CN101466708A - 可用作蛋白激酶抑制剂的噻吩甲酰胺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及可用作蛋白激酶抑制剂的式I化合物。本发明还提供含所述化合物的药学上可接受的组合物，和用这些组合物治疗各种疾病、病症或障碍的方法。本发明还提供制备本发明化合物的方法。

Description

可用作蛋白激酶抑制剂的噻吩甲酰胺

优先权要求

[0001]本专利申请要求2006年4月13日提交的美国临时专利申请序号60/791,807的优先权，其通过引用整体结合到本文中。

发明技术领域

[0002]本发明涉及可用作蛋白激酶抑制剂的化合物。本发明还提供含本发明化合物的药学上可接受的组合物，和用这些组合物治疗各种病症的方法。本发明还提供制备本发明化合物的方法。

发明背景

[0003]近年来，对与疾病有关的酶和其它生物分子的结构更确切的了解对寻找新的治疗药物有很大帮助。作为本发明研究对象的一类重要的酶是蛋白激酶。

[0004]多种蛋白激酶组成结构相关的酶的大家族，这些酶的作用是控制细胞中多种信号转导处理(参见Hardie，G and Hanks，S.TheProtein Kinase Facts Book，I and II，Academic Press，San Diego，CA：1995)。据认为，由于它们的结构保守性和催化功能，蛋白激酶由共同祖基因进化产生。几乎所有激酶含相似的250-300氨基酸催化域。可按照它们进行磷酸化的相应底物(例如蛋白-酪氨酸、蛋白-丝氨酸/苏氨酸、脂质等)将激酶分为多个家族。已鉴定出通常响应这些激酶家族中各激酶的序列基元(参见例如Hanks，S.K.，Hunter，T.，FASEB J.1995，9，576-596；Knighton et al.，Science 1991，253，407-414；Hiles et al，Cell1992，70，419-429；Kunz et al，Cell 1993，73，585-596；Garcia-Bustos et al，EMBO J 1994，13，2352-2361)。

[0005]一般而言，通过将三磷酸核苷的磷酰基转运到涉及信号途径的蛋白受体上，蛋白激酶介导细胞内信号。这些磷酸化事件起分子开/关转换的作用，分子开/关转换可调节或调控靶蛋白生物功能。这些磷酸化事件最终被触发，以响应多种细胞外和其它刺激。此类刺激的实例包括环境和化学应激信号(例如休克、热休克、紫外线辐照、细菌内毒素和H₂O₂)、细胞因子(例如白介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，和生长因子(例如粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)和成纤维细胞生长因子(FGF))。细胞外刺激可影响一种或多种细胞反应，这些反应与细胞生长、迁移、分化、激素分泌、转录因子激活、肌肉收缩、葡萄糖代谢、蛋白合成控制、细胞周期的保留和调节有关。

[0006]许多疾病与由上述蛋白激酶-介导的事件引发的异常细胞反应有关。这些疾病包括但不限于癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病、骨病、代谢疾病、神经和神经变性疾病、心血管疾病、过敏和哮喘、早老性痴呆和激素相关疾病。因此，已在药物化学中付出了大量努力，以寻找作为有效治疗药物的蛋白激酶抑制剂。

[0007]马球样(Polo-like)激酶(Plk)属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族，这些激酶在从酵母到人的不同种之间高度保守(在Lowery DM etal.，Oncogene 2005，24；248-259中的综述)。Plk激酶在细胞周期中具有多种作用，这些作用包括控制进入有丝分裂和通过有丝分裂递进。

[0008]Plk1是Plk家族成员中被最充分表征的一员。Plk1在有丝分裂指数高的组织中广泛表达，且最丰富。在有丝分裂中，Plk1的蛋白水平升高并达到峰值(Hamanaka，R et al.，J Biol Chem 1995，270，21086-21091)。据报道，Plk1的底物是已知调节进入有丝分裂和通过有丝分裂递进的所有分子，它们包括CDC25C、细胞周期蛋白B、p53、APC、BRCA2和蛋白酶体。在多种类型的癌症中，Plk1上调，表达水平与疾病的严重程度相关(Macmillan，JC et al.，Ann Surg Oncol 2001，8，729-740)。Plk1是致癌基因，可转化NIH-3T3细胞(Smith，MR et al.，Biochem BiophysRes Commun 1997，234，397-405)。通过siRNA、反义、显微注射抗体去除或抑制Plk1或将Plk1的显性负构件转染到细胞中，可减少体外肿瘤细胞增殖和生存力(Guan，R et al.，Cancer Res 2005，65，2698-2704；Liu，X et al.，Proc NatlAcad Sci USA 2003，100，5789-5794，Fan，Y et al.，World J Gastroenterol 2005，11，4596-4599；Lane，HA et al.，J Cell Biol 1996，135，1701-1713)。去除Plk1的肿瘤细胞激活纺锤体关卡，且在纺锤体形成、染色体排列和分离以及胞质分裂中造成缺陷。据报道，生存力丧失是诱导凋亡的结果。相反，据报道，正常细胞在去除Plk1后仍保持生存力。通过siRNA体内剔除Plk1或使用显性负构件，导致异种移植模型中肿瘤生长抑制或退化。

[0009]Plk2主要在细胞周期的G1期表达，定位在分裂间期细胞中的中心体。剔除Plk2的小鼠发育正常，可生育且存活率正常，但比野生型小鼠小约20％。剔除Plk2的动物细胞在整个细胞周期比正常小鼠的细胞发育慢(Ma，S et al.，Mol Cell Biol 2003，23，6936-6943)。通过siRNA去除Plk2或将激酶钝化突变体转染到细胞可阻断中心粒复制。部分通过抑制p53响应，Plk2下调也使肿瘤细胞对紫杉醇增敏，且促进有丝分裂突变(Burns TF et al.，Mol Cell Biol 2003，23，5556-5571)。

[0010]Plk3在整个细胞周期中均表达，并从G1增加至有丝分裂。在高度增殖的卵巢肿瘤和乳腺癌中表达被上调，它与预后恶化有关(Weichert，W et al.，BrJ Cancer 2004，90，815-821；Weichert，W et al.，Virchows Arch 2005，446，442-450)。除调节有丝分裂外，据信，Plk3还涉及细胞周期中高尔基体断裂和DNA-损伤响应。据报道，通过显性负表达抑制Plk3可促进DNA损伤后p53非依赖型凋亡，和抑制肿瘤细胞的集落形成(Li，Z et al.，J Biol Chem 2005，280，16843-16850。

[0011]Plk4的结构与其它Plk家族成员更不相同。去除该激酶可造成癌细胞凋亡(Li，J et al.，Neoplasia 2005，7，312-323)。剔除Plk4的小鼠在E7.5停滞，进行有丝分裂的细胞比例高，且部分染色体分离(Hudson，JW et al.，Current Biology 2001，11，441-446)。

[0012]蛋白激酶家族的分子涉及肿瘤细胞生长、增殖和存活。因此，非常需要开发可用作蛋白激酶抑制剂的化合物。有关Plk激酶是细胞分裂要素的证据很可信。阻断细胞周期是已认可的抑制肿瘤细胞增殖和存活的临床方法。因此，需要开发可用作Plk家族蛋白激酶(例如Plk1、Plk2、Plk3和Plk4)的抑制剂，此类抑制剂可抑制肿瘤细胞的增殖和减少肿瘤细胞的成活力，尤其是对开发新的癌症的治疗药物存在非常强烈的医学需要。

发明概述

[0013]本发明化合物及其药学上可接受的组合物是有效的蛋白激酶抑制剂。在某些实施方案中，这些化合物是有效的PLK蛋白激酶抑制剂；在某些实施方案中，是PLK1蛋白激酶抑制剂。这些化合物或其药学上可接受的盐具有本文中定义的式I。

[0014]这些化合物及其药学上可接受的组合物可用于治疗或预防多种疾病、障碍或病症，它们包括但不限于自身免疫性、炎性、增殖或过度增殖疾病、神经变性疾病或免疫介导的疾病。由本发明提供的化合物也可用于在生物学和病理学现象中的激酶研究；由此类激酶介导的细胞内信号转导途径的研究和新的激酶抑制剂的对比评价。

发明详述

本发明描述了式I化合物：

其中

R¹为H、C_1-6脂族基团或C_3-6脂环族基团；

G为-C(R)₂-或-O-；

L为任选被0-3个JL取代的C_0-3脂族基团；

A环为含1-2个氮的5元芳族单环环；A环任选被0-3个J^A取代；

B环为含0-3个杂原子的5元-6元芳族单环环，所述杂原子选自O、N和S；B环任选被0-5个J^B取代，且任选与B′环稠合；

B′环是含0-3个杂原子的5元-8元芳族或非芳族单环环，所述杂原子选自O、N和S；B′环任选被0-4个J^B′取代；

J^A、J^B和J^B′各自独立为C_1-6卤代烷基、卤基、NO₂、CN、Q或-Z-Q；

Z独立为C_1-6脂族基团，其中0-3个亚甲基单元任选被以下基团取代：-NR-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(＝NR)-、-C(＝NOR)-、-SO-或-SO₂-；各Z任选被0-2个J^Z取代；

Q为H；C_1-6脂族基团；具有0-3个杂原子的3元-8元芳族或非芳族单环环，所述杂原子独立选自O、N和S；或具有0-5个杂原子的8元-12元芳族或非芳族双环环系统，所述杂原子独立选自O、N和S；各Q任选被0-5个J^Q取代；

J^L和J^Z各自独立为H、卤基、C_1-6脂族基团、C_3-6脂环族基团、NO₂、CN、-NH₂、-NH(C_1-4脂族基团)、-N(C_1-4脂族基团)₂、-OH、-O(C_1-4脂族基团)、-CO₂H、-CO₂(C_1-4脂族基团)、-O(卤代C_1-4脂族基团)或卤代(C_1-4脂族基团)；

各J^Q独立为M或-Y-M；

各Y独立为未被取代的C_1-6脂族基团，其中0-3个亚甲基单元任选被以下基团取代：-NR-、-O-、-S-、-C(O)-、-SO-或-SO₂-；

各M独立为H、C_1-6脂族基团、C_3-6脂环族基团、卤代(C_1-4脂族基团)、-O(卤代C_1-4脂族基团)、C_3-6杂环基、卤基、NO₂、CN、OH、OR′、SH、SR′、NH₂、NHR′、N(R′)₂、COH、COR′、CONH₂、CONHR′、CONR′₂、NHCOR′、NR′COR′、NHCONH₂、NHCONHR′、NHCON(R′)₂、SO₂NH₂、SO₂NHR′、SO₂N(R′)₂、NHSO₂R′或NR′SO₂R′；

