CN101278012A - 用于阻断血小板和细胞粘附、细胞迁移和炎症的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供沙拉丁素组合物及其使用方法。本发明的一个方面是一种预防或者减缓粘附、瘢痕疙瘩和疤痕发展的方法。粘附、瘢痕疙瘩和疤痕可能由手术造成，例如整形手术或者矫形手术，或者可以是原有疤痕。本发明的另一个方面是一种治疗屈肌腱损伤的方法。

Description

用于阻断血小板和细胞粘附、细胞迁移和炎症的方法和组合物
交叉引用
本申请涉及并要求享有2005年9月28日提交的美国临时申请60/721,754的优先权，在此完整引入作为参考。
发明背景
损伤应答是一种用于恢复组织完整性的固有的宿主免疫应答。伤口愈合，不管是由外伤、手术、微生物或者外源材料启动，都是通过事件的交叠模式进行，包括凝结、炎症、上皮形成、肉芽组织的形成、基质和组织重塑。修复过程在很大程度上受相互作用的分子信号调节，包括激发和协调多种细胞活性的细胞因子，所述细胞活性重点涉及炎症和愈合。
初始损伤引发凝结作用和急性局部炎性应答，继之以间质细胞募集、增殖和基质合成。无法解决炎症可能导致慢性不愈合创口，而基质不受控制的积聚经常涉及异常细胞因子途径，导致过量的疤痕和纤维化结果。
大多数类型的损伤损害血管，而凝结是起动止血作用和防止宿主过度失血的应答。血管壁损伤将胶原暴露于流动血液中的成分。胶原是凝血酶原表面组分，其已经被证明是血小板粘附、聚集及其颗粒释放的刺激剂，导致其他血小板被募集到该区域形成凝聚物或者血栓(Ruggeri，Z.M.等人；Seminars in Hematology，1994，31，229-39)。血小板与血管表面的初次接触受胶原结合的von Willebrand因子(vWF)和血小板上特异性vWF受体--糖蛋白Ib-V-IX复合物的介导。这种可逆的粘附使得血小板翻转到受损区域，然后继之以胶原受体(α(2)β(1)，GPVI)介导的坚固粘附，进一步导致血小板活化。这导致血小板α(IIb)β3受体的构象活化、纤维蛋白原结合和最终的血小板凝集。此外ADP、肾上腺素和循环凝结因子驱动血小板的其它激活过程，而同时凝血酶活性的增加有助于交联的纤维蛋白凝块的形成。血小板-血小板凝集支持该过程，并被作为调节物的纤维蛋白原驱动，所述纤维蛋白原通过糖蛋白IIb/IIIa受体桥接细胞。
这种正常的生理反应在病理过程中起作用，所述病理过程中血小板与巩膜损伤所暴露的胶原粘附(Van der Rest M.等人；FASEB Journal，1991，5，2814-23)并启始建立阻塞。根据阻塞的位置和程度，并发症例如心肌梗死、中风、炎症或者肺栓塞可能是该过程的结果。
作为一个直接作用的抗血栓剂，肝素阻断凝血酶活性从而阻止富含纤维蛋白的血栓形成，在当前被用于抗血栓介入。肝素在下列适应症中使用，例如：不稳定心绞痛和急性心肌梗塞。但是，肝素的若干缺点仍未得到解决，例如静脉应用，需要抗凝血酶-III作为辅因子，对于凝块结合的凝血酶的亲合力降低，被若干种血浆蛋白灭活，间或诱导血小板减少和它的生物学异质性。
近来开发的低分子量肝素提供了皮下应用的形式；但是相对于标准肝素，治疗效益一般。令人遗憾的是，相同情况也适用于直接作用的其它抗凝血酶，例如水蛭素，水蛭肽和华法林。问题之一似乎涉及抗血栓治疗中凝血酶产生的增加(Rao，A.K等人，Circulation，1996，94，389-2395)。
因此近来其他策略集中于因子Xa驱动的凝血酶原活化过程。挑战是设计合适的针对该因子的抑制剂。
另一类治疗表示为溶栓疗法，集中在葡激酶、链激酶、尿激酶型纤溶酶原激活剂、组织型纤溶酶原激活剂和茴香酰化-纤溶酶原-链激酶激活剂复合物。诱导再灌注所需的时间差异对于这些溶血剂中的每一种是不同的，但是从降低总死亡率来说，所有产品的贡献是相同的。此外，再阻塞和/或延长出血是并发症中的一部分。这可能是由于对纤维蛋白的特异性相对较低以及这些化合物的血浆半衰期短。
当人造表面接触血液时，并发症发生了。当属于这种情况时，通过活化血小板和/或诱导凝结，增加诱导血栓事件的倾向。这些作用可能造成血管移植、心脏瓣膜、支架、导管或者任何其他血液接触装置或者材料的失效。此处公开的蛋白具有产生不致血栓的表面，因此还可以通过将该蛋白固定到如上所述的材料和装置上进一步利用。这种处理使得这类材料或装置生物相容和抗血栓。
当前用于尝试控制血小板粘附、活化和后续血栓形成和内膜增生的两条治疗路线是抗血小板剂和抗血栓给药。虽然药物例如阿司匹林通过抑制环加氧酶途径有效地阻断凝血烷A2的合成，但它们没有阻止胶原诱导的血小板粘附和活化，这刺激内膜增生的发展。肝素作为抗血栓剂的使用伴随着并发症和限制，包括不可预测的剂量反应、需要密切的实验室监控、对凝块结合的凝血酶的活性有限、多个抑制部位、抗凝血酶III依赖性、出血的风险，以及需要连续输液。显然，理想的治疗剂是一种产生位置特异和局部的效果，而且没有全身分布或者广泛凝血病的治疗剂。
由于现有抗血栓剂相关的局限性，存在对新的替代策略和治疗剂的实际需要。因此，显而易见需要新的和改进的治疗剂和方法，用于抑制血小板粘附的病理生理学事件，预计在该领域的贡献可以降低与血管成形术或者手术程序相关的发病率和死亡率。
引用的参考
本说明书中提及的全部出版物和专利申请在此以相同程度引入作为参考，就像各个个体出版物或者专利申请是具体和单独指出被引入作为参考。
发明概述
本发明的第一个方面涉及治疗血白细胞介导的炎性病症的方法，通过向需要其的患者施用有效量的沙拉丁素(saratin)。在一个实施方式中，沙拉丁素抑制血白细胞的粘附或者细胞迁移，所述血白细胞例如淋巴细胞，单核细胞，巨噬细胞或者多形核白细胞。在另一个实施方式中，沙拉丁素用于治疗血小板介导的炎症。
本发明的另一个方面涉及抑制细胞迁移和/或细胞粘附到细胞外基质蛋白的方法。在一个实施方式中，沙拉丁素预防细胞粘附到炎性细胞的细胞外基质蛋白。在另一个实施方式中，细胞外基质蛋白是胶原，白蛋白，弹性蛋白或者纤维连接蛋白。
此外，本发明涉及用沙拉丁素治疗手术诱导的并发症的方法。手术诱导的并发症通常与手术诱导的炎症有关。在一个实施方式中，为了治疗手术诱导的炎症，向患者施用有效量的沙拉丁素。手术诱导的并发症也可能是手术诱导的粘附。在另一个实施方式中，为了治疗手术诱导的粘附，向患者施用有效量的沙拉丁素。在一个实施方式中，沙拉丁素预防手术诱导的血小板和/或血白细胞粘附。在一个实施方式中，沙拉丁素预防手术诱导的淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞或者多形核白细胞粘附。在一个实施方式中，沙拉丁素用于手术引起的并发症的治疗，所述并发症由矫形或者整形外手术引起。在一个实施方式中，沙拉丁素用于抑制细胞迁移到损伤部位，例如手术引起的损伤。
有效量的沙拉丁素可以作为局部剂或者植入物的涂层给药。植入物可以是天然或者人工植入物。人工植入物可以是医疗装置，例如整形植入物，心血管植入物或者矫形植入物。在一个实施方式中，医疗装置是心脏瓣膜，移植物，支架，导管，椎间盘，杆，螺钉，板，软骨，或者粘附屏障。天然植入物可以是器官，组织，组织移植物，或者细胞植入物。在一个实施方式中，天然植入物是血管移植物。优选的，沙拉丁素在手术部位被用作局部药剂。
在一个实施方式中，沙拉丁素用于在植入前包被移植物(graft)，移植体(transplant)，或者装置。在另一个实施方式中，沙拉丁素在植入后用于移植物，移植体，或者装置。在另一个实施方式中，沙拉丁素用于手术损伤部位。在又一个实施方式中，沙拉丁素用于损伤组织以防止愈合过程中结疤。组织的损伤可能是由手术、烧伤或者炎性病症所致。
在本发明的另一个方面，沙拉丁素用于预防和/或治疗疤痕和瘢痕疙瘩的形成。疤痕和/或瘢痕疙瘩可能是手术引起的或者由烧伤或者炎性皮肤病所致。在一个实施方式中，疤痕和/或瘢痕疙瘩是整形手术引起的。在一个实施方式中，施用沙拉丁素来抑制手术程序，例如膝、肩膀或者臀部关节切开术或者植入矫形装置，尤其是由手术植入物例如膝、臀部或者肩膀置换或者其他植入的物品产生的疤痕组织。在本发明的另一个实施方式中，直接将沙拉丁素注入已进行美容改造皱纹的患者的皱纹中，以预防疤痕组织形成。
附图说明
通过参考下列阐述说明性实施方式的详细说明和其中的附图，能够更好的理解此处描述的方法和组合物的特点和优势：
图1描绘了在10μg/mL IV型胶原和BSA包被的滤纸(filter)上，沙拉丁素对MCP-1-诱导的人单核细胞迁移的影响。
图2描绘了在1mg/mL BSA，1mg/mL胶原或者1mg/mL纤维连接蛋白包被的滤纸上，沙拉丁素对MCP-1-诱导的人单核细胞迁移的影响。
图3描绘了在10μg/mL IV型胶原和BSA包被的滤纸上，沙拉丁素对MIP-1α-诱导的人T淋巴细胞迁移的影响。
图4描绘了在1mg/mL BSA，1mg/mL IV型胶原或者1mg/mL纤维连接蛋白包被的滤纸上，沙拉丁素对MCP-1α-诱导的人T淋巴细胞迁移的影响。
图5描绘了在小鼠气囊模型中，与注射盐水对照的动物相比，沙拉丁素对MCP-1(JE)-诱导的细胞迁移的影响。标记为沙拉丁素给药的组也用MCP-1(JE)诱导。
图6描绘了在小鼠气囊模型中，与注射盐水对照的动物相比，沙拉丁素对MCP-1(JE)-诱导的细胞因子产生的影响。在每种情况下，标记为沙拉丁素给药的组也用MCP-1(JE)诱导。
图7描绘了序列表。
发明内容
定义和一般的参数
当在本说明书中使用时，下列单词和词组通常被认为具有下面阐明的含义，除了在使用它们的内容中另有指示。
术语“有效量”或者“治疗有效量”是指当向需要这类治疗的动物对象给药时足以实现如下面所定义的治疗的沙拉丁素量。治疗有效量是不同的，取决于接受治疗的对象和病情、对象的体重和年龄、病情的严重程度、给药方式等等，这可以由本领域的普通技术人员很容易地确定。该术语还适用于在靶细胞中诱导特定应答的剂量，所述特异应答例如降低血小板粘附和/或细胞迁移。具体剂量是不同的，取决于选择的特定沙拉丁素化合物、依照的给药方案、它是否与其他化合物联合给药、给药的时间、给药的组织和载有它的物理递药系统。
此处使用的术语“治疗”和其语法同等物包括实现治疗效果和/或预防效果。治疗效果表示根治或者改善接受治疗的根本病症。并且，根除或者改善与根本病症相关的一种或者多种生理症状以致在患者中观察到好转，即实现了治疗效果，尽管患者仍可能罹患着根本病症。至于预防效果，可以将组合物向处于发展特定疾病风险的患者、或者向报告疾病的一种或者多种生理学症状的患者给药，即便可能还没有做出该疾病的诊断。
