CN101331126A - 作为plk调节剂的苯并咪唑噻吩化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供5－杂芳基取代的苯并咪唑噻吩化合物、含所述化合物的药用组合物，它们的制备方法及其作为药物的用途。

Description

作为PLK调节剂的苯并咪唑噻吩化合物
发明背景
本发明涉及新的5-杂芳基苯并咪唑噻吩化合物、含这些化合物的药物制剂和这些化合物的治疗用途。
马球样激酶(″PLK″)是进化保守丝氨酸/苏氨酸激酶，它在调节细胞周期过程中起关键重要。PLK在进入和退出酵母到哺乳动物细胞的各种生物的有丝分裂中起作用。PLK包括PLK1、PLK2、PLK3和PLK4。
PLK1过度表达似乎非常与瘤细胞(包括癌)有关。发表的研究证实，PLK1RNA在＞80％肺和乳腺瘤中表达水平高，而在邻近的正常细胞中很少或不表达。数个研究证实，在几种癌症中存在PLK表达、组织学级别和预后相关性。发现PLK阳性细胞百分率与卵巢和子宫内膜癌组织学级别之间具有显著相关性(p＜0.001)。这些研究指出PLK在侵袭性子宫内膜癌细胞中高度表达，该表达可反映子宫内膜癌的恶性和增殖程度。用RT-PCR分析，相对于正常组织，在97％食管癌和73％胃癌中PLK过度表达。另外，在食管癌中PLK过度表达水平高的患者组出现预后显著比PLK过度表达水平低患者组差。在头和颈癌中，发现在大多数肿瘤中PLK1的mRNA表达增加；Kaplan-Meier分析表明PLK1表达水平中等的患者存活期比PLK1表达水平高的那些患者长。通过非小细胞肺癌患者分析，得到与PLK1表达相关的相似结果。
SmithKline Beecham的PCT公布号WO2004/014899公开了新的式(I)苯并咪唑噻吩化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或生理上的功能衍生物：
Figure A20068004104400071
其中：
R1选自H、烷基、烯基、炔基、-C(O)R7、-CO2R7、-C(O)NR7R8、-C(O)N(R7)OR8、-C(O)N(R7)-R2-OR8、-C(O)N(R7)-Ph、-C(O)N(R7)-R2-Ph、-C(O)N(R7)C(O)R8、-C(O)N(R7)CO2R8、-C(O)N(R7)C(O)NR7R8、-C(O)N(R7)S(O)2R8、-R2-OR7、-R2-O-C(O)R7、-C(S)R7、-C(S)NR7R8、-C(S)N(R7)-Ph、-C(S)N(R7)-R2-Ph、-R2-SR7、-C(＝NR7)NR7R8、-C(＝NR7)N(R8)-Ph、-C(＝NR7)N(R8)-R2-Ph、-R2-NR7R8、-CN、-OR7、-S(O)fR7、-S(O)2NR7R8、-S(O)2N(R7)-Ph、-S(O)2N(R7)-R2-Ph、-NR7R8、N(R7)-Ph、-N(R7)-R2-Ph、-N(R7)-SO2R8和Het；
Ph为任选被选自以下的取代基取代1-3次的苯基：卤素、烷基、-OH、-R2-OH、-O-烷基、-R2-O-烷基、-NH2、-N(H)烷基、-N(烷基)2、-CN和-N3；
Het为具有1、2、3或4个选自N、O和S的杂原子的5元-7元杂环或具有1、2、3或4个选自N、O和S的杂原子的5元-6元杂芳基，这些杂环或杂芳基各自任选被选自以下的取代基取代1-2次：卤素、烷基、氧代基、-OH、-R2-OH、-O-烷基、-R2-O-烷基、-NH2、-N(H)烷基、-N(烷基)2、-CN和-N3；
Q1为式：-(R2)a-(Y1)b-(R2)c-R3基团
a、b和c相同或不同，各自独立为0或1，且a或b中至少一个为1；
n为0、1、2、3或4；
Q2为式：-(R2)aa-(Y2)bb-(R2)cc-R4基团，
或两相邻Q2基团选自烷基、烯基、-OR7、-S(O)fR7和-NR7R8，它们与它们连接的碳原子一起形成C5-6环烷基；C5-6环烯基；苯基；具有选自N、O和S的1或2个杂原子的5元-7元杂环；或具有选自N、O和S的1或2个杂原子的5元-6元杂芳基；
aa、bb和cc相同或不同，各自独立为0或1；
各Y1和Y2相同或不同，且独立选自-O-、-S(O)f-、-N(R7)-、-C(O)-、-OC(O)-、-CO2-、-C(O)N(R7)-、-C(O)N(R7)S(O)2-、-OC(O)N(R7)-、-OS(O)2-、-S(O)2N(R7)-、-S(O)2N(R7)C(O)-、-N(R7)S(O)2-、-N(R7)C(O)-、-N(R7)CO2-和-N(R7)C(O)N(R7)-；
各R2相同或不同，且独立选自亚烷基、亚烯基和亚炔基；
各R3和R4相同或不同，各自独立选自H、卤素、烷基、烯基、炔基、-C(O)R7、-C(O)NR7R8、-CO2R7、-C(S)R7、-C(S)NR7R8、-C(＝NR7)R8、-C(＝NR7)NR7R8、-CR7＝N-OR7、-OR7、-S(O)fR7、-S(O)2NR7R8、-NR7R8、-N(R7)C(O)R8、-N(R7)S(O)2R8、-NO2、-CN、-N3和式(ii)基团：
Figure A20068004104400091
其中：
环A选自C5-10环烷基、C5-10环烯基、芳基；具有选自N、O和S的1、2或3个杂原子的5元-10元杂环；和具有选自N、O和S的1、2或3个杂原子的5元-10元杂芳基；
各d为0或1；
e为0、1、2、3或4；
各R6相同或不同，且独立选自H、卤素、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、Ph、Het、-CH(OH)-R2-OH、-C(O)R7、-CO2R7、-CO2-R2-Ph、-CO2-R2-Het、-C(O)NR7R8、-C(O)N(R7)C(O)R7、-C(O)N(R7)CO2R7、-C(O)N(R7)C(O)NR7R8、-C(O)N(R7)S(O)2R7、-C(S)R7、-C(S)NR7R8、-C(＝NR7)R8、-C(＝NR7)NR7R8、-CR7＝N-OR8、＝O、-OR7、-OC(O)R7、-OC(O)Ph、-OC(O)Het、-OC(O)NR7R8、-O-R2-S(O)2R7、-S(O)fR7、-S(O)2NR7R8、-S(O)2Ph、-S(O)2Het、-NR7R8、-N(R7)C(O)R8、-N(R7)CO2R8、-N(R7)-R2-CO2R8、-N(R7)C(O)NR7R8、-N(R7)-R2-C(O)NR7R8、-N(R7)C(O)Ph、-N(R7)C(O)Het、-N(R7)Ph、-N(R7)Het、-N(R7)C(O)NR7-R2-NR7R8、-N(R7)C(O)N(R7)Ph、-N(R7)C(O)N(R7)Het、-N(R7)C(O)N(R7)-R2-Het、-N(R7)S(O)2R8、-N(R7)-R2-S(O)2R8、-NO2、-CN和-N3；
其中当定义Q1时，在b为1，且c为0时，R3不为卤素、-C(O)R7、-C(O)NR7R8、-CO2R7、-C(S)R7、-C(S)NR7R8、-C(＝NR7)R8、-C(＝NR7)NR7R8、-CR7＝N-OR7、-OR7、-S(O)fR7、-S(O)2NR7R8、-NR7R8、-N(R7)C(O)R8、-N(R7)S(O)2R8、-NO2、-CN或-N3；
其中当定义Q2时，在bb为1，且cc为0时，R4不为卤素、-C(O)R7、-C(O)NR7R8、-CO2R7、-C(S)R7、-C(S)NR7R8、-C(＝NR7)R8、-C(＝NR7)NR7R8、-CR7＝N-OR7、-OR7、-S(O)fR7、-S(O)2NR7R8、-NR7R8、-N(R7)C(O)R8、-N(R7)S(O)2R8、-NO2、-CN或-N3；
R5选自H、卤素、烷基、环烷基、OR7、-S(O)fR7、-NR7R8、-NHC(O)R7、-NHC(O)NR7R8和-NHS(O)2R7；
f为0、1或2；且
各R7和各R8相同或不同，且各自独立选自H、烷基、烯基、炔基、环烷基和环烯基；
其中当R1为-CO2CH3，且n为0时，Q1不为-OH。
还公开了含这些化合物的药用组合物、制备它们的方法和用这些化合物治疗由PLK介导的病症的方法。
发明概述
按照本发明的第1方面，提供选自以下的化合物及其药学上可接受的盐或溶剂合物：
其中*代表手性碳。
在另一方面，提供对映体富集的化合物，该化合物选自A、B、C、D、E、F、G、H和I，其中手性碳的立体化学为R。
在本发明的第3方面，提供药用组合物，该组合物含有选自以下的化合物：A、B、C、D、E、F、G、H和I及其药学上可接受的盐或溶剂合物。在一个实施方案中，药用组合物还含有药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在本发明的第4方面，提供在有需要的哺乳动物中治疗PLK介导的病症的方法。该方法包括给予哺乳动物治疗有效量的选自以下的化合物：A、B、C、D、E、F、G、H和I及其药学上可接受的盐或溶剂合物。
在本发明的第5方面，提供在有需要的哺乳动物中治疗敏感瘤的方法。该方法包括给予哺乳动物治疗有效量的选自以下的化合物：A、B、C、D、E、F、G、H和I及其药学上可接受的盐或溶剂合物。敏感瘤可选自乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、淋巴瘤、白血病、子宫内膜癌、黑素瘤、胰腺癌、卵巢癌、鳞状上皮细胞癌、头和颈癌及食管癌。
在本发明的第6方面，提供治疗特征在于不适当细胞增殖的病症的方法。该方法包括使细胞与治疗有效量的选自以下的化合物接触：A、B、C、D、E、F、G、H和I及其药学上可接受的盐或溶剂合物。
在本发明的第7方面，本发明提供抑制细胞增殖的方法。该方法包括使细胞与一定量的选自以下的化合物接触：A、B、C、D、E、F、G、H和I及其药学上可接受的盐或溶剂合物。
在另一方面，本发明提供抑制细胞有丝分裂的方法。该方法包括给予细胞一定量的选自以下的化合物：A、B、C、D、E、F、G、H和I及其药学上可接受的盐或溶剂合物。
在另一方面，本发明提供选自以下的用于治疗的化合物：A、B、C、D、E、F、G、H和I及其药学上可接受的盐或溶剂合物。
在又另一方面，本发明提供选自以下的化合物：A、B、C、D、E、F、G、H和I及其药学上可接受的盐或溶剂合物，该化合物用于在有需要的哺乳动物中治疗PLK介导的病症。
在又另一方面，本发明提供选自以下的化合物：A、B、C、D、E、F、G、H和I及其药学上可接受的盐或溶剂合物，该化合物用于治疗哺乳动物中的敏感瘤。
在另一方面，本发明提供选自以下的化合物：A、B、C、D、E、F、G、H和I及其药学上可接受的盐或溶剂合物，该化合物用于治疗特征在于不适当细胞增殖的病症。
在又另一方面，本发明提供选自以下的化合物：A、B、C、D、E、F、G、H和I及其药学上可接受的盐或溶剂合物，该化合物用于抑制细胞增殖。
在又另一方面，本发明提供选自以下的化合物：A、B、C、D、E、F、G、H和I及其药学上可接受的盐或溶剂合物，该化合物用于抑制细胞有丝分裂。
在又另一方面，本发明提供选自以下的化合物：A、B、C、D、E、F、G、H和I及其药学上可接受的盐或溶剂合物在制备药物中的用途，该药物用于治疗哺乳动物中PLK介导的病症。
在又另一方面，本发明提供选自以下的化合物：A、B、C、D、E、F、G、H和I及其药学上可接受的盐或溶剂合物在制备药物中的用途，该药物用于治疗哺乳动物中敏感瘤。
在又另一方面，本发明提供选自以下的化合物：A、B、C、D、E、F、G、H和I及其药学上可接受的盐或溶剂合物在制备药物中的用途，该药物用于治疗哺乳动物中特征在于不适当细胞增殖的病症。
在又另一方面，本发明提供选自以下的化合物：A、B、C、D、E、F、G、H和I及其药学上可接受的盐或溶剂合物在制备药物中的用途，该药物用于抑制细胞增殖。
在又另一方面，本发明提供选自以下的化合物：A、B、C、D、E、F、G、H和I及其药学上可接受的盐或溶剂合物在制备药物中的用途，该药物用于抑制细胞有丝分裂。
在又另一方面，本发明提供含选自以下的化合物的药用组合物：A、B、C、D、E、F、G、H和I及其药学上可接受的盐或溶剂合物，该组合物用于治疗哺乳动物中的敏感瘤。
发明详述
本文中使用的“一种或多种本发明化合物”或“一种或多种选自A、B、C、D、E、F、G、H和I的化合物”表示选自以下的化合物：A、B、C、D、E、F、G、H和I或其药学上可接受的盐或溶剂合物。
本文中使用的“一种或多种选自A-1、B-1、C-1、D-1、E-1、F-1、G-1、H-1和I-1的化合物”表示选自以下的化合物：A-1、B-1、C-1、D-1、E-1、F-1、G-1、H-1和I-1或其药学上可接受的盐或溶剂合物。
本文中使用的术语“任选”表示随后阐述的一个或多个事件可能发生或可能不发生，且包括发生的事件和未发生的事件。
本发明化合物存在立体异构形式(例如它们含一个或多个手性或不对称碳原子)。术语“手性”是指不与其镜像重叠的分子。术语“非手性”是指与其镜像重叠的分子。
术语“立体异构体”是指具有相同化学组成但原子或基团的空间排列不同的化合物。立体异构体可以是旋光异构体或几何异构体。旋光异构体包括对映体和非对映体。“对映体”是含手性碳原子的一对旋光异构体中之一，这些手性碳原子的分子构型具有左和右手(手性)形式。即“对映体”是指化合物的旋光异构体对中的各异构体，这些旋光异构体的镜像互不重叠。“非对映体”是具有两个或多个不对称中心的化合物的旋光异构体对之一，且其分子彼此不为镜像。用(R)-(S)系统命名手性中心。按照该系统，将具体化合物确定为″R″或″S″对映体取决于与手性碳连接的原子或基团的性质。
各对映体对平面偏振光的行为即它们的光学活性不同。使平面偏振光按顺时针方向旋转的对映体称为右旋，用代表正向旋转的符号″d″或″(+)″表示。将使平面偏振光按逆时针方向旋转的对映体称为左旋，用代表反向旋转的符号″l″或″(-)″表示。对映体的构型与它们使平面偏振光旋转的方向之间无关。(R)和(S)符号与平面偏振光旋转的方向之间也无必然的联系。可用常规技术测定本发明化合物对映体的光学活性或平面偏振光旋转方向。