R为H或未被取代的C_1-6脂族基团；

R′为未被取代的C_1-6脂族基团；或两个R′基团和它们连接的原子一起形成未被取代的具有0-1个杂原子的3元-8元非芳族单环，所述杂原子独立选自O、N和S。

[0015]本发明化合物包括以上一般性阐述的那些化合物，通过本文中公开的类、亚类和具体化合物进一步说明。除另有说明外，采用本文中使用的以下定义。对于本发明的目的，按照Periodic Table ofthe Elements，CAS version，Handbook of Chemistry and Physics，第75版鉴定化学元素。另外，有关有机化学的一般性原则参见＂OrganicChemistry＂，Thomas Sorrell，University Science Books，Sausalito：1999和＂March′s Advanced Organic Chemistry＂，第5版，Ed.：Smith，M.B.andMarch，J.，John Wiley & Sons，New York：2001所述，这些文献的全部内容通过引用结合到本文中。

[0016]本文中所述原子的特定数目范围包括其中任何整数。例如，具有1-4个原子的组可具有1、2、3或4个原子。

[0017]本文中所述本发明化合物可任选被一个或多个取代基取代，例如以上一般性所述或通过本发明特定类、亚类和具体化合物举例说明的那些。应认识到，短语“任选取代的”与短语“取代的或未被取代的”可互换使用。一般而言，术语“取代”无论位于术语“任选”之前或之后，均指在给定结构中氢原子团被特定取代基置换。除另有说明外，任选取代的基团在基团的各可取代位置可具有取代基，且当在任何给定结构中一个以上的位置可被选自指定基团的一个以上的取代基取代时，在每个位置中的取代基可相同或不同。本发明设想的取代基组合优选是导致形成稳定的或化学上可行的化合物的那些取代基组合。

[0018]本文中使用的术语“稳定的”是指为了本文中公开的一个和多个目的，当经历允许它们的制备、检测、回收、纯化和使用的条件时，基本上未改变的化合物。在某些实施方案中，稳定的化合物或化学上可行的化合物是当在40℃或更低温度下保存至少一周时，在无水分存在或其它化学反应条件下基本上未改变的化合物。

[0019]本文中使用的术语“脂族”或“脂族基团”表示直链(即非支链)或支链，取代的或未被取代的烃链，该烃链完全饱和或含一个或多个不饱和单元，其与分子的其余部分有一个连接点。除另有说明外，脂族基团含1-20个脂族碳原子。在某些实施方案中，脂族基团含1-10个脂族碳原子。在其它实施方案中，脂族基团含1-8个脂族碳原子。在还其它实施方案中，脂族基团含1-6个脂族碳原子，在又其它实施方案中，脂族基团含1-4个脂族碳原子。合适的脂族基团包括但不限于直链或支链，取代的或未被取代的烷基、烯基或炔基。具体实例包括但不限于甲基、乙基、异丙基、正丙基、仲丁基、乙烯基、正丁烯基、乙炔基和叔丁基。

[0020]术语“脂环族”(或“碳环”或“碳环基”或“环烷基”)是指完全饱和或含一个或多个不饱和单元的单环C₃-C₈烃或双环C₈-C₁₂烃，但这些烃不是芳族，与分子其余部分有一个连接点，其中在所述双环环系统中的任何单个环具有3-7个成员。合适的脂环族基团包括但不限于环烷基和环烯基。具体实例包括但不限于环己基、环丙烯基和环丁基。

[0021]本文中使用的术语“杂环”、“杂环基”或“杂环的”表示非芳族单环、双环或三环环系统，其中一个或多个环成员是独立选择的杂原子。在某些实施方案中，“杂环”、“杂环基”或“杂环的”基团具有3-14个环成员，其中一个或多个环成员是独立选自氧、硫、氮或磷的杂原子，且系统中的各环含3-7个环成员。

[0022]合适的杂环包括但不限于3-1H-苯并咪唑-2-酮、3-(1-烷基)-苯并咪唑-2-酮、2-四氢呋喃基、3-四氢呋喃基、2-四氢噻吩基、3-四氢噻吩基、2-吗啉代、3-吗啉代、4-吗啉代、2-硫代吗啉代、3-硫代吗啉代、4-硫代吗啉代、1-吡咯烷基、2-吡咯烷基、3-吡咯烷基、1-四氢哌嗪基、2-四氢哌嗪基、3-四氢哌嗪基、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、1-吡唑啉基、3-吡唑啉基、4-吡唑啉基、5-吡唑啉基、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-哌啶基、2-噻唑烷基、3-噻唑烷基、4-噻唑烷基、1-咪唑烷基、2-咪唑烷基、4-咪唑烷基、5-咪唑烷基、二氢吲哚基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、苯并硫杂环戊烷(benzothiolane)、苯并二噻烷和1，3-二氢-咪唑-2-酮。

[0023]环状基团(例如脂环族和杂环)可以是线型稠合环、桥环或螺环。

[0024]术语“杂原子”表示氧、硫、氮或磷中的一个或多个(包括氮、硫或磷的任何氧化形式；任何碱性氮的季铵化形式；或杂环的可取代的氮例如N(如在3，4-二氢-2H-吡咯基中)、NH(如在吡咯烷基中)或NR⁺(如在N-取代的吡咯烷基中))。

[0025]本文中使用的术语“不饱和”表示具有一个或多个不饱和单元的部分。

[0026]本文中使用的术语“非芳族”描述饱和或部分不饱和的环。

[0027]本文中使用的术语“芳族”描述完全不饱和的环。

[0028]本文中使用的术语“烷氧基”或“烷硫基”是指前文中定义的烷基通过氧(“烷氧基”)或硫(“烷硫基”)原子与主碳链连接。

[0029]术语“卤代烷基”、“卤代烯基”、“卤代脂族基团”和“卤代烷氧基”表示视情况而定被一个或多个卤素原子取代的烷基、烯基或烷氧基。术语“卤素”、“卤基”和＂卤代＂表示F、Cl、Br或I。

[0030]单独或作为更大部分如在“芳烷基”、“芳烷氧基”或“芳氧基烷基”中的一部分使用的术语“芳基”是指具有总数5-14个环成员的单环、双环和三环环系统，其中系统中的至少一个环是芳环，和其中系统中的各环含3-7个环成员。术语“芳基”可与术语“芳环”互换使用。术语“芳基”也指下文中定义的杂芳环系统。

[0031]单独或作为较大部分如在“杂芳烷基”或“杂芳基烷氧基”中的一部分使用的术语“杂芳基”是指具有总数5-14个环成员的单环、双环和三环环系统，其中系统中至少一个环是芳环，系统中至少一个环含一个或多个杂原子，和其中系统中的各环含3-7个环成员。术语“杂芳基”可与术语“杂芳环”或术语“杂芳族”互换使用。合适的杂芳环包括但不限于2-呋喃基、3-呋喃基、N-咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、5-咪唑基、苯并咪唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噁唑基、4-噁唑基、5-噁唑基、N-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、哒嗪基(例如3-哒嗪基)、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、四唑基(例如5-四唑基)、三唑基(例如2-三唑基和5-三唑基)、2-噻吩基、3-噻吩基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基(例如2-吲哚基)、吡唑基(例如2-吡唑基)、异噻唑基、1，2，3-噁二唑基、1，2，5-噁二唑基、1，2，4-噁二唑基、1，2，3-三唑基、1，2，3-噻二唑基、1，3，4-噻二唑基、1，2，5-噻二唑基、嘌呤基、吡嗪基、1，3，5-三嗪基、喹啉基(例如2-喹啉基、3-喹啉基、4-喹啉基)和异喹啉基(例如1-异喹啉基、3-异喹啉基或4-异喹啉基)。

[0032]本文中使用的术语“保护基”和“保护基团”可互换使用，是指用于临时性封闭多官能化合物中的一个或多个需要的反应部位的物质。在某些实施方案中，保护基具有一个或多个，或优选所有以下特性：a)可选择性加入官能团，得到高收率的保护底物，即b)对在一个或多个其它反应部位发生的反应稳定；和c)可通过不进攻再生的脱保护的官能团的试剂以好的收率选择性除去。在Greene，T.W.，Wuts，P.G在＂Protective Groups in Organic Synthesis＂，第3版，JohnWiley & Sons，New York：1999(和该书的其它版本)中对举例说明的保护基有详细描述，其全部内容通过引用结合到本文中。本文中使用的术语“氮保护基”是指用于临时性封闭多官能化合物中的一个或多个需要的氮反应部位的物质。优选的氮保护基也具有以上举例说明的特性，在Greene，T.W.，Wuts，P.G在＂Protective Groups in OrganicSynthesis＂，第7章，第3版，John Wiley & Sons，New York：1999中对某些举例说明的氮保护基也有详细描述，其全部内容通过引用结合到本文中。

[0033]在某些实施方案中，烷基或脂族基团链的亚甲基单元可任选被另一个原子或基团置换。此类原子或基团的实例包括但不限于-NR-、-O-、-S-、-CO₂-、-OC(O)-、-C(O)CO-、-C(O)-、-C(O)NR-、-C(＝N-CN)、-NRCO-、-NRC(O)O-、-SO₂NR-、-NRSO₂-、-NRC(O)NR-、-OC(O)NR-、-NRSO₂NR-、-SO-或-SO₂-，其中R的定义同本文。除另有说明外，该任选的置换形成化学稳定的化合物。任选的置换可发生在链中和链的任一末端；即发生在连接点和/或末端。只要可形成化学稳定的化合物，两个任选的置换也可在链中彼此相邻发生。任选的置换也可在链中所有碳原子上进行完全置换。例如C₃脂族基团可任选被-NR-、-C(O)-和-NR-置换，形成-NRC(O)NR-(脲)。

[0034]除另有说明外，如果置换发生在末端，则置换原子与末端上的H连接。例如，如果-CH₂CH₂CH₃的亚甲基单元任选被-O-置换，得到的化合物可以是-OCH₂CH₃、-CH₂OCH₃或-CH₂CH₂OH。

[0035]除另有说明外，本文中所示结构还要包括该结构的所有异构(例如对映体、非对映体和几何异构体(或构象异构体))形式；例如各不对称中心的R和S构型，(Z)和(E)双键异构体和(Z)和(E)构象异构体。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体和对映体、非对映体和几何异构体(或构象异构体)混合物在本发明范围内。

[0036]除另有说明外，本发明化合物的所有互变异构体均在本发明范围内。

[0037]除另有说明外，取代基可围绕任何可旋转键自由旋转。例如，所示取代基

也代表

[0038]另外，除另有说明外，本文中所示结构还要包括不同之处仅在于存在一个或多个同位素富集原子的化合物。例如，具有本发明结构，但不同之处在于氢被氘或氚取代或碳被¹³C-或¹⁴C-富集碳置换的化合物在本发明范围内。此类化合物可用于例如生物测定的分析工具或探针。

[0039]使用以下缩写：

PG                              保护基

LG                              离去基团

DCM                             二氯甲烷

Ac                              乙酰基

PdCl₂(PPh₃)₂                    二氯二(三苯基膦)合钯(II)

Pd(PPh₃)₄                       四(三苯基膦)合钯(O)

