂ）₆₁₂は、約７６％同一であり、翻訳生成物は、約６５％同一である。
実施例４に記載されたノミ唾液抽出物（すなわち、ｆｓｐＮタンパク質）のＨＰＬＣ分離物のピークＮのタンパク質で免疫されたウサギから集められた抗血清が、ノミ唾液腺ｃＤＮＡライブラリー（実施例６に記載のようにして調製された）をプローブするために用いられた第二のイムノスクリーニング試験において、約２０の陽性クローンが単離された。回収された核酸分子の一つの核酸配列は、ｎｆｓｐＮ（Ａ）の配列と同一であるように見える。他の核酸分子の少なくとも二つは、ノミ唾液のｆｓｐＮタンパク質のファミリーの可能性を再度支持して、ｎｆｓｐＮ（Ａ）のそれに類似であるが、同一ではない核酸配列を有する。更に、他の核酸分子は、ミオシン遺伝子配列に類似である核酸配列を持っているように見える。
ｆｓｐＮ（Ａ）及びｆｓｐＮ（Ｂ）核酸分子及びタンパク質の核酸及びアミノ酸配列は、それぞれ、既知の核酸及びアミノ酸配列に、Genbank homology searchを用いて比較された。両方の核酸配列は、ヒトのプロスタン酸ホスファターゼの核酸配列の相当する（すなわち、カルボキシル末端）領域に類似であることが見い出された。ヒトのアミノ酸配列の連続する類似点の最も高度に保存された領域は、ヒトの酵素のアミノ酸約２７２から約３３３に広がっている。ｎｆｓｐＮ（Ａ）とｎｆｓｐＮ（Ｂ）の核酸配列の相当する領域を有するヒト酵素の約２６８から約３３３のアミノ酸をコードする核酸配列の比較は、ヒトのプロスタン酸ホスファターゼ遺伝子の領域に、ｎｆｓｐＮ（Ａ）核酸は、約４０％同一であり、ｎｆｓｐＮ（Ｂ）は約４３％同一であることを示している。ヒトの酵素の約２６８から約３３３のアミノ酸に広がる領域とｐｆｓｐＮ（Ａ）とｐｆｓｐＮ（Ｂ）の相当する領域の比較は、ヒトのプロスタン酸ホスファターゼ遺伝子の領域に、ｎｆｓｐＮ（Ａ）核酸は、約２８％同一であり、ｎｆｓｐＮ（Ｂ）は約３０％同一であることを示している。少なくともいくつかのｆｓｐＮタンパク質が、活性酸ホスファターゼをコードする可能性は、ノミ唾液抽出物ＦＳ−３が実施例３に記載されたように活性酸ホスファターゼを有することが示されていることを見い出したことにより支持されている。
ｎｆｓｐＮ（Ａ）_1197'と本明細書で示されている核酸分子ｎｆｓｐＮ（Ａ）の見かけの完全な核酸配列は、SEQ ID NO:55として本明細書に表示されている。SEQ ID NO:55の翻訳は、ここでSEQ ID NO:56として本明細書に表示されたアミノ酸配列を有するｐｆｓｐＮ（Ａ）₃₉₈と名づけられている見かけの完全長のｆｓｐＮタンパク質を与える。（核酸配列SEQ ID NO:55及びアミノ酸SEQ ID NO:56は、相当する領域で核酸配列SEQ ID NO:50又はアミノ酸配列SEQ ID NO:51若しくはSEQ ID NO:54に正確に匹敵しないので、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51及びSEQ ID NO:54の配列エラーのために不適合がありそうであることに注意すべきである）。
SEQ ID NO:56と、ｆｓｐＮ１（SEQ ID NO:11）、ｆｓｐＮ２（SEQ ID NO:12）及びｆｓｐＮ３（SEQ ID NO:13）のために得られたＮ末端アミノ酸配列との比較は、ｆｓｐＮ１及びｆｓｐＮ２のアミノ末端アミノ酸が、SEQ ID NO:56の１８位のアミノ酸に相当するが、ｆｓｐＮ３のアミノ末端アミノ酸はSEQ ID NO:56の２０位のアミノ酸に相当することを示している。SEQ ID NO:13は、２０から３９までの位置に広がるアミノ酸のSEQ ID NO:56の領域に同一であるように見え、ｎｆｓｐＮ（Ａ）がｆｓｐＮ３をコードすることを示唆している。SEQ ID NO:11は、SEQ ID NO:56の相当する領域に約６７％同一であり、SEQ ID NO:12は、SEQ ID NO:56の相当する領域に（SEQ ID NO:12の３個の未知のアミノ酸を除いて）約６０％同一であり、ｆｓｐＮ１及びｆｓｐＮ２が、ｆｓｐＮ３として同じノミ唾液タンパク質ファミリーの一員であることの示唆を支持している。