本文中使用的术语“外消旋体”和“外消旋混合物”是指具有相等即50∶50比例的化合物的(R)-和(S)-旋光异构体(例如对映体)的混合物。
本文中使用的术语“对映体富集”是指含旋光异构体混合物的组合物，其中一种对映体的量大于另一种的量。因此，“对映体富集”是指旋光异构体的混合物，其中对映体的比例大于50∶50。对映体富集的化合物包含相对于另一种大于50％(重量)的一种对映体。例如，对映体富集的5-{5-[6-(1-哌嗪基)-3-吡啶基]-1H-苯并咪唑-1-基}-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酰胺是指含相对于化合物的(S)-对映体含量大于50％(重量)的(R)-对映体的组合物。在一个实施方案中，对映体富集的化合物含相对于另一种含量为至少75％(重量)的一种对映体。在另一个实施方案中，对映体富集的化合物含相对于另一种含量为至少80％(重量)的一种对映体。在一个特定实施方案中，对映体富集的化合物含相对于另一种含量为至少85％(重量)的一种对映体。
本文中使用的术语“对映体纯”是指对映体富集的化合物，该化合物含相对于另一种含量为至少90％(重量)的一种对映体。在一个实施方案中，对映体纯化合物含相对于另一种含量为至少95％(重量)的一种对映体。在一个特定实施方案中，对映体纯化合物含相对于另一种含量为至少99％(重量)的一种对映体。
本发明提供选自以下的化合物及其药学上可接受的盐和溶剂合物：
其中*代表手性碳。
在一个特定实施方案中，化合物A、B、C、D、E、F、G、H和I为对映体富集的化合物，其中手性碳的立体化学为R。
因此，在一个优选的实施方案中，本发明提供选自以下的化合物及其药学上可接受的盐和溶剂合物：
5-{5-[6-(1-哌嗪基)-3-吡啶基]-1H苯并咪唑-1-基}-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]-乙基}氧基)-2-噻吩甲酰胺；
Figure A20068004104400172
5-{5-[2-(4-甲基-1-哌嗪基)-4-吡啶基]-1H-苯并咪唑-1-基}-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酰胺；
Figure A20068004104400173
5-(5-{2-[(1-甲基-4-哌啶基)氨基]-4-吡啶基}-1H-苯并咪唑-1-基)-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酰胺；
Figure A20068004104400174
5-[5-(2-氨基-4-吡啶基)-1H-苯并咪唑-1-基]-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酰胺；
5-[5-(1H吡唑-4-基)-1H苯并咪唑-1-基]-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酰胺；
Figure A20068004104400182
3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}-5-(5-{6-[(1-甲基-4-哌啶基)氨基]-3-吡啶基}-1H苯并咪唑-1-基)-2-噻吩甲酰胺；
Figure A20068004104400183
3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}-5-{5-[6-(1-哌嗪基)-3-吡啶基]-1H苯并咪唑-1-基}-2-噻吩甲酰胺；
3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}-5-(5-{1-[3-(4-乙基-1-哌嗪基)丙基]-1H吡唑-4-基}-1H苯并咪唑-1-基)-2-噻吩甲酰胺；
Figure A20068004104400191
3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}-5-[-5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1H-苯并咪唑-1-基]-2-噻吩甲酰胺。
本领域技术人员会认识到，可按其药学上可接受的盐或溶剂合物形式使用本发明化合物。本发明化合物(或其对映体富集或纯形式)的药学上可接受的盐包括由药学上可接受的无机或有机酸或碱形成的常规盐和季铵盐。合适的酸式盐的更具体实例包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、过氯酸盐、富马酸盐、乙酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、羟基乙酸盐、甲酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、棕榈酸盐、丙二酸盐、羟基马来酸盐、苯乙酸盐、谷氨酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、富马酸盐、甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、萘-2-磺酸盐、苯磺酸盐、羟基萘甲酸盐、氢碘酸盐、苹果酸盐、steroic、鞣酸盐等。
其它酸例如草酸虽然本身不是药学上可接受的，但可用于制备可用作中间体的盐，得到本发明化合物及其药学上可接受的盐。合适的碱式盐的更具体实例包括钠、锂、钾、镁、铝、钙、锌、N，N’-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因的盐。
本文中使用的术语“溶剂合物”是指由溶质(本发明化合物或其对映体富集或纯形式)和溶剂形成的可变化学计量的复合物。溶剂例如包括水、甲醇、乙醇或乙酸。
制备本发明化合物的药学上可接受的盐及溶剂合物的方法为本领域常规方法。参见例如Burger′s Medicinal Chemistry And DrugDiscovery，第5版，Vol 1：Principles And Practice。
如本领域技术人员认识到的那样，按照下述制备本发明化合物的方法，某些中间体也可以是化合物的药学上可接受的盐或溶剂合物形式。那些有关在制备本发明化合物的方法中使用的任何中间体的术语与上述有关本发明化合物的含义相同。制备此类中间体的药学上可接受的盐和溶剂合物的方法在本领域中已知，与制备本发明化合物的药学上可接受的盐和溶剂合物的方法类似。
本发明化合物通常为PLK抑制剂。PLK抑制剂表示在下述PLK抑制测定实施例中pIC50大于6的化合物，或在下述亚甲基蓝生长抑制测定实施例中IC50小于10μM的化合物；更尤其是，PLK抑制剂是用以下实施例所述方法测定，pIC50大于7或IC50小于1μM的化合物。
本发明还提供用于动物例如哺乳动物例如人医学治疗的本发明化合物。尤其是，本发明提供用于治疗PLK介导的病症的化合物。本发明还提供用于治疗敏感瘤的化合物。本发明还提供用于治疗特征在于不适当细胞增殖的病症的化合物。本发明还提供用于抑制细胞增殖的化合物。本发明还提供用于抑制细胞有丝分裂的化合物。
本发明提供治疗几种病症或疾病的方法，这些方法均包括给予治疗有效量的本发明化合物的步骤。本文中使用的术语“治疗”是指缓解指定的病症；消除或减轻该病症症状；延缓或消除该病症的进程和防止或延迟曾患该病患者的病症复发。
本文中使用的术语“治疗有效量”表示例如研究人员或临床师正在寻找的在所给予的患者中足以引起细胞培养物、组织、系统、动物(包括人)生物或医学反应的本发明化合物的量。例如，治疗PLK介导的病症的本发明化合物治疗有效量是足以治疗患者中PLK介导的病症的量。类似的，治疗敏感瘤的本发明化合物治疗有效量是足以治疗患者中敏感瘤的量。在一个本发明实施方案中，本发明化合物治疗有效量是足以抑制细胞有丝分裂的量。在本发明的一个实施方案中，本发明化合物治疗有效量是足以调节、控制、结合或抑制PLK的量。
本发明化合物的确切治疗有效量将取决于多种因素，它们包括但不限于所治疗患者的年龄和体重、需要治疗的具体病症及其严重程度、制剂的性质和给药途径，但最终应由主治医师或兽医判断。通常，按0.1-200mg/kg接受者(动物)体重/日，更通常按1-100mg/kg体重/日，给予本发明化合物治疗。可接受的日剂量可为约0.1-约2000mg/日，优选约0.1-约100mg/日。
作为一个方面，本发明提供调节、控制、结合或抑制PLK以治疗PLK介导的病症的方法。“调节、控制、结合或抑制PLK”是指调节、控制、结合或抑制PLK活性；和调节、控制、结合或抑制PLK过度表达。此类病症包括与PLK有关的某些瘤(包括癌和肿瘤)和特征在于不适当细胞增殖的病症。
本发明提供治疗PLK介导的病症的方法，该方法包括给予动物治疗有效量的本发明化合物。本发明的该方法和其它方法可用于治疗动物例如哺乳动物和尤其人。PLK介导的病症在本领域中已知，它们包括但不限于瘤和特征在于不适当细胞增殖的病症。
本发明还提供治疗有需要的动物例如哺乳动物(例如人)中敏感瘤(癌或肿瘤)的方法，该方法包括给予该动物治疗有效量的本发明化合物。本文中使用的“敏感瘤”是指对PLK抑制剂治疗敏感的瘤。与PLK有关并因此对PLK抑制剂治疗敏感的瘤在本领域中已知，包括原发性和转移性肿瘤和癌。例如，本发明范围内的敏感瘤包括但不限于乳腺癌、结肠癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、前列腺癌、淋巴瘤、白血病、子宫内膜癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、鳞状上皮细胞癌、头和颈癌以及食管癌。本发明化合物可单独用于治疗此类敏感瘤，或可与某些现有化疗一起用于提供加性或协同作用，和/或可用于恢复某些现有化疗和放疗的有效性。
本发明还提供治疗有需要的动物例如哺乳动物(例如人)中特征在于不适当细胞增殖的病症的方法。该方法包括给予治疗有效量的本发明化合物。“不适当细胞增殖”表示由不适当细胞生长导致的细胞增殖；由过度细胞分裂导致的细胞增殖；由加速度细胞分裂导致的细胞增殖；由不适当细胞存活导致的细胞增殖和/或按正常速度发生但不是需要的正常细胞的细胞增殖。特征在于不适当细胞增殖的病症包括但不限于瘤、血管增生病症、纤维变性病症、肾小球膜细胞增殖病症和代谢病。血管增生病症包括关节炎和再狭窄。纤维变性病症包括肝硬变和动脉粥样硬化。肾小球膜细胞增殖病症包括肾小球肾炎、恶性肾硬化、血栓形成微血管病综合征、器官移植排斥和肾小球病。代谢病包括银屑病、创伤愈合缓慢、炎症和神经变性疾病。骨关节炎和其它破骨细胞增殖依赖性过度骨重吸收的疾病是特征在于不适当细胞增殖的病症的实例，其中细胞增殖在正常细胞中按正常速度发生但不是需要的。
本发明还提供抑制细胞增殖的方法，该方法包括使细胞与足以抑制细胞增殖的量的本发明化合物接触。在一个特定实施方案中，细胞是瘤细胞。在一个特定实施方案中，细胞是不适当增殖性细胞。本文中使用的术语“不适当增殖性细胞”是指不适当(异常)生长的细胞；过度或以加速度分裂的细胞；不适当(异常)存活的细胞和/或按正常速度增殖但该增殖不是需要的正常细胞。瘤细胞(包括癌细胞)是不适当增殖细胞但不是唯一的不适当增殖细胞的实例。
PLK对细胞有丝分裂必不可少，因此，据信本发明化合物有效抑制有丝分裂。“抑制有丝分裂”是指抑制进入细胞周期的M期；一旦已经进入M期，则抑制细胞周期的M期正常发展；和抑制正常退出细胞周期的M期。因此，本发明化合物可通过抑制细胞进入有丝分裂、通过抑制细胞经过有丝分裂发展或通过抑制细胞退出有丝分裂，抑制有丝分裂。作为一个方面，本发明提供抑制细胞有丝分裂的方法，该方法包括给予细胞足以抑制有丝分裂的量的本发明化合物。在一个特定实施方案中，细胞是瘤细胞。在一个特定实施方案中，细胞是不适当增殖的细胞。
本发明还提供本发明化合物在制备治疗动物例如哺乳动物(例如人)中PLK介导的病症的药物中的用途。本发明还提供化合物在制备治疗动物的敏感瘤的药物中的用途。本发明还提供化合物在制备治疗特征在于不适当细胞增殖的病症的药物中的用途。本发明还提供化合物在制备抑制细胞增殖的药物中的用途。本发明还提供化合物在制备抑制细胞有丝分裂的药物中的用途。
虽然可以给予治疗有效量的本发明化合物的化学原料用于治疗，但通常按药用组合物或制剂的活性成分提供。因此，本发明还提供含本发明化合物的药用组合物。该药用组合物还可含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。在与制剂的其它成分配伍且对其接受者无害的意义上，载体、稀释剂和/或赋形剂必须是可接受的。按照本发明的另一方面，还提供制备药物制剂的方法，该方法包括将本发明化合物和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂混合。
可按每单位剂量含预定量的活性成分的单位剂型提供药物制剂。这种单位可含治疗有效剂量的本发明化合物或治疗有效剂量的分数，以便在预定时间可以给予多个单位剂型，达到需要的治疗有效剂量。优选的单位剂量制剂是含本文上述日剂量或亚剂量或其适当分数的活性成分的那些制剂。另外，可按药剂领域中熟知的任何方法制备此类药物制剂。
药物制剂可适合通过任何适当的途径例如通过口服(包括口颊或舌下)、直肠、鼻、局部(包括口颊、舌下或透皮)、阴道或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内或皮内)途径给药。可通过药剂领域中任何已知方法例如通过使活性成分与载体或赋形剂混合，制备此类制剂。