PdCl₂(dppf)                     二氯[1，1′-二茂铁二(二苯基膦)]合钯(II)

TMS                             三甲基甲硅烷基

TMSI                            三甲基碘硅烷

TMSCl                           三甲基氯硅烷

DMF                             二甲基甲酰胺

EtOAc                           乙酸乙酯

DMSO                            二甲亚砜

MeCN                            乙腈

TFA                             三氟乙酸

TCA                             三氯乙酸

ATP                             三磷酸腺苷

EtOH                            乙醇

Ph                              苯基

Me                              甲基

Et                              乙基

Bu                              丁基

DEAD                            偶氮二羧酸二乙酯

HEPES                           4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸

BSA                  牛血清白蛋白

DTT                  二硫苏糖醇

MOPS                 4-吗啉丙磺酸

NMR                  核磁共振

HPLC                 高效液相色谱

LCMS                 液相色谱-质谱

TLC                  薄层层析

Rt                   保留时间

[0040]在某些本发明实施方案中，G为-C(R)₂-。在其它实施方案，G为O。

[0041]在某些实施方案中，R¹为H。

[0042]在其它实施方案中，A环是含1个氮原子的5元芳环。在其它实施方案中，A环含2个氮原子。在某些实施方案中，A环是吡唑基、吡咯基或咪唑基。在某些实施方案中，A环是吡唑基。在其它实施方案中是吡咯基。在还其它实施方案中，是咪唑基。

[0043]在某些实施方案中，B环是含0-3个杂原子的5元-6元芳族单环环，所述杂原子选自O、N和S。在某些实施方案中，B环是5元环。在其它实施方案中，B环是6元环。在某些实施方案中，B环与环B′稠合。在某些实施方案中，B′环是含0-3个杂原子的5元-6元芳族单环环，所述杂原子选自O、N和S。

[0044]在某些实施方案中，J^A为H、C_1-6脂族基团、C_3-6脂环族基团、卤代(C_1-4脂族基团)、-O(卤代C_1-4脂族基团)、C_3-6杂环基、卤基、NO₂、CN、OH、OR、SH、SR、NH₂、NHR、N(R)₂、COH、COR、CONH₂、CONHR、CONR₂、NHCOR、NRCOR、NHCONH₂、NHCONHR、NHCON(R)₂、SO₂NH₂、SO₂NHR、SO₂N(R)₂、NHSO₂R或NRSO₂R。在某些实施方案中，J^A为H。

[0045]在某些实施方案中，J^B为H、C_1-6脂族基团、C_3-6脂环族基团、卤代(C_1-4脂族基团)、-O(卤代C_1-4脂族基团)、C_3-6杂环基、卤基、NO₂、CN、OH、OR、SH、SR、NH₂、NHR、N(R)₂、COH、COR、CONH₂、CONHR、CONR₂、NHCOR、NRCOR、NHCONH₂、NHCONHR、NHCON(R)₂、SO₂NH₂、SO₂NHR、SO₂N(R)₂、NHSO₂R或NRSO₂R。

[0046]在其它实施方案中，J^B′为H、C_1-6脂族基团、C_3-6脂环族基团、卤代(C_1-4脂族基团)、-O(卤代C_1-4脂族基团)、C_3-6杂环基、卤基、NO₂、CN、OH、OR、SH、SR、NH₂、NHR、N(R)₂、COH、COR、CONH₂、CONHR、CONR₂、NHCOR、NRCOR、NHCONH₂、NHCONHR、NHCON(R)₂、SO₂NH₂、SO₂NHR、SO₂N(R)₂、NHSO₂R或NRSO₂R。

[0047]在某些实施方案中，本发明化合物由表1中化合物代表：

表1

通用合成方法

[0048]一般而言，可通过方法例如以下通用流程所示那些和随后的制备实施例制备本发明化合物。除另有说明外，以下流程中所有变量的定义同本文。

流程1

[0049]以上流程1所示为制备本发明化合物的通用合成路线。在本领域技术人员已知的合适的卤化条件下，将原料3-甲氧基噻吩1二卤化。在合适的酰化条件下，将在2位卤素选择性转化为酯部分，得到2，其中X为卤基。使2的甲氧基脱保护，然后在Mitsonobu条件下，将得到的3的3-羟基用合适的官能团衍生化，得到4，其中X为卤基。

[0050]然后在合适的交叉偶联条件下，使在4的噻吩核(X)的5位上的剩余卤素与i发生交叉偶联反应，其中CP为适当的偶联基团，得到5。

[0051]或者，将在4的噻吩核的5位上的剩余卤素转化为交叉偶联基团(CP)，然后与ii发生交叉偶联反应，其中X为合适的离去基团，得到5。最后，在合适的酰胺形成条件下，将5的酯部分转化为酰胺，得到本发明化合物。

流程2

[0052]以上流程2所示为制备本发明化合物的备选合成路线。使流程1中所述中间体2与i发生交叉偶联反应，其中CP为合适的交叉偶联基团，得到6。或者，使2的噻吩核5位上的卤素转化为适当的交叉偶联基团(CP)，然后与ii发生交叉偶联反应，其中X为合适的离去基团，得到6。将6的甲氧基脱保护，然后在Mitsunobu条件下，将得到的7的3-羟基用合适的官能团衍生化，得到5，在合适的酰胺形成条件下，将5转化为酰胺，得到本发明化合物。

流程3

[0053]以上流程3所示为制备本发明化合物的通用合成路线，其中A环通过氮原子与噻吩核连接。使Michael受体8(用类似于Synthesis，(10)，847-850，1984中报道的方法制备)与

进行共轭加成反应，其中A环为含氮环，得到9。然后在Mitsunobu条件下，将9的3-羟基用适当官能团衍生化，得到5。最后，在合适的酰胺形成条件下，将5的酯部分转化为酰胺，得到本发明化合物。

流程4

[0054]以上流程4所示为制备本发明化合物的通用合成路线，其中A环通过碳原子与噻吩核连接。在Mitsonobu条件下，将原料3-羟基-噻吩-2，5-二甲酸二甲酯11(Fiesselmann，Schipprak Chem.Ber.1956，89，1897-1900)用适当官能团衍生化，得到12。

[0055]然后将该酯官能团用作构建A环的结构部分。

[0056]最后，在合适的酰胺形成条件下，将5的第二个酯官能团转化为酰胺，得到本发明化合物。

[0057]因此，本发明也提供制备本发明化合物的方法。

[0058]本发明的一个实施方案提供制备式I化合物的方法：

其中G为O，R¹为H，A环、B环、J^A、J^B和L的定义同本文，该方法包括在合适的酰胺形成条件下，使式5化合物反应

其中G为O，R¹为C_1-6脂族基团，A环、B环、J^A、J^B和L定义同本文，形成式I化合物。本领域技术人员已知合适的酰胺形成条件，可在＂March′s Advanced Organic Chemistry＂中找到这些条件。合适的酰胺形成条件的实例包括但不限于在NH₃/MeOH的存在下将甲酸甲酯加热。

[0059]一个实施方案还包括在合适的交叉偶联条件下，使式4化合物；

其中X为卤素，B环、J^B和L定义同本文；

与式i化合物偶联的步骤，

其中CP为交叉偶联基团，A环和J^A定义同本文；形成式5化合物。

[0060]本文中使用的术语“交叉偶联反应”是指其中在金属催化剂的帮助下形成碳-碳键的反应。通常，碳原子中之一与官能团(“交叉偶联基团”)结合，同时其它碳原子与卤素结合。交叉偶联反应的实例包括但不限于Suzuki偶联、Stille偶联和Negishi偶联。

[0061]本文中使用的术语“交叉偶联基团”是指在交叉偶联反应中可与另一个官能团(例如卤素)反应形成碳-碳(＂C-C＂)键的官能团。在某些实施方案中，在两芳基之间形成C-C键。

[0062]本文中使用的术语“交叉偶联条件”是指使交叉偶联反应发生所需要的化学条件(例如需要的温度、反应时间长度、溶剂体积)。

[0063]交叉偶联基团及其相应的交叉偶联条件的实例包括但不限于硼酸和硼酸酯和Suzuki偶联条件；SnBu₃和Stille偶联条件；和ZnX和Negishi偶联条件。

[0064]所有这3种偶联条件通常涉及使用催化剂、合适的溶剂和任选的碱。Suzuki偶联条件涉及使用钯催化剂、合适的碱和合适的溶剂。合适的钯催化剂的实例包括但不限于PdCl₂(PPh₃)₂、Pd(Ph₃)₄和PdCl₂(dppf)。合适的碱包括但不限于K₂CO₃和Na₂CO₃。合适的溶剂包括但不限于四氢呋喃、甲苯和乙醇。

[0065]Stille偶联条件涉及使用催化剂(通常为钯，但有时为镍)、合适的溶剂和其它任选的试剂。合适的催化剂的实例包括但不限于PdCl₂(PPh₃)₂、Pd(Ph₃)₄和PdCl₂(dppf)。合适的溶剂包括但不限于四氢呋喃、甲苯和二甲基甲酰胺。

[0066]Negishi偶联条件涉及使用催化剂(钯或镍)和合适的溶剂。合适的催化剂的实例包括但不限于Pd₂(dba)₃、Ni(PPh₃)₂Cl₂、PdCl₂(PPh₃)₂和Pd(Ph₃)₄。合适的溶剂包括但不限于四氢呋喃、甲苯和二甲基甲酰胺。

[0067]本领域技术人员已知Suzuki、Stille和Negishi条件，在包括＂March′s Advanced Organic Chemistry＂在内的多种参考文献有更详细的阐述。

[0068]另一个实施方案还包括在合适的偶联基团形成条件下，使式4化合物；

其中X为卤基，B环、J^B和L的定义同本文；

与偶联基团前体偶联，形成式5a化合物的步骤：

其中CP为交叉偶联基团，B环、J^B和L的定义同本文。偶联基团前体是用于形成交叉偶联基团的试剂或试剂的基团。实例包括但不限于在Negishi偶联反应中用于形成硼酸酯的二硼酸二(频哪醇酯)；用于形成硼酸的硼酸三甲酯；用于形成锡烷的Bu₃SnCl；和用于形成锌酸盐的ZnCl₂。合适的偶联基团形成条件的实例包括但不限于通过钯介导的催化制备硼酸酯；通过将硼酸酯水解制备硼酸；通过两步法制备锡烷：1)卤素金属交换，然后2)用Bu₃SnCl进行金属转移；和通过两步法制备锌酸盐：1)卤素金属交换，然后2)加入ZnCl₂。

[0069]另一个实施方案还包括在合适的交叉偶联条件下，使式5a化合物与

偶联的步骤，

其中X为合适的离去基团，A环和J^A定义同本文；形成式5化合物，其中L、A环、B环、J^A和J^B定义同本文。本领域技术人员已知合适的离去基团，它们包括但不限于卤基和三氟甲磺酸酯基。