此处使用的术语“治疗效果”，包括如上所述的治疗效果和/或预防效果。预防效果包括延缓或者消除疾病或者病症的出现，延缓或者消除疾病或者病症的症状发作，减缓、中止或者逆转疾病或者病症的进展，或者其任意组合。
术语“治疗上可接受的盐”是指来自本领域公知的各种有机和无机反离子的盐，包括，仅作为举例，钠，钾，钙，镁，铵，四烷基铵，等等；和当分子包含碱官能团时的有机或者无机酸的盐，例如盐酸，氢溴酸盐，酒石酸盐，甲磺酸盐，乙酸盐，马来酸盐，草酸盐等等。
沙拉丁素
沙拉丁素是一种天然存在的蛋白，从医用水蛭欧洲医蛭(Hirudomedicinalis)的唾液中分离，描述于美国专利6,774,107和6,881,722。已经显示沙拉丁素结合胶原，因此作为天然血小板粘附胶原的抑制剂。具体地，已经表明沙拉丁素阻断vWF结合胶原，并且有效地预防高剪切力下血小板与胶原的粘附。此外，如此处的研究所描述，沙拉丁素抑制趋化因子诱导的迁移。
对沙拉丁素进行测序，从欧洲医蛭cDNA文库中克隆基因。沙拉丁素表征为SEQ.ID.NO.2序列所描述的氨基酸序列，由103个氨基酸组成，构成大约12068道尔顿±1kda的理论相对分子量。该蛋白显示出与其他先前描述的序列没有相似性的独特一级结构。沙拉丁素富含天冬氨酸和谷氨酸，使得通过IEF-PAGE测量，分子的酸性等电点为pH 3.7+-.0.5。SDS-PAGE分析证明，在电泳前蛋白还原的情况下，运动偏移，提示了翻译后修饰。多肽测序显示6个半胱氨酸分子，这可能构成蛋白的翻译后修饰。沙拉丁素的电喷射质谱显示实际分子量为12061道尔顿，提示最多3个二硫键参与蛋白天然形式的二级结构的形成。
沙拉丁素可以通过例如重组技术的程序产生。用于本发明的合适的重组沙拉丁素在多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)中表达和分离。该重组和天然存在的蛋白是胶原依赖性血小板粘附的有效抑制剂，并且如此处所示是细胞迁移所需的基质蛋白的非特异性抑制剂，因此可以用于与心脏病、循环系统疾病和炎性病症有关的不同病症的治疗。此外，沙拉丁素可用于包被天然或者人工的胶原表面，以便使它们对细胞没有粘附性，并预防细胞的活化。
通常，本发明涉及在一定条件下将沙拉丁素引导到组织腔内或者腔上所选位置之内或者之上，所述组织例如，脉管系统或者器官，使沙拉丁素可以作为局部药剂或者作为表面上的粘附涂层局部使用，以预防和抑制对组织损伤的不良血栓应答或者不良的细胞迁移，包括与手术、烧伤、组织移植或者自身免疫疾病相关的损伤。沙拉丁素可以与各种治疗剂联合用于现场给药。
较早已经指出不同的治疗介入诱导局部损伤，所述损伤理论上理想的是被立即和局部治疗。残留的未处理的受损细胞启动一系列过程，所述过程涉及凝结、补体激活、和对细胞因子释放的细胞应答、诱导增殖、以及其他生物活性过程。在本发明的一些实施方式中，因此这是沙拉丁素直接置于被处理的组织的一个方面。局部应用的另一个方面是将与用于介入的药剂全身效应有关的潜在问题最小化。
本发明包括从水蛭欧洲医蛭分离的活性多肽沙拉丁素的制剂和使用方法。利用加压透析和至少一种层析步骤如疏水性相互作用层析(HIC)和/或至少一种阴离子交换层析和任选的至少一种反向高效液相(RP-HPLC)步骤的组合，可以从唾液中分离蛋白。
本发明还涉及分离的DNA，所述DNA包括编码水蛭来源的血小板粘附抑制剂的多核苷酸，所述抑制剂具有蛋白所示的氨基酸序列。描述cDNA克隆的核苷酸序列显示于SEQ.ID.NO.1。核苷酸序列的1-63位代表推定的21氨基酸前导序列，64-372位包含编码103个氨基酸残基多肽和如SEQ.ID.NO.2中成熟蛋白所示氨基酸序列的开放阅读框。图7A描述SEQ.ID.NO.1和2。图7B和7C描述SEQ.ID.NO.3-12。SEQ.ID.NO.3-12是引物序列，用于沙拉丁素基因通过PCR的扩增和分离，大肠杆菌(E.coli)表达载体的构建和表达，杆状病毒供体质粒(baculo donor plasmid)的构建和表达，和酵母表达载体和表达，如美国专利6,774,107中所描述，在此完整引入作为参考。
本发明还涉及重组载体和包含重组载体的宿主细胞，所述重组载体包括编码本发明水蛭来源的血小板粘附抑制剂的合成基因。回收和分离表达蛋白的方法基于标签技术或者从为天然存在沙拉丁素而建立的纯化方案改变而来。根据用于转化了合适载体的酵母细胞、昆虫细胞、幼仓鼠肾细胞和大肠杆菌(E.coli)细胞中胞外或者胞内表达的个体方案，从上清或者沉淀回收重组蛋白的步骤可以适当采用本领域技术人员已知的技术。在作为宿主的大肠杆菌中发现合适的表达，其中通过pelb前导序列的插入促成胞周质表达。在渗透和离心后实现从大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)的产物回收(大约5mg/L)。含有变性酵母改造载体(alterative yeast adopted vector)的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，S.cerevisiae)(＞10mg/L肉汤培养基)用作平行试验。通过离心分离分泌的物质。通过交叉流过滤和离子交换层析实现纯化。在其他利用COS细胞或者CHO细胞的表达途径中，产物表达大约为750ng/mL。纯化的重组物质经电泳和层析分析证明是纯的和均质的，通过氨基酸测序和分子质量测定证明与唾液来源的沙拉丁素相同。用于产生沙拉丁素的技术公开于美国专利6,774,107。例如转基因小鼠，或者其他生物体，包括其他哺乳动物，也可以用于表达沙拉丁素。
本发明的蛋白，沙拉丁素，包括保持了公开序列活性的变异体，包括片段或者亚基，天然存在的变异体，等位基因变异体，随机产生的人工突变体和人为序列变化例如添加保持活性的氨基酸、反向肽(inverse peptide)和包含D-氨基酸的肽。片段或者亚基是指含有的氨基酸比完整蛋白少的序列的任意部分，例如除去完整蛋白N-和/或C-末端部分的部分序列。例如，本发明的蛋白包括沙拉丁素蛋白水解片段，在分离过程中通过SDS-PAGE分析观察到分子量为10kDa。该蛋白还包括具有一种或者多种非天然氨基酸或者其他修饰的修饰形式，例如PEG化或者糖基化。例如，该蛋白包括来自酵母的糖基化产物。
本发明还涵盖杂合蛋白，例如由表达载体内多个基因的表达产生的融合蛋白或者蛋白，并可能包括具有公开蛋白的特异活性的多肽，所述多肽通过肽键与第二种多肽连接。值得注意地，本发明蛋白的其他变异体也被包括，尤其是与分离的蛋白仅仅是保守氨基酸取代有差异的任意变异体。这类保守氨基酸取代在例如Taylor等人，J.Mol.Biol，1986，188，233中定义。
血小板的vWF依赖性结合
本发明涉及称为沙拉丁素的多肽的作用，所述多肽在损伤后减少血小板粘附和积聚。本发明还涉及抑制血小板与胶原vWF依赖性的结合，还有沙拉丁素作为血栓抑制剂的医学用途，其中所述多肽作为局部药剂或者作为植入物和医疗装置的涂层局部使用，所述植入物例如生物植入物(器官，细胞或者组织)。
血细胞尤其是血小板与受损组织包括血管的粘附，是手术程序中一种已知的现象。这类损伤可能在不同的手术和经皮疗法期间发生，所述疗法已经开展用于阻塞的通道、管道和其他腔的复通，以去除有病的组织，和植入替代的组织、医疗装置或者其组成部分。
组织对机械诱导的外伤、外科介入、支架安置、移植物的放置的细胞和分子应答是炎症、平滑肌细胞迁移、增殖和肌成纤维细胞转化的相互作用，一旦外伤发生就发生(Futura；1997.p.289-317)。介入也可能造成一定程度的其他损伤，所述损伤具有局部脱内皮化和底层的细胞外基质组分例如胶原和弹性蛋白的暴露。在一些患者中，血小板和纤维蛋白原的募集可能接着导致急性血栓性阻塞。
血小板与受损血管壁的粘附首先通过von Willebrand因子(vWF)介导，这是一种释放自内皮细胞并在血浆中循环的多聚体糖蛋白，其中它的功能是作为因子VIII的载体蛋白(Annu.Rev.Biochem.1998；67：395-424)。高度多聚体化的vWF还循环包含在血小板的α-颗粒内，在此它在血小板活化后释放(Annu.Rev.Biochem.1998；67：395-424)。在升高的剪切力情况下，例如那些在动脉中粥样斑块或者机械介入部位遇到的情况，vWF可能通过其A3结构域结合表面暴露的胶原纤维(Biochemistry 1986；25(26)：8357-8361，Blood 1987；70(5)：1577-1583，J.Biol.Chem.1987；262(28)：13835-13841)。然后胶原结合的vWF又通过vWF-A1结构域中表位的剪切依赖性暴露“栓系”血小板，与血小板GPIb/IX/V相互作用(Blood 1985；65(1)：85-90，Blood 1985；65(4)：823-831，Br.J.Haematol 1986；63(4)：681-691)。因此vWF作为胶原和血小板的桥梁，并且是流动条件下血小板粘附到胶原的先决条件(J.Lab.Clin.Med.1974；83(2)：296-300)。血小板滚过vWF导致微弱的粘附，但是，此外，为了促进持久的血小板粘附、活化和聚集，需要胶原和血小板表面上其他受体的直接相互作用(Thromb.Haemost 1997；78(1)：434-438，Thromb.Haemost 1997；78(1)：439-444)。血小板上的直接胶原受体包括GP VI(Blood 1987；69(6)：1712-1720，Thromb.Haemost1999；81(5)：782-792，J.Clin.Invest.1989；84(5)：1440-1445)，GP Ia/IIa(α2/β1)(J.Clin.Invest.1989；84(5)：1440-1445，Nature 1985；318(6045)：470-472)，和程度更低的GP IV(CD36)(J.Biol.Chem.1989；264(13)：7576-7583)，甚至可能有p65(J.Clin.Invest.1997；100(3)：514-521)。在没有vWF辅助的血小板结合时，已证明这些受体在流动条件下无力介导血小板募集到胶原(Br.J.Haematol 1986；63(4)：681-691)。最后，vWF与纤维蛋白原联用，通过结合血小板GPIIb/IIIa促进血小板的交联和进一步活化(J.Clin.Invest.2000；105(6)：783-791)，为发展血栓提供稳定性和力量。