可以离散单位例如胶囊剂或片剂；散剂或颗粒剂；水或非水液体的溶液剂或混悬剂；食用泡沫或甜点心或水包油液体或油包水液体乳剂提供适合口服给药的药物制剂。例如，对于口服给药的片剂或胶囊剂形式，可使活性药物成分与口服无毒性的药学上可接受的惰性载体例如乙醇、甘油、水等混合。通过将化合物粉碎为合适的微小尺寸，并与类似分碎的药物载体例如食用糖例如淀粉或甘露醇混合，制备散剂。也可存在矫味剂、防腐剂、分散剂和着色剂。
通过制备上述粉末混合物，填充至成型明胶壳，制备胶囊剂。可将助流剂和润滑剂例如胶体二氧化硅、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙或固体聚乙二醇加入粉末混合物，然后填充操作。也可加入崩解剂或增溶剂例如琼脂-琼脂、碳酸钙或碳酸钠，以便摄取胶囊后改善药物利用度。
另外，当需要或必须时，还可将合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂掺入混合物。合适的粘合剂包括淀粉；明胶；天然糖例如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂；天然和合成胶例如阿拉伯胶、黄芪胶或藻酸钠；羧甲基纤维素、聚乙二醇；蜡等。用于这些剂型的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、皂土、黄原胶等。例如通过制备粉末混合物，制粒或压缩块，加入润滑剂和崩解剂，压成片，制备片剂。通过使适当粉碎的化合物与上述稀释剂或基质，并任选与粘合剂例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮；溶液阻滞剂例如石蜡；吸收促进剂例如季盐和/或吸收剂例如皂土、高岭土或磷酸二钙混合，制备粉末混合物。可通过用粘合剂例如糖浆、淀粉浆、阿拉伯胶或纤维素或聚合物材料的溶液润湿，过筛，将粉末混合物制粒。制粒的备选方法是，可使粉末混合物通过压片机，结果将未完整形成的压缩决粉碎为颗粒。可通过加入硬脂酸、硬脂酸盐、滑石粉或矿物油润滑颗粒，防止粘到压片用的冲上。然后将润滑的混合物压成片剂。也可使本发明化合物与自由流动的惰性载体混合，不经制粒或压缩块步骤直接压成片剂。可提供由虫胶密封包衣料、糖或聚合物材料包衣料和蜡抛光包衣料组成的透明或不透明防护性包衣层。可将染料加入这些包衣料中，以区分不同单位剂量。
可按剂量单位形式，配制口服流体例如溶液、糖浆和酏剂，以使给出量含规定量的活性成分。可通过将化合物溶于适当矫味的水溶液制备糖浆，而通过使用无毒醇溶媒制备酏剂。可通过使化合物分散于无毒溶媒配制混悬剂。还可加入增溶剂和乳化剂例如乙氧基化异十八醇和聚氧乙烯山梨醇醚；防腐剂；矫味添加剂例如薄荷油或天然甜味剂或糖精或其它人造甜味剂等。
如果需要，可将口服用剂量单位制剂微囊化。还可通过例如包衣或将微粒物质包埋在聚合物、蜡或类似物质中，制备延长或缓慢释放的制剂。
也可通过脂质体递药系统例如小单层脂质体、大单层脂质体和多室脂质体形式给予本发明化合物。可由多种磷脂例如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱形成脂质体。
还可通过使用与化合物分子偶联的作为单一载体的单克隆抗体，递送本发明化合物。化合物也可与作为靶向药物载体的可溶性聚合物偶联。此类聚合物可包括肽、聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基甲基丙烯酰胺-苯酚、聚羟乙基天冬酰胺苯酚或棕榈酰基残基取代的聚环氧乙烷聚赖氨酸。另外，化合物可与一类可生物降解的可用于完成控制释放药物的聚合物偶联，此类聚合物为例如聚乳酸、聚ε-己内酯、聚羟丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联或两性嵌段共聚物。
可通过与接受者的皮肤保持长时间充分接触的离散贴剂提供适合透皮给药的药物制剂。例如，通常可通过Pharmaceutical Research，3(6)：318(1986)中所述离子导入法从贴剂递送活性成分。
可将适合局部给药的药物制剂配制成软膏剂、霜剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油。
对于治疗眼或其它外组织例如口腔和皮肤，优选使用局部软膏剂或霜剂药物制剂。当配制软膏剂时，活性成分可与石蜡或水互溶性软膏基质一起使用。或者，可用水包油霜剂或油包水基质配制活性成分的霜剂。
适合局部给予眼的药物制剂包括滴眼剂，其中活性成分溶于或悬浮于合适的载体，尤其水性溶剂。
适合局部给予口腔的药物制剂包括锭剂、软锭剂和口腔洗涤剂。
可用栓剂或灌肠剂提供适合直肠给药的药物制剂。
适合鼻给药的其中载体是固体的药物制剂包括粒度为例如20-500微米的粗粉末，按鼻吸入的方式给药，即通过使鼻紧密贴近粉末容器，通过鼻腔快速吸入。其中载体是液体的适合鼻喷雾或鼻滴剂给药的制剂包括活性成分的水或油溶液。适合通过吸入给药的药物制剂包括微细粒子粉尘或薄雾，它可通过各种计量的剂量压力的气雾剂、喷雾器或吹入器产生。
可用阴道栓剂、茶匙剂、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫或喷雾剂制剂提供适合阴道给药的药物制剂。
适合肠胃外给药的药物制剂包括可含有抗氧剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与接受者血液等渗的溶质的水和非水无菌注射液；和可含有悬浮剂和增稠剂的水和非水无菌混悬液。可用多剂量或多剂量容器例如密封的安瓿和针瓶提供制剂，该制剂可在冷冻干燥(冻干)条件下贮存，临用前只需加入无菌液体载体例如注射用水。可由无菌粉末、颗粒和片剂制备即时用注射溶液和混悬夜。
应理解，除加入上述具体提及的成分外，制剂还可包括本领域中有关所述制剂类型常用的其它试剂，例如适合口服给药的那些可包括矫味剂。
在上述治疗和使用方法中，本发明化合物可单独使用、与一种或多种其它本发明化合物或与其它治疗药物联用。尤其是，在治疗PLK介导的病症的方法和治疗敏感瘤的方法中，考虑与其它化疗、激素和/或抗体药物联合以及与外科手术疗法和放疗联合。本文中使用的术语“化疗”是指当给予患者时产生疗效的任何化学药物。“化疗”药物包括但不限于抗肿瘤药物、镇痛药和止吐药。本文中使用的“抗肿瘤药物”包括细胞抑制和细胞毒药物。因此，本发明联合疗法包括给予至少一种本发明化合物和使用至少一种其它癌症治疗方法。在一个实施方案中，本发明联合疗法包括给予至少一种本发明化合物和至少一种其它化疗药物。在一个特定实施方案中，本发明包括给予至少一种本发明化合物和至少一种抗肿瘤药物。作为另一个方面，本发明提供治疗方法和上述用途，该方法包括给予本发明化合物和至少一种化疗药物。在一个特定实施方案中，化疗药物是抗肿瘤药物。在另一个实施方案中，本发明提供上述药用组合物，该组合物还包含至少一种其它化疗药物，更尤其是该化疗药物是抗肿瘤药物。
通常，对所治疗的敏感瘤有活性的任何化疗药物均可与本发明化合物联用，条件是该具体药物在临床上与使用本发明化合物的疗法相容。可用于本发明的典型的抗肿瘤药物包括但不限于抗微管药物例如双萜类和长春花生物碱；铂配位络合物；烷化剂例如氮芥、氧杂氮杂磷烷类(oxazaphosphor-ines)、烷基磺酸酯、亚硝基脲和三氮烯；抗生素药物例如蒽环类、放线菌素类和博来霉素类；拓扑异构酶II抑制剂例如表鬼臼毒素；抗代谢药例如嘌呤和嘧啶类似物和抗叶酸化合物；拓扑异构酶I抑制剂例如喜树碱；激素和激素类似物；信号转导途径抑制剂；非-受体酪氨酸激酶血管发生抑制剂；免疫治疗药；促凋亡药；和细胞周期信号抑制剂。
抗微管或抗有丝分裂药物是在细胞周期的M期或有丝分裂期期间对肿瘤细胞的微管具有相位特异性的药物。抗微管药物的实例包括但不限于双萜和长春花生物碱。双萜的实例包括但不限于紫杉醇及其类似物多西他赛。长春花生物碱的实例包括但不限于长春碱、长春新碱和长春瑞滨。
铂配位络合物是与DNA相互作用的非相位特异性抗肿瘤药物。铂络合物进入肿瘤细胞，经历水合作用，和DNA形成链内和链间交联，造成对肿瘤不利的生物作用。铂配位络合物的实例包括但不限于顺铂和卡铂。
烷化剂是非相位特异性抗肿瘤药物且为强亲电试剂。通常，通过烷基化，烷化剂通过DNA分子的亲核部分例如磷酸酯、氨基和羟基与DNA形成共价键。此类烷基化破坏核酸功能，导致细胞死亡。烷化剂的实例包括但不限于氮芥例如环磷酰胺、美法仑和苯丁酸氮芥；烷基磺酸酯例如白消安；亚硝基脲例如卡莫司汀和三氮烯例如达卡巴嗪。
抗生素化疗药物是非相位特异性药物，它们与DNA结合或插入。通常，这种作用得到稳定的DNA复合物或链断裂，因此破坏核酸的正常功能，导致细胞死亡。抗生素抗肿瘤药物的实例包括但不限于放线菌素例如放线菌素D；蒽环类例如道诺霉素和多柔比星；和博来霉素。
拓扑异构酶II抑制剂包括但不限于表鬼臼毒素。
表鬼臼毒素是从曼德拉植物衍生的相位特异性抗肿瘤药物。表鬼臼毒素通常在细胞中通过与拓扑异构酶II和DNA形成三元复合物，造成DNA链断裂，影响细胞周期的S和G2期。链断裂累积，随后细胞死亡。表鬼臼毒素的实例包括但不限于依托泊苷和替尼泊苷。
抗代谢抗肿瘤药物是作用于细胞周期的S期(DNA合成)的相位特异性抗肿瘤药物，它通过抑制DNA合成或抑制嘌呤或嘧啶碱合成从而限制DNA合成。因此，S期停止进行，随后细胞死亡。抗代谢抗肿瘤药物的实例包括但不限于氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、巯基嘌呤和硫鸟嘌呤。
喜树碱包括喜树碱和喜树碱衍生物可供使用，或正在作为拓扑异构酶I抑制剂开发。
据信，喜树碱细胞毒活性与其拓扑异构酶I抑制活性有关。喜树碱的实例包括但不限于伊立替康、托泊替康和7-(4-甲基哌嗪-1-基-亚甲基)-10，11-亚乙二氧基-20-喜树碱的各种旋光形式。激素和激素类似物是治疗癌症的有效化合物，其中激素和癌生长和/或生长缺乏有关。据认为可用于治疗瘤的激素和激素类似物的实例包括但不限于肾上腺皮质激素类药物例如泼尼松和泼尼松龙，它们可用于治疗儿童恶性淋巴瘤和急性白血病；氨基格鲁米特和其它芳香酶抑制剂例如可用于治疗肾上腺类固醇癌和依赖激素的含雌激素受体的乳腺癌的阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑(vorazole)和依西美坦；黄体酮(progestrins)例如可用于治疗依赖激素的乳腺癌和子宫内膜癌的醋酸甲地孕酮；雌激素；雄激素和抗雄激素药物例如可用于治疗前列腺癌和良性前列腺肥大的氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、醋酸环丙孕酮和5α-还原酶例如非那雄胺和度他雄胺；抗雌激素药物例如可用于治疗依赖激素的乳腺癌的他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、曲洛昔芬和iodoxyfene；和促性腺素释放激素(GnRH)及其类似物例如LHRH激动剂和拮抗剂例如醋酸戈舍瑞林和亮丙立德(luprolide)，它们刺激治疗前列腺癌的促黄体生成激素(LH)和/或促卵泡激素(FSH)释放。
信号转导途径抑制剂是阻断或抑制引起细胞内改变的化学过程的那些抑制剂。如本文中使用的那样，该改变为细胞增殖或分化。可用于本发明的信号转导抑制剂包括受体酪氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶、SH2/SH3域阻断剂、丝氨酸/苏氨酸激酶、磷脂酰(phosphotidyl)肌醇-3激酶、肌醇信号和Ras致癌基因的抑制剂。
几种蛋白酪氨酸激酶催化各种涉及调节细胞生长的蛋白中的特异性酪氨酰残基磷酸化。此类蛋白酪氨酸激酶可大致分为受体或非受体激酶。
受体酪氨酸激酶是具有细胞外配体结合域、跨膜域和酪氨酸激酶域的跨膜蛋白。受体酪氨酸激酶参与调节细胞生长，有时称为生长因子受体。已证实例如通过过度表达或突变导致这些激酶中的多个不适当激活或激活失控即畸形激酶生长因子受体活性导致细胞生长失控。因此，此类激酶的异常活性与恶性组织生长有关。因此，此类激酶的抑制剂可提供治疗癌症方法。生长因子受体包括例如表皮生长因子受体(EGFr、ErbB2和ErbB4)；血小板衍生生长因子受体(PDGFr)；血管内皮生长因子受体(VEGFR)；具有免疫球蛋白样和表皮生长因子同源域的酪氨酸激酶(TIE-2)；胰岛素生长因子-1受体(IGF-1)；巨嗜细胞集落刺激因子(cfms)、BTK、ckit、cmet；成纤维细胞生长因子(FGF)受体；Trk受体(TrkA、TrkB和TrkC)；ephrin(eph)受体和RET原致癌基因。正在开发几种生长因子受体抑制剂，它们包括配体拮抗剂、抗体、酪氨酸激酶抑制剂、反义寡核苷酸和aptamers。在例如Kath，JohnC，Exp.Opin.Ther.Patents(2000)10(6)：803-818；Shawver et al DDTVol 2，No.21997年2月；和Lofts，F.J.et al，″Growth Factor Receptorsas Targets″(作为靶标的生长因子受体)，New Molecular Targets forCancer Chemotherapy，Ed.Workman，Paul and Kerr，David，CRC Press1994，London中有关于抑制生长因子受体功能的生长因子受体和药物的论述。
不是生长因子受体激酶的酪氨酸激酶称为非受体酪氨酸激酶。可用于本发明的作为抗肿瘤药物的靶标或潜在靶标的非受体酪氨酸激酶包括cSrc、Lck、Fyn、Yes、Jak、cAb1、FAK(粘着斑激酶)、Brutons酪氨酸激酶和Bcr-Ab1。在Sinh，S.and Corey，S.J.，(1999)Journal ofHematotherapy and Stem Cell Research 8(5)：465-80；和Bolen，J.B.，Brugge，J.S.，(1997)Annual Review of Immunology.15：371-404中有关于抑制非受体酪氨酸激酶功能的此类非受体激酶和药物的论述。