[0070]另一个实施方案还包括在合适的O-C键偶联条件下，使式3化合物：

其中X为卤基；

与

偶联的步骤；其中LG为合适的离去基团，L、B环和J^B定义同本文；形成式4化合物。合适的离去基团包括但不限于卤基、三氟甲磺酸酯基、甲磺酸酯基和甲苯磺酸酯基。或者，可通过Mitsunobu反应，由基团例如OH原位形成LG。合适的O-C键偶联反应包括但不限于Mitsunobu反应(DEAD/PPh₃/THF)和用强碱例如KOtBu、NaH或LiAlH₄进行简单的烷基化。

[0071]本发明一个实施方案提供制备式5化合物的方法：

其中G为O，A环、B环、J^A、J^B和L定义同本文，

该方法包括在合适的O-C键偶联条件下，使下式化合物：

与

反应；其中LG为合适的离去基团，L、B环和JB定义同本文；形成式5化合物。

[0072]一个实施方案还包括以下步骤：

a)在合适的交叉偶联条件下，使式2化合物：

与式i化合物偶联

其中CP为交叉偶联基团，A环和J^A定义同本文，形成式6化合物：

b)在合适的脱保护条件下，使式6化合物脱保护，形成式7化合物。合适的脱保护条件的实例包括但不限于BBr₃、TMSI、TMSCl+NaI，和盐酸吡啶鎓。

[0073]另一个实施方案还包括以下步骤：

a)在合适的偶联基团形成条件下，使式2化合物：

与偶联基团前体偶联，形成式5b化合物：

其中CP为交叉偶联基团；

b)使式5b化合物与

偶联；其中X为合适的离去基团，A环和J^A定义同本文，

形成式6化合物：

[0074]本领域技术人员已知合适的离去基团的实例，它们包括但不限于卤基和三氟甲磺酸酯基。

[0075]另一个实施方案提供制备式7化合物的方法：

该方法包括通过合适的共轭加成条件将加入式8化合物中，其中A环为含具有亲核进攻能力的氮原子的芳环，J^A定义同本文：

形成式7化合物。含具有亲核进攻能力的氮原子的芳环的实例包括但不限于

合适的共轭加成条件包括但不限于在DCM中，在室温下，使2当量

与式8化合物混合；在乙腈/DMF中，使1.15当量与式8化合物混合，在110℃下过夜。

[0076]在本发明某些实施方案中，交叉偶联基团是硼酸或硼酸酯。在某些实施方案中是硼酸酯。

[0077]另一个实施方案提供制备式5化合物的方法：

其中A环是吡唑，G为O，B环、J^A、J^B和L定义同本文，

该方法包括将式12化合物加到乙腈阴离子中，其中按照本领域技术人员已知的方法得到该阴离子；

然后在肼的存在下，使中间体环合，形成式5化合物。

[0078]用适当的碱生成该阴离子。用于生成阴离子的碱的实例包括但不限于NaH、LDA、Buli和t-BuLi。

[0079]另一个实施方案还包括在合适的O-C键偶联条件下，使式11化合物：

与

偶合的步骤，其中LG为合适的离去基团，L、B环和J^B定义同本文；形成式12化合物。合适的离去基团包括但不限于卤基、甲磺酸酯基和甲苯磺酸酯基。或者，可在Mitsunobu反应中，由基团例如OH原位得到LG。合适的O-C键偶联反应包括但不限于Mitsunobu反应(DEAD/PPh₃/THF)和用强碱例如KOtBu、NaH或LiAlH₄进行简单烷基化。

[0080]如上所述，本发明提供可用于治疗包括但不限于以下的疾病、障碍和病症的化合物：自身免疫性疾病、炎性疾病、增殖和过度增殖疾病、免疫介导的疾病、骨病、代谢疾病、神经和神经变性疾病、心血管疾病、激素相关疾病、过敏、哮喘和早老性痴呆。本发明的另一个方面提供蛋白激酶抑制剂化合物，因此可用于治疗疾病、障碍和病症以及本文中所述其它用途。在本发明的另一个方面，提供药学上可接受的组合物，其中这些组合物包含本文中所述任何化合物和任选包含药学上可接受的载体、助剂或溶媒。在某些实施方案中，这些组合物任选还包含一种或多种其它治疗药物。

[0081]还应认识到，某些本发明化合物可存在治疗用的游离形式，或当适当时，为药学上可接受的盐或其药学上可接受的衍生物。

[0082]本文中使用的“药学上可接受的衍生物”是给予有需要的患者后可直接或间接提供本文中另外所述化合物或其代谢物或其残基的加合物或衍生物。药学上可接受的衍生物的实例包括但不限于酯和此类酯的盐。

[0083]本文中使用的术语“药学上可接受的盐”是指适合预定用途的化合物的盐。在某些实施方案中，盐适用于与人和低级动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应等，具有合理的利益/风险比。在其它实施方案中，盐可适用于体外分析、动力学研究、晶体学研究等。

[0084]在本领域中熟知药学上可接受的盐。例如，S.M.Berge etal.在J.Pharmaceutical Sciences，1977，66，1-19中详细论述了药学上可接受的盐，其通过引用结合到本文中。本发明化合物药学上可接受的盐包括由合适的无机和有机酸和碱衍生的那些盐。在化合物最后分离和纯化期间，可原位制备这些盐。可通过1)使游离形式的纯化化合物与合适的有机或无机酸反应，2)将由此形成的盐分离，制备酸加成盐。

[0085]药学上可接受的无毒酸加成盐实例是与无机酸例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸或与有机酸例如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸或通过用本领域中使用的其它方法例如离子交换形成的氨基盐。其它药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚酸盐、甘油磷酸盐、甘醇酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、palmoate、果胶酯酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。由适当的碱衍生的盐包括碱金属、碱土金属、铵和N⁺(C_1-4烷基)₄盐。本发明还设想本文中公开化合物的任何碱性含氮基团的季铵化。可通过此类季铵化得到可在水或油中溶解或分散的产物。

[0086]可通过1)使酸形式的纯化化合物与合适的有机或无机碱反应，2)将由此形成的盐分离，制备碱加成盐。碱加成盐包括碱金属或碱土金属盐。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。当合适时，其它药学上可接受的盐包括无毒铵、季铵和用反荷离子例如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、磺酸低级烷基酯和磺酸芳基酯形成的胺阳离子。其它酸和碱，虽然本身不是药学上可接受的，但可用于制备可用作中间体的盐，通过该中间体得到本发明化合物及其药学上可接受的酸或碱加成盐。

[0087]本文中所述本发明药学上可接受的组合物还包含药学上可接受的载体、助剂或溶媒，在本文中，它们包括任何和所有溶剂、稀释剂或其它液体溶媒、分散体或悬浮液助剂；表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂和适合需要的具体剂型的类似物。Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，E.W.Martin(Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1980)公开了用于配制药学上可接受的组合物的各种载体和制备其的已知技术。除作为不与本发明化合物配伍的任何常规载体介质例如通过产生任何有害生物作用或按有害方式与药学上可接受的组合物的任何其它成分相互作用外，考虑其用途在本发明范围内。

[0088]可作为药学上可接受的载体物质的某些实例包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂；血清蛋白例如人血清白蛋白；缓冲物质例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸或山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅胶、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、羊毛脂；糖例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；黄芪胶粉末；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂例如可可豆脂和栓剂蜡；油例如椰子油、棉籽油；红花油；芝麻油；橄榄油；玉米油和大豆油；二元醇；例如丙二醇或聚乙二醇；酯例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂例如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏液；乙醇和磷酸盐缓冲液，以及其它无毒可配伍润滑剂例如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和香精，也可根据配制配方设计师的判断将防腐剂和抗氧剂加入组合物。

[0089]本发明的一个方面提供治疗或缓解疾病严重程度的方法，所述疾病选自自身免疫性疾病、炎性疾病；增殖或过度增殖疾病例如癌症、免疫介导的疾病、骨病、代谢疾病、神经或神经变性疾病、心血管疾病、过敏、哮喘、早老性痴呆或激素相关疾病，该方法包括给予有需要的患者有效量的化合物或含化合物的药学上可接受的组合物。术语“癌症”包括但不限于以下癌症：乳腺癌；卵巢癌；宫颈癌；前列腺癌；睾丸癌、泌尿生殖道癌；食道癌；喉癌、成胶质细胞瘤；成神经细胞瘤；胃癌；皮肤癌、角化棘皮瘤；肺癌、表皮样瘤、大细胞瘤、小细胞瘤、肺腺癌；骨癌；结肠癌、腺瘤；胰腺癌、腺癌；甲状腺癌、卵泡癌、未分化癌、乳头状癌；精原细胞瘤；黑素瘤；肉瘤；膀胱癌；肝癌和胆道癌；肾癌；骨髓病；淋巴病、霍奇金病、毛细胞瘤；口腔癌和咽癌(口)、唇癌、舌癌、口癌、咽癌；小肠癌；结肠-直肠癌、大肠癌、直肠癌；脑和中枢神经系统癌；和白血病。

[0090]在某些实施方案中，化合物或药学上可接受的组合物的“有效量”是治疗所述疾病的有效量。可用有效治疗或缓解所述疾病的严重程度的任何量和任何给药途径给予通过本发明方法得到的化合物和组合物。在某些实施方案中，所述疾病选自增殖疾病、神经变性疾病、自身免疫性疾病和炎性疾病，以及免疫介导的疾病。在某些实施方案中，所述疾病是增殖疾病。在某些实施方案中是癌症。

[0091]在其它本发明实施方案中，所述疾病是蛋白-激酶介导的病症。在某些实施方案中，所述蛋白激酶是PLK。

[0092]本文中使用的术语“蛋白激酶-介导的病症”表示蛋白激酶在其中起作用的任何疾病或其它有害病症。此类病症包括但不限于自身免疫性疾病、炎性疾病、增殖和过度增殖疾病、免疫介导的疾病、骨病、代谢疾病、神经和神经变性疾病、心血管疾病、激素相关疾病、过敏、哮喘和早老性痴呆。

[0093]本文中使用的术语“PLK介导的病症”表示PLK在其中起作用的任何疾病或其它有害病症。此类病症包括但不限于增殖疾病例如癌症、神经变性疾病、自身免疫性疾病和炎性疾病，以及免疫介导的疾病。

[0094]在某些实施方案中，本发明化合物和组合物是蛋白激酶抑制剂。作为蛋白激酶抑制剂，本发明化合物和组合物尤其可用于治疗或缓解疾病、病症或障碍的严重程度，其中蛋白激酶与所述疾病、病症或障碍有关。在一个方面，本发明提供治疗或缓解疾病、病症或障碍的严重程度的方法，其中蛋白激酶与疾病状态有关。在另一方面，本发明提供治疗或缓解疾病、病症或障碍的严重程度的方法，其中抑制酶活性与治疗疾病有关。在另一方面，本发明提供用抑制酶活性的化合物治疗或缓解疾病、病症或障碍的严重程度的方法，这些化合物通过与蛋白激酶结合抑制酶活性。在某些实施方案中，所述蛋白激酶是PLK。