随着血小板GP IIb/IIIa和ADP受体拮抗剂的出现，大步推进了近年来建立的抗聚集疗法(Coronary Art Dis 1999；10(8)：553-560，J.Am.Coll.Surg.2000；191(1)：76-92)。但是，这些策略不是设计用于抑制血小板与暴露的胶原纤维的初始粘附，并且不论GP IIb/IIIa拮抗剂在减弱血小板-血小板相互作用中的效果，血小板仍然粘附到受损的血管壁(Blood 1993；81(5)：1263-1276，Circulation 1995；91(5)：1354-1362)。此外，血小板活化几乎肯定造成了聚集和急性血栓，亚急性和慢性内膜增生的进展至少部分受促有丝分裂调节物例如血小板衍生生长因子(PDGF)的影响，PDGF由血小板的活化释放。实际上，已经证明抑制PDGF在不同动物种类中减少内膜增生(Science 1991；253(5024)：1129-1132，Circulation 1999；99(25)：3292-3299)。
已经报道若干种水蛭来源的物质抑制胶原-血小板相互作用(Blood1995；85(3)：705-711，Platelets 2000；11(2)：83-86，J.Biol.Chem.1992；267(10)：6893-6898，J.Biol.Chem.1992；267(10)：6899-6904，BloodCoagul Fibrinolysis 1991，2(1)：179-184)。失稳酶(Destabilase)，一种从欧洲医蛭分离的具有纤维蛋白解聚活性的异肽酶，已被报道抑制不同激动剂包括胶原诱导的血小板凝集，但被认为是直接结合血小板膜(Platelets 2000；11(2)：83-86)。水蛭抗血小板蛋白(LAPP)，一种来自药用南美水蛭(Haementeria officinalis)唾液的～13kda蛋白，在静态(J.Biol.Chem.1992；267(10)：6899-6904，Thromb.Haemost 1999，82(3)：1160-1163)和流动提高(Arterioscler Thromb.Vase.Biol.1995，15(9)：1424-1431)的条件下抑制血小板粘附到胶原，对vWF-和血小板GP Ia/IIa-介导的与胶原的结合均有影响(Thromb.Haemost 1999，82(3)：1160-1163)。Calin是一种来自欧洲医蛭的约65kDa蛋白，其出现了相似的模式。Calin也在静态和流动条件下都抑制胶原-血小板的相互作用(Blood 1995；85(3)：705-711，Blood Coagul Fibrinolysis 1991，2(1)：179-184，Thromb.Haemost 1999，82(3)：1160-1163)。此外，LAPP和Calin都是胶原诱导的血小板凝集的抑制剂，在类似于阻断vWF结合胶原的浓度抑制聚集(J.Biol.Chem.1992；267(10)：6893-6898，BloodCoagul Fibrinolysis 1991，2(1)：179-184，Blood 1995，85(3)：712-719)。
炎症
本发明还涉及沙拉丁素对炎症的效果。本发明还涉及抑制细胞迁移，以及沙拉丁素作为炎症抑制剂的医疗用途，其中所述多肽作为局部药剂或者作为生物学植入物和医疗装置的涂层局部使用，所述生物学植入物例如器官，细胞或者组织。
炎症是免疫系统对感染或者刺激的最先应答，可以被称为先天性级联。炎症具有两种组分：(i)细胞的和(ii)渗出性的。
渗出性组分参与液体的运动，通常包含许多重要的蛋白例如纤维蛋白和免疫球蛋白。血管在感染的上游扩张，在下游收缩，同时毛细血管对感染组织的渗透性增加，导致血浆进入组织的净损失—引起水肿或者肿胀。
细胞组分参与血白细胞从血管进入发炎组织的运动。血白细胞或者白细胞在炎症中起作用；它们从毛细血管渗出进入组织，并作为吞噬细胞吞噬细菌和细胞碎屑。例如，不限于任何理论，淋巴细胞和单核细胞募集到发炎的组织，以及还有巨噬细胞释放趋化因子进一步募集多形核白细胞。血白细胞还可以通过阻断感染和预防其传播来起辅助作用。
当细胞通过L-选择蛋白结合在内皮表面开始栓系时，发生细胞迁移。然后借助于细胞表面呈递的粘附分子例如LFA-1与内皮细胞上呈递的其配体分子(例如VCAM和ICAM)的相互作用，发生牢固的粘附。该过程被趋化因子增强，所述趋化因子调节该相互作用的亲合力。在该变移发生后，一个步骤需要细胞的内陷和它们与细胞外基质蛋白(ECM)的结合。最终细胞开始沿着趋化因子的浓度梯度进行迁移。因此细胞与ECM的结合在它们向炎性部位的迁移中起作用。在此处描述的研究中，检验单核细胞和T淋巴细胞沿趋化因子浓度梯度迁移的能力。但是，在迁移前，细胞必须首先结合ECM。
优选的，将沙拉丁素设计为在手术期间应用于血管内表面，在此它包被暴露的胶原并抑制血小板与动脉壁胶原的vWF-依赖性结合和a2β1整合蛋白结合。在预防血小板与损伤的血管粘附中，沙拉丁素阻断参与血小板凝集和活化的事件序列的第一步，从而可以预防在血管手术和血管内程序范围中发生的后续血栓形成和内膜增生。沙拉丁素对于胶原的特异性是此处所述研究中的一个调查主题。此外，检验了炎症期间沙拉丁素对体内细胞积聚以及促炎性和炎性细胞因子分泌的影响。
为这个目的，用于趋化性的滤纸用1mg/mL的ECMs，即IV型胶原、牛血清白蛋白(BSA)和纤维连接蛋白包被。结果表明，通过体外Boyden小室法检测(参见图1到4)，沙拉丁素抑制人单核细胞向MCP-1或者T淋巴细胞向MIP-1α的趋化性。体外趋化性是检测体内细胞迁移的先决条件。当滤纸用0.01或者1mg/mL ECMs包被时，证明了沙拉丁素对单核细胞和T淋巴细胞向MCP-1和MIP-1α体外趋化性的这种抑制(参见图1到4)。尽管当细胞迁移通过IV型胶原-包被的滤纸时，抑制最为显著，但当滤纸用BSA或者另一种细胞外基质蛋白例如纤维连接蛋白包被时，也可以观察到抑制。表1概述了图1到4中进行的实验的IC50结果。当置于1mg/mL底物上时，抑制任一种细胞类型的效能等级是胶原＞纤维连接蛋白＞BSA。细胞倾向于差异利用ECM蛋白进行移动和迁移，因此不限于任何理论，观察到的沙拉丁素抑制浓度(IC50)的差异可能表明沙拉丁素在基质上的相互作用，这样的话沙拉丁素预防炎性细胞与基质的相互作用，并且沙拉丁素与炎性细胞本身没有相互作用。这些结果表明沙拉丁素不仅在使用胶原时而且在使用其他ECM蛋白时发挥其抑制效果。不限于任何理论，看起来似乎沙拉丁素可以混杂地结合若干种蛋白。由于沙拉丁素阻断暴露胶原的血小板的a2β1整合蛋白结合位点，可以推断其他基质蛋白上的其他整合蛋白识别部位都可能受到类似影响。
表1：图1到4的IC50结果的概述
细胞类型 化学引诱剂 包被蛋白   包被浓度(mg)   沙拉丁素IC50(nM)
  单核细胞   MCP-1   胶原IV   0.01   0.172
  胶原IV   1.0   0.0623
  纤维连接蛋白   1.0   19.4
  BSA   1.0   1.1
  T淋巴细胞   MIP-1α   胶原IV   0.01   6.863
  胶原IV   1.0   0.0079
  纤维连接蛋白   1.0   3.69
  BSA   1.0   184.9
除了沙拉丁素体外抑制单核细胞和T淋巴细胞趋化性的能力以外，还检测该化合物是否可以在体内影响细胞的迁移。因此，通过在注射炎性细胞因子MCP-1的小鼠中产生气囊来模拟炎性应答。已知该细胞因子募集单核细胞，因为这些细胞表达MCP-1的受体CCR2(ExpertOpin.Ther.Targets 7：35(2003))。结果显示在这种气囊模型中，MCP-1诱导细胞迁移进入小鼠的气囊，而沙拉丁素抑制细胞向MCP-1的体内迁移(图5)。尽管没有研究募集进入气囊的细胞类型，我们推测大部分细胞是单核细胞系的，因为在计数浸润细胞的数目前，单核细胞特异性趋化因子MCP-1只使用了2小时。单核细胞的募集通常伴随不同的促炎性和炎性细胞因子和趋化因子的释放。此处描述的研究结果显示，与基准值相比，MCP-1给药到气囊中增加了IL-8、TNF-α和IL-1β的积聚，但是，这些增加没有达到统计显著性(图6)。尽管沙拉丁素的给药减少了MCP-1诱导的相同细胞因子的积聚，但这些减少没有达到统计显著性，很可能是因为该研究中使用的动物数量。
观察到MCP-1对气囊中FGF的分泌没有影响。类似地，也可以证明沙拉丁素对从未用于实验的小鼠或注射MCP-1的小鼠中发现的FGF水平没有影响。这可能是模型定时的结果，其中抽吸囊泡前只有2.5小时。沙拉丁素能够降低MCP-1刺激动物中发现的TGF-β水平。该细胞因子是多效性的，先前已经显示在其他细胞类型中，诱导下述细胞的募集：肥大细胞(J.Immunol.1994，152：5860)，小鼠Langerhans细胞(J.Immunol.174：2778(2005))，白细胞(Gastroenterology.122：1122(2002))，破骨细胞(J.Bone Miner.Res.2001，16：1237)，人单核细胞核树突状细胞(J.Immunol.2000，164：2285)，骨髓间充质细胞(Exp.Cell Res.1999，250：485)，中性粒细胞(J.Investig.Allergol.Clin.Immunol.1998，8：346)和NK细胞(Int.Immunol.1993，5：825)。因为对照组不同(刺激的，无沙拉丁素)，我们不能确定TGF-β的降低是否是由于MCP-1、沙拉丁素或者两者。目前还不清楚，沙拉丁素抑制细胞原位迁移的能力是否是由于TGF-β的水平降低。如所述，沙拉丁素还降低其他细胞因子和趋化因子的水平，所述细胞因子和趋化因子在不同细胞类型的募集中起作用。这些包括IL-8，TNF-α和IL-1β。
在一个实施方式中，沙拉丁素制剂防止细胞迁移到组织，包括炎症部位例如受损组织。在另一个实施方式中，沙拉丁素制剂防止T淋巴细胞迁移到组织，包括炎症部位例如受损组织。在另一个实施方式中，沙拉丁素制剂防止单核细胞迁移到组织，包括炎症部位例如受损组织。在另一个实施方式中，沙拉丁素制剂防止参与炎症的细胞因子的产生。不限于任何理论，此处描述的结果表明，沙拉丁素可能具有减少细胞迁移到炎症部位的能力，从而影响针对组织损伤的免疫应答。例如，沙拉丁素在炎症部位减少细胞因子产生的能力表明沙拉丁素可能通过降低该部位的免疫应答来减轻炎症。