SH2/SH3域阻断剂是破坏多种酶或连接蛋白中SH2或SH3域结合的药物，这些酶和蛋白包括PI3-K p85亚单位、Src家族激酶、连接分子(Shc、Crk、Nck、Grb2)和Ras-GAP。在Smithgall，T.E.(1995)，Journal of Pharmacological and Toxicological Methods.34(3)125-32中有关于作为抗癌药物靶标的SH2/SH3域的论述。
丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂包括MAP激酶级联阻断剂包括Raf激酶(Rafk)、Mitogen或细胞内调节激酶(MEKs)和细胞外调节激酶(ERKs)的阻断剂；和蛋白激酶C家族成员阻断剂包括PKC的亚型(α、β、γ、ε、μ、λ、η、ζ)；IkB激酶家族(IKKa、IKKb)；PKB家族激酶；Akt激酶家族成员和TGFβ受体激酶的阻断剂。在Yamamoto，T.，Taya，S.，Kaibuchi，K.，(1999)，Journal of Biochemistry.126(5)799-803；Brodt，P，Samani，A.和Navab，R.(2000)，Biochemical Pharmacology，60.1101-1107；Massague，J.，Weis-Garcia，F.(1996)Cancer Surveys.27：41-64；Philip，PA，.and Harris，A.L.(1995)，Cancer Treatment andResearch.78：3-27，Lackey，K.et al Bioorganic and Medicmal ChemistryLetters，(10)，2000，223-226；和Martinez-lacaci，L.，et al，Int.J.Cancer(2000)，88(1)，44-52中有关于此类丝氨酸/苏氨酸激酶及其抑制剂的论述。
磷脂酰肌醇-3激酶家族成员的抑制剂包括PI3-激酶、ATM、DNA-PK和Ku的阻断剂也可与本发明化合物联用。在Abraham，R.T.(1996)，Current Opinion in Immunology.8(3)412-8；Canman，C.E.，Lim，D.S.(1998)，Oncogene 17(25)3301-3308；Jackson，S.P.(1997)，International Journal of Biochemistry and Cell Biology.29(7)：935-8；和Zhong，H.et al，Cancer Res，(2000)60(6)，1541-1545中有关于此类激酶的论述。
肌醇信号抑制剂例如磷脂酶C阻断剂和肌醇类似物也可与本发明联用。在Powis，G.，and Kozikowski A.，(1994)New Molecular Targetsfor Cancer Chemotherapy ed.，Paul Workman and David Kerr，CRC Press1994，London中有关于此类信号抑制剂的论述。
可与本发明联用的另一组信号转导路径抑制剂是Ras致癌基因抑制剂。此类抑制剂包括法尼基转移酶、香叶基-香叶基转移酶和CAAX蛋白酶、反义寡核苷酸和核酶的抑制剂；和免疫疗法。已证实此类抑制剂阻滞含野生型突变Ras的细胞中Ras激活，因此可起抗增殖药物的作用。在Scharovsky，O.G.，Rozados，V.R.，Gervasoni，S.I.Matar，P.(2000)，Journal of Biomedical Science.7(4)292-8；Ashby，M.N.(1998)，Current Opinion in Lipidology.9(2)99-102；和BioChim.Biophys.Acta，(1989)1423(3)：19-30中有关于Ras致癌基因抑制的论述。
如上所述，受体激酶配体结合的抗体也可用作信号转导抑制剂。该组信号转导途径抑制剂包括使用受体酪氨酸激酶的细胞外配体结合域的人源化抗体。例如，Imclone C225 EGFR特异性抗体(参见Green，M.C.et al，Monoclonal Antibody Therapy for Solid Tumors，Cancer Treat.Rev.，(2000)，26(4)，269-286)；
Figure A20068004104400321
ErbB2抗体(参见TyrosineKinase Signaling in Breast Cancer：ErbB Family Receptor TyrosineKinases(乳腺癌中的酪氨酸激酶信号：ErbB家族受体酪氨酸激酶)，Breast Cancer Res.，2000，2(3)，176-183)；和2CB VEGFR2特异性抗体(参见Brekken，R.A.et al，Selective Inhibition of VEGFR2 Activity by aMonoclonal Anti-VEGF Antibody Blocks Tumor Growth in Mice(单克隆抗VEGF抗体的选择性抑制VEGFR2活性阻滞小鼠中肿瘤生长)，Cancer Res.(2000)60，5117-5124)。
受体激酶血管发生抑制剂也可用于本发明。与血管发生相关的VEGFR和TIE2的抑制剂在以上有关信号转导抑制剂(两种受体均是受体酪氨酸激酶)中论述过。其它抑制剂可与本发明化合物联用。例如，不识别VEGFR(受体酪氨酸激酶)但与配体结合的抗VEGF抗体；抑制血管发生的整联蛋白(αvβ3)的小分子抑制剂；还证实内皮抑制素和制管张素(非RTK)可与PLK抑制剂联用。
用于免疫治疗方案的药物也可与本发明化合物联用。
用于促凋亡方案的药物(例如bcl-2反义寡核苷酸)也可与本发明联用。蛋白的Bcl-2家族成员阻滞凋亡。因此，bcl-2上调与化疗抗性有关。研究表明，表皮生长因子(EGF)刺激bcl-2家族的抗凋亡成员(即mcl-1)。因此，设计的下调肿瘤中bcl-2表达的策略已证实具有临床利益，现正进行II/III期试验，即Genta的G3139 bcl-2反义寡核苷酸。在Water JS et al.，J.Clin.Oncol.18：1812-1823(2000)；和Kitada S et al.，Antisense Res.Dev.4：71-79(1994)中有关于对bcl-2使用反义寡核苷酸策略的此类促凋亡策略的论述。
细胞周期信号抑制剂抑制参与细胞周期控制的分子。依赖细胞周期蛋白的激酶(CDKs)及其相互作用细胞周期蛋白控制经过真核细胞周期的发展。使不同细胞周期蛋白/CDK复合物协同激活或失活对于通过细胞周期的正常发展必不可少。正在开发几种细胞周期信号抑制剂。例如，在Rosania，et al.，Exp.Opin.Ther Patents 10(2)：215-230(2000)中有关于依赖细胞周期蛋白的激酶包括CDK2、CDK4和CDK6及其抑制剂实例的论述。
在一个实施方案中，本发明方法包括给予动物本发明化合物和组合应用的信号转导途径抑制剂尤其吉非替尼(gefitinib)
使用这些联合药物的方法和用途可包括按任何顺序序贯或分别同时或用组合的药用组合物给予本发明化合物和其它化疗/抗肿瘤药物。当组合在同一制剂时，可以认识到两种化合物必须稳定且彼此配伍，和可配制用于给药的制剂的其它成分。当分别配制时，可用任何便利的制剂，按本领域中此类化合物已知的方式提供它们。
当本发明化合物与化疗药物联用时，各化合物的剂量可与化合物单独给药时的剂量不同。本领域技术人员会容易的认识到适当的剂量。应选择本发明化合物和其它治疗活性药物的适当剂量和给药的相对时间，以达到需要的联合疗效，它们由主治医师的意见和判断决定。
可通过以下实施例中所述方法便利地制备本发明化合物。
本发明还提供放射性标记的本发明化合物和生物素化的本发明化合物及其固体载体结合的形式。可用常规技术制备放射性标记的本发明化合物和生物素化的本发明化合物。例如，可通过在适当的催化剂的存在下使本发明化合物与氚气反应，得到放射性标记的本发明化合物，制备放射性标记的本发明化合物。在一个实施方案中，化合物被氚化。
放射性标记的本发明化合物和生物素化的本发明化合物可用于鉴定抑制PLK的化合物的测定；鉴定治疗PLK介导的病症、治疗敏感瘤、治疗特征在于不适当增殖的病症、抑制细胞增殖和抑制细胞有丝分裂的化合物的测定。因此，本发明提供鉴定此类化合物的测定方法，该方法包括使放射性标记的本发明化合物或生物素化的本发明化合物与目标蛋白或细胞匀浆特异性结合的步骤。更尤其是，合适的测定方法包括竞争结合测定。可在本领域常规方法测定中使用放射性标记的本发明化合物和生物素化的本发明化合物及其固体载体结合的形式。
以下实施例仅用于举例说明，无意以任何方式限制本发明的范围，本发明由权利要求限定。
实施例中使用的以下缩写具有列举的含义。
g       克
mg      毫克
mol     摩尔
mmol    毫摩尔
N       当量
M       摩尔浓度
mM      毫摩尔浓度
μM     微摩尔浓度
nM      纳摩尔浓度
L       升
ml      毫升
μL     微升
h       小时
min     分钟
℃      摄氏度
HCl     盐酸
DCM       二氯甲烷
MeOH      甲醇
EtOAc     乙酸乙酯
MgSO4     硫酸镁
NaHCO3    碳酸氢钠
K2CO3     碳酸钾
Na2SO4    硫酸钠
N2        氮气
H2        氢气
XANTPHOS(4，5-二(二苯基膦基)-9，9-二甲基呫吨)是Aldrich销售的催化剂
试剂为市售或按文献方法制备。在以下结构中，″Me″是指基团-CH3。
所有涉及到醚时均指乙醚；盐水是指NaCl饱和水溶液。除另有说明外，所有温度均用℃(摄氏度)表示。除另有说明外，所有反应均在惰性气氛和室温下进行。
在Varian VXR-300、Varian Unity-300、Varian Unity-400仪器或General Electric QE-300上记录1H NMR图谱。按百万分数(ppm，δ单位)表示化学位移。偶合常数的单位为赫兹(Hz)。分裂类型描述表观多重性，以s(单峰)，d(双峰)，t(三重峰)，q(四重峰)，m(多重峰)，br(宽峰)表示。
在JOEL JMS-AX505HA，JOEL SX-102或SCIEX-APIiii分光计上记录低分辩质谱(MS)；用JOEL SX-102A分光计得到高分辩MS。所有质谱均在电喷雾离子化(ESI)、化学离子化(CI)、电子撞击(EI)下进行，或通过快原子轰击(FAB)方法得到。在Nicolet 510FT-IR分光计上，用1-mm NaCl池得到红外(IR)光谱。所有反应均通过0.25mm E.Merck硅胶板(60F-254)薄层色谱监测，用UV光，5％乙醇/磷钼酸或对甲氧基苯甲醛溶液或质谱(电喷雾或AP)目测检验。在硅胶(230-400目，Merck)上进行闪柱层析或使用自动硅胶层析(Isco，Inc.Sq 16×或100sgCombiflash)。
在与Waters 996二极管阵列检测器连接的Waters 2795仪器上得到报道的HPLC保留时间(RT)，检测波长210-500nm。使用的柱是Synergl Max-RP(50×2mm)型#00B-4337-B0。溶剂梯度为15％MeOH：水-100％MeOH(0.1％甲酸)，洗脱6min。流速为0.8mL/min。进样体积为3微升。
中间体实施例1：5-氨基-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]乙基}氧 基)-2-噻吩甲酸甲酯
Figure A20068004104400361
步骤A-5-硝基-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酸甲酯
Figure A20068004104400362
将聚合物-负载的三苯基膦(62.36g，2.21mmol/g，137.8mmol)的DCM(1.0L)浆状物在室温下搅拌10分钟。将混合物冷却至0℃。依次加入可按与文献方法(Barker，J.M.；Huddleston，P.R.；Wood，M.L.；Burkitt，S.A.Journal of Chemical Research(Miniprint)2001，1001-1022)类似的方式制备的3-羟基-5-硝基-2-噻吩甲酸甲酯(20.00g，98.44mmol)、(1S′)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙醇(26.20g，137.8mmol)和偶氮二羧酸二叔丁酯(31.73g，137.8mmol)。将反应混合物在室温下搅拌21.25h，然后通过垂熔漏斗过滤，浓缩。将残渣用4N HCl的1，4-二噁烷(300ml)溶液处理，在室温下搅拌3h。然后加入3N氢氧化钠(300mL)和饱和NaHCO3水溶液(200ml)将混合物淬灭。将混合物用DCM(3×250mL)萃取。合并的有机部分经MgSO4干燥，过滤，在硅胶上浓缩。经柱层析(0-25％EtOAc∶己烷)纯化，得到36.08g(98％)标题化合物，为黄色油状物。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.82(d，1H，J＝7.8Hz)，7.68(d，1H，J＝7.8Hz)，7.59(t，1H，J＝7.4Hz)，7.46(s，1H)，7.42(t，1H，J＝7.6Hz)，5.77(q，1H，J＝6.1Hz)，3.94(s，3H)，1.74(d，3H，J＝6.1Hz).