SEQ ID NO:56と、ヒトのプロスタン酸ホスファターゼのアミノ酸配列との比較は、二つの配列がアミノ酸レベルで約３０％同一を共有していることを示している。
実施例１３
この実施例は、ｆｓｐＮタンパク質を含むバクテリア組み換え細胞及びｆｓｐＮタンパク質を製造するその細胞の用途を示している。
ｎｆｓｐＮ₁₀₀₀と名づけられた約１０００ｂｐＤＮＡ断片は、以下のプライマーを用いてｆｓｐＮタンパク質をコードする核酸分子からＰＣＲ増幅された：Ｆ７センス、核酸配列５’ＧＧＣＧＴＣＴＣＧＡＧＡＧＡＡＴＴＧＡＡＡＴＴＴＧＴＧＴＴＴＧＣＧ３’（XhoI部位は下線部分）、SEQ ID NO:46と表示されている、及びＦ７アンチセンス、核酸配列５’ＡＧＡＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＡＡＴＴＴＡＴＣＡＴＧＡＧＣＧＧ３’（EcoRI部位は下線部分）、SEQ ID NO:47と表示されている。ＰＣＲ生成物は、XhoI及びEcoRI制限エンドヌクレアーゼで消化され、ゲル精製され、XhoI及びEcoRIで消化され、組み換え分子ｐＨｉｓ−ｎｆｓｐＮ₁₀₀₀を形成する発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＢ（InVitrogen, Corpから入手しうる）へサブクローン化された。この組み換え体分子は、E.coliＢＬ２１能力細胞（Novagenから入手しうる）へ形質転換され、組み換え細胞E.coli：ｐＨｉｓ−ｎｆｓｐＮ₁₀₀₀を形成した。
組み換え細胞E.coli：ｐＨｉｓ−ｎｆｓｐＮ₁₀₀₀は、培養され、実施例１１Ａに記載されたように融合タンパク質ｐＨｉｓ−ＰｆｓｐＮ３を形成するように誘導された。この組み換え融合タンパク質は、実施例１１Ａに記載されたようにＴ７標識モノクロナール抗体を用いて、イムノブロット分析により検出された。ｐＨｉｓ−ＰｆｓｐＮ３はＮｉ−ＮＴＡスピンキット（Qiagenn, Chatsworth,CAから入手しうる）を用いて、Ｎｉ精製され、この精製は上記のようにＴ７標識モノクロナール抗体を用いて証明された。
実施例１４
この実施例は、昆虫細胞中でのｆｓｐＮタンパク質の発現を示している。
バキュロウイルスポリヘドリン転写制御配列に作動可能に連結しているｎｆｓｐＮ₁₀₀₀核酸分子を含む組み換え分子ｐＶＬ−ｎｆｓｐＮ₁₀₀₀は、以下の方法で製造された。ｎｆｓｐＮ₁₀₀₀と名づけられた約１０００ｂｐＤＮＡ断片が、以下のプライマーを用いてｆｓｐＮタンパク質をコードする核酸分子からＰＣＲ増幅された：センスプライマー１７、核酸配列５’ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧＴＡＴＡＡＡＴＡＴＧＴＧＧＣＧＴＣＴＡＣＴＧ３’（EcoRI部位は下線部分）を有し、SEQ ID NO:48と表示され、昆虫細胞中での発現を増強するように設計されている、及びアンチセンスプライマー１８、核酸配列５’ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＧＡＣＧＡＴＴＴＡＣＡＣＡＡＴＴＴＡＴＣ３’（EcoRI部位は下線部分）を有し、SEQ ID NO:49と表示されいる。ＰＣＲ生成物は、EcoRIで消化され、非方向的にバキュロウイルスシャトルベクターｐＶＬ１３９３（InVitrogen, Corpから入手しうる）へクローン化された。配向は、酵素EcoRVでの制限消化により決定された。