腱损伤
本发明的一个方面是沙拉丁素治疗腱损伤的用途。优选的，在治疗受损腱的手术期间或者之后使用沙拉丁素。腱将肌肉与它们的骨性起端和附着物连接。可以利用局部麻醉(手术紧邻区域是无痛的)、区域麻醉(邻近手术区域的局部范围和周围区域是无痛的)、或者全身麻醉(患者无意识和无痛)，进行腱修复。在受损腱上产生一个切口。腱的受损或者撕裂末端被缝合在一起。如果腱已经严重受损，可能需要腱移植物(经常使用来自脚或者脚趾或者身体另一部分的一块腱)。必要时，腱被再附着到周围的结缔组织。检查该区域神经和血管的损伤，闭合切口。腱修复的目标是恢复腱撕裂后关节或者周围组织正常功能。腱修复手术的风险包括疤痕组织的形成，这阻止了顺畅的运动，例如，充分的腱滑动。在一个实施方式中，沙拉丁素将用于阻止滑动的减少，滑动减少可能造成使用时功能降低或者疼痛增加。
用于撕裂或者切断的腱和韧带(“连接索”或者“索”)的修复技术根据损伤性质和受影响的具体索差异很大。经常受损的索的实例包括手的屈肌腱和膝的前十字韧带(ACL)。
已经切断的长屈肌腱的修复通常通过面对面缝合切断腱的末端来实现。在一个实施方式中，施用沙拉丁素来预防手术后固定期间沿着腱的长度方向形成疤痕和/或粘连。在受损的屈肌腱不经过手术治疗的情况下，沙拉丁素用于在愈合过程中预防结疤。在一个实施方式中，沙拉丁素用于完整长度的暴露腱。在另一个实施方式中，在缝合所处的界面使用沙拉丁素。
就前十字韧带(连接股骨的底部和胫骨的顶部)来说，用力产生的应力更大得多，与周围组织和骨之间相互作用更低，索的偏移更少，愈合趋势也大不相同。当使用骨-腱-骨移植物时，沙拉丁素用于促进ACL的重建。沙拉丁素可用于如上所述的任意程序。
关节镜手术和其他手术
关节镜检查是一种手术程序，其中与远程光源和视频监视器相连的相机通过上皮和关节囊中的一个小切入口插入解剖关节(例如，膝，肩膀，等等)。通过相似的切入口，手术器械可以被放入关节，它们的使用通过关节镜显像来引导。这类的程序包括，例如，膝的部分半月板切除术和韧带重建，肩膀的肩峰成形术和肩袖清创术和肘滑膜切除术。作为扩展手术适应症和小口径关节镜发展的结果，腕和踝关节镜检查也已经成为常规。
在一个实施方式中，在关节镜手术期间的围手术期使用沙拉丁素制剂。所述应用包括不间断应用、以频度间隔反复应用(例如，过程内以频度间隔的重复血管内推注)，并且除短暂停止外不间断应用，以便导入产物或者药剂或者程序装置，这样的话在受伤或者手术部位局部保持基本上恒定的预定浓度。在另一个实施方式中，在所有手术受损组织的程序结束时，闭合之前，沙拉丁素被用作浸浴涂层。在一些实施方式中，沙拉丁素通过手术期间反复灌洗或者在闭合结束时一次灌洗给药。
除关节镜检查外，沙拉丁素制剂还可以局部用于任意的人体腔或者通道、手术创伤、外伤(例如，烧伤)或者任何手术/介入程序中。这些程序包括，但不限于，泌尿学程序，妇产科学程序，心血管和常规血管诊断和治疗程序，内窥镜程序以及口腔、牙齿和牙周程序。在一个优选的实施方式中，沙拉丁素与准备植入的移植物和装置一起使用。例如，在植入前，沙拉丁素用于包被组织移植物或者不含血的装置。沙拉丁素还可用于植入后的移植物或者装置和/或还用在手术损伤部位。
疤痕/瘢痕疙瘩形成
在本发明的另一个方面，沙拉丁素用于预防和/或治疗疤痕和瘢痕疙瘩的形成。在一个实施方式中，施用沙拉丁素来抑制手术步骤产生的疤痕组织，所述手术步骤例如膝、臀部或者肩膀关节切开术或者矫形装置的植入，尤其是通过手术植入例如膝、臀部或者肩膀替换或者其他植入物。在本发明的另一个实施方式中，直接将沙拉丁素注入已经进行皱纹美容整形的患者的皱纹或者外用以预防疤痕组织形成。在另一个实施方式中，施用沙拉丁素来抑制烧伤产生的疤痕组织。在另一个实施方式中，在整形手术、重建手术后使用沙拉丁素预防和/或治疗伤疤和瘢痕疙瘩的形成。例如，在择期手术例如头和颈提升术、为了更好美容效果的乳房增大术或者缩乳术之后，可以使用沙拉丁素。
此处使用的术语“疤痕组织”和“疤痕组织形成”包括纤维化产生的任意病理病症，包括瘢痕瘤病、纤维囊性病和关节僵直。该术语还包括术后粘连或者皱缩，创伤、烧伤后形成的瘢痕疙瘩、增生性或者肥厚肿块，源自炎性应答的凹陷疤痕包括痤疮、皱纹、湿疹、蜂窝织炎形成、增生性纤维变性，和参与体内局部区域成纤维细胞增殖和代谢的其他纤维化病症。此处这类局部区域还可以指一个部位、位置或者生物学组织。因此，本发明的方法还预期了涉及这些病理的病症的治疗，所述方法涉及沙拉丁素在预防和减少疤痕组织形成中的用途。
在另一个实施方式中，利用沙拉丁素治疗术后粘连，例如在腹部或者盆腔手术后。腹膜腔内的损伤或者炎症产生纤维性渗出液。因而，浆膜表面粘着在一起。纤维性渗出液可以被成纤维细胞吸收或者侵入，形成永久的纤维性粘连。
此外，沙拉丁素适于在产科-妇科程序后治疗和/或预防炎症和/或粘连。并且，沙拉丁素适于治疗和/或预防胃或者肠手术造成的一般手术炎性粘连，和整形手术中炎性介导的瘢痕形成。在瘢痕疙瘩患者和皮肤具有较高水平色素的患者中，沙拉丁素可用于疤痕修补。这为整形手术拓展了一组全新的患者，所述患者先前由于顾忌疤痕是禁忌的。利用沙拉丁素预防炎症还可以预防血管发生以及预防受影响区域残留的“潜伏”癌组织的可能刺激。
在心-血管程序中，沙拉丁素作为涂层用于装置例如心瓣膜，例如，猪心瓣膜。此外，沙拉丁素可以用在合成或者机械心瓣膜上，通过包被支架或者药剂-洗脱支架直接应用。沙拉丁素还可以用于留置导管和端口以预防血栓形成。
在本发明的另一个方面，除了治疗和/或预防血小板介导的炎症外，沙拉丁素还可以用于治疗和/或预防白细胞介导的炎症。不限于一种作用机理，通过结合暴露的胶原、纤维连接蛋白原纤维或者细胞基质的其他组分，沙拉丁素可以掩蔽白细胞的(例如中性粒细胞，淋巴细胞和单核细胞)识别部位。通过阻断白细胞迁移到发炎的组织，沙拉丁素能够预防趋化因子来源之一，所述趋化因子进一步募集炎性细胞。此外，通过在受损部位减少细胞因子产生，沙拉丁素能够直接阻断白细胞迁移到受损部位和/或预防其募集。此外，不受限于作用机制，沙拉丁素还抑制成纤维细胞迁移，因此减慢纤维连接蛋白网络的形成和减少或者预防瘢痕形成。
炎性病症
在一个方面，沙拉丁素用于治疗炎性病症。不限于任何作用机理，沙拉丁素减轻急性炎症的严重程度，同时允许新组织的敷设，从而允许愈合进展。炎症可能在各种严重病症的发展中起作用。炎症是一种过程，我们的身体利用其保护自身抵抗有害物质例如细菌和病毒。它是身体抵抗感染和损伤的第一道防御，它经常伴随着发热、发红、肿胀和疼痛。炎症可以在身体的不同部位发生：关节，器官，或者动脉。
有时我们的免疫系统错误地引发炎性应答，即使没有迫切的感染风险时。
通过大量研究已经证明了趋化因子和细胞因子在炎症反应中的作用。趋化因子的局部给药，例如，IL-8，通过皮下注射导致急性炎症反应，所述炎症反应受中性粒细胞浸润控制。更延迟的单核细胞浸润响应B趋化因子而发生，例如MCP-1，RANTES和MIP-1α。另一方面，利用中和抗体的治疗对趋化因子的抑制已经显示减弱炎性应答。中和针对IL-8的抗体抑制再灌注损伤、内毒素诱导的关节炎、内毒素引发的皮下炎症和急性肾小球肾炎引起的急性炎症反应(J.Leuk.Biol.1994；56：559-564)。抗-IL-8还显示减轻延迟型过敏性反应(J.Immunol.1995；155：2141-2157)。MIP-1a抗体减轻小鼠中实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)的严重性。此外，小鼠中MIP-1α基因的缺失减轻post-Coxsackie-诱导的心肌炎的严重性，但也降低了这类小鼠对流感感染的抵抗力(J.Leuk.Biol.1996；59：61-67)，提示MIP-1a可能促进抗病毒宿主防御。
如表2所示，在多种炎性病症中，分别利用免疫组织化学或者酶联免疫测定技术，在局部组织或者体液中已经检测到趋化因子。CNS中MIP-1α和MCP-1的产生与大鼠(J Immunol 1993；150：2525-2533)和小鼠EAE模型(J Neuroimmunol 1995；60：143-150；J Immunol.1995；155：5003-5010；FASEB J 1993；7：592-600)中急性临床疾病症状的发展有关。此外，已经显示与患有其他神经学疾病的对照患者相比，MS患者脑脊液中MIP-1a表达升高，升高的水平与增加的CSF白细胞计数相关联(J.Neurol.Sci.1995；129：223-227)。此外，近来研究显示，急性病期间MIP-1α调节EAE的免疫发病机理，并且MCP-1调节疾病的复发期。这种差异调节看起来源自MIP-1α，所述MIP-1α主要由浸润巨噬细胞和T淋巴细胞产生，而MCP-1主要由CNS固有星形细胞产生(ILARJournal 1999；40(4))。
在炎性病症细胞因子作用的另一个实例中，最近的结果表明在响应过敏原暴露中，RANTES、MIP-1α和MCP-1可能在哮喘中调节细胞通行(Am.J.Respir.Crit.Care Med.，1997；156(5)，1377-1383)。
表2：疾病状态下检测到的趋化因子
 疾病状态   部位   趋化因子
 囊性纤维化   灌洗液   IL-8，ENA-78，MCP-1
 急性肺病   组织   IL-8，ENA-78，MCP-1，Rantes
 哮喘反应   灌洗液   MCP-1，MIP-1α，Rantes
 内毒素血症和脓毒病   血浆   IL-8，MIP-1α，MCP-1，Rantes
 类风湿性关节炎   滑液   IL-8，ENA-78，MCP-1，MIP1α
 骨关节炎   滑液   MIP-1β
 银屑病(psotiatic scale)   组织提取物   IL-8，GROα，β，γ，MCP-1，IP-10，ENA-78
 胃肠炎症   组织   IL-8，MCP-1，MIP1α/β，Rantes，IP-10
 动脉硬化   组织   MCP-1，MIP1α/β，Rantes，IL-8，GROβ
 免疫复合物血管球性肾炎   组织   IL-8，MCP-1
 眼色素层巩膜炎   组织   IL-8，IP-10，MCP-1，Rantes，MIP-1α/β
 结核样麻风   组织   IP-10
 大手术后   血浆   IL-8