步骤B-5-氨基-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酸甲酯
Figure A20068004104400371
向装有温度探针、顶置机械搅拌器、回流冷凝器和加料漏斗的烧瓶中加入铁粉(26.84g，480.6mmol)和乙酸(130ml)。将铁/乙酸浆状物机械搅拌，加热至50℃内部温度。向加料漏斗中加入5-硝基-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酸甲酯(36.08g，96.13mmol)的乙酸(160mL)溶液。然后按使内部温度保持＜60℃的速度将加料漏斗中的溶液滴加到铁/乙酸浆状物中(总加入时间2.5h)。将反应混合物冷却至室温，用DCM(500mL)稀释，然后通过加入6N氢氧化钠(750mL)和饱和NaHCO3水溶液(200mL)淬灭。然后使混合物全部通过硅藻土垫过滤，将不溶物除去，将硅藻土再用DCM(250mL)冲洗。将含水部分和有机部分分离。将含水部分用EtOAc(2×400mL)萃取。将有机部分合并，经MgSO4干燥，过滤，浓缩，得到30.66g(92％)标题化合物，为橙色固体。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.89(d，1H，J＝7.7Hz)，7.62(d，1H，J＝7.7Hz)，7.56(t，1H，J＝7.7Hz)，7.36(t，1H，J＝7.7Hz)，5.72(s，1H)，5.65(q，1H，J＝6.3Hz)，4.26(brs，2H)，3.80(s，3H)，1.66(d，3H，J＝6.3Hz)；MS(APCI)：368.00[M+Na]+.
中间体实施例2：5-氨基-3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]-氧基}-2-噻吩 甲酸甲酯
Figure A20068004104400381
步骤A-3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}-5-硝基-2-噻吩甲酸甲酯
Figure A20068004104400382
按照类似于中间体实施例1，步骤A的方法，由3-羟基-5-硝基-2-噻吩甲酸甲酯和(1S)-1-(2-氯苯基)乙醇制备标题化合物。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)；δ7.96(s，1H)，7.65(dd，1H，J＝1.7，7.8Hz)，7.47(dd，1H，J＝1.5，7.7Hz)，7.40(dt，1H，J＝1.3，7.5Hz)，7.34(dt，1H，J＝1.9，7.5Hz)，5.98(q，1H，J＝6.0Hz)，3.85(s，3H)，1.59(d，3H，J＝6.2Hz).
步骤B-5-氨基-3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}-2-噻吩甲酸甲酯
Figure A20068004104400391
按照类似于中间体实施例1，步骤B的方法，由3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}-5-硝基-2-噻吩甲酸甲酯制备标题化合物。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.54(dd，1H，J＝1.8，7.9Hz)，7.45(dd，1H，J＝1.4，7.7Hz)，7.37(dt，1H，J＝1.4，7.7Hz)，7.31(dt，1H，J＝1.8，7.6Hz)，6.76(brs，2H)，5.57(q，1H，J＝6.2Hz)，5.49(s，1H)，3.63(s，3H)，1.51(d，3H，J＝6.4Hz)；MS(ESI)：334.03[M+Na]+.
实施例1：5-{5-[6-(1-哌嗪基)-3-吡啶基]-1H-苯并咪唑-1- 基}-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酰胺
Figure A20068004104400392
步骤A-5-[(4-溴-2-硝基苯基)氨基]-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)噻吩-2-甲酸甲酯
Figure A20068004104400393
在N2下，搅拌下，向5-氨基-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酸甲酯(10.0g，29.0mmol)、2，5-二溴硝基苯(8.13g，29.0mmol)、三(二亚苄基丙酮)合二钯(0)(0.53g，0.58mmol)和4，5-二(二苯基膦基)-9，9-二甲基呫吨(0.73g，1.3mmol)在甲苯(100ml)中的混合物加入碳酸铯(47.0g，144mmol)。将反应混合物在55℃下搅拌1.75h，然后将混合物略微冷却，真空浓缩至干。将固体在DCM中制成浆状物，过滤。将滤液在硅胶上浓缩。经柱层析(3-40％EtOAc∶己烷)纯化，得到9.69g(61％)标题化合物，为红色泡沫状物。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ9.46(s，1H)，8.31(d，1H，J＝2.4Hz)，7.88(s，1H，J＝8.0Hz)，7.61(m，2H)，7.47(m，2H)，7.10(d，1H，J＝8.8Hz)，6.42(s，1H)，5.70(m，1H)，3.86(s，3H)，1.71(d，3H，J＝6.4Hz).
步骤B-5-[(2-氨基-4-溴苯基)氨基]-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)噻吩-2-甲酸甲酯
Figure A20068004104400401
在55psi H2下，将5-[(4-溴-2-硝基苯基)氨基]-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]-乙基}氧基)噻吩-2-甲酸甲酯(8.54g，15.7mmol)和硫化铂(5％(重量)吸附在碳上，3.05g，0.785mmol)在EtOAc(250ml)中搅拌1.25h，然后将混合物过滤，浓缩，得到标题化合物，为黄色泡沫状物(8.66g粗产物)。MS(ESI)：516.0[M]+。
步骤C-5-(5-溴-1H-苯并咪唑-1-基)-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]乙基}氧基)噻吩-2-甲酸甲酯
在室温下，将5-[(2-氨基-4-溴苯基)氨基]-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]-乙基}氧基)噻吩-2-甲酸甲酯(8.66g粗产物)和催化量的对甲苯磺酸吡啶鎓(～20mg)在原甲酸三乙酯∶DCM(30mL∶10mL)中搅拌45min，然后反应混合物经柱层析(0-30-50％EtOAc∶己烷)纯化。将得到的泡沫状物用乙醚研磨，得到6.04g(73％，2步合计)标题化合物，为灰色固体。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.90(m，3H)，7.61(m，2H)，7.41(m，2H)，7.28(d，1H，J＝8.4Hz)，6.72(s，1H)，5.78(m，1H)，3.90(s，3H)，1.75(d，3H，J＝6.4Hz).
步骤D-4-(5-{1-[5-[(甲氧基)羰基]-4-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩基]-1H-苯并咪唑-5-基}-2-吡啶基)-1-哌嗪甲酸1，1-二甲基乙酯
Figure A20068004104400411
将4-[5-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-2-吡啶基]-1-哌嗪甲酸1，1-二甲基乙酯(1.0g，2.5mmol)悬浮于N，N-二甲基乙酰胺(14ml)，用1N碳酸钠水溶液(6mL，6mmol)、5-(5-溴-1H-苯并咪唑-1-基)-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酸甲酯(800mg，1.5mmol)和1，1′-二(二苯基膦基)二茂铁二氯合钯(II)DCM加合物(210mg，0.26mmol)处理，加热至80℃，保持1.5h。让反应物冷却至室温，过夜。使反应混合物在5∶1的氯仿∶MeOH和饱和NaHCO3水溶液之间分配。加入甲苯，将混合物浓缩(2×)，除去残余N，N-二甲基乙酰胺。粗化合物经柱层析(己烷∶EtOAc，含0.5％三乙胺)纯化，得到1.0g标题化合物，为油状物。MS(APCI)：708.15[M+H]+。
步骤E-4-(5-{1-[5-(氨基羰基)-4-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩基]-1H-苯并咪唑-5-基}-2-吡啶基)-1-哌嗪甲酸1，1-二甲基乙酯
Figure A20068004104400421
将4-(5-{1-[5-[(甲氧基)羰基]-4-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩基]-1H-苯并咪唑-5-基}-2-吡啶基)-1-哌嗪甲酸1，1-二甲基乙酯(1.0g，1.41mmol)溶于7N氨的MeOH溶液(15mL)，放入密闭容器。将混合物在80℃下加热16h，然后冷却至室温。粗混合物经柱层析(己烷∶EtOAc，含0.5％三乙胺)纯化，得到810mg标题化合物，为黄色泡沫状物。MS(APCI)：693.11[M+H]+。
步骤F-5-{5-[6-(1-哌嗪基)-3-吡啶基]-1H-苯并咪唑-1-基}-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酰胺
将4-(5-{1-[5-(氨基羰基)-4-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩基]-1H-苯并咪唑-5-基}-2-吡啶基)-1-哌嗪甲酸1，1-二甲基乙酯(810mg，1.17mmol)的氯仿(20mL)溶液用三氟乙酸(3mL)处理，在室温下搅拌1.5h。缓慢加入饱和NaHCO3水溶液至pH＞7，淬灭反应。使反应混合物在5∶1的氯仿∶MeOH和饱和NaHCO3水溶液之间分配。有机层经Na2SO4干燥。将混合物过滤，浓缩，经柱层析(90/9/1DCM/MeOH/氢氧化铵∶DCM)纯化。将产物用乙醚研磨，过滤，得到277mg标题化合物，为浅黄色固体。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.53(s，1H)，8.47(d，1H，J＝2.4Hz)，7.95-7.87(m，3H)，7.82(br s，1H)，7.77-7.74(m，2H)，7.61-7.50(m，3H)，7.12(br s，2H)，6.86(d，1H，J＝8.8Hz)，5.94(q，1H，J＝6.0Hz)，3.42(t，4H，J＝4.9Hz)，2.76(t，4H，J＝4.9Hz)，1.73(d，3H，J＝6.0Hz)；
HRMS C30H28N6O2F3S：[M+H]+理论值593.1947，实测值593.1942。
实施例2：5-{5-[2-(4-甲基-1-哌嗪基)-4-吡啶基]-1H-苯并咪唑-1- 基}-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酰胺
Figure A20068004104400431
步骤A-5-(5-溴-1H-苯并咪唑-1-基)-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]-乙基}氧基)噻吩-2-甲酰胺
在95℃下，将5-(5-溴-1H-苯并咪唑-1-基)-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)噻吩-2-甲酸甲酯(3.98g，7.58mmol)和100ml 7N氨的MeOH溶液在密闭容器中加热72h制备标题化合物。将混合物冷却至室温，过滤，得到黄色固体。剩余滤液经柱层析(0-20％MeOH∶DCM)纯化，将残余固体和以上黄色固体合并，得到3.21g(83％)标题化合物。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.94(d，1H，J＝1.6Hz)，7.89(s，1H)，7.66(m，3H)，7.43(m，2H)，7.28(m，1H)，7.17(s，1H)，6.61(s，1H)，5.83(s，1H)，5.78(m，1H)，1.79(d，3H，J＝6.4Hz).MS(ESI)：511.0[M+H]+.
步骤B-5-[5-(2-氟-4-吡啶基)-1H-苯并咪唑-1-基]-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酰胺
Figure A20068004104400441
将2-氟吡啶-4-硼酸(0.21g，1.5mmol)、5-(5-溴-1H-苯并咪唑-1-基)-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)噻吩-2-甲酰胺(0.505g，0.99mmol)和碳酸钠(1N的水溶液，3.4mL)在N.N-二甲基乙酰胺(10mL)中混合。加入1，1′-二(二苯基膦基)二茂铁二氯合钯(II)(0.078g，0.1mmol)，将反应混合物在N2下搅拌，同时在80℃下加热2h。然后将混合物冷却，在EtOAc和水之间分配。将水层用EtOAc萃取两次。合并的有机液经MgSO4干燥，在硅胶上浓缩，经柱层析(0-70％EtOAc∶己烷)纯化，得到0.343g(67％)标题化合物，为浅棕褐色固体。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.29(d，1H，J＝5.3Hz)，8.12(s，2H)，7.68(m，4H)，7.51(m，3H)，7.21(s，1H)，7.18(s，1H)，6.71(s，1H)，5.85(m，2H)，1.82(d，3H，J＝5.9Hz)；MS(ESI)：527.2[M+H]+.
步骤C-5-{5-[2-(4-甲基-1-哌嗪基)-4-吡啶基]-1H-苯并咪唑-1-基}-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酰胺
在180℃下，将5-[5-(2-氟-4-吡啶基)-1H-苯并咪唑-1-基]-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酰胺(0.243g，0.44mmol)、1-甲基哌嗪(0.4mL，3.6mmol)和乙醇(95％，0.4mL)溶液在Personal Chemistry微波炉中加热36min，然后将混合物用DCM稀释，用水洗涤，经MgSO4干燥，在硅胶上浓缩。经柱层析(10-100％90/9/1DCM/MeOH/氢氧化铵∶DCM)纯化，得到0.200g(71％)标题化合物，为棕褐色固体。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.26(d，1H，J＝5.1Hz)，8.04(s，1H)，7.98(s，1H)，7.74(d，1H，J＝7.9Hz)，7.71(d，1H，J＝7.9Hz)，7.64(t，1H，J＝7.6Hz)，7.57(dd，1H，J＝8.5，1.6Hz)，7.50(m，2H)，7.21(brs，1H)，6.92(d，1H，J＝5.1Hz)，6.88(s，1H)，6.68(s，1H)，5.87(q，1H，J＝6.3Hz)，5.81(br s，1H)，3.74(m，4H)，2.67(m，4H)，2.39(s，3H)，1.82(d，3H，J＝6.4Hz)；MS(ESI)：607.3[M+H]+.