得られた組み換え分子、すなわちｐＶＬ−ｎｆｓｐＮ₁₀₀₀は、組み換え体細胞S.frugiperda：ｐＶＬ−ｎｆｓｐＮ₁₀₀₀を製造するために、野生型線状バキュロウイルスＤＮＡ（ＡｃＭＮＰＶ）及びインセクチン（insectin）カチオン性リポソームで、製造者の仕様書（InVitrogen, Corpから入手しうる）に従い、S.frugiperda細胞（Colorado Bioprocessing Center, Fort Collins, Coにより提供された）へ同時トランスフェクションされた。この上清が、トランスフェクションの５日後にノミｆｓｐＮタンパク質（実施例１２に記載されている；Ｂ２２３７と表示される）に対するウサギ抗血清を用いるウエスタンブロット分析により試験され、約４０ｋＤのタンパク質が検出された。組み換えウイルス、ｖＢＶ−ｎｆｓｐＮ₁₀₀₀が、上清及び精製されたプラークから回収された。
実施例１５
この実施例は、ノミ又はノミ唾液に感受性にされたイヌの血清中の抗ノミ唾液ＩｇＥを検出するためのＥＬＩＳＡの用途を記載している。
Ａ．第一の研究において、人工的にノミ刺傷に感受性にされた３頭のイヌから集めた血清が、プールされ、そのプールされた血清を、この血清に存在している非ＩｇＥ免疫グロブリンを除くために、タンパク質Ｇに接触させて前処理された。ＩｇＥ抗体は、次いでCon-Aクロマトグラフィーを用いて前処理された血清からアフィニティー精製された。
このアフィニティー精製されたＩｇＥ抗体は、以下のノミ唾液産生物及びタンパク質に曝された：２mg/mlのＦＳ−１唾液抽出物（２３，３００ノミ時間／μl）；fspA、fspB、fspC1、fspC2、fspD1、fspD2、fspE、fspF、fspG、fspH、fspI、fspJ、fspK、fspL、fspM1、fspM2及びfspN（実施例３に記載されているように２３，３００ノミ時間／μlの試料をＨＰＬＣクロマトグラフィーに付した）。ノミ唾液産生物及びタンパク質は、０．１M炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６に懸濁し、それぞれの１００μl試料は、マイクロタイター皿のウエルに置かれた。この試料は、一晩室温で温置され、ＰＢＳ／ツウイーンで５回洗浄され、ＰＢＳ、２％ＢＳＡ、０．０２％ＮａＮ₃の溶液で１時間３７℃で保護し、ＰＢＳ／ツウイーンで５回洗浄された。この洗浄されたウエルは、それぞれアフィニティー精製されたイヌのＩｇＥ抗体の１００μlのアリコートに３７℃で１時間曝された。このウエルは、ＰＢＳ／ツウイーンで５回洗浄され、ＰＢＳ、２％ＢＳＡ、０．０５％トリトンＸ−１００中で１：０００に希釈されたモノクロナールマウス抗イヌＩｇＥ抗体調製物１００μlに３７℃で１時間曝された。このウエルは、ＰＢＳ／ツウイーンで５回洗浄され、１００μlのロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰに３７℃で１時間曝され、ＰＢＳ／ツウイーンで５回洗浄された。このウエルは、１００μlのＫＰＬＴＭＢ：Ｈ₂Ｏ₂、１：１で１０分間展開し、反応は、２．５N硫酸水素塩５０μlで停止された。このウエルは、４５０nmで測定された。
表１８及び図１０に示されたこの結果は、ＦＡＤ＋イヌは、それらの血清中に、ＦＳ−１ノミ唾液抽出物ならびにノミ唾液タンパク質、fspE、fspF、fspG、fspH、fspI、fspJ、fspK、fspL、fspM1、fspM2及びfspNに感受性であり、かつ特異的方法で反応するＩｇＥ抗体を持つことを示している。このＩｇＥ抗体調製物は、反応するならば、ノミ唾液タンパク質、fspA、fspB、fspC1、fspC2、fspD1及びfspD2と、最小量で反応した。したがって、このＩｇＥの反応性は、同じノミ唾液生成物及びタンパク質での人工的に感受性にさせたイヌでの実施例８の皮膚試験に正確に一致した。