[0095]可体外、体内或在细胞系中测定作为蛋白激酶抑制剂的化合物的活性。体外测定包括检测激活的激酶的激酶活性或ATP酶活性抑制的测定。或者，体外测定可定量检测抑制剂与蛋白激酶结合的能力，可通过结合前将抑制剂放射性标记，使抑制剂/激酶复合物分离，测定放射性标记结合的量；或通过进行竞争性实验，其中将新抑制剂与和已知放射性配体结合的激酶一起温育，测量。

[0096]可将蛋白激酶抑制剂或其药用盐配制成给予动物或人的药用组合物。含有效治疗或预防蛋白激酶介导的病症的量的蛋白抑制剂和药学上可接受的载体的这些药用组合物是本发明的另一个实施方案。在某些实施方案中，所述蛋白激酶介导的病症是PLK介导的病症。在某些实施方案中，是PLK1介导的病症。

[0097]治疗需要的化合物的确切量因患者而异，取决于患者的种族、年龄和一般状况；感染的严重程度、具体药物、给药模式等。优选将本发明化合物配制为便于给药和剂量均一性的剂量单位形式。本文中使用的表述“剂量单位形式”是指适合所治疗患者的药物的物理分离单位。但是，可以理解，本发明化合物和组合物的每日用法须由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对于任何具体患者或生物体的特定有效剂量水平要取决于多种因素，这些因素包括所治疗的病症和病症的严重程度；所使用的具体化合物的活性；所使用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；给药时间、给药途径和所使用的具体化合物的排泄途径；疗程；与所用的具体化合物联用或同时使用的药物；和医学领域中熟知的类似因素。本文中使用的术语“患者”表示动物，优选哺乳动物，最优选人。

[0098]可通过以下途径给予人和其它动物本发明药学上可接受的组合物：口服、直肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹膜内、局部(如通过散剂、软膏剂或滴剂)、含服、口腔或鼻喷雾或取决于所治疗感染严重程度的类似方式。在某些实施方案中，可按约0.01mg/kg-约50mg/kg，优选约1mg/kg-约25mg/kg患者体重/日剂量水平，口服或肠胃外给予本发明化合物，每日一次或多次，得到需要的疗效。

[0099]用于口服给药的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳液、微乳、溶液、混悬液、糖浆和酏剂。除活性化合物外，液体剂型可含本领域中常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂；增溶剂和乳化剂例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(尤其棉籽、落花生、玉米、胚芽、橄榄、蓖麻和芝麻的油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨醇的脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物也可包含助剂例如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香精。

[00100]可按照已知技术，用合适的分散或湿润剂和悬浮剂配制注射制剂，例如无菌注射水或油混悬剂。无菌注射制剂也可是用无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂配制的无菌注射溶液、混悬液或乳液，例如以1，3-丁二醇为溶剂的溶液。其中，可使用的可接受的溶媒和溶剂是水、林格氏液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。另外，无菌非挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。因此，可使用任何非刺激性非挥发油，它们包括合成甘油单酯或甘油二酯。另外，脂肪酸例如油酸还用于制备注射剂。

[00101]例如通过除菌滤器或通过加入无菌固体组合物形式的杀菌剂，将注射剂灭菌，临用前，可将无菌固体组合物溶于或分散于无菌水或其它无菌注射介质。

[00102]为延长本发明化合物的作用，通常需要延缓通过皮下或肌内注射的化合物的吸收。可通过使用水溶性差的结晶或无定形物质的液体混悬液实现。然后化合物的吸收速度取决于其溶出速度，溶出速度又可取决于结晶大小和晶型。或者，可通过将化合物溶于或悬浮于油溶媒，完成延迟吸收的肠胃外给药的化合物形式。通过在可生物降解聚合物例如聚丙交酯-聚乙交酯中形成化合物的微囊骨架制备注射贮库形式。根据化合物与聚合物的比例和具体使用的聚合物的性质，可控制化合物的释放速度。其它可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酐)。也可通过用与身体组织相容的脂质体或微乳捕获化合物，制备贮库注射制剂。

[00103]用于直肠或阴道给药的组合物优选为栓剂，可通过使本发明化合物与合适的非刺激性赋形剂或载体混合，制备栓剂，例如在环境温度下为固体但在体温下为液体因此在直肠或阴道腔熔化和释放活性化合物的可可豆酯、聚乙二醇或栓剂蜡。

[00104]用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，活性化合物与至少一种惰性药学上可接受的赋形剂或载体例如柠檬酸钠或磷酸氢二钙和/或以下物质混合：a)填充剂或补充剂例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，b)粘合剂例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，c)保湿剂例如甘油，d)崩解剂例如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，e)溶液阻滞剂例如石蜡，f)吸收促进剂例如季铵化合物，g)湿润剂例如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯，h)吸收剂例如高岭土和皂土，和i)润滑剂例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠及其混合物。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，剂型也可包含缓冲剂。

[00105]相似种类的固体成分也可用作软和硬填充明胶胶囊中的填充剂，在此类胶囊中使用此类赋形剂如乳糖或奶糖(milk sugar)和高分子量聚乙二醇等。可用包衣剂和壳例如肠溶包衣剂和药剂领域中熟知的其它包衣剂制备固体剂量形式的片剂、糖锭剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂。它们可任选含遮光剂并也可为以下组合物：该组合物仅在或优先在肠道的某个部分任选以缓释方式释放活性成分。可使用的包埋成分的实例包括高分子物质和蜡。相似种类的固体成分也可用作软和硬填充明胶胶囊中的填充剂，此类胶囊使用此类赋形剂如乳糖或奶糖和高分子量聚乙二醇等。

[00106]活性化合物也可以是含一种或多种上述赋形剂的微囊形式。可用包衣剂和壳例如肠溶包衣剂、控释包衣剂和药剂领域中熟知的其它包衣剂制备固体剂量形式的片剂、糖锭剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，活性化合物可与至少一种惰性稀释剂例如蔗糖、乳糖或淀粉混合。按其通常惯例，此类剂型还可包含非惰性稀释剂的其它物质，例如压片润滑剂和其它压片助剂如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，剂型也可包含缓冲剂。它们可任选含遮光剂并也可为以下组合物：该组合物仅在或优先在肠道的某个部分任选以缓释方式释放活性成分。可使用的包埋成分的实例包括高分子物质和蜡。

[00107]用于局部或透皮给予本发明化合物的剂型包括软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、散剂、溶液剂、喷雾剂、吸入剂或贴剂。在无菌条件下，将活性成分与药学上可接受的载体和可能需要的任何防腐剂或缓冲剂混合。还可考虑眼药制剂、滴耳剂和滴眼剂在本发明的范围内。另外，本发明还考虑使用透皮贴剂，该透皮贴剂具有提供控制递送化合物至身体的额外优点。可通过将化合物溶于或分散于合适介质制备此类剂型。也可用吸收促进剂增加透过皮肤的化合物通量。可通过提供速度控制膜或通过使化合物分散在聚合物基质或凝胶中，控制速度。

[00108]除本发明化合物外，也可在组合物中使用本发明化合物的药学上可接受的衍生物或前药，治疗或预防以上确定的病症。

[00109]“药学上可接受的衍生物或前药”表示给予接受者后本发明化合物的酯或其它衍生物的任何药学上可接受的酯、盐能够直接或间接提供本发明化合物或抑制性活性代谢物或其残基。尤其有利的衍生物或前药是与母体化合物相比，当给予患者此类化合物(例如通过让口服给予的化合物更容易吸收到血液中)时，增加本发明化合物生物利用度或促使母体化合物递送到生物房室(例如脑或淋巴系统)的那些物质。

[00110]本发明化合物的药学上可接受的前药包括但不限于酯、氨基酸酯、磷酸酯、金属盐和磺酸酯。

[00111]可用于这些药用组合物的药学上可接受的载体包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂；血清蛋白例如人血清白蛋白、缓冲物质例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅胶、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素类物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。

[00112]可通过口服、肠胃外、吸入喷雾、局部、直肠、鼻、含服、阴道或植入贮库给予本发明组合物。本文中使用的术语“肠胃外”包括但不限于皮下、静脉内、肌内、关节内、滑液内、胸骨内、鞘内、肝内、损害内和颅内注射或输注技术。优选，通过口服、腹膜内或静脉内给予组合物。

[00113]无菌注射形式的本发明组合物可以是水或油性混悬液。可按照本领域已知技术，用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制这些混悬液。这种无菌注射制剂也可以是用无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂配制的无菌注射溶液或混悬液，例如用1，3-丁二醇制备的溶液。其中可使用的可接受的溶媒和溶剂是水、林格氏液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌非挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。因此，可使用任何非刺激性非挥发油，它们包括合成甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸例如油酸及其甘油酯衍生物可用于制备注射剂，天然的药学上可接受的油例如橄榄油或蓖麻油，尤其它们的聚氧乙烯化形式也可用于该制剂。这些油溶液或混悬液也可含长链醇稀释剂或分散剂，例如在药学上可接受的剂型配制中常用的羧甲基纤维素或类似分散剂，这些剂型包括乳剂和混悬剂。在制备药学上可接受的固体、液体或其它剂型中常用的其它常用的表面活性剂例如吐温、司盘和其它乳化剂或生物利用度促进剂也可用于制剂。

[00114]可以任何口服可接受的剂型，通过口服给予本发明药用组合物，这些剂型包括但不限于胶囊剂、片剂、水混悬剂或溶液剂。在口服片剂中，常用的载体包括但不限于乳糖和玉米淀粉。通常也可加入润滑剂例如硬脂酸镁。对于口服给予的胶囊形式，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当需要口服给予水混悬液时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂混合。如果需要，也可加入某些甜味剂、矫味剂或着色剂。

[00115]或者，可通过直肠以栓剂形式给予本发明药用组合物。可通过将药物与合适的非刺激性赋形剂混合，制备这些栓剂，所述赋形剂在室温下为固体但在直肠温度下为液体，因此在直肠中融化释放药物。此类物质包括但不限于可可豆脂、蜂蜡和聚乙二醇。

[00116]也可局部，尤其当治疗靶标包括易通过局部涂药到达的部位或器官时，给予本发明药用组合物，这些靶标包括发生疾病的眼睛、皮肤或下肠道。可容易地制备用于各这些部位或器官的合适的局部制剂。

[00117]可通过直肠栓剂(见以上)或合适的灌肠剂实现用于下肠道的局部给药。也可使用局部透皮贴剂。

[00118]为局部给药，可将药用组合物配制成合适的软膏，该软膏含悬浮或溶于一种或多种载体中的活性成分。用于局部给予本发明化合物的载体包括但不限于矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，可将药用组合物配制成合适的洗剂或霜剂，它们含有悬浮或溶于一种或多种药学上可接受的载体中的活性成分。合适的载体包括但不限于矿物油、司盘-60、吐温60、十六烷基酯蜡、十六醇十八醇混合物(cetearyl alcohol)、2-辛基十二醇、苯甲醇和水。