实施例3：5-(5-{2-[(1-甲基-4-哌啶基)氨基]-4-吡啶基}-1H-苯并咪 唑-1-基)-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酰胺
在180℃下，将5-[5-(2-氟-4-吡啶基)-1H-苯并咪唑-1-基]-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酰胺(0.180g，0.34mmol)、4-氨基-1-甲基哌啶(0.4mL)和乙醇(95％，0.4mL)溶液在Personal Chemistry微波炉中加热40min，然后将混合物用DCM稀释，用水洗涤。将水层用DCM(×4)萃取，将有机液合并，经MgSO4干燥，在硅胶上浓缩。经柱层析(10-100％90/9/1 DCM/MeOH/氢氧化铵∶DCM)纯化，得到0.120g(57％)标题化合物，为浅黄色固体。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.13(d，1H，J＝5.3Hz)，8.02(d，1H，J＝1.1Hz)，7.96(s，1H)，7.72(m，2H)，7.64(t，1H，J＝7.6Hz)，7.56(dd，1H，J＝8.6，1.5Hz)，7.48(m，2H)，7.21(br s，1H)，6.82(dd，1H，J＝5.3，1.3Hz)，6.67(s，1H)，6.59(s，1H)，6.09(brs，1H)，5.87(q，1H，J＝6.2Hz)，4.53(d，1H，J＝8.1Hz)，3.73(m，1H)，2.84(d，2H，J＝10.3Hz)，2.32(s，3H)，2.21(t，2H，J＝10.9Hz)，2.12(d，2H，J＝13.0Hz)，1.81(d，3H，J＝6.2Hz)，1.60(m，2H)；MS(ESI)：621.1[M+H]+.
实施例4：5-[5-(2-氨基-4-吡啶基)-1H-苯并咪唑-1- 基]-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酰胺
步骤A-5-[5-(2-氯-4-吡啶基)-1H-苯并咪唑-1-基]-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酸甲酯
将2-氯-4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-吡啶(0.501g，2.09mmol)、5-(5-溴-1H-苯并咪唑-1-基)-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)噻吩-2-甲酸甲酯(1.00g，1.90mmol)和碳酸钠(1N的水溶液，7.5mL)在N，N-二甲基乙酰胺(15mL)中混合。加入1，1′-二(二苯基膦基)二茂铁二氯合钯(II)(0.233g，0.285mmol)，将反应混合物在N2下搅拌，同时在80℃下加热4h。然后将混合物冷却，在5∶1的DCM∶MeOH和饱和NaHCO3水溶液之间分配。将有机层用盐水洗涤两次，经Na2SO4干燥，在硅胶上浓缩。经柱层析(20-100％EtOAc/己烷，含0.5％三乙胺)纯化，得到0.520g(49％)标题化合物，为黄色固体。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.43(d，1H，J＝5.3Hz)，8.04(d，2H，J＝13.9Hz)，7.90(d，1H，J＝7.9Hz)，7.66(d，1H，J＝7.9Hz)，7.58(m，4H)，7.47(dd，1H，J＝1.1，5.1Hz)，7.41(t，1H，J＝7.6Hz)，6.78(s，1H)，5.81(q，1H，J＝6.2Hz)，3.92(s，3H)，1.77(d，3H，J＝6.2Hz)；MS(ESI)：558.1[M+H]+.
步骤B-5-(5-{2-[(二苯基甲叉基)氨基]-4-吡啶基}-1H-苯并咪唑-1-基)-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酸甲酯
向5-[5-(2-氯-4-吡啶基)-1H-苯并咪唑-1-基]-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酸甲酯(0.250g，0.45mmol)和二苯酮亚胺(0.09mL，0.54mmol)的1，4-二噁烷(2mL)脱气溶液中依次加入碳酸铯(367mg，1.13mmol)、4，5-二(二苯基膦基)-9，9-二甲基-呫吨(10.0mg，0.018mmol)和三(二亚苄基丙酮)合二钯(0)(8.0mg，0.009mmol)。将反应混合物加热至90℃，保持24h。然后将反应混合物用EtOAc稀释，在硅胶上浓缩，经柱层析(0-60％EtOAc∶己烷)纯化，得到0.255g(83％)标题化合物，为灰白色固体。MS(ESI)：703.3[M+H]+。
步骤C-5-[5-(2-氨基-4-吡啶基)-1H-苯并咪唑-1-基]-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酸甲酯
Figure A20068004104400481
向5-(5-{2-[(二苯基甲叉基)氨基]-4-吡啶基}-1H-苯并咪唑-1-基)-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酸甲酯(0.160mg，0.228mmol)的四氢呋喃(6mL)溶液中加入HCl(2N，水溶液，3.0mL)，将溶液在室温下搅拌过夜。然后将反应混合物用DCM稀释，用饱和NaHCO3水溶液洗涤，经MgSO4干燥。将滤液在硅胶上蒸发。经柱层析(10-100％1/9/90氢氧化铵/MeOH/DCM∶DCM)纯化，得到0.107g(88％)标题化合物，为灰白色固体。MS(ESI)：539.2[M+H]+。
步骤D-5-[5-(2-氨基-4-吡啶基)-1H-苯并咪唑-1-基]-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酰胺
在85℃下，将5-[5-(2-氨基-4-吡啶基)-1H-苯并咪唑-1-基]-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酸甲酯(0.107g，0.199mmol)和8mL 7N氨的MeOH溶液在密闭的容器中加热10h，制备标题化合物。将混合物在硅胶上蒸发，经柱层析(10-90％1/9/90氢氧化铵/MeOH/DCM∶DCM)纯化，得到0.085g(82％)需要的产物，为白色固体。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.58(s，1H)，7.98(s，1H)，7.92(m，2H)，7.83(br s，1H)，7.76(m，2H)，7.57(m，3H)，7.14(s，1H)，7.12(br s，1H)，6.84(d，1H，J＝5.3)，6.75(s，1H)，5.95(m，3H)，1.73(d，3H，J＝6.0Hz).
HRMS C26H21N5O2F3S：[M+H]+理论值524.1368，实测值524.1367。
实施例5：5-[5-(1H-吡唑-4-基)-1H-苯并咪唑-1- 基]-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酰胺
Figure A20068004104400491
步骤A-5-[5-(1H-吡唑-4-基)-1H-苯并咪唑-1-基]-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酸甲酯
Figure A20068004104400492
将4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(148mg，0.76mmol)的N，N-二甲基乙酰胺(3mL)溶液用1N碳酸钠水溶液(1.5mL，1.5mmol)、5-(5-溴-1H-苯并咪唑-1-基)-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]乙基}氧基)噻吩-2-甲酸甲酯(200mg，0.38mmol)和1，1′-二(二苯基膦基)二茂铁二氯合钯(II)DCM加合物(70mg，0.07mmol)处理，加热至80℃，保持2h。冷却至室温后，使反应混合物在5∶1的氯仿∶MeOH和饱和NaHCO3水溶液之间分配。将有机层用盐水(×2)洗涤。将各液层分离，有机层经Na2SO4干燥。将溶液过滤，浓缩，置于真空泵真空下过夜，除去残余N，N-二甲基乙酰胺。粗化合物经柱层析(50-100％EtOAc/己烷，含0.5％三乙胺)纯化，得到132mg标题化合物，为泡沫状物。MS(APCI)：512.9[M+H]+。
步骤B-5-[5-(1H-吡唑-4-基)-1H-苯并咪唑-1-基]-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酰胺
Figure A20068004104400501
按照类似于实施例1，步骤E的方法，由5-[5-(1H-吡唑-4-基)-1H-苯并咪唑-1-基]-3-({(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙基}氧基)-2-噻吩甲酸甲酯制备标题化合物。
1HNMR(400MHz，CDCl3)：δ7.91(m，4H)，7.72(d，1H，J＝7.9Hz)，7.69(d，1H，J＝8.0Hz)，7.45(m，3H)，7.20(br s，1H)，5.91(br s，1H)，5.85(q，1H，J＝6.2Hz)，1.80(d，3H，J＝6.0Hz).
HRMS C24H19N5O2F3S：[M+H]+理论值498.1212，实测值498.1204。
实施例6：3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}-5-(5-{6-[(1-甲基-4-哌 啶基)氨基]-3-吡啶基}-1H-苯并咪唑-1-基)-2-噻吩甲酰胺
Figure A20068004104400502
步骤A-5-[(4-溴-2-硝基苯基)氨基]-3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}噻吩-2-甲酸甲酯
Figure A20068004104400511
按照类似于实施例1，步骤A的方法，由5-氨基-3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}-2-噻吩甲酸甲酯制备标题化合物。MS(ESI)：534.0[M+Na]+。
步骤B-5-[(2-氨基-4-溴苯基)氨基]-3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}噻吩-2-甲酸甲酯
Figure A20068004104400512
按照类似于实施例1，步骤B的方法，由5-[(4-溴-2-硝基苯基)氨基]-3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}噻吩-2-甲酸甲酯制备标题化合物。MS(ESI)：482.0[M+H]+。
步骤C-5-(5-溴-1H-苯并咪唑-1-基)-3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}噻吩-2-甲酸甲酯
Figure A20068004104400513
按照类似于实施例1，步骤C的方法，由5-[(2-氨基-4-溴苯基)氨基]-3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}噻吩-2-甲酸甲酯制备标题化合物。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.02(s，1H)，7.70(dd，1H，J＝7.6，1.8Hz)，7.51-7.28(m，6H)，6.74(s，1H)，5.86(q，1H，J＝6.3Hz)，3.97(s，3H)，1.79(d，3H，J＝6.5Hz)；MS(APCI)：492.79[M+H]+，
步骤D-5-(5-溴-1H-苯并咪唑-1-基)-3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]-氧基}噻吩-2-甲酰胺
Figure A20068004104400521
按照类似于实施例2，步骤A的方法，由5-(5-溴-1H-苯并咪唑-1-基)-3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}噻吩-2-甲酸甲酯制备标题化合物。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.00(s，1H)，7.97(d，J＝1.3Hz，1H)，7.46-7.41(m，3H)，7.35-7.26(m，3H)，7.17(brs，1H)，6.60(s，1H)，5.85(q，J＝6.4Hz，1H)，5.75(br s，1H)，1.76(d，J＝6.4Hz，3H).MS(APCI)：478.0[M+H]+.
步骤E-3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}-5-[5-(6-氟吡啶-3-基)-1H-苯并咪唑-1-基]噻吩-2-甲酰胺
Figure A20068004104400522
按照类似于实施例2，步骤B的方法，由5-(5-溴-1H-苯并咪唑-1-基)-3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}噻吩-2-甲酰胺和2-氟吡啶-4-硼酸制备标题化合物。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.47(s，1H)，8.02(m，2H)，7.49(m，4H)，7.34(m，2H)，7.21(br s，1H)，7.03(m，1H)，6.67(s，1H)，5.89(m，1H)，5.76(brs，1H)，1.79(d，3H，J＝5.6Hz)；MS(ESI)：493.1[M+H]+.
步骤F-3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}-5-(5-{6-[(1-甲基-4-哌啶基)氨基]-3-吡啶基}-1H-苯并咪唑-1-基)-2-噻吩甲酰胺
Figure A20068004104400531
按照类似于实施例3的方法，由3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}-5-[5-(6-氟吡啶-3-基)-1H-苯并咪唑-1-基]噻吩-2-甲酰胺和1-甲基-4-哌啶胺制备标题化合物。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.35(d，1H，J＝2.0Hz)，7.96(s，1H)，7.90(s，1H)，7.68-7.66(m，1H)，7.50-7.41(m，4H)，7.35-7.20(m，3H)，6.61(s，1H)，6.46(d，1H，J＝8.4Hz)，5.88-5.75(m，1H)，4.47-4.45(m，1H)，3.75(br s，1H)，2.96-2.88(m，2H)，2.36(s，3H)，2.30-2.08(m，6H)，1.77(d，3H，J＝6.4Hz)；MS(ESI)：587[M+H]+.