Ｂ．第二の研究において、人工的にノミ刺傷に感受性にされたイヌから集められた血清は、この血清に存在している非ＩｇＥ免疫グロブリンの少なくともいくつかを除くために、タンパク質Ｇに接触させて前処理された。前処理された血清のＦＳ−１ノミ唾液抽出物への反応性は、実施例１５Ａに記載のようにして決定された。また、イヌ糸状虫に感染させたイヌから集められ、プールされ、タンパク質Ｇに接触させて前処理された血清の、ＦＳ−１ノミ唾液抽出物への反応性が試験された。表１９並びに図１１Ａ及び１１Ｂに示された結果は、ＦＡＤ＋イヌからのＩｇＥの反応性は用量依存性であるが、イヌ糸状虫に感染させたイヌからのＩｇＥは、ＦＳ−１ノミ唾液抽出物に対して反応性を持たないことを示している。

実施例１６
この実施例は、ノミ唾液抽出物ＦＳ−１、E.coli産生ｆｓｐＨ、E.coli産生ｆｓｐＮ３又は昆虫細胞S.frugiperda産生ｆｓｐＮ３を含む処方物を含む、本発明の処方物の、ノミアレルギー皮膚炎に感受性動物を同定する能力（すなわち、ノミアレルギー皮膚炎感受性動物へ、ノミアレルギー皮膚炎を誘導すること）を記載している。
処方物は、以下のようにして製造された。ＦＳ−１は、実施例２に記載されたようにして製造された。E.coli産生ｆｓｐＨは、発現ベクターλＰ_R／Ｔ² ｏｒｉ／Ｓ１０ＨＩＳ−ＲＳＥＴ−Ａ９に作動可能に連結されているｆｓｐＨをコードする核酸分子で形質転換されたE.coli細胞により産生され、その産生は、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０２９４１の実施例７に記載されている；得られたＰＨＩＳ−ｆｓｐＨ融合タンパク質は、実施例１３に記載のように精製された。E.coli産生ｆｓｐＮ３及びS.frugiperda産生ｆｓｐＮ３は、それぞれ実施例１３及び１４に記載のようにして産生され；E.coli産生ｆｓｐＮ３は実施例１１Ａに記載のように精製され；S.Frugiperda産生ｆｓｐＮ３は，アニオン／カチオン交換クロマトグラフィーにより精製された。
この処方物は、実施例８に記載したように、人工的に感受性にされたイヌ２０８０１０９、２０８２１０１、２０８２１２８、ＢＦＱ２、ＣＰＯ２、ＣＱＱ２で試験された。注射試料は、以下のようであった：（ａ）食塩水陰性対照；（ｂ）ヒスタミン陽性対照；（ｃ）２μg ＦＳ−１；（ｄ）０．１μg E.coli産生ｆｓｐＨ；（ｅ）１．０μg E.coli産生ｆｓｐＨ；（ｆ）０．２μg E.coli産生ｆｓｐＮ３；（ｇ）２．０μg E.coli産生ｆｓｐＮ３；（ｈ）０．２μg S.frugiperda産生ｆｓｐＮ３；（ｉ）２．０μg S.frugiperda産生ｆｓｐＮ３。この即時過敏性の結果は、表２０に示されており、遅延過敏結果は、表２１に示されている。評価は、実施例８に記載されたようであった；ＮＡは、悪い注射を示している。