[00119]可在等渗调pH的无菌盐水中将药用组合物配制成眼用微粉化混悬液，或优选在含或不含防腐剂例如苯扎氯铵的等渗调pH的无菌盐水中配制成眼用溶液。或者，可在软膏例如凡士林中配制眼用药用组合物。

[00120]也可通过鼻喷雾剂或吸入给予本发明药用组合物。按照药剂领域中熟知的技术制备此类组合物，可用盐水制备溶液，用苯甲醇或其它合适的防腐剂、增加生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其它常用稳定剂或分散剂。

[00121]可与载体物质组合得到单一剂型的蛋白激酶抑制剂的量取决于所治疗的宿主、具体给药模式而变。优选，应按0.01-100mg抑制剂/kg体重/日剂量给予接受这些组合物的患者，配制组合物。

[00122]还应理解，用于任何具体患者的特定剂量和治疗方案取决于多种因素，它们包括所使用的特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、排泄速度、联合药物、主治医师的判断和所治疗的具体疾病的严重程度。抑制剂的量还取决于组合物中的具体化合物。

[00123]按照另一个实施方案，本发明提供治疗或预防蛋白激酶介导的病症(在某些实施方案中，为PLK介导的病症)的方法，该方法包括给予患者上述药用组合物之一的步骤。本文中使用的术语“患者”表示动物，优选人。

[00124]优选，用该方法治疗或预防选自例如以下癌症的病症：乳腺、结肠、前列腺、皮肤、胰腺、脑、泌尿生殖道、淋巴系统、胃、喉的癌症和包括肺腺癌和小细胞肺癌在内的肺癌；中风、糖尿病、骨髓瘤、肝肿大、心肥大、早老性痴呆、囊性纤维变性和病毒性疾病，或上述任何具体疾病。

[00125]本发明的另一方面涉及在患者中抑制蛋白激酶活性，该方法包括给予患者式I化合物或含所述化合物的组合物。

[00126]根据所治疗或预防的具体的蛋白激酶介导的病症，通常可将给予的治疗或预防该病症的其它药物与本发明抑制剂一起给予。例如，化疗药物或其它抗增殖药物可与本发明蛋白激酶抑制剂联合治疗增殖疾病。

[00127]可由含蛋白激酶抑制剂的化合物或组合物，分别给予作为多剂量方案的一部分的那些其它药物。或者，那些药物可在单一组合物中作为单剂量形式的一部分与蛋白激酶抑制剂混合在一起。

[00128]在某些实施方案中，所述蛋白激酶抑制剂是PLK激酶抑制剂。在其它实施方案中，所述蛋白激酶抑制剂是PLK1激酶抑制剂。

[00129]本发明也可用于除涉及给予患者以外的那些方法。

[00130]本发明的一个方面涉及在生物样品或患者中抑制蛋白激酶活性的方法，该方法包括使所述生物样品与式I化合物或含所述化合物的组合物接触。本文中使用的术语“生物样品”表示体外或离体样品，它们包括但不限于细胞培养物或其提取物；从哺乳动物或其提取物得到的活组织检查物；和血液、唾液、尿、粪、精液、泪液或其它体液或其提取物。

[00131]生物样品中蛋白激酶活性的抑制可用于本领域技术人员已知的多种目的。此类目的的实例包括但不限于输血、器官移植和生物样品贮存。

[00132]本发明的另一个方面涉及蛋白激酶的生物和病理现象的研究；由此类蛋白激酶介导的细胞内信号转导途径的研究；和新的蛋白激酶抑制剂的对比性评价。此类用途的实例包括但不限于生物测定，例如酶测定和基于细胞的(cell-based)测定。

[00133]一般而言，可通过本领域技术人员已知的方法制备本发明化合物。可通过已知方法分析那些化合物，这些方法包括但不限于LCMS(液相色谱质谱)和NMR(核磁共振)。也可按照这些实例测试本发明化合物。应理解，以下所示特定条件仅为实例，而不应限制这些可用于制备、分析或测试本发明化合物的条件的范围。另外，本发明还包括本领域技术人员已知的制备、分析和测试本发明化合物的条件。

实施例

100134]本文中使用的术语＂Rt(分钟)＂是指与化合物有关的HPLC保留时间，以分钟为单位。除另有说明外，得到报道的保留时间所使用的HPLC方法如下：

柱：ACE C8柱，4.6×150mm

梯度：0-100％乙腈+甲醇60：40(20mM三磷酸酯(Trisphosphate))

流速：1.5mL/分钟

检测波长：225nm。

[00135]在MicroMass Quattro Micro质谱分光计上分析质谱样品，按电喷雾离子化下的单MS模式操作。用色谱方法将样品引入质谱分光计。

[00136]用Bruker DPX400仪，在400MHz下记录¹H-NMR图谱。如下制备并分析以下式I化合物。

实施例1：

3-[1-(2-氯-苯基)-乙氧基]-5-咪唑-1-基-噻吩-2-甲酰胺(I-1)

方法A：3-羟基-5-咪唑-1-基-噻吩-2-甲酸甲酯

[00137]将咪唑(710mg，10.4mmol，2当量)和2-氯-3-氧代-2，3-二氢-噻吩-2-甲酸甲酯(1.0g，5.19mmol，1.0当量)溶于无水DCM(25mL)，然后在环境温度下搅拌18小时。使粗反应混合物在EtOAc(50mL)和盐水(50mL)之间分配。将水相用EtOAc(3×20mL)萃取，将合并的有机萃取液用盐水(1×10mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，真空浓缩。残渣经柱层析(5％MeOH/DCM)纯化，然后在EtOAc/己烷中重结晶，得到副标题化合物，为黄色粉末(692mg，3.09mmol59％)；¹H NMR(400MHz，d-6DMSO)δ3.77(3H，s)，7.02(1H，s)，7.14(1H，d)，7.74(1H，d)，8.28(1H，d)，10.82(1H，br s).

方法B：3-[1-(2-氯-苯基)-乙氧基]-5-咪唑-1-基-噻吩-2-甲酸甲酯

[00138]在氮气下，将三苯基膦(304mg，1.16mmol，1.3当量)、1-(2-氯-苯基)-乙醇(182mg，1.16mmol，1.3当量)和3-羟基-5-咪唑-1-基-噻吩-2-甲酸甲酯(200mg，0.89mmol，1.0当量)的无水THF(5mL)溶液冷却至0℃。滴加偶氮二羧酸二乙酯(183μL，1.16mmol，1.3当量)。将反应物在0℃下搅拌30分钟，然后升温至环境温度，保持3.5小时。将溶剂真空除去，将残渣再溶于DCM，然后将其吸附到SiO₂上。粗产物经柱层析(75％EtOAc/石油醚)纯化，得到副标题化合物，为浅黄色泡沫状物(290mg，0.80mmol，84％)；¹H NMR(400MHz，d-6 DMSO)δ1.60(3H，d)，3.80(3H，s)，5.90(1H，q)，7.14(1H，d)，7.31-7.37(1H，m)，7.43-7.49(3H，m)，7.74-7.78(2H，m)，8.29(1H，d).

方法C：3-[1-(2-氯-苯基)-乙氧基]-5-咪唑-1-基-噻吩-2-甲酰胺(I-1)

[00139]将3-[1-(2-氯-苯基)-乙氧基]-5-咪唑-1-基-噻吩-2-甲酸甲酯(265mg，0.73mmol，1.0当量)悬浮于7MNH₃的MeOH溶液(10mL)，在压力试管中加热至80℃，保持3天。将溶剂真空除去，产物经柱层析(2％-5％MeOH/EtOAc)分离，然后用乙醚研磨，得到标题化合物，为奶油色粉末(163mg，0.47mmol，64％)；¹H NMR(400MHz，d-6DMSO)δ1.71(3H，d)，5.89(1H，q)，7.03(1H，br s)，7.11(1H，s)，7.23(1H，s)，7.36-7.42(2H，m)，7.49(1H，dd)，7.63(1H d)，7.66(1H，dd)，7.78(1H，br s)，8.17(1H，s)

实施例2：

5-(5-氨基-2H-吡唑-3-基)-3-[1-(2-氯-苯基)-乙氧基]-噻吩-2-甲酰胺(I-2)

方法D：3-[1-(2-氯-苯基)-乙氧基]-噻吩-2，5-二甲酸二甲酯

[00140]在0℃下，在氮气下，搅拌下，将偶氮二羧酸二乙酯(1.29g，7.41mmol，1.3当量)加入1-(2-氯-苯基)-乙醇(893mg，5.70mmol，1.0当量)、三苯基膦(1.94g，7.41mmol，1.3当量)和3-羟基噻吩-2，5-二甲酸二甲酯(1.23g，5.70mmol，1.0当量)的无水THF(20mL)溶液，让反应物升温至环境温度过夜。将粗反应混合物真空浓缩，经柱层析(10％EtOAc/石油醚)纯化，得到副标题化合物，为白色固体(1.94g，5.6mmol，93％)；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ1.71(3H，d)，3.89(3H，s)，3.95(3H，s)，5.80(1H，q)，7.20-7.32(3H，m)，7.39(1H，d)，7.66(1H，d).

方法E：3-[1-(2-氯-苯基)-乙氧基]-5-氰基乙酰基-噻吩-2-甲酸甲酯

[00141]在环境温度下，在氮气下，将MeCN(231mg，5.62mmol，1.0当量)加入NaH(225mg，60％矿物油分散体，5.62mmol，1.0当量)的无水二噁烷(30mL)悬浮液中。搅拌25分钟后，加入3-[1-(2-氯苯基)-乙氧基]-噻吩-2，5-二甲酸二甲酯(1.94g，5.62mmol，1.0当量)，将反应物加热回流过夜。将反应物冷却至环境温度，用水淬灭，使其在EtOAc(100mL)和盐水(100mL)之间分配。将水相用EtOAc(2×50mL)萃取，将合并的有机萃取液干燥(MgSO₄)，真空浓缩。粗产物经柱层析(50％EtOAc/石油醚)纯化，得到副标题化合物，为白色固体(115mg，0.32mmol，6％)；¹H NMR(400MHz，d-6 DMSO)δ1.61(3H，d)，3.82(3H，s)，4.62-4.74(2H，m).5.88(1H，q)，7.35(1H，t)，7.40(1H，t)，7.48(1H，d)，7.73(1H，d)，7.91(1H，s).