实施例7：3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}-5-{5-[6-(1-哌嗪基)-3- 吡啶基]-1H-苯并咪唑-1-基}-2-噻吩甲酰胺
Figure A20068004104400532
步骤A-4-[5-(1-{4-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}-5-[(甲氧基)羰基]-2-噻吩基}-1H-苯并咪唑-5-基)-2-吡啶基]-1-哌嗪甲酸1，1-二甲基乙酯
Figure A20068004104400541
按照类似于实施例1，步骤D的方法，由5-(5-溴-1H-苯并咪唑-1-基)-3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}噻吩-2-甲酸甲酯和4-[5-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-2-吡啶基]-1-哌嗪甲酸1，1-二甲基乙酯制备标题化合物。MS(APCI)：674.1[M+H]+。
步骤B-4-{5-[1-(5-(氨基羰基)-4-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}-2-噻吩基)-1H-苯并咪唑-5-基]-2-吡啶基}-1-哌嗪甲酸1，1-二甲基乙酯
Figure A20068004104400542
按照类似于实施例1，步骤E的方法，由4-[5-(1-{4-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}-5-[(甲氧基)羰基]-2-噻吩基}-1H-苯并咪唑-5-基)-2-吡啶基]-1-哌嗪甲酸1，1-二甲基乙酯制备标题化合物。MS(APCI)：659.1[M+H]+。
步骤C-3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}-5-{5-[6-(1-哌嗪基)-3-吡啶基]-1H-苯并咪唑-1-基}-2-噻吩甲酰胺
按照类似于实施例1，步骤F的方法，由4-{5-[1-(5-(氨基羰基)-4-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}-2-噻吩基)-1H-苯并咪唑-5-基]-2-吡啶基}-1-哌嗪甲酸1，1-二甲基乙酯制备标题化合物。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.63(s，1H)，8.54(d，1H，J＝2.5Hz)，8.02(s，1H)，7.96(dd，1H，J＝8.8，2.7Hz)，7.85(br s，1H)，7.73(dd，1H，J＝7.6，1.7Hz)，7.69-7.55(m，3H)，7.51-7.37(m，2H)，7.26(s，1H)，7.16(br s，1H)，6.93(d，1H，J＝8.8Hz)，6.04(q，1H，J＝6.3Hz)，3.53-3.47(m，4H)，2.87-2.81(m，4H)，1.78(d，3H，J＝6.3Hz)；
HRMS C29H27ClN6O2S：[M+H]+理论值559.1680，实测值559.1676。
实施例8：3-{[1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}-5-(5-{1-[3-(4-乙基-1- 哌嗪基)丙基]-1H-吡唑-4-基}-1H-苯并咪唑-1-基)-2-噻吩甲酰胺
Figure A20068004104400552
步骤A-3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}-5-[5-(1H-吡唑-4-基)-1H-苯并咪唑-1-基]-2-噻吩甲酸甲酯
Figure A20068004104400553
将4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(355mg，1.83mmol)的N，N-二甲基乙酰胺(15mL)溶液用1N碳酸钠水溶液(4.5ml，4.5mmol)、5-(5-溴-1H-苯并咪唑-1-基)-3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}噻吩-2-甲酸甲酯(600mg，1.22mmol)和1，1′-二(二苯基膦基)二茂铁二氯合钯(II)DCM加合物(149mg，0.18mmol)处理，加热至80℃，过夜。冷却至室温后，使反应混合物在5∶1的氯仿∶MeOH和饱和NaHCO3水溶液之间分配。将各液层分离，有机层经Na2SO4干燥。将溶液过滤，浓缩，置于真空泵真空下过夜，除去残余N，N-二甲基乙酰胺。粗化合物经柱层析(己烷∶EtOAc，含0.5％三乙胺)纯化，得到349mg标题化合物，为泡沫状物。MS(APCI)：478.9[M+H]+。
步骤B-3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}-5-(5-{1-[3-(4-乙基-1-哌嗪基)丙基]-1H-吡唑-4-基}-1H-苯并咪唑-1-基)-2-噻吩甲酸甲酯
Figure A20068004104400561
向3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}-5-[5-(1H-吡唑-4-基)-1H-苯并咪唑-1-基]-2-噻吩甲酸甲酯(125mg，0.26mmol)的N，N-二甲基甲酰胺(2ml)溶液中加入碳酸铯(136mg，0.42mmol)，搅拌30min。将文献已知(Journal of the Chemical Society，Abstracts 1961，2404-2418)1-(3-溴丙基)-4-乙基哌嗪二氢溴酸盐(165mg，0.42mmol)和另外的碳酸铯(136mg，0.42mmol)加入反应物中，在70℃下搅拌1h。未出现反应。再加入碳酸铯(170mg)，反应在1.5h内完成。将反应化合物在硅胶上浓缩，经柱层析(己烷然后DCM：90/9/1DCM/MeOH/氢氧化铵)纯化，得到140mg标题化合物，为黄色油状物。MS(ESI)：633.31[M+H]+。
步骤C-3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}-5-(5-{1-[3-(4-乙基-1-哌嗪基)丙基]-1H-吡唑-4-基}-1H-苯并咪唑-1-基)-2-噻吩甲酰胺
Figure A20068004104400571
将3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}-5-(5-{1-[3-(4-乙基-1-哌嗪基)丙基]-1H-吡唑-4-基}-1H-苯并咪唑-1-基)-2-噻吩甲酸甲酯(140mg，0.22mmol)溶于7N氨的MeOH溶液(6mL)中，放入密闭容器。将反应物在80℃下加热过夜，冷却至室温，此时反应不完全。再加入7N氨的MeOH溶液(1.5mL)，再将反应物在80℃下加热4小时。然后加入硅胶，将混合物浓缩，经柱层析(90/9/1DCM/MeOH/氢氧化铵∶DCM)纯化，得到45mg标题化合物，为浅褐色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6：δ8.58(s，1H)，8.28(s，1H)，8.01(s，1H)，7.98(s，1H)，7.80(br s，1H)，7.73(dd，1H，J＝7.5，1.8Hz)，7.64(d，1H，J＝9.7Hz)，7.56-7.39(m，4H)，7.22(s，1H)，7.18(br s，1H)，6.04(q，1H，J＝6.3Hz)，4.17(t，2H，J＝7.0Hz)，2.56-2.50(m，2H)，2.45-2.25(m，10H)，2.06-1.94(m，2H)，1.77(d，3H，J＝6.3Hz)，1.01(t，3H，J＝7.1Hz)；
HRMS C32H37N7O2SCl：[M+H]+理论值618.2412，实测值618.2410。
实施例9：3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}-5-[5-(1-甲基-1H-吡唑 -4-基)-1H-苯并咪唑-1-基]-2-噻吩甲酰胺
将1-甲基-4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)1H-吡唑(1.6g，7.6mmol)悬浮于N，N-二甲基乙酰胺(22mL)，用1N碳酸钠水溶液(11.7mL，11.7mmol)、5-(5-溴-1H-苯并咪唑-1-基)-3-{[(1R)-1-(2-氯苯基)乙基]氧基}-2-噻吩甲酰胺(2.8g，5.9mmol)和1，1′-二(二苯基膦基)二茂铁二氯合钯(II)DCM加合物(479mg，0.59mmol)处理，加热至80℃，保持30min。让反应物冷却至室温后，在5∶1的DCM∶MeOH和水之间分配。将各液层分离，有机层经Na2SO4干燥。将混合物过滤，浓缩，置于真空泵下，在50℃下过夜，除去残余N，N-二甲基乙酰胺。将油状物溶于DCM。加入硅胶，将混合物浓缩。化合物经柱层析(90/9/1DCM/MeOH/氢氧化铵∶DCM)纯化。将产物用乙醚研磨，过滤，得到2.85g标题化合物，为白色固体。因为存在杂质，所以将该固体溶于DCM，经柱层析(EtOAc∶MeOH)再纯化，得到产物，为白色固体(2.76g)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.54(s，1H)，8.19(s，1H)，7.95(s，1H)，7.93(s，1H)，7.81(br s，1H)，7.68(dd，1H，J＝7.7，1.5Hz)，7.58(d，1H，J＝8.5Hz)，7.52-7.47(m，2H)，7.45-7.34(m，2H)，7.18(s，1H)，7.11(br s，1H)，5.99(q，1H，J＝6.3Hz)，3.85(s，3H)，1.72(d，3H，J＝6.2Hz)；
HRMS C24H20ClN5O2S：[M+H]+理论值478.1100，实测值478.1102。
比较实施例
可用本领域中已知方法，包括SmithKline Beecham的PCT公布号WO2004/014899中所述那些方法，制备编号126、127、134和156的比较实施例。
Figure A20068004104400591
生物学实施例
I.PLK1的抑制测定
A.6×N-端His标记的PLK激酶域的制备
在多角体蛋白启动子控制下，由杆状病毒感染的T.ni细胞制备6×N-端His标记的PLK激酶域(前面是MKKGHHHHHHD的氨基酸21-346)SEQ ID：No.1。所有方法均在4℃下实施。将细胞在50mMHEPES，200mM NaCl，50mM咪唑，5％甘油；pH 7.5中裂胞。按14Krpm，将匀浆在SLA-1500离心机中离心1h，使上清液通过1.2微米滤器过滤。将上清液加载到镍螯合琼脂糖(Amersham Pharmacia)柱上，用裂解缓冲液洗涤。用20％、30％和100％缓冲液B步骤洗脱蛋白，其中缓冲液B为50mM HEPES，200mM NaCl，300mM咪唑，5％甘油；pH 7.5。通过SDS-PAGE测定含PLK的流分。用50mM HEPES，1mMDTT，5％甘油；pH 7.5将含PLK的流分稀释5倍，然后加载到SP琼脂糖(Amersham Pharmacia)柱上。用50mM HEPES，1mM DTT，5％甘油；pH 7.5洗涤柱后，用50mM HEPES，1mM DTT，500mM NaCl；5％甘油；pH 7.5分步洗脱PLK。用10kDa分子量截断膜浓缩PLK，然后加载到在25mM HEPES，1mM DTT，500mM NaCl，5％甘油；pH 7.5中平衡的Superdex 200凝胶过滤(Amersham Pharmacia)柱上。通过SDS-PAGE测定含PLK的流分。合并PLK，等分并在-80℃下贮存。用质谱、N-端测序和氨基酸分析对样品进行质量控制。
B.如下测定酶活性+/-抑制剂：
在信号发生随时间和酶线性增加的条件下，得到所有测量结果。按各种已知浓度，将试验化合物的100％DMSO溶液加入白色384孔测定板(在10μL和某些20μl测定中加入0.1μL；在某些20μL测定中加入1μL)。用DMSO(1-5％终浓度，视情况而定)和EDTA(在反应中为65mM)作对照。在22℃下如下制备反应混合物：
25mM HEPES，pH 7.2
15mM MgCl2
1μM ATP
0.05μCi/孔33P-γATP(10Ci/mMol)
1μM底物肽(生物素-Ahx-SFNDTLDFD)SEQ ID：No.2
0.15mg/mL BSA
1mM DTT
2nM PLK1激酶域(最后加入)
通过自动液体机械手加入酶后，立即将反应混合物(10或20μl)快速加入各孔中，在22℃下温育1-1.5h。用50μl终止反应混合物(50mM EDTA，4.0mg/mL链霉抗生物素SPA珠的标准Dulbecco PBS(不含Mg2+和Ca2+)溶液，50μM ATP)/孔终止20μl酶反应物反应。用10μL终止反应混合物(50mM EDTA，3.0mg/mL与链霉抗生物素偶联的SPA成像珠(″LeadSeeker″)的标准Dulbecco PBS(不含Mg2+和Ca2+)溶液，50μM ATP)/孔终止10μL反应物反应。用透明塑料封盖封板，按500×g旋转1min或沉降过夜，在Packard TopCount中，按30秒/孔(普通SPA)计数，或用Viewlux成像机(LeadSeeker SPA)成像。将高于背景(EDTA对照)的信号转换为相对于在对照(仅含DMSO)孔中得到的抑制％。
C.结果
在下表1和2报道得到的数据。在表1和2中，+＝pIC50＜6；++＝pIC50 6-8；+++＝pIC50＞8。
II.亚甲蓝细胞生长抑制测定
在5％CO2，95％空气潮湿培养箱中，在37℃下，在含10％胎牛血清(FBS)的高葡萄糖DMEM(Life Technologies)中培养正常人包皮成纤维细胞(HFF)、人结肠(HCT116，RKO)、肺(H460，A549)和乳腺(MCF7)肿瘤细胞系。用胰蛋白酶/EDTA收获细胞，用血细胞计数器计数，并按以下密度：HFF 5,000细胞/孔，HCT116 3,000细胞/孔，RKO 2,500细胞/孔，H460 2,500细胞/孔，A549 5,000细胞/孔，MCF74,000细胞/孔，接种在96孔组织培养板(Falcon 3075)中，每孔含100μL培养基。次日，将化合物用含100μg/mL庆大霉素的低葡萄糖DMEM稀释，第二次用10mM的DMSO贮备液稀释至最终需要的浓度。将100μL/孔各稀释度溶液加入含100μL培养基的测定板中。将含0.6％DMSO的培养基加入对照孔中。在所有孔中的DMSO终浓度均为0.3％。将细胞在37℃，5％CO2下温育72h。吸去培养基。通过用80μl/孔亚甲蓝(Sigma M9140，0.5％的50∶50乙醇∶水溶液)将细胞染色，在室温下温育30-60min，估算细胞生物量。吸去染色，通过浸泡在水中漂洗板，然后晾干。为使细胞释放着色剂，加入100μL增溶溶液(1％N-月桂酰肌氨酸钠盐PBS溶液，Sigma L5125)，将板轻轻振摇约30min。在微量读板器上测量620nM处的光密度。计算相对于溶媒处理的对照孔的细胞生长抑制％。用非线性回归(Levenberg-Marquardt)和方程，y＝Vmax*(1-(x/(K+x)))+Y2，其中″K″等于IC50，内推抑制细胞生长50％的化合物浓度(IC50)。下表1中报道得到的数据。在表1中，+＝IC50＞1μM；++＝IC50 0.1-1μM：+++＝IC50＜0.1μM。
III.细胞滴定度(Cell-Titer)Glo细胞生长抑制测定