 伤口愈合部位   组织   MCP-1和IP-10
 巨细胞病毒脑脊髓炎   脑脊液   MCP-1
 特应性和接触性皮炎   组织   Rantes，Eotaxin，IL-8，MCP-1，IP-10
在一些实施方式中，沙拉丁素用于炎性病症的治疗。例如，沙拉丁素可用于治疗脑脊髓炎。脑脊髓炎是脑和脊髓炎症的泛称，描述了许多病症：(i)急性播散性脑脊髓炎或者感染后脑脊髓炎，一种脑和脊髓的髓鞘脱失病，可能通过疫苗接种或者病毒感染引发；(ii)播散性脑脊髓炎，多发性硬化的同义词，一种中枢神经系统(大脑和脊髓)的病症，特征为神经功能由于髓磷脂流失和继发性轴索损伤而降低；(iii)马脑脊髓炎，一种感染马和人的潜在致命性蚊传播病毒病；(iv)肌痛性脑脊髓炎，一种涉及中枢神经系统炎症的综合征，具有肌肉疼痛和疲劳的症状；该术语有时可以与慢性疲劳综合征互换使用；和(v)实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)，一种脑炎症的动物模型。在一些实施方式中，沙拉丁素通过鞘内或者硬膜外注射局部给药。
此外，在其他实施方式中，沙拉丁素用于阻塞性肺病的治疗。这是一种疾病状态，表征为非完全可逆的气流限制。该气流限制通常是渐进的，并且与肺对有害颗粒或者气体的异常炎性应答相关。慢性阻塞性肺病(COPD)是对一组呼吸道疾病的总括术语，特征为气流阻塞或者限制。该总括术语包括的病症是：慢性支气管炎，肺气肿，和支气管扩张症。
在另一个实施方式中，沙拉丁素用于哮喘的治疗。哮喘是呼吸系统疾病，其中气道收缩，发炎，并附着过量粘液，通常是对一种或者多种触发的响应，例如接触环境刺激剂(或者过敏原)、冷空气、锻炼或者情绪应激。
同时，沙拉丁素可以用于内毒素血症和脓毒病的治疗。脓毒病是一种医学病症，由对感染的免疫应答产生。败血症是菌血症造成的血流脓毒病，所述菌血症是血流中存在细菌。术语败血病还用于通指脓毒病。引发脓毒病的免疫应答是一种全身炎性应答，引起炎症和凝结途径的广泛活化。内毒素血症由血液中内毒素的存在引起，如果源自革兰氏阴性杆状菌，其可能引起出血、肾坏死和休克。
在一个实施方式中，沙拉丁素用于类风湿性关节炎(RA)的治疗。RA是一种自身免疫病症，造成机体的免疫系统攻击骨关节。在另一个实施方式中，沙拉丁素用于治疗牛皮癣，一种皮肤病，其中快速增殖的皮肤细胞在皮肤上产生发痒的、鳞状发炎斑块。在另一个实施方式中，沙拉丁素用于接触性或者特应性皮炎的治疗。接触性皮炎是一种皮肤炎症，当皮肤接触某些物质时发生，皮肤对所述物质敏感或者过敏。过敏性接触性皮炎可能在初始或者长时间暴露于一种刺激物后出现。接触性皮炎包括刺激性皮炎，光毒性皮炎，过敏性皮炎，光敏性皮炎，接触荨麻疹，全身接触型皮炎等等。当皮肤对某种物质敏感时，并且当过多物质用于皮肤，刺激性皮炎可能发生。特应性皮炎，有时称为湿疹，是一种皮炎，特应性皮肤病。
此外，沙拉丁素可以用于治疗痤疮。
此外，沙拉丁素可以用于动脉硬化的治疗，包括动脉粥样硬化。动脉硬化是描述中等或者大动脉的任何硬化的总称。动脉粥样硬化是一种具体归因于粥样斑块的动脉硬化。
此外，沙拉丁素可以用于肾小球肾炎的治疗。肾小球肾炎是一种初发或者继发自身免疫肾病，特征为肾小球炎症。它可能是无症状的，或者表现为血尿症和/或蛋白尿。存在许多已识别的类型，分为急性、亚急性或者慢性肾小球肾炎。病因是感染性的(细菌，病毒或者寄生病原体)、自身免疫或者副肿瘤性的。
此外，沙拉丁素可以用于治疗粘液囊炎，狼疮，急性播散性脑脊髓炎(ADEM)，阿狄森氏病，抗磷脂抗体综合征(APS)，再生障碍性贫血，自身免疫肝炎，乳糜泄，克罗恩氏病，糖尿病(1型)，古德帕斯彻氏综合征，葛瑞夫兹氏病，Guillain-Barre综合征(GBS)，桥本病，炎性肠病，红斑狼疮，重症肌无力，眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)，视神经炎，ord′s甲状腺炎，骨性关节炎，眼色素层巩膜炎，天疱疮，多发性关节炎，原发性胆汁性肝硬变，莱特尔氏综合征，多发性大动脉炎，颞动脉炎，温自身免疫性溶血性贫血，韦格纳肉芽肿病，普秃，查加斯氏病，慢性疲劳综合征，家族性自主神经异常，子宫内膜异位，化脓性汗腺炎，间质性膀胱炎，神经性肌强直，结节病，硬皮病，溃疡性结肠炎，白癜风，外阴痛，阑尾炎，动脉炎，关节炎，睑缘炎，细支气管炎，支气管炎，子宫颈炎，胆管炎，胆囊炎，绒毛膜羊膜炎，结肠炎，结膜炎，膀胱炎，泪腺炎，皮肌炎，心内膜炎，子宫内膜炎，肠炎，小肠结肠炎，上髁炎，附睾炎，筋膜炎，纤维织炎，胃炎，肠胃炎，齿龈炎，肝炎，汗腺炎，回肠炎，虹膜炎，喉炎，乳腺炎，脑膜炎，脊髓炎，心肌炎，肌炎，肾炎，脐炎，卵巢炎，睾丸炎，骨炎，耳炎，胰腺炎，腮腺炎，心包炎，腹膜炎，咽炎，胸膜炎，静脉炎，肺炎，直肠炎，前列腺炎，肾盂肾炎，鼻炎，输卵管炎，窦炎，口腔炎，滑膜炎，腱炎，扁桃腺炎，葡萄膜炎，阴道炎，血管炎，或者外阴炎。
组合疗法
沙拉丁素也可以在公开的方法中与其他合适的药剂联用。例如，沙拉丁素可以与此处描述的药剂一起使用。若干种预防血小板粘附的抑制剂是针对vWF的单克隆抗体。已经清楚地表明，糖蛋白IIb/IIIa抑制剂可能有利于抑制血小板粘附。这些抑制剂有的像单克隆Ab c7E3已经进行临床试验，而其他抑制剂像KGD-和RGDF-抑制剂仍在研究中。
一种用于筛选新化合物的来源是从自然界的吸血动物获得，所述新化合物干扰胶原诱导的血小板粘附。如文献所述，已经从自然界分离出若干种抑制剂：从欧洲医蛭分离的称为Calin的65kDa蛋白(美国专利5,587,360 WO 92/07005)(Munro，R.等人，Blood Coagulation andFibrinolysis，1991，2，179-184)和从水蛭Haementera officinalis唾液腺分离的16kDa(LAPP)蛋白(美国专利5,324,715)。当在胶原依赖性血小板凝集的静态分析中检测时，两种蛋白均被描述为聚集抑制剂。
软蜱，Omithodoros moubata，也包含一种抗血小板的蛋白(Moubatin)，其具有预防胶原刺激的血小板凝集的活性(Waxman，L.等人；J.Biol.Cherα，1993，268，5445-49)。Noeske-Jungblut C.等人在WO9309137中公开了另一种来自吸血昆虫的血小板凝集抑制剂。从蛇毒中分离出一种50kDa蛋白，从吸血虫Triatoma pallidipennis的唾液中分离出一种19kDa蛋白。发现所述蛋白包含特异抑制胶原诱导的血小板凝集的因子。名为pallidipin的19kda蛋白在血浆中抑制胶原介导的血小板聚集。Gan等人将锯鳞蝰素(Echistatin)描述为结合纤维蛋白原受体GP IIa/IIIb的抑制剂(J.Biol.Chem，1988，263，19827-32)。
用于冠状动脉应用的实例是抗血栓剂，例如，前列环素和水杨酸盐，溶栓剂，例如，链激酶，尿激酶，组织纤溶酶原活化因子(TPA)和茴香酰化纤溶酶原-链激酶活化剂复合物(APSAC)，抗血小板剂，例如，乙酰水杨酸(ASA)和氯吡格雷，血管舒张剂，例如，硝酸盐，钙离子通道阻断药，抗增殖剂，例如，秋水仙碱和烷化剂，插入剂，生长调节因子例如白介素，转化生长因子-β和血小板来源生长因子的同类物，针对生长因子的单克隆抗体，甾族的和非甾族的抗炎剂，和能够调节介入后血管弹性、功能、动脉硬化、和对血管或者器官损伤的愈合响应的其他药剂。抗生素也可以包括在本发明包含的组合或者涂层中。此外，涂层可用于影响血管壁内治疗剂的局部递送。通过在可膨胀的多聚体中掺入活性剂，活性剂将在多聚体膨胀时释放。
沙拉丁素可以与其他药剂一起配制或者联合给药，所述药剂能够缓解炎性病症例如脑脊髓炎、哮喘和此处描述的其他疾病的症状。这些药剂包括非甾族的抗炎药物(NSAIDs)，例如乙酰水杨酸；布洛芬；奈普生；吲哚美辛；萘丁美酮；托美汀；等等。皮质激素用于减轻炎症并抑制免疫系统的活性。这类最常开处方的药物是泼尼松。氯奎(Aralen)或者羟氯奎(Plaquenil)在患有狼疮的一些个体中也非常有用。它们最常针对狼疮的皮肤和关节症状开药。硫唑嘌呤(Imuran)和环磷酰胺(Cytoxan)抑制炎症并倾向于抑制免疫系统。其他药剂，例如氨甲蝶呤和环孢菌素用于控制狼疮症状。抗凝剂用于防止血液快速凝结。它们的范围从以极低剂量预防血小板粘附的阿司匹林到肝素/可密定。
沙拉丁素可以与液体或者固体组织屏障亦称为润滑剂一起配制或者联合给药。组织屏障的实例包括，但不限于，多糖，聚多糖，生物膜(seprafilm)，interceed和透明质酸。
可以与沙拉丁素联合给药的药物包括通过吸入有效递送的任何合适药物，例如，止痛剂，如可待因，二氢吗啡，麦角胺，芬太尼或者吗啡；心绞痛制剂，例如地尔硫卓；抗过敏剂，如色甘酸盐，酮替芬或者奈多罗米；抗感染剂，如头孢菌素，青霉素，链霉素，磺胺，四环素或者戊烷脒；抗组胺剂，例如美沙吡林；抗炎剂，例如倍氯米松，氟尼缩松，布地奈德，替泼尼旦，曲安奈德或者氟替卡松；止咳剂，例如那可汀；支气管扩张剂，例如麻黄素，肾上腺素，非诺特罗，福莫特罗，异丙肾上腺素，间羟异丙肾上腺素，苯肾上腺素，苯丙醇胺，吡布特罗，瑞普特罗，利米特罗，沙丁胺醇，沙美特罗，特布他林，新异丙肾上腺素，妥洛特罗，奥西那林或者(-)-4-氨基-3，5-二氯-α-[[[6-[2-(2-吡啶基)乙氧基]己基]-氨基]甲基]苯甲醇；利尿药，例如阿米洛利；抗胆碱剂例如异丙托铵，阿托品或者氧托溴铵；激素，例如可的松，氢化可的松或者泼尼松；黄嘌呤例如氨茶碱，胆茶碱，赖氨酸茶碱或者茶碱；以及治疗蛋白和肽，例如胰岛素或者胰高血糖素。以下对于本领域技术人员来说是显而易见的，在合适情况下，药物可以采用盐的形式(例如作为碱金属或者胺盐或者作为酸加成盐)或者作为酯(例如低级烷基酯)或者作为溶剂化物(例如水合物)，以优化药物的活性和/或稳定性。
根据接受治疗的病症，沙拉丁素可以与此处公开的药剂或者其他合适的药剂联用。当用于联合治疗时，沙拉丁素可能与第二药剂同时或者分开给药。这种联合给药可以包括两种药剂以相同剂型同时给药、不同剂型同时给药和分开给药。也就是说，沙拉丁素和任意上述药剂可以在相同剂型中一起配制并同时给药。或者，沙拉丁素和任意上述药剂可以同时给药，其中两种药剂存在于分开的制剂中。在另一种替代方式中，沙拉丁素可以在任意上述药剂之后即刻给药，或者反之亦然。在分开给药方式中，沙拉丁素和任意上述药剂可以间隔几分钟，或者间隔几小时，或者间隔几天给药。