要約すれば、これらの結果は、E.coli産生ｆｓｐＨは、すべてのイヌで強い陽性の即時反応を示し、その反応は、ノミ唾液に対するイヌの反応に比例していることを示している。E.Coli産生及びS.frugiperda産生ｆｓｐＮ３タンパク質は、またそれぞれ４頭及びすべてのイヌで陽性の即時反応を示した。ＦＳ−１に対して強い遅延過敏応答を示した２頭のイヌは、組み換えで産生されたｆｓｐＨ及びｆｓｐＮ３に対して類似の遅延過敏応答を示した。
［配列表］
下記の配列表を、３７ＣＦＲ第１．８２１項に準拠して提出する。コンピュータ可読形態での複写１通も、これとともに提出される。
出願人は、これとともに提出される配列番号１〜配列番号５４の冊子体の内容とコンピュータ可読形態での複写とは同一であることを３７ＣＦＲ第１．８２１項に準拠して言明する。
（１）全体的情報：
（ｉ）出願者：FRANK，GLENN R． HUNTER，SHIRLEY WU
WALLENFELS，LYNDA
（ii）発明の名称：新規な外部寄生生物唾液タンパク質及びそのようなタンパク質を収集する装置
（iii）配列の数：５６
（iv）連絡先：
（Ａ）名宛人：Sheridan Ross & McIntosh
（Ｂ）街路：1700 Lincoln Street, Suite 3500
（Ｃ）市：Denver
（Ｄ）州：コロラド
（Ｅ）国：米国
（Ｆ）ＺＩＰ：80203
（ｖ）コンピュータ可読形態：
（Ａ）媒体の型式：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭＰＣ互換型
（Ｃ）オペレーティングシステム：PC-DOS/MS-DOS
（Ｄ）ソフトウエア：PatentIn リリース＃１．０、バージョン＃１．２５
（vi）最新の出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（viii）弁理士／代理人の情報：
（Ａ）名称：Connell, Gary J.
（Ｂ）登録番号：32,020
（Ｃ）参照／書類番号：2618-17-C2
（ix）遠隔通信情報：
（Ａ）電話：（303）863-9700
（Ｂ）テレファックス：（303）863-0223
（２）配列番号１に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：22アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：Xaa=Tyr，Gln，SerまたはArg
（Ｂ）存在位置：１
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：Xaa=GlyまたはTyr
（Ｂ）存在位置：２
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：Xaa=LysまたはSer
（Ｂ）存在位置：３
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：Xaa=GlyまたはSer
（Ｂ）存在位置：９
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：Xaa=GlyまたはLys
（Ｂ）存在位置：10
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：Xaa=ArgまたはIle
（Ｂ）存在位置：14
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：Xaa=IleまたはLeu
（Ｂ）存在位置：17
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：Xaa=LysまたはAsp
（Ｂ）存在位置：19
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：Xaa=GlyまたはLeu
（Ｂ）存在位置：21
（xi）配列の記載：配列番号１：