在5％CO2培养箱中，在37℃下，在含10％胎牛血清的RPMI 1640中培养A549-L(人肺)、BT474(人乳腺)、Colo 205(人结肠)、H1299(人肺)、Hela(人子宫颈)、HCT-116(人结肠)、HN5(人头和颈)、HT29(人结肠)、LNCap(人前列腺)、MCF7(人乳腺)、MDA-MB468(人乳腺)、MX-1(人乳腺)、RPMI 8226(人外周血)、SKOV3(人卵巢)和P388(鼠白血病)细胞系。在测定前2-3天，将细胞系分装在T75瓶(Falcon#353136)中，将细胞密度设为在测定收获时得到约70-80％融合的密度。用0.25％含EDTA的胰蛋白酶(Glibco/Invitrogen#25200-056)收获细胞。用锥虫蓝排除染色法，在细胞悬浮液中对细胞计数，然后按以下密度，在96孔Costar#3916黑色平底板中，将细胞接种到各孔中，每孔含105μL培养基。所有人细胞系均按500细胞/孔接种。按250细胞/孔接种P388。所有板在5％CO2，37℃下接种，过夜，然后次日加入试验化合物。用CellTiter-Glo (Promega#G7573)处理一块板中的各细胞类型，进行第0天增殖测量，按下述读板。在透明U底聚丙烯96孔板(Falcon#35-1190中制备连续两倍稀释度的试验化合物。将9μL的这些稀释度溶液加入细胞板各孔中。所有孔中的DMSO终浓度均为0.15％。将细胞在37℃，5％CO2下温育72h。和化合物一起温育72h后，将各板显色，读板。将与孔中细胞培养基等体积的CellTiter-Glo试剂加入测定板中。将板振摇约2分钟，在室温下温育约15min，在Victor V或Envison 2100读板器上读取化学发光信号。按相对于100％增殖(DMSO对照)的增殖百分率表示细胞生长抑制％。用XL拟合，通过数据的4或6参数拟合分析抑制细胞生长50％的化合物浓度(IC50)，因为背景将未加入细胞的数值从所有样品中扣除。数据见下表2所示。在表2中，+＝IC50＞1μM；++＝IC50 0.1-1μM：+++＝IC50＜0.1μM。
III.药代动力学(PK)
在饲养后有意识的CD-1小鼠中，对本发明化合物的静脉内药代动力学进行了初步研究。将化合物配制成1-10mg/kg，5mL/kg，1-2mg/mL溶液(表3)。21只雄性小鼠(n＝3只小鼠/时间点)(～30g)通过在尾静脉一次性大剂量注射接受剂量溶液。iv制剂是20％β环糊精的pH3.5-6盐水溶液或PEG400∶乙醇∶盐水(50∶15∶35v/v)溶液。在iv给药后2、15、30、60min、2、4和6h，在CO2室中麻醉后，通过心脏穿刺定时采集血样(～0.4ml)。将血样收集到含肝素的试管中，收集后迅速置于碎冰上。通过离心收集血浆，冷冻，在约-80℃下贮存以备分析。通过配备电喷雾离子源的LC/MS/MS和用合适基质的校正曲线测定血液或血浆浓度。定量的低水平(LLQ)为10ng/mL。按照非房室方法，用计算机程序WinNonlin Professional(4.1版)分析血液或血浆浓度-时间数据。对于最高达Cmax的各递增梯形，用线性梯形规则；对于其后各梯形，用log梯形规则计算血液或血浆浓度-时间曲线下面积(AUC)。用最小平方回归分析，通过决定回归分析末期数据点的适当数目的目测数据，由浓度-时间曲线的log-线性分布相得到末期消除速率常数(λz)。
iv给药后，估算总身体清除率(CL)。通过用剂量除以AUC(0-t)计算CL。将清除率值如下分类。低清除＜30mL/min/kg，中等清除为30-70mL/min/kg，高清除＞70mL/min/kg。根据肝血流量分类，即0-30％肝血流量为低，30-70％为中等，70-100％为高。小鼠肝血流量为～100mL/min/kg。
表1
  MEB  MEB  MEB  MEB  MEB  MEB  MEB
PLK1pIC50 HCT116IC50(μM)  H460IC50(μM)  MCF7IC50(μM)  A549IC50(μM)  RKOIC50(μM)  MX-1IC50(μM)  HFFIC50(μM)
 实施例1   +++  ++  ++  ND  ++  +++  ++  +
 实施例2   +++  ND  ND  ND  ND  ND  ND  ND
 实施例3   +++  ND  ND  ND  ND  ND  ND  ND
 实施例4   +++  +++  +++  ND  +++  +++  +++  ++
 实施例5   +++  +++  +++  ND  +++  +++  +++  ++
 实施例6   +++  ND  ND  ND  ND  ND  ND  ND
 实施例7   +++  ++  ND  ND  ND  +++  ND  ND
 实施例8   +++  ND  ND  ND  ND  ND  ND  ND
 实施例9   +++  +++  +++  ND  +++  +++  +++  ++
 MEB  MEB   MEB   MEB  MEB   MEB  MEB
PLK1pIC50 HCT116IC50(μM)  H460IC50(μM)   MCF7IC50(μM)   A549IC50(μM)  RKOIC50(μM)   MX-1IC50(μM)  HFFIC50(μM)
  PU4870实施例126  +++  +++  +++   +   +++  +++   ND  ++
  实施例126的手性R  +++  +++  +++   +++   +++  +++   +++  ++
  实施例126的手性S  ++  +  +   +   +  +   ND  +
  PU4870实施例127  +++  ND  +++   ++   +++  +++   ND  +
  实施例127的手性R  +++  +++  +++   +++   +++  +++   ND  ND
  PU4870实施例134  ++  +  +   +   +  +   ND  +
  PU4870实施例156  ++  +  +   +   ND  +   ND  +
ND：未测定
表2
  CTG  CTG  CTG   CTG   CTG   CTG   CTG
HCT116IC50(μM) COLO205IC50(μM)  P388IC50(μM)   A549-LIC50(μM)   HT29IC50(μM)   SKOV-3IC50(μM)   MX-1IC50(μM)
  实施例1   +++  +++  ++   ++   +++   ++   +++
  实施例2   +++  +++  ++   +++   +++   ++   +++
  实施例3   +++  +++  +++   +++   +++   +++   +++
  实施例4   +++  ND  ND   ND   ND   ND   ND
  实施例5   +++  ND  ND   ND   ND   ND   ND
  实施例6   +++  +++  ++   +++   +++   +++   +++
  实施例7   +++  +++  +++   +++   +++   ++   ++
  实施例8   +++  +++  +++   +++   +++   +++   +++
  实施例9   +++  +++  ++   +++   +++   +++   +++
  PU4870实施例126   ND  ND  ND   ND   ND   ND   ND
  实施例126的手性R   +++  +++  ND   +++   +++   +++   +++
  实施例126的手性S   ND  ND  ND   ND   ND   ND   ND
  PU4870实施例127   ++  ND  ND   ND   ND   ND   ND
  实施例127的手性R   ND  ND  ND   ND   ND   ND   ND
  PU4870实施例134   +  ND  ND   ND   ND   ND   ND
  PU4870实施例156   ND  ND  ND   ND   ND   ND   ND
ND：未测定
续表2
  CTG  CTG   CTG  CTG  CTG   CTG  CTG   CTG
BT474IC50(μM) HelaIC50(μM) HN5IC50(μM) LNCapIC50(μM) MCF7IC50(μM)   MDA-MB468IC50(μM) H1299IC50(μM) RPMI 8226IC50(μM)
  实施例8   +++  +++   +++  +++  +++   +++  +++   +++
  实施例9   +++  +++   +++  +++  +++   +++  +++   +++
  PU4870实施例126   ND  ND   ND  ND  ND   ND  ND   ND
  实施例126的手性R   ND  +++   ND  ND  +++   +++  +++   ND
  实施例126的手性S   ND  ND   ND  ND  ND   ND  ND   ND
  PU4870实施例127   ND  ND   ND  ND  ND   ND  ND   ND
  实施例127的手性R   ND  ND   ND  ND  ND   ND  ND   ND
  PU4870实施例134   ND  ND   ND  ND  ND   ND  ND   ND
  PU4870实施例156   ND  ND   ND  ND  ND   ND  ND   ND
ND：未测定
表3
  制剂   剂量(mg/kg)   血浆CL(ml/min/kg)   AUC(0-t)(ng*h/ml)
  实施例1   1MG/ML的20％SBE β-环糊精、盐水溶液(PH＝4.0)   4.8   23.5   3420
  实施例2   20％SBE β-CD的盐水溶液PH 5.0   4.3   32.3   2200
  实施例3   20％SBE β-CD的盐水溶液PH＝3.0-4.0   3.9   35.6   1850
  实施例4   14％(W/V)SBE CD的盐水溶液，1.4％DMSO和22.4％PEG400；PH＝4.0   2.7   37.9   1170
  实施例5   1MG/ML的20％SBE β-环糊精、盐水溶液(PH＝4.5-5.0)   1.9   23.1   1370
  实施例6   20％SBE β-CD的盐水溶液，PH＝3.5-4.0   3.1   18.6   2780
  实施例7   20％SBE β-CD的盐水溶液，PH＝4.0   7.4   33   3740
  实施例8   20％SBE β-CD的盐水溶液，PH＝4.0   3.7   43.6   1410
  实施例9   50％PEG400∶15％乙醇∶35％盐水   4.2   12.1   5760
  PU4870实施例126   ND   ND   ND
  实施例126的手性R   50％PEG400；10％50mM HCL；15％乙醇；10％盐水，PH＝5-5.5   4   90.85   730*
  PU4870实施例127   ND   ND   ND
  实施例127的手性R   1MG/ML的20％SBE β-环糊精、盐水溶液PH＝4.5-5   2.5   98.6   400**
ND：未测定，*0-4h，**0-1h
结果总结
在PLK1酶测定和/或亚甲蓝或细胞滴定度glo细胞增殖测定中，显示实施例1-9的酶和/或细胞活性优于比较实施例126(手性S)、134和156。
在试验系统中，显示实施例1-9在小鼠中的药代动力学(PK)性质优于比较实施例126(手性R)和127(手性R)。当通过IV给予小鼠实施例1-9和比较实施例126和127的手性R的溶液时，与比较实施例126(手性R)和127(手性R)相比，实施例1-9的清除率(CL)较低和血浆浓度-时间曲线下面积(AUC)较高。
序列表
<110>史密丝克莱恩比彻姆公司
<120>苯并咪唑噻吩化合物
<130>PR61604
<150>60/714,303
<151>2005-09-06
<160>2
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>11
<212>PRT
<213>杆状病毒感染的T.ni细胞
<400>1
Met Lys Lys Gly His His His His His His Asp
 1               5                  10
<210>2
<211>9
<212>PRT
<213>优化的PLK肽底物
<400>2
Ser Phe Asn Asp Thr Leu Asp Phe Asp
 1               5

Claims (32)

1.一种化合物及其药学上可接受的盐和溶剂合物，所述化合物选自：
Figure A2006800410440002C1
其中*表示手性碳。
2.权利要求1的对映体富集的化合物，其中所述手性碳的立体化学为R。
3.一种对映体富集的化合物及其药学上可接受的盐和溶剂合物，所述化合物具有A-1所示绝对立体化学：
Figure A2006800410440003C1
4.一种对映体富集的化合物及其药学上可接受的盐和溶剂合物，所述化合物具有B-1所示绝对立体化学：
Figure A2006800410440003C2
5.一种对映体富集的化合物及其药学上可接受的盐和溶剂合物，所述化合物具有C-1所示绝对立体化学：
Figure A2006800410440003C3
6.一种对映体富集的化合物及其药学上可接受的盐和溶剂合物，所述化合物具有D-1所示绝对立体化学：
Figure A2006800410440003C4
7.一种对映体富集的化合物及其药学上可接受的盐和溶剂合物，所述化合物具有E-1所示绝对立体化学：
Figure A2006800410440004C1
8.一种对映体富集的化合物及其药学上可接受的盐和溶剂合物，所述化合物具有F-1所示绝对立体化学：
Figure A2006800410440004C2
9.一种对映体富集的化合物及其药学上可接受的盐和溶剂合物，所述化合物具有G-1所示绝对立体化学：
Figure A2006800410440004C3
10.一种对映体富集的化合物及其药学上可接受的盐和溶剂合物，所述化合物具有H-1所示绝对立体化学：
Figure A2006800410440004C4
11.一种对映体富集的化合物及其药学上可接受的盐和溶剂合物，所述化合物具有I-1所示绝对立体化学：
Figure A2006800410440005C1
12.一种药用组合物，所述组合物包含权利要求1-11中任一项的化合物。
13.权利要求12的药用组合物，所述组合物还包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
14.权利要求12的药用组合物，所述组合物还包含化疗药物。
15.一种在有需要的哺乳动物中治疗PLK介导的病症的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的权利要求1的化合物。
16.一种在有需要的哺乳动物中治疗敏感瘤的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的权利要求1的任一化合物。
17.权利要求16的方法，其中所述敏感瘤选自乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、淋巴瘤、白血病、子宫内膜癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、鳞状上皮细胞癌、头和颈癌和食管癌。
18.一种在有需要的哺乳动物中治疗乳腺癌的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的权利要求1的化合物。
19.一种在有需要的哺乳动物中治疗特征在于不适当细胞增殖的病症的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的权利要求1的化合物。
20.一种抑制细胞增殖的方法，所述方法包括使所述细胞与足以抑制细胞增殖的量的权利要求1的化合物接触。
21.一种抑制细胞有丝分裂的方法，所述方法包括给予所述细胞足以抑制细胞有丝分裂的量的权利要求1的化合物。
22.权利要求1-11中任一项的化合物，所述化合物用于治疗。
23.权利要求1-11中任一项的化合物，所述化合物用于在有需要的哺乳动物中治疗PLK介导的病症。
24.权利要求1-11中任一项的化合物，所述化合物用于在有需要的哺乳动物中治疗敏感瘤。
25.权利要求1-11中任一项的化合物，所述化合物用于在有需要的哺乳动物中治疗乳腺癌。
26.权利要求1-11中任一项的化合物，所述化合物用于在有需要的哺乳动物中治疗特征在于不适当细胞增殖的病症。
27.权利要求1-11中任一项的化合物，所述化合物用于抑制细胞增殖。
28.权利要求1-11中任一项的化合物，所述化合物用于抑制细胞有丝分裂。
29.权利要求1-11中任一项的化合物在制备药物中的用途，该药物用于在有需要的哺乳动物中治疗PLK介导的病症。
30.权利要求1-11中任一项的化合物在制备药物中的用途，该药物用于在有需要的哺乳动物中治疗敏感瘤。
31.权利要求1-11中任一项的化合物在制备药物中的用途，该药物用于治疗特征在于不适当细胞增殖的病症。
32.一种包含权利要求1-11中任一项的化合物的药用组合物，所述组合物用于在有需要的哺乳动物中治疗敏感瘤。
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