制剂和包衣
此处描述的沙拉丁素化合物通常以治疗组合物的形式给药。本发明的沙拉丁素化合物可以掺入适合给人类施用的治疗组合物中。因此本发明提供治疗组合物，其包含作为活性成分的一种或者多种沙拉丁素化合物或者此处描述的修饰形式、或者治疗上可接受的盐和/或其配位络合物，以及一种或者多种治疗上可接受的赋形剂、载体(包括惰性固体稀释剂和填料)、稀释剂(包括无菌水溶液和不同的有机溶剂)、渗透增强剂、增溶剂和佐剂。这类组合物利用本领域公知的方法制备。
本发明的沙拉丁素多肽可以与任意无毒的有机或者无机酸形成治疗上可接受的盐。无机酸是，例如，盐酸，氢溴酸，硫酸或者磷酸和酸金属盐例如正磷酸一氢钠和硫酸氢钾。有机酸的实例是单、二和三羧酸，例如乙酸，乙醇酸，乳酸，丙酮酸，丙二酸，琥珀酸，戊二酸，富马酸，苹果酸，酒石酸，柠檬酸，抗坏血酸，马来酸，羟基马来酸，苯甲酸，羟基苯甲酸，苯乙酸，肉桂酸，水杨酸和磺酸例如甲烷磺酸。羧基末端氨基酸部分的盐包括与任意合适的无机或者有机碱形成的无毒羧酸盐。这些盐包括，例如，碱金属例如钠和钾，碱土金属例如钙和镁，IIIA族的轻金属包括铝，和有机伯、仲和叔胺例如三烷基胺，包括三乙胺，普鲁卡因，二苄基胺，1-乙烯胺，N，N′-二苄乙烯-二胺，二氢松香胺和N-烷基吡啶。
本发明的沙拉丁素多肽可以被共价修饰。这些共价修饰有益于，例如在此处描述的治疗组合物内或者体内给药后稳定本发明的沙拉丁素多肽。一种类型的共价修饰包括将本发明的肽连接到各种非蛋白多聚体之一上，例如，聚乙二醇(PEG)，聚丙二醇，或者聚氧亚烷基，利用本领域已知的方法。
其他修饰包括谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基分别脱酰胺成相应的谷氨酰和天冬氨酰残基，脯氨酸和赖氨酸的羟化，丝氨酰或者苏氨酰残基羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman &Co.，San Francisco，pp.79-86(1983))，N端胺的乙酰化，和任意C端羧基的酰胺化。另一类型的修饰包括肽表面面积的人工亲水化，通过将酪氨酸残基转化为氨基酪氨酸或者通过在赖氨酸残基中添加羧基。其他修饰包括形成沙拉丁素肽-寡胺复合物。本发明肽的另一类型的共价修饰包括添加糖基化部位。进行本文所述修饰的方法是本领域公知的。
将本发明的治疗组合物配制为适合其预定的给药途径。给药途径的实例包括，但不限于，口服，含服，静脉内，肠胃外，吸入，直肠，皮内，皮下，经粘膜，经皮，肺，关节内，气管内，肌内，胸骨内，鼻或者局部给药。局部给药可能还涉及经皮给药的用途，例如透皮贴片或者离子电渗疗法装置。本发明还提供本发明沙拉丁素肽通过局部递送装置/导管或者通过支架和支架涂层和血管移植物和移植物包被技术的用途。
根据待给药的化合物、待治疗的患者和疾病状况，选择给药途径。化合物可以通过不同途径给药，这取决于疾病的严重性或者类型或者治疗介入，例如紧急情况可能需要静脉内给药，急性的但不危急生命的情况下可能口服治疗，而手术过程后的治疗可以通过支架或者基于导管的装置给药。
利用一种或者多种生理上可接受的载体，治疗组合物可以采用常规方式配制，所述载体包括赋形剂和辅剂，其促进活性化合物制备成可以治疗使用的制剂。合适的制剂取决于所选的给药途径和标准治疗规范。此处使用的术语“治疗上可接受的载体”是指一种惰性、无毒的固体或者液体填充剂、稀释剂或者包囊物质，与活性化合物或者患者没有不利的反应。合适的液体载体是本领域公知的，例如无菌水，盐水，水性右旋糖，糖溶液，乙醇，多元醇和油，包括石油、动物油、植物油、或者合成来源的油，例如，花生油，豆油和矿物油。
本发明的沙拉丁素肽可以与其他药剂复合，所述药剂作为它们治疗配制的一部分。治疗组合物可以采用以下形式，例如，利用治疗上可接受的赋形剂通过常规方法制备的片剂或者胶囊，所述赋形剂例如结合剂(例如，阿拉伯胶，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)，羟丙基甲基纤维素，蔗糖，淀粉，和乙基纤维素)；填充剂(例如，玉米淀粉，明胶，乳糖，阿拉伯胶，蔗糖，微晶纤维素，高岭土，甘露醇，磷酸二钙，碳酸钙，氯化钠，或者藻酸)；润滑剂(例如硬脂酸镁，硬脂酸，硅酮液，滑石，蜡，油，和胶态氧化硅)；和崩解剂(例如微结晶纤维素，玉米淀粉，淀粉羟基乙酸钠和藻酸。如果是水溶性的，这类配制的复合物然后可以在合适的缓冲液中配制，例如，磷酸盐缓冲盐水或者其他生理上可相容的溶液。或者，如果所获复合物在水溶剂中溶解性差，则它可以与非离子表面活性剂例如TWEENTM或者聚乙二醇一起配制。因此，该化合物和它们生理上可接受的溶剂化物可以配制用于给药。
用于肠胃外、皮内或者皮下给药的溶液或者悬浮液可以包括下列组分：无菌稀释剂例如注射用水，盐水溶液，固定油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或者其他合成溶剂；抗菌剂例如苯甲醇或者对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或者亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸；缓冲液例如乙酸盐、柠檬酸盐或者磷酸盐和用于张力调整的药剂例如氯化钠或者右旋糖。利用酸或者碱，例如盐酸或者氢氧化钠，可以调节pH。肠胃外制剂可以装入安瓿、一次性注射器或者由玻璃或者塑料制成的多剂量小瓶。
适于注射用途的治疗组合物包括无菌水溶液(水溶性情况下)或者分散剂和用于无菌注射溶液或者分散剂的临时制备的无菌粉剂。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL.TM.(BASF，Parsippany，NJ.)或者磷酸盐缓冲液(PBS)。组合物优选的是无菌的，并且应该流动到产生易于注射性的程度。该组合物在制备和储存条件下应该是稳定的，并且保持抗微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或者分散介质，包含，例如，水，乙醇，多元醇(例如，甘油，丙二醇，和液态聚乙二醇，等等)，和其合适的混合物。例如，通过使用包衣例如卵磷脂，在分散剂的情况下保持所需的粒度和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。微生物作用的预防可以利用各种抗细菌和抗真菌剂实现，例如，对羟苯甲酸，氯代丁醇，苯酚，抗坏血酸，硫柳汞，等等。很多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如，糖，多元醇例如甘露醇，山梨糖醇，或者氯化钠。通过在组合物中包括延缓吸收的药剂，例如，单硬脂酸铝和明胶，可以实现注射组合物的吸收延长。
根据需要，将治疗有效或者有益量的活性化合物(例如，沙拉丁素化合物)与上面所列成分中的一种或者组合掺入合适的溶剂，继之以过滤灭菌，可以制备无菌注射溶液。通常，通过将活性化合物掺入无菌介质来制备分散剂，所述介质包含基本的分散媒介和来自所需的上面列举的其他成分。就用于无菌注射溶液制备的无菌粉剂来说，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这产生一种活性成分外加任意其他所需成分的粉剂，所述其他所需成分来自其预先无菌过滤的溶液。
本发明还提供沙拉丁素和衍生物通过例如局部递送装置/导管或者通过支架和支架涂层和血管移植物和移植物涂层技术的用途。本发明还提供施用组合物中沙拉丁素的方法，所述组合物在局部区域随时间洗脱规定量的沙拉丁素。
特别的，本发明的一个实施方式涉及基于导管的装置局部递送沙拉丁素的用途。沙拉丁素还可以利用导管与或者不与其他治疗剂从多聚基质进入身体组织。在本方法中使用的聚合材料的基本要求是适于专门应用的生物相容性和药剂释放性质。
局部控制的沙拉丁素释放可以只通过渗透、只通过离子电渗、只通过电穿孔或者组合的离子电渗来实现，并且电穿孔可以用于在血管腔内有效释放和掺入沙拉丁素。优选导管能够进行设计好的程序，在选择的血管空间中保持高浓度的治疗剂，这样的话结果产生一种改进的只涂布沙拉丁素或者还有其它治疗剂的血管。
本发明特别适合在介入性心脏病学程序期间或者之后沙拉丁素的局部递送，所述介入心脏病学程序例如血管成形术和支架植入术和动脉内膜切除术。
在一个优选的方面，本发明是包被了沙拉丁素的植入物。所述植入物可以部分或者完全被沙拉丁素包被。通常，植入物是一种医疗装置。植入物还可以包括生物学植入物，例如器官，组织，或者细胞移植物。沙拉丁素还可以用于手术部位。本发明的一个实施方式是，通过用包括聚合物的组合物至少部分包被支架或者基于导管的装置，提供具有本发明沙拉丁素肽的支架或者基于导管的装置。本发明的聚合物是促进沙拉丁素肽连接到支架或者基于导管的装置和/或促进沙拉丁素的控制释放的任何多聚体。聚合物可能是，例如，可吸收或者不可吸收的成膜聚合物。聚合物可以是生物稳定的或者生物可吸收的，取决于需要的释放速率或者需要的多聚体稳定性程度。
可以使用的合适生物可吸收多聚体包括，但不限于，选自下列的多聚体：脂族聚酯，聚(氨基酸)，共聚(醚-酯)，聚亚烷基草酸酯，聚酰胺，聚(亚氨碳酸酯)，聚酸酐，聚原酸酯，聚氧杂酯(polyoxaesters)，聚氨基酯，聚乳酸(PLA)，聚环氧乙烷(PEO)，聚己内酯(PCL)，聚羟丁酸戊酸盐，包含胺基的聚氧杂酯，聚(酸酐)，聚磷腈，硅树脂，水凝胶，生物分子和其混合物。
用于本发明目的的其他聚合生物分子，优选其不是沙拉丁素的靶标，包括天然存在的物质，其可以在人体内酶解或者在人体中水解不稳定，例如明胶，糖胺多糖和可吸收的生物相容性多糖例如壳聚糖，淀粉，脂肪酸(和其酯)，葡萄糖(glucoso)-聚糖和透明质酸。
具有相对较低慢性组织响应的合适的生物稳定多聚体，例如聚氨酯，硅树脂，聚(甲基)丙烯酸酯，聚酯，聚环氧烷(聚环氧乙烷)，聚乙烯醇，聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮，以及，水凝胶例如由交联的聚乙烯吡咯烷酮和聚酯形成的水凝胶，也可以被使用。还可以使用其他多聚体，如果它们能够在支架或者基于导管的装置上溶解、固化或者聚合。这些包括聚烯烃，聚异丁烯和乙烯-α烯烃共聚物；丙烯酸类聚合物(包括甲基丙烯酸酯)和共聚物，乙烯基卤化物多聚体和共聚物，例如聚氯乙烯；聚乙烯醚，例如聚乙烯甲醚；聚乙二烯卤化物例如聚偏二氟乙烯和聚偏二氯乙烯；聚丙烯腈，聚乙烯酮；聚乙烯芳香族例如聚苯乙烯；聚乙烯酯例如聚乙酸乙烯酯；乙烯单体彼此之间和烯烃的共聚物，例如乙烯-丙烯酸甲酯共聚物，丙烯腈-苯乙烯共聚物，ABS树脂和乙烯-乙酸乙烯共聚物；聚酰胺例如尼龙66和聚己内酰胺；醇酸树脂树脂；聚碳酸酯；聚甲醛；聚酰亚胺；聚醚；环氧树脂，聚氨酯；人造纤维；嫘萦三乙酸酯(rayontriacetate)，纤维素，乙酸纤维素，乙酸丁酸纤维素酯；玻璃纸；硝酸纤维素酯；丙酸纤维素酯；纤维素醚(即，羧甲基纤维素和羟烷基纤维素)；和其组合。