（２）配列番号２に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：78アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：Xaa=HisまたはTyr
（Ｂ）存在位置：27
（xi）配列の記載：配列番号２：

（２）配列番号３に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：12アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号３：

（２）配列番号４に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：37アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号４：

（２）配列番号５に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：11アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号５：

（２）配列番号６に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：38アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号６：

（２）配列番号７に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：23アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号７：

（２）配列番号８に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：27アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号８：

（２）配列番号９に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：36アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号９：

（２）配列番号１０に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：21アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号１０：

（２）配列番号１１に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：12アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）
（xi）配列の記載：配列番号１１：

（２）配列番号１２に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：23アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号１２：

（２）配列番号１３に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号１３：

（２）配列番号１４に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：37アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：Xaa=HisまたはTyr
（Ｂ）存在位置：27
（xi）配列の記載：配列番号１４：

（２）配列番号１５に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（プライマー）
（xi）配列の記載：配列番号１５：

（２）配列番号１６に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：17塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（プライマー）
（xi）配列の記載：配列番号１６：

（２）配列番号１７に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（プライマー）
（xi）配列の記載：配列番号１７：

（２）配列番号１８に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：23塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（プライマー）
（xi）配列の記載：配列番号１８：

（２）配列番号１９に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：17塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（プライマー）
（xi）配列の記載：配列番号１９：

（２）配列番号２０に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：93塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号２０：

（２）配列番号２１に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：23塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（プライマー）
（xi）配列の記載：配列番号２１：

（２）配列番号２２に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：23塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（プライマー）
（xi）配列の記載：配列番号２２：

（２）配列番号２３に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（プライマー）
（xi）配列の記載：配列番号２３：

（２）配列番号２４に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：573塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号２４：

（２）配列番号２５に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：149アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号２５：

（２）配列番号２６に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：158アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号２６：

（２）配列番号２７に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：10アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：Xaa=SerまたはGln
（Ｂ）存在位置：１
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：Xaa=あらゆるアミノ酸
（Ｂ）存在位置：８
(ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：Xaa=GlyまたはLys
（Ｂ）存在位置：９
（xi）配列の記載：配列番号２７：

（２）配列番号２８に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：6アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号２８：

（２）配列番号２９に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：23アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
(ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：Xaa=あらゆるアミノ酸
（Ｂ）存在位置：８
（xi）配列の記載：配列番号２９：

（２）配列番号３０に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
(ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：Xaa=あらゆるアミノ酸
（Ｂ）存在位置：15
（xi）配列の記載：配列番号３０：

（２）配列番号３１に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：25アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号３１：

（２）配列番号３２に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：242塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
(ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：CDS
（Ｂ）存在位置：3..242
（xi）配列の記載：配列番号３２：

（２）配列番号３３に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：80アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号３３：

（２）配列番号３４に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：591塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
(ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：CDS
（Ｂ）存在位置：1..466
（xi）配列の記載：配列番号３４：

（２）配列番号３５に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：155アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号３５：

（２）配列番号３６に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：34塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：プライマー
（xi）配列の記載：配列番号３６：

（２）配列番号３７に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：32塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：プライマー
（xi）配列の記載：配列番号３７：

（２）配列番号３８に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：22塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：プライマー
（xi）配列の記載：配列番号３８：

（２）配列番号３９に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：27塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：プライマー
（xi）配列の記載：配列番号３９：

（２）配列番号４０に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：19塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：プライマー
（xi）配列の記載：配列番号４０：

（２）配列番号４１に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：17塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：プライマー
（xi）配列の記載：配列番号４１：

（２）配列番号４２に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：22塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：プライマー
（xi）配列の記載：配列番号４２：

（２）配列番号４３に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：プライマー
（xi）配列の記載：配列番号４３：

（２）配列番号４４に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：54塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：プライマー
（xi）配列の記載：配列番号４４：

（２）配列番号４５に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：39塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：プライマー
（xi）配列の記載：配列番号４５：

（２）配列番号４６に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：33塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：プライマー
（xi）配列の記載：配列番号４６：

（２）配列番号４７に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：29塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：プライマー
（xi）配列の記載：配列番号４７：

（２）配列番号４８に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：34塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：プライマー
（xi）配列の記載：配列番号４８：

（２）配列番号４９に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：33塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：プライマー
（xi）配列の記載：配列番号４９：