方法F：5-(5-氨基-2H-吡唑-3-基)-3-[1-(2-氯-苯基)-乙氧基]-噻吩-2-甲酸甲酯

[00142]搅拌下，将水合肼(17.4mg，0.35mmol，1.1当量)加入3-[1-(2-氯苯基)-乙氧基]-5-氰基乙酰基-噻吩-2-甲酸甲酯(115mg，0.32mmol，1.0当量)的EtOH(4mL)溶液中，将反应物在80℃下加热过夜。将反应混合物真空浓缩，经柱层析(70/9/1DCM/MeOH/NH₃水溶液)纯化，得到副标题化合物，为白色固体(35mg，0.09mmol，29％)；

方法G：5-(5-氨基-2H-吡唑-3-基)-3-[1-(2-氯-苯基)-乙氧基]-噻吩-2-甲酰胺

[00143]使5-(5-氨基-2H-吡唑-3-基)-3-[1-(2-氯苯基)-乙氧基]-噻吩-2-甲酸甲酯(47mg，0.124mmol，1.0当量)悬浮于7M NH₃的MeOH溶液(6mL)，在压力试管中加热至100℃，保持3天。将溶剂真空除去，产物经柱层析(70/9/1DCM/MeOH/NH₃水溶液)分离，得到标题化合物，为灰白色固体(15mg，0.041mmol，33％)；¹H NMR(400MHz，d-4MeOH)δ1.73(3H，d)，5.66(1H，br s)，5.93(1H，q)，6.88(1H，s)，7.27-7.38(2H，m)，7.44(1H，d)，7.54(1H，d).

 

#	名称	LCMS质量+	HPLCRt(分钟)
				I-1	3-[1-(2-氯-苯基)-乙氧基]-5-咪唑-1-基-噻吩-2-甲酰胺	348.2	9.8
I-2	5-(5-氨基-2H-吡唑-3-基)-3-[1-(2-氯-苯基)-乙氧基]-噻吩-2-甲酰胺	363.2	9.6

实施例4：PLK测定

[00144]用以下测定评价作为人PLK激酶抑制剂的本发明化合物。

Plk1抑制测定：

[00145]用放射性磷酸盐结合测定筛选具有抑制Plk1能力的化合物。在25mM HEPES(pH7.5)，10mM MgCl₂和1mM DTT的混合物中进行测定。底物终浓度为50μM[γ-33P]ATP(136mCi 33PATP/mmol ATP，Amersham Pharmacia Biotech/Sigma Chemicals)和10μM肽(SAM68蛋白Δ332-443)。在25℃下，在15nM Plk1(A20-K338)的存在下进行测定。制备含除ATP和目的试验化合物外的上列所有试剂的测定贮备缓冲液。将30μL贮备液放入96孔板中，然后按一式两份(终DMSO浓度为5％)，加入2μL含系列稀释浓度的试验化合物的DMSO贮备液(通常起始浓度为10μM终浓度，按2倍稀释倍数进行系列稀释)。将板在25℃下预温育10分钟，然后通过加入8μL[γ-33P]ATP(终浓度50μM)起动反应。

[00146]60分钟后，通过加入100μL0.14M磷酸使反应终止。用100μL0.2M磷酸将多网(multiscreen)磷酸纤维素过滤器96孔板(Millipore，分类号MAPHN0B50)预处理，然后加入125μL终止反应的测定混合物。将板用4×200μL0.2M磷酸漂洗。干燥后，将100μLOptiphase‘SuperMix′液体闪烁混合物(Perkin Elmer)加入孔中，然后进行闪烁计数(1450Microbeta液体闪烁计数器，Wallac)。

[00147]将所有数据点的平均背景值扣除后，通过用Prism软件包(Macintosh，GraphPad Software的GraphPad Prism 3.0cx版本，SanDiego California，USA)对初始速率数据进行非线性回归分析，计算Ki(app)数据。

Plk1抑制测定：

[00148]用放射性磷酸盐结合测定筛选具有抑制Plk1能力的化合物。在25mM HEPES(pH7.5)，10mM MgCl₂，0.1％BSA和2mM DTT的混合物中进行测定。底物终浓度为150μM[γ-33P]ATP(115mCi 33PATP/mmol ATP，Amersham Pharmacia Biotech/Sigma Chemicals)和300μM肽(KKKISDELMDATFADQEAK)。在25℃下，在4nM Plk1的存在下进行测定。制备含除ATP和目的试验化合物外的上列所有试剂的测定贮备缓冲液。将30μL贮备液放入96孔板中，然后按一式两份(终DMSO浓度为5％)，加入2μL含系列稀释浓度的试验化合物的DMSO贮备液(通常起始浓度为10μM终浓度，按2倍稀释倍数进行系列稀释)。将板在25℃下预温育10分钟，然后通过加入8μL[γ-33P]ATP(终浓度150μM)起动反应。

[00149]90分钟后，通过加入100μL0.14M磷酸将反应终止。用100μL0.2M磷酸将多网磷酸纤维素过滤器96孔板(Millipore，分类号MAPHN0B50)预处理，然后加入125μL终止反应的测定混合物。将板用4×200μL0.2M磷酸漂洗。干燥后，将100μL Optiphase‘SuperMix′液体闪烁混合物(Perkin Elmer)加入孔中，然后进行闪烁计数(1450Microbeta液体闪烁计数器，Wallac)。

[00150]将所有数据点的平均背景值扣除后，通过用Prism软件包(Macintosh，GraphPad Software的GraphPad Prism 3.0cx版本，SanDiego California，USA)对初始速率数据进行非线性回归分析，计算Ki(app)数据。

一般而言，本发明化合物均可有效抑制Plk1。以下化合物在放射性结合测定中显示的Ki为10nM-100nM：I-1。以下化合物在放射性结合测定中显示的Ki为100nM-4μM：I-2。

Plk2抑制测定：

[00151]用放射性磷酸盐结合测定筛选具有抑制Plk2能力的化合物。在25mM HEPES(pH7.5)，10mM MgCl₂，0.1％BSA和2mM DTT的混合物中进行测定。底物终浓度为200μM[γ-33P]ATP(57mCi 33PATP/mmol ATP，Amersham Pharmacia Biotech/Sigma Chemicals)和300μM肽(KKKISDELMDATFADQEAK)。在25℃下，在25nM Plk2的存在下进行测定。制备含除ATP和目的试验化合物外的上列所有试剂的测定贮备缓冲液。将30μL贮备液放入96孔板中，然后按一式两份(终DMSO浓度为5％)，加入2μL含系列稀释浓度的试验化合物的DMSO贮备液(通常起始浓度为10μM终浓度，按2倍稀释倍数进行系列稀释)。将板在25℃下预温育10分钟，然后通过加入8μL[γ-33P]ATP(终浓度200μM)起动反应。

[00152]90分钟后，通过加入100μL0.14M磷酸将反应终止。用100μL0.2M磷酸将多网磷酸纤维素过滤器96孔板(Millipore，分类号MAPHN0B50)预处理，然后加入125μL终止反应的测定混合物。将板用4×200μL0.2M磷酸漂洗。干燥后，将100μL Optiphase‘SuperMix′液体闪烁混合物(Perkin Elmer)加入孔中，然后进行闪烁计数(1450Microbeta液体闪烁计数器，Wallac)。

[00153]将所有数据点的平均背景值扣除后，通过用Prism软件包(Macintosh，GraphPad Software的GraphPad Prism 3.0cx版本，SanDiego California，USA)对初始速率数据进行非线性回归分析，计算Ki(app)数据。

Plk3抑制测定：

[00154]用放射性磷酸盐结合测定筛选具有抑制Plk3能力的化合物。在25mM HEPES(pH7.5)，10mM MgCl₂和1mM DTT的混合物中进行测定。底物终浓度为75μM[γ-33P]ATP(60mCi33P ATP/mmolATP，Amersham Pharmacia Biotech/Sigma Chemicals)和10μM肽(SAM68蛋白Δ332-443)。在25℃下，在5nM Plk3(S38-A340)的存在下进行测定。制备含除ATP和目的试验化合物外的上列所有试剂的测定贮备缓冲液。将30μL贮备液放入96孔板中，然后按一式两份(终DMSO浓度为5％)，加入2μL含系列稀释浓度的试验化合物的DMSO贮备液(通常起始浓度为10μM终浓度，按2倍稀释倍数进行系列稀释)。将板在25℃下预温育10分钟，然后通过加入8μL[γ-33P]ATP(终浓度75μM)起动反应。

[00155]60分钟后，通过加入100μL 0.14M磷酸将反应终止。用100μL0.2M磷酸将多网磷酸纤维素过滤器96孔板(Millipore，分类号MAPHN0B50)预处理，然后加入125μL终止反应的测定混合物。将板用4×200μL 0.2M磷酸漂洗。干燥后，将100μL Optiphase‘SuperMix′液体闪烁混合物(Perkin Elmer)加入孔中，然后进行闪烁计数(1450Microbeta液体闪烁计数器，Wallac)。

[00156]将所有数据点的平均背景值扣除后，通过用Prism软件包(Macintosh，GraphPad Software的GraphPad Prism 3.0cx版本，SanDiego California，USA)对初始速率数据进行非线性回归分析，计算Ki(app)数据。

Plk4抑制测定：

[00157]用放射性磷酸盐结合测定筛选具有抑制Plk4能力的化合物。在8mM MOPS(pH7.5)，10mM MgCl₂，0.1％BSA和2mM DTT的混合物中进行测定。底物终浓度为15μM[γ-33P]ATP(227mCi 33PATP/mmol ATP，Amersham Pharmacia Biotech/Sigma Chemicals)和300μM肽(KKKMDATFADQ)。在25℃下，在25nM Plk4的存在下进行测定。制备含除ATP和目的试验化合物外的上列所有试剂的测定贮备缓冲液。将30μL贮备液放入96孔板中，然后按一式两份(终DMSO浓度为5％)，加入2μL含系列稀释浓度的试验化合物的DMSO贮备液(通常起始浓度为10μM终浓度，按2倍稀释倍数进行系列稀释)。将板在25℃下预温育10分钟，然后通过加入8μL[γ-33P]ATP(终浓度15μM)起动反应。

[00158]180分钟后，通过加入100μL 0.14M磷酸将反应终止。用100μL 0.2M磷酸将多网磷酸纤维素过滤器96孔板(Millipore，分类号MAPHN0B50)预处理，然后加入125μL终止反应的测定混合物。将板用4×200μL 0.2M磷酸漂洗。干燥后，将100μL Optiphase‘SuperMix′液体闪烁混合物(Perkin Elmer)加入孔中，然后进行闪烁计数(1450Microbeta液体闪烁计数器，Wallac)。

[00159]将所有数据点的平均背景值扣除后，通过用Prism软件包(Macintosh，GraphPad Software的GraphPad Prism 3.0cx版本，SanDiego California，USA)对初始速率数据进行非线性回归分析，计算Ki(app)数据。

序列表

<110>弗特克斯

<120>噻吩甲酰胺

<130>125805/00280

<140>60/791,807

<141>2006-04-13

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>16

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>Plk 1

<400>1

<210>2

<211>19

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>Plk 1

<400>2

<210>3

<211>11

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>Plk 1

<400>3

Claims (37)