适用于本发明的其他多聚体是生物可吸收的弹性体，例如，脂族聚酯弹性体。在合适的比例下，脂族聚酯共聚物是弹性体。弹性体表现出它们倾向于与金属支架良好粘合并且能承受明显的变形而不裂开的优势。
合适的涂层材料的实例包括，但不限于，纤维素聚合物例如邻苯二甲酸乙酸纤维素酯，羟基丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯和羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯；聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯，丙烯酸聚合物和共聚物，和甲基丙烯酸树脂即商品化供应的商品名为EUDRAGIT
Figure A20068003624300381
(Roth Pharma，Westerstadt，Germany)，玉米蛋白，虫胶，和多糖。
此外，涂层材料可以包含常用载体例如增塑剂，颜料，着色剂，助流剂，稳定剂，造孔剂和表面活性剂。
在一个实施方式中，涂层由水凝胶组成，例如聚环氧乙烷，白蛋白，亲水性聚甲基丙烯酸酯和亲水性聚氨酯。
抗血栓和抗再狭窄涂层是常规的生物相容性涂层，还可以作为局部药剂递送的药池。涂层主要基于水凝胶，而制备各种类型水凝胶和涂层医疗装置的方法的专利文献的实例包括WO9211896，WO9811828，WO0147572，EP0887369和WO0139811。
涂层内所含的治疗物质的释放模式可以进行调整，例如通过改变聚合物层的厚度或者通过选择有助于所选的物理化学性质(例如电荷，疏水性，亲水性)的特异性聚合物涂层和/或通过将涂层制成不同层。本领域普通技术人员都了解聚合物选择的标准和释放速率的优化。Fischell(Circulation，1996，94：1494-95)、Topol等人(Circulation，1998，98：1802-20)和McNair等人在device Technology，1996，16-22中描述了其他涂层。
理想的是沙拉丁素治疗可以与合适的治疗介入同时给药，这可以通过将沙拉丁素掺入手术装置的涂层实现。另一个方面还可能涉及用沙拉丁素直接包被受损的组织。
此外，在本发明中也可以使用常规的沙拉丁素递送方法，例如自由流体形式，包括与其他治疗剂的组合。优选地，使用聚合物/水凝胶基质。沙拉丁素在医疗装置或者涂层向受损组织局部施用的常规技术方案是例如将沙拉丁素掺入聚合物或者水凝胶涂层。
就聚合物组合物而言，此处使用的术语“水凝胶”包括具有不同大小和容量的孔或者空隙和不同物理化学性质的合成聚合物，所述物理化学性质尤其针对凝胶基质的电荷或者亲水性/疏水性，所述凝胶基质可以在涂层或者涂层的装置的制备期间引入。各种合成弹性体和天然存在的聚合物质是本领域技术人员已知的。沙拉丁素可以在多聚物制备期间掺入基质或者在聚合物包被或者塑形成所需形状后添加。此外，多种不同的聚合材料和制造方法很多可以用于形成本发明所用的聚合物基质。合适聚合材料或者组合的实例包括，但不限于，生物相容性和/或可生物降解的聚合物。已经对若干种烷基烷基-和氰基丙烯酸酯用于手术用途进行了研究，发现一些异丁基氰基丙烯酸酯是特别适合的。
典型的水凝胶聚合物可以由单体混合物制备，所述单体混合物包括40-60重量份有一个烯烃双键的羟烷基烷基丙烯酸酯的纯化单酯，40-60重量份包含一个烯烃双键的甲基丙酸烯单体，和0.001-5重量份的聚合引发剂。通过本体聚合、溶液聚合、悬浮聚合或者乳液聚合的常规技术，可以完成聚合。使用的聚合技术取决于所需聚合物的体积和要产生的终产物的性质。典型的水凝胶产物将被描述单酯与甲基丙酸烯单体的摩尔比例为1∶1到2.3∶1范围内，优选1.5∶1，其中聚合物的孔径大于90埃。作为具有单一烯烃双键的羟烷基丙烯酸酯的单酯，可接受的化合物包括，但不限于，甲基丙烯酸2-羟乙酯，甲基丙烯酸缩水甘油酯，甲基丙烯酸2-羟丙酯，甲基丙烯酸缩水甘油酯，丙烯酸2-羟乙酯，和丙烯酸2-羟丙酯。可接受的甲基丙酸单体是甲基丙烯酸，甲基丙烯酰胺5和甲基丙烯腈。聚合引发剂取决于聚合方法或者聚合物的最终预期用途。例如，当聚合物要被制备为固体物品时，可以使用自由基引发剂。优选该类型的引发剂包括双功能的聚酯，例如2，5-二甲基-2，5-二(2乙基己氧基过氧(ethylhexoylperoxy))己烷，或者叔丁基过氧新戊酸酯(peroxypivilate)。或者，当聚合物的最终用途是作为涂层以单体混合物形式应用并在原位聚合时，引发剂可以是辐射活化的，例如UV催化剂2，2偶氮双(2-甲基丙腈)或者偶氮双异丁腈(AIBN)。引发剂不限于在特定聚合方法中使用或者用于特定终产物。例如，自由基引发剂可以在涂层中使用，而辐射活化的引发剂可以在固体物品的形成中使用。除单酯和甲基丙酸烯单体基本上相似的部分之外，单体混合物可以用痕量的更长链的烷基丙烯酸酯或者甲基丙烯酸酯共聚单体例如甲基丙烯酸环己酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯或者乙二醇二甲基丙烯酸酯来增强。在需要增加聚合物强度的情况下，这类附加的共聚单体增强聚合物交联。这些共聚单体的痕量通常小于总体单体混合物的0.1重量％。可以将本发明使用的水凝胶聚合物制备为产生通过内部作用充分交联的物体，所获的物体不需要其他的交联单体。可生物降解的聚合物的其他实例是聚(丙交酯)，聚乙交酯，聚酸酐，聚原酸酯，聚缩醛(polyactals)，聚二氢吡喃，聚腈基丙烯酸酯以及这些和聚乙二醇的共聚物。这些可以采用共聚聚合物水凝胶或者交联聚合物网络的形式，其中增强局部输送的药剂或者在聚合期间被掺入，或者就某些水凝胶来说随后加入。优选的基质将根据试剂的分子特征制作以控制向外的自由扩散。
可以制备延迟释放和延长释放组合物。通过将药剂与可接受的离子交换树脂复合并包被这类复合物，或者在组合物内包括一种或者多种缓释剂以促进本发明沙拉丁素肽的缓释，可以获得延迟释放/延长释放的治疗组合物。缓释剂的实例包括，但不限于，镁合金，聚(乙醇)酸，聚(乳酸)或者通常基于乙醇酸-和乳酸的聚合物，共聚物，聚己内酯和通常，聚羟基烷羧酸盐，聚(羟基烷醇酸)，聚(乙二醇)，聚乙烯醇，聚(原酸酯)，聚(酸酐)，聚(碳酸酯)，聚酰胺，聚酰亚胺，聚亚胺，聚(亚氨基碳酸酯)，聚(乙烯亚胺)，聚二噁烷，聚氧化乙烯(聚环氧乙烷)，聚(磷腈)，聚砜，脂类，聚丙烯酸，聚甲基丙烯酸甲酯，聚丙烯酰胺，聚丙烯腈(聚氰基丙烯酸酯)，聚HEMA，聚氨酯，聚烯烃，聚苯乙烯，聚对苯二酸酯，聚乙烯，聚丙烯，聚醚酮，聚氯乙烯，聚氟化物，硅树脂，聚硅酸酯(生物活性玻璃)，硅氧烷(聚二甲基硅氧烷)，羟磷灰石，丙交酯-己内酯，天然和非天然的聚氨基酸，聚b-氨基酯，白蛋白，藻酸盐，纤维素/乙酸纤维素，几丁质/壳聚糖，胶原，纤维蛋白/纤维蛋白原，明胶质，木质素，基于蛋白的聚合物，聚(赖氨酸)，聚(谷氨酸酯)，聚(丙二酸酯)，聚(透明质酸)，聚核酸，聚糖，聚(羟基烷羧酸酯)，聚异戊间二烯，基于淀粉的聚合物，其共聚物，其线性的、支化的、超支化的、树枝状、交联的、官能化的衍生物，或者水凝胶，所述水凝胶基于活化聚乙二醇与碱性水解的动物或者植物蛋白的结合。
此外，速释组合物和延迟释放/延长释放组合物的组合可以配制在一起。
口服液体制剂可以采用水性或者油性悬浮液、溶液、乳液、糖浆剂或者酏剂的形式，并与活性化合物一起包含湿润剂、甜味剂、以及着色和调味剂，或者可以表现为干燥品，在使用前用水或者其他合适的介质复溶。这类液体制剂可以包含常规添加剂像悬浮剂，乳化剂，非水介质和防腐剂。在水或者其他水性介质中制备的用于口服给药的液体制剂可以包含不同的悬浮剂，例如甲基纤维素，藻酸盐，黄芪胶，果胶，藻胶钠，角叉菜胶，阿拉伯胶，聚乙烯吡咯烷酮，和聚乙烯醇。可以按照常规方法制备用于患者吸入的各种液体和粉末制剂。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或者可食载体。合适的口服组合物可以被例如封装入明胶胶囊中或者压缩成片剂。用于口服给药的片剂、锭剂和胶囊包含常规赋形剂例如结合剂，填充剂，稀释剂，成片剂，润滑剂，崩解剂，和湿润剂。片剂可以根据本领域公知的方法进行包衣。还可以使用液体载体将口服组合物制备用作漱口药，其中液体载体中的化合物口服应用并含漱和吐出或者吞咽。治疗相容性的结合剂，和/或可以包括佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等等可能包含任何下列成分，或者具有相似性质的化合物：结合剂例如微晶纤维素，西黄蓍胶或者明胶；赋形剂例如淀粉或者乳糖，崩解剂例如藻酸，Primogel，或者玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁或者Sterotes；助流剂例如胶体二氧化硅；甜味剂例如蔗糖或者糖精；或者调味剂例如薄荷，水杨酸甲酯，或者柑桔调味料。对于通过吸入给药，化合物以气溶胶喷射的形式从压力容器或者分配器或者喷雾器递送，所述压力容器或分配器包含合适的推进剂，例如，气体例如二氧化碳，或喷雾剂。
局部施用，可以采用水性或者油性悬浮液、，溶液、乳液、胶冻或者乳化膏剂的形式。局部组合物可以采用治疗剂的形式，但它不是必须的。例如，它可以是化妆品。在本发明的一个实施方式中，提供局部给药的局部组合物。局部给药的局部组合物包括局部载体。局部载体是通常适于局部药剂给药的载体，并包括本领域已知的任意这类材料。选择局部载体使其提供期望形式的组合物，例如，作为液体，洗液，面霜，糊剂，凝胶，粉剂，或者膏剂，并且可以包含天然存在或者合成来源的材料。所选载体对活性剂或者局部制剂的其他组分不会产生不利的影响是非常重要的。此处使用的合适局部载体的实例包括水，醇和其他无毒的有机溶剂，甘油，矿物油，有机硅，矿脂，羊毛脂，脂肪酸，植物油，对羟苯甲酸酯，蜡，等等。