（２）配列番号５０に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：646塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：CDS
（Ｂ）存在位置：3..519
（xi）配列の記載：配列番号５０：

（２）配列番号５１に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：172アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号５１：

（２）配列番号５２に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：612塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：CDS
（Ｂ）存在位置：2..461
（xi）配列の記載：配列番号５２：

（２）配列番号５３に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：153アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号５３：

（２）配列番号５４に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：56アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号５４：

（２）配列番号５５に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：1197塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
(ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：CDS
（Ｂ）存在位置：1..1196
（xi）配列の記載：配列番号５５：

（２）配列番号５６に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：398アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号５６：

本発明の様々な実施態様を詳細に説明したが、これらの実施態様に対する変更および適応が当業者に生じるであろうことは明白である。しかし、そのような変更および適応は、本発明の、下記の請求の範囲に記述されたとおりの対象範囲内にあることを明白に理解しなければならない。

Claims

ノミの唾液産生物から得られる抽出物であって、
前記抽出物は、
前記ノミを含む唾液収集装置内の収集手段上の同ノミの唾液産生物を収集する工程（ａ）と、前記ノミの唾液産生物を前記収集手段から抽出して前記抽出物を作製する工程（ｂ）と、を含む方法により得られ、
前記唾液収集装置は（ｉ）チャンバーに操作可能に連結されたハウジングと、（ｉｉ）前記ハウジングと前記チャンバーとの間のインターフェイスとを備え、前記インターフェイスは、（１）前記装置内に保持されたノミによって沈積された唾液産生物の少なくとも一部を収集し得る手段と、（２）混入物質が前記収集手段に接触するのを妨げることができる障壁手段とを含み、前記チャンバーは前記ハウジングよりも暖かい周囲温度を有し、それにより前記ハウジングと前記チャンバーとの間に温度の差異が形成され、前記ハウジングにより前記ノミが保持され、かつ前記温度の差異が前記ハウジング内に保持されたノミを引きつけ、前記障壁手段及び収集手段によって給餌し、それにより唾液産生物が前記収集手段上に沈積され、
前記抽出物を作製する工程（ｂ）は、
前記ノミ収集装置に取り付けられたポリフッ化ビニリデン膜上にてノミ唾液産生物を得る第一の工程と、
前記ノミ唾液産生物を含む前記ポリフッ化ビニリデン膜を５０％アセトニトリルと０．１％ＴＦＡを含む第一の溶媒に８時間浸し、抽出された混合物を回収し凍結乾燥することにより第一のペレットを生成する第二の工程と、
前記膜と同一の膜を５０％アセトニトリルと１％ＴＦＡを含む第二の溶媒にて室温にて一晩攪拌しながら浸漬し、溶離された混合物を回収し凍結乾燥することにより第二のペレットを生成する第三の工程と、