1.一种式I化合物：

其中

R¹为H、C_1-6脂族基团或C_3-6脂环族基团；

G为-C(R)₂-或-O-；

L为任选被0-3个J^L取代的C_0-3脂族基团；

A环为含1-2个氮原子的5元芳族单环环；A环任选被0-3个J^A取代；

B环为含0-3个杂原子的5元-6元芳族单环环，所述杂原子选自O、N和S；B环任选被0-5个J^B取代，且任选与B′环稠合；

B′环为含0-3个杂原子的5元-8元芳族或非芳族单环环，所述杂原子选自O、N和S；B′环任选被0-4个J^B′取代；

J^A、J^B和J^B′各自独立为C_1-6卤代烷基、卤基、NO₂、CN、Q或-Z-Q；

Z独立为C_1-6脂族基团，其中0-3个亚甲基单元任选被以下基团置换：-NR-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(＝NR)-、-C(＝NOR)-、-SO-或-SO₂-；各Z任选被0-2个J^Z取代

Q为H；C_1-6脂族基团；具有0-3个杂原子的3元-8元芳族或非芳族单环环，所述杂原子独立选自O、N和S；或具有0-5个杂原子的8元-12元芳族或非芳族双环环系统，所述杂原子独立选自O、N和S；各Q任选被0-5个J^Q取代；

J^L和J^Z各自独立为H、卤基、C_1-6脂族基团、C_3-6脂环族基团、NO₂、CN、-NH₂、-NH(C_1-4脂族基团)、-N(C_1-4脂族基团)₂、-OH、-O(C_1-4脂族基团)、-CO₂H、-CO₂(C_1-4脂族基团)、-O(卤代C_1-4脂族基团)或卤代(C_1-4脂族基团)；

各J^Q独立为M或-Y-M；

各Y独立为未被取代的C_1-6脂族基团，其中0-3个亚甲基单元任选被以下基团置换：-NR-、-O-、-S-、-C(O)-、-SO-或-SO₂-；

各M独立为H、C_1-6脂族基团、C_3-6脂环族基团、卤代(C_1-4脂族基团)、-O(卤代C_1-4脂族基团)、C_3-6杂环基、卤基、NO₂、CN、OH、OR′、SH、SR′、NH₂、NHR′、N(R′)₂、COH、COR′、CONH₂、CONHR′、CONR′₂、NHCOR′、NR′COR′、NHCONH₂、NHCONHR′、NHCON(R′)₂、SO₂NH₂、SO₂NHR′、SO₂N(R′)₂、NHSO₂R′或NR′SO₂R′；

R为H或未被取代的C_1-6脂族基团；

R′为未被取代的C_1-6脂族基团；或两个R′基团和它们连接的原子一起形成未被取代的具有0-1个杂原子的3元-8元非芳族单环环，所述杂原子独立选自O、N和S。

2.权利要求1的化合物，其中G为-C(R)₂-。

3.权利要求1的化合物，其中G为O。

4.权利要求1-3中任一项的化合物，其中R¹为H。

5.权利要求1-4中任一项的化合物，其中A环为吡唑基、吡咯基或咪唑基。

6.权利要求5的化合物，其中A环为吡唑基。

7.权利要求5的化合物，其中A环为吡咯基。

8.权利要求5的化合物，其中A环为咪唑基。

9.权利要求1-8中任一项的化合物，其中B环为含0-2个氮原子的6元芳环。

10.权利要求1-9中任一项的化合物，其中B环与B′环稠合。

11.权利要求10的化合物，其中B′环为含0-3个杂原子的5元-6元芳环，所述杂原子选自O、N和S。

12.权利要求1-11中任一项的化合物，其中J^A为H、C_1-6脂族基团、C_3-6脂环族基团、卤代(C_1-4脂族基团)、-O(卤代C_1-4脂族基团)、C_3-6杂环基、卤基、NO₂、CN、OH、OR、SH、SR、NH₂、NHR、N(R)₂、COH、COR、CONH₂、CONHR、CONR₂、NHCOR、NRCOR、NHCONH₂、NHCONHR、NHCON(R)₂、SO₂NH₂、SO₂NHR、SO₂N(R)₂、NHSO₂R或NRSO₂R。

13.权利要求12的化合物，其中J^A为H。

14.权利要求1-13中任一项的化合物，其中J^B为H、C_1-6脂族基团、C_3-6脂环族基团、卤代(C_1-4脂族基团)、-O(卤代C_1-4脂族基团)、C_3-6杂环基、卤基、NO₂、CN、OH、OR、SH、SR、NH₂、NHR、N(R)₂、COH、COR、CONH₂、CONHR、CONR₂、NHCOR、NRCOR、NHCONH₂、NHCONHR、NHCON(R)₂、SO₂NH₂、SO₂NHR、SO₂N(R)₂、NHSO₂R或NRSO₂R。

15.权利要求1-14中任一项的化合物，其中J^B′为H、C_1-6脂族基团、C_3-6脂环族基团、卤代(C_1-4脂族基团)、-O(卤代C_1-4脂族基团)、C_3-6杂环基、卤基、NO₂、CN、OH、OR、SH、SR、NH₂、NHR、N(R)₂、COH、COR、CONH₂、CONHR、CONR₂、NHCOR、NRCOR、NHCONH₂、NHCONHR、NHCON(R)₂、SO₂NH₂、SO₂NHR、SO₂N(R)₂、NHSO₂R或NRSO₂R。

16.以下化合物：

17.一种组合物，所述组合物包含权利要求1-16中任一项的化合物和药学上可接受的载体、助剂或溶媒。

18.一种在患者中抑制蛋白激酶活性的方法，所述方法包括给予所述患者

a)权利要求17的组合物；或

b)权利要求1-16中任一项的化合物。

19.一种在生物样品中抑制蛋白激酶活性的方法，所述方法包括使所述生物样品与以下物质接触：

a)权利要求17的组合物；或

b)权利要求1-16中任一项的化合物。

20.权利要求18或权利要求19的方法，其中所述蛋白激酶为PLK。

21.权利要求20的方法，其中所述蛋白激酶为PLK1。

22.一种在患者中治疗以下病症的方法：增殖病症、神经变性病症、自身免疫性病症、炎性病症或免疫介导的病症，所述方法包括给予患者以下物质的步骤：

a)权利要求17的组合物；或

b)权利要求1-16中任一项的化合物。

23.权利要求18或权利要求22的方法，所述方法包括给予所述患者选自以下的其它治疗药物：化疗或抗增殖药物、抗炎药物、免疫调节或免疫抑制药物、神经营养因子、治疗心血管疾病的药物、治疗破坏性骨病的药物、治疗肝病的药物、抗病毒药物、治疗血液病的药物、治疗糖尿病的药物或治疗免疫缺陷疾病的药物，其中：

所述其它治疗药物适合所治疗的疾病；和

将所述其它治疗药物和所述组合物作为单一剂量形式一起给予，或作为多剂量形式的一部分与所述组合物分别给予。

24.一种在患者中治疗黑素瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、成神经细胞瘤或癌症的方法，所述癌症选自结肠癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、中枢神经系统(CNS)癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌或胰腺癌，其中所述方法包括给予所述患者

a)权利要求17的组合物；或

b)权利要求1-16中任一项的化合物。

25.一种在患者中治疗癌症的方法，其中所述方法包括给予所述患者

a)权利要求17的组合物；或

b)权利要求1-16中任一项的化合物。

26.权利要求25的方法，其中所述方法包括用以下物质通过抑制PLK破坏癌细胞有丝分裂的步骤：

a)权利要求17的组合物；或

b)权利要求1-16中任一项的化合物。

27.一种制备式I化合物的方法：

其中G为O，R¹为H，且A环、B环、J^A、J^B和L同权利要求1-16中任一项定义，

所述方法包括在合适的酰胺形成条件下，使式5化合物反应

其中A环、B环、J^A、J^B和L同权利要求1-16中任一项定义，

形成式I化合物。

28.权利要求27的方法，所述方法还包括在合适的交叉偶联条件下，使式4化合物；

其中X为卤基，且B环、J^B和L同权利要求1-16中任一项定义；

与式i化合物偶联

其中CP为交叉偶联基团，且A环和J^A同权利要求1-16中任一项定义；

形成式5化合物的步骤。

29.权利要求27的方法，所述方法还包括在合适的偶联基团形成条件下，使式4化合物；

其中X为卤基，且B环、J^B和L同权利要求1-16中任一项定义；

与偶联基团前体偶联，形成式5a化合物的步骤：

其中CP为交叉偶联基团，且B环、J^B和L同权利要求1-16中任一项定义。

30.权利要求29的方法，所述方法还包括在合适的交叉偶联条件下，使式5a化合物与式ii化合物偶联

其中X为合适的离去基团，且A环和J^A同权利要求1-16中任一项中定义；形成式5化合物的步骤，其中L、A环、B环、J^A和J^B同权利要求1-16中任一项定义。

31.权利要求28或权利要求29的方法，所述方法还包括在合适的O-C键偶联条件下，使式3化合物：

其中X为卤基；

与

偶联；

其中LG为合适的离去基团，且L、B环和J^B同权利要求1-16中任一项定义；

形成式4化合物的步骤。

32.一种制备式I化合物的方法：

其中G为O，R¹为H，且A环、B环、J^A、J^B和L同权利要求1-16中任一项定义，

所述方法包括在合适的O-C键偶联条件下，使式7化合物：

与

反应；

其中LG为合适的离去基团，且L、B环和J^B同权利要求1-16中任一项中定义；

形成式I化合物。

33.权利要求32的方法，所述方法还包括以下步骤：

a)在合适的交叉偶联条件下，使式2化合物：

与式i化合物偶联，

其中CP为交叉偶联基团，且A环和J^A同权利要求1-16中任一项中定义，形成式6化合物：

b)在合适的脱保护条件下，使式6化合物脱保护，形成式7化合物。

34.权利要求32的方法，所述方法还包括以下步骤：

a)在合适的偶联基团形成条件下，使式2化合物：

与偶联基团前体偶联，形成式5b化合物：

其中CP为交叉偶联基团；

b)使式5b化合物与

偶联；其中X为合适的离去基团，且A环和J^A定义同本文，形成式6化合物：

c)在合适的脱保护条件下，使式6化合物脱保护，形成式7化合物。

35.权利要求32的方法，所述方法还包括通过合适的共轭加成条件，将

其中A环为含能够亲核进攻的氮原子的芳环，且J^A同权利要求1-16中任一项定义；

加入式8化合物：

形成式7化合物的步骤。

36.权利要求27的方法，其中A环为吡唑，G为O，且B环、J^A、J^B和L同权利要求1-16中任一项定义；

所述方法还包括以下步骤

(a)将式12化合物加入乙腈阴离子；

然后在肼的存在下，使中间体环合，形成式5化合物。

37.权利要求35的方法，所述方法还包括在合适的O-C键偶联条件下，使式11化合物：

与

偶联；其中LG为合适的离去基团，且L、B环和J^B同权利要求1-16中任一项定义；

形成式12化合物的步骤。