前記第一のペレットと前記第二のペレットとを１２．８％アセトニトリルを含む第三の溶媒と混合し、溶媒中に溶解させられたノミ唾液産生物を回収する第四の工程と、
前記第三の溶媒と混合した時に得られた非溶解物質を１２．８％のアセトニトリルと再び混合して異なるノミ唾液産生物を回収する第五の工程と、
前記第四の工程と前記第五の工程とにより得られたノミ唾液産生物を混合する第六の工程と、
からなる、抽出物。
ノミの唾液産生物から得られる抽出物であって、
前記抽出物は、
前記ノミを含む唾液収集装置内の収集手段上の同ノミの唾液産生物を収集する工程（ａ）と、前記ノミの唾液産生物を前記収集手段から抽出して前記抽出物を作製する工程（ｂ）と、を含む方法により得られ、
前記唾液収集装置は（ｉ）チャンバーに操作可能に連結されたハウジングと、（ｉｉ）前記ハウジングと前記チャンバーとの間のインターフェイスとを備え、前記インターフェイスは、（１）前記装置内に保持されたノミによって沈積された唾液産生物の少なくとも一部を収集し得る手段と、（２）混入物質が前記収集手段に接触するのを妨げることができる障壁手段とを含み、前記チャンバーは前記ハウジングよりも暖かい周囲温度を有し、それにより前記ハウジングと前記チャンバーとの間に温度の差異が形成され、前記ハウジングにより前記ノミが保持され、かつ前記温度の差異が前記ハウジング内に保持されたノミを引きつけ、前記障壁手段及び収集手段によって給餌し、それにより唾液産生物が前記収集手段上に沈積され、
前記抽出物を作製する工程（ｂ）は、
前記ノミ収集装置に取り付けられたポリフッ化ビニリデン膜上にてノミ唾液産生物を得る第一の工程と、
前記ノミ唾液産生物を含む前記ポリフッ化ビニリデン膜を５０％アセトニトリルと０．１％ＴＦＡを含む第一の溶媒に８時間浸し、抽出された混合物を回収し凍結乾燥することにより第一のペレットを生成する第二の工程と、
前記膜と同一の膜を５０％アセトニトリルと１％ＴＦＡを含む第二の溶媒にて室温にて一晩攪拌しながら浸漬し、溶離された混合物を回収し凍結乾燥することにより第二のペレットを生成する第三の工程と、
前記第一のペレットと前記第二のペレットとを１２．８％アセトニトリルを含む第三の溶媒と混合する第四の工程と、
前記第四の工程の混合により得られた非溶解物質を１２．８％のアセトニトリルと再び混合する第五の工程と、
前記第五の工程の混合により得られた非溶解物質を５０％のアセトニトリルと混合し、ノミ唾液産生物を回収し、抽出物を得る第六の工程と、
からなる、抽出物。
非ヒト動物がアレルギー性皮膚炎に対して感受性であるか、若しくはそれを有しているかをテストするための検定キットであって、前記キットは、
（ａ）請求項１又は２に記載の抽出物と、
（ｂ）前記非ヒト動物がアレルギー性皮膚炎に対して感受性であるか、若しくはそれを有しているかを決定するための手段と、
を備える、検定キット。
非ヒト動物がアレルギー性皮膚炎に対して感受性であるか若しくはそれを有しているかを同定するための方法であって、前記方法は：
（ａ）前記非ヒト動物上のある部位に請求項１又は２に記載の抽出物を投与し、かつ前記非ヒト動物上の別の部位に、陽性対照溶液及び陰性対照溶液からなる群から選択されるコントロール溶液を投与するする工程と、
（ｂ）前記抽出物の投与に起因する反応を前記コントロール溶液の投与に起因する反応と比較する工程と、
を含み、
前記非ヒト動物は、前記抽出物に対する反応が少なくとも前記陽性対照溶液に対する反応と同じくらい大きい場合にアレルギー性皮膚炎に対して感受性であるか若しくはそれを有していると決定され、かつ前記非ヒト動物は、前記抽出物に対する反応が前記陰性対照溶液に対する反応と同じくらいのサイズである場合にアレルギー性皮膚炎に対して感受性でないか若しくはそれを有していないと決定される、方法。
非ヒト動物におけるアレルギー性皮膚炎の指標となる抗体の存在を測定することにより、前記非ヒト動物がアレルギー性皮膚炎に対して感受性であるか若しくはそれを有していることを同定するための方法であって、前記方法は、
（ａ）請求項１又は２に記載の抽出物と前記非ヒト動物由来の体液とを、前記抽出物と前記体液中に存在する前記抗体との免疫複合体の形成に十分な条件下で、接触させる工程と、
（ｂ）形成された免疫複合体の存在を検出する工程と、
を含み、
前記免疫複合体の存在は前記非ヒト動物がアレルギー性皮膚炎に対して感受性であるか若しくはそれを有していることの指標となる、方法。
前記抗体が免疫グロブリンＩｇＥ抗体を含む、請求項５に記載の方法。