本发明的沙拉丁素多肽适合作为治疗组合物和组合中的治疗有效化合物。本发明的治疗制剂任选可以包括其他活性成分像阿司匹林、抗凝血剂例如水蛭素或者肝素或者血栓溶解剂例如纤溶酶原活化剂或者链激酶或者包括此处所述的任意其他药剂。
本发明的制剂可以作为单位剂量给药，所述单位剂量包含对于所选给药途径典型的常用无毒治疗上可接受的载体、稀释剂、佐剂和介质。
本发明的单位剂量可以包含每日所需量的本发明沙拉丁素肽，或者其等分数之一，以构成所需量。用于指定患者(哺乳动物，包括人)的最佳治疗上可接受的剂量和剂量率取决于各种因素，例如使用的特定活性物质的活性，年龄，体重，健康状况，性别，饮食，给药时间和途径，清除率，治疗目的，例如，治疗或者预防和待治疗的血栓性疾病的性质。本发明的剂量无须保持不变，但可以根据本领域技术人员公知的参数进行调整。此外，本发明的剂量可以是亚-或者超-治疗。
在一个实施方式中，本发明的肽的治疗有效量在大约0.001和100mg/kg体重之间，优选在0.01和10mg/kg体重之间。在一个实施方式中，本发明肽的剂量是0.33mg/kg体重。
在一个实施方式中，对于血管应用，制剂包括大约0.1mg/mL到大约30mg/mL沙拉丁素。在另一个实施方式中，用于血管应用的制剂包括大约0.1mg/mL到大约1mg/mL沙拉丁素，大约1mg/mL到大约5mg/mL沙拉丁素，大约5mg/mL到大约10mg/mL沙拉丁素，大约10mg/mL到大约15mg/mL沙拉丁素，大约15mg/mL到20mg/mL沙拉丁素，大约20mg/mL到大约25mg/mL沙拉丁素，或者大约25mg/mL到大约30mg/mL沙拉丁素。在一个优选的实施方式中，用于血管应用的制剂包括大约1mg/mL到大约5mg/mL沙拉丁素。对于非血管应用，制剂包括大约0.01mg/mL到大约20mg/mL沙拉丁素。在一个实施方式中，非血管应用的制剂包括大约0.01mg/mL到大约0.1mg/mL沙拉丁素，大约0.1mg/mL到大约1mg/mL沙拉丁素，大约1mg/mL到大约5mg/mL沙拉丁素，大约5mg/mL到大约10mg/mL沙拉丁素，大约10mg/mL到大约15mg/mL沙拉丁素，或者大约15mg/mL到20mg/mL沙拉丁素。在一个优选的实施方式中，用于非血管应用的制剂包括大约0.1mg/mL到大约1mg/mL沙拉丁素。通常，使用的制剂量取决于应用部位所需要的剂量。医生可以使用过量的制剂，然后通过海绵揩拭或者灌洗去除多余的量，以到达所需浓度。
在另一个实施方式中，0.1mg/mL到20mg/mL沙拉丁素以足以覆盖预定区域的体积被用于血管用途。在一个实施方式中，1mg/mL到5mg/mL，5mg/mL到10mg/mL，或者10mg/mL到20mg/mL沙拉丁素以足以覆盖预定区域的量被用于血管用途。在一个优选的实施方式中，1mg/mL到5mg/mL沙拉丁素以足以覆盖预定区域的量被用于血管用途。在另一个实施方式中，0.01mg/mL到10mg/mL沙拉丁素以足以覆盖预定区域的量被用于非血管用途。在一个实施方式中，0.01mg/mL到5mg/mL，或者5mg/mL到10mg/mL沙拉丁素以足以覆盖预定区域的量被用于血管用途。在一个优选的实施方式中，0.01mg/mL到5mg/mL沙拉丁素以足以覆盖预定区域的量被用于非血管用途。本领域普通技术人员应该理解，在一些实施方式中，可能需要使用更高的局部浓度以达到有效浓度，因为一些治疗剂可能损失，例如，因为冲洗或者海绵揩拭去除。此外当与其他治疗剂例如凝血酶抑制剂或者抗凝剂联用时，沙拉丁素的治疗有效量可能不同。
本发明的目的还在于提供用于接触体液的可移植或者体外的医疗装置，以便使装置表面基本抗血栓，所述装置包被如上文和权利要求所定义的固定多肽。在医疗装置上固定本发明的多肽，这使得表面是生物相容和抗血栓。这类装置有时具有通常诱导血小板凝集的表面特性，这对于它们预期用于与血液或者其他体液接触的可移植的体外装置是不利的。通常由塑料材料和合成纤维制备的这类装置的实例是假体，人工器官，眼晶体，缝线，人工血管段，导管，透析器，管道和载血液的血管。
优选的制剂是单纯的磷酸盐缓冲盐水，而矫形外科应用利用粘性更高的制剂，例如含有水凝胶的制剂。合适的制剂可以是大约0.01mg/mL到大约0.1mg/mL沙拉丁素，大约0.1mg/mL到大约1mg/mL沙拉丁素，大约1mg/mL到大约5mg/mL沙拉丁素，大约5mg/mL到大约10mg/mL沙拉丁素，大约10mg/mL到大约15mg/mL沙拉丁素，大约15mg/mL到20mg/mL沙拉丁素，大约20mg/mL到大约25mg/mL沙拉丁素，大约25mg/mL到大约30mg/mL沙拉丁素，大约30mg/mL到大约40mg/mL沙拉丁素，或者大约40mg/mL到大约50mg/mL沙拉丁素，溶于PBS或者水凝胶或者其他合适的介质。该材料可以冷冻、冷藏或者作为冻干粉剂保存。
实施例
实施例1：犬屈肌腱修复模型中沙拉丁素的用途
对于手外科医生来说，指内肌腱损伤仍是一个临床挑战。犬模型常用于研究肌腱损伤及其治疗的生物学效果。
本研究的的目的是评价体内犬模型中屈肌腱修复后沙拉丁素对结果的影响。在犬屈肌腱修复模型中肌腱损伤后，沙拉丁素以凝胶制剂或者作为单纯的液体用于损伤部位。在对照组，使用凝胶或者液体对照(无沙拉丁素)。在犬肌腱撕裂和修复后评价屈曲功(WOF)和肌腱强度，所述犬在术后10天处死。预期在用沙拉丁素治疗的犬中，WOF和肌腱强度更高，并且疤痕缩小。
实施例2：沙拉丁素促进伤口愈合和瘢痕形成
小鼠模型
在小鼠中测定沙拉丁素对伤口愈合的影响。伤口由精细手术剪产生，由4mm全层的皮肤切口构成。无菌胶绷带用于覆盖每个伤口。在伤口形成后，在切口上使用沙拉丁素。在损伤后第0、1、2、3和5天，使用磁共振显微成像(MRI)评定每个伤口部位新血管的形成。在损伤后第1-2天，沙拉丁素治疗将缩少围绕伤口的大量新生血管形成，加快伤口愈合，并减少疤痕形成。
对伤口的目测也提供了沙拉丁素治疗有益的证据。在后来的时间点，与对照动物比较，用沙拉丁素治疗的动物几乎没有显示疤痕形成的证据。
对小鼠的伤口破坏强度，或者跨伤口的组织拉伸强度进行评价。在右腰部产生全层皮肤切口，然后在伤口上局部施用沙拉丁素。在切口后40小时和第7天测量破坏伤口所需的力。相对于对照，用沙拉丁素治疗的动物在愈合伤口的强度方面将显示显著的增强。
Yucatan猪模型
利用Yucatan猪，还可检测沙拉丁素在伤口愈合和瘢痕形成中的作用。猪皮被认为在生理上类似于人的皮肤。
每只动物可以诱导4组手术伤口。每组由3个损伤组成：(1)部分层损伤(1cm2)，(2)全层损伤(1cm2)，和(3)切割伤口(4cm)。这些手术伤口模拟急性浅表伤口(例如，磨损，全层褥疮，溃疡)和术后切口或者撕裂伤。无菌胶绷带用于覆盖每个伤口。
在伤口形成后，在切口上使用沙拉丁素。在损伤后第0、1、2、3和5天，使用磁共振显微成像(MRI)评定每个伤口部位新血管的形成。在损伤后第1-2天，沙拉丁素治疗将减少围绕伤口的大量新生血管形成，加快伤口愈合，并使疤痕形成最小化。
对伤口的目测也提供了沙拉丁素治疗有益的证据。在后来的时间点与对照动物比较，接受沙拉丁素治疗的动物几乎没有显示疤痕形成的证据。
对猪的伤口破坏强度，或者跨伤口的组织拉伸强度进行评价。在右腰部产生全层皮肤切口，然后在伤口上局部施用沙拉丁素。在切口后40小时和第7天测量破坏伤口所需的力。相对于对照，接受沙拉丁素治疗的动物在愈合伤口的强度方面将显示显著的增强。
实施例3：在体外沙拉丁素抑制MCP-1诱导的人单核细胞迁移
单核细胞细胞分离：从外周血单核细胞(PBMC)分离单核细胞。通过Ficoll-Paque梯度离心从白膜层(San Diego Blood Bank)分离PBMC。通过在100mm陪替氏培养皿中孵育1×107细胞/mL的PBMC 2个小时并收集粘附细胞，分离单核细胞。
单核细胞趋化性：利用盲孔Boyden小室技术定量单核细胞迁移。在添加0.5％BSA的RPMI 1640中悬浮单核细胞，浓度为1×106细胞/mL。包含不同浓度化合物(沙拉丁素)的200微升(200μL)孔置于Boyden小室的顶部孔。小室底部孔载有100ng/mL MCP-1。在顶部孔和底部孔之间放置8-μm孔聚碳酸酯滤纸。在分析中，使用前聚碳酸酯滤纸分别用10μg/mL IV型胶原、1mg/mL IV型胶原、0.01mg/mL纤维连接蛋白或者1mg/mL纤维连接蛋白在4℃包被过夜。滤纸还用10μg/mL或者1mg/mL BSA包被。小室在37℃，5％CO2中孵育2小时。孵育后，去除顶部孔中的细胞，然后滤纸用甲醇固定并用吉姆萨染色剂染色。通过计数迁移通过滤纸的细胞总数来定量细胞运动。
结果：已知沙拉丁素以高亲合力结合胶原。还不清楚它是否还结合其他细胞外基质蛋白(ECM)或者普通蛋白例如牛血清白蛋白(BSA)。在本研究中这个问题被探究。首先，趋化性滤纸用10μg/mL胶原或者BSA包被，检测单核细胞向趋化因子的迁移。图1A中的结果显示，100ng/mL MCP-1显著诱导人单核细胞的趋化性(P＜0.0026，与无MCP-1下细胞的迁移相比)。100，10，1和0.1μg/mL沙拉丁素的添加抑制MCP-1-诱导的单核细胞通过胶原包被滤纸的迁移。该抑制的IC50是172pM(图1B)。沙拉丁素还抑制MCP-1诱导的单核细胞通过包被0.01mg/mL BSA的趋化性，IC50为1.1nM(图1C)。
似乎沙拉丁素的抑制效果可能归因于使用蛋白的量。例如，10μg/mL浓度的胶原或者BSA可能过低，这可能促进沙拉丁素的抑制效果，尤其在BSA包被滤纸上。因此，我们用1mg/mL胶原或者BSA包被滤纸，并且我们还添加另一种细胞外基质，纤维连接蛋白。与图1结果类似，MCP-1(100ng/mL)对于人单核细胞迁移通过包被胶原、BSA或者纤维连接蛋白的滤纸来说是一种有效的趋化因子。在3种底物上沙拉丁素抑制MCP-1的这种活性。对于胶原、BSA和纤维连接蛋白上细胞迁移的这种抑制的IC50分别为62.3pM，37nM和19.4nM(图2A，B和C)。这些结果表明沙拉丁素是免疫细胞流入的抑制剂，并且沙拉丁素可以影响免疫细胞对组织损伤的响应。
实施例4：在体外沙拉丁素抑制MIP-1α诱导的人T淋巴细胞迁移
T淋巴细胞分离：从外周血单核细胞(PBMC)分离T淋巴细胞群。通过Ficoll-Paque梯度离心从白膜层(San Diego Blood Bank)分离PBMC。通过在100mm陪替氏培养皿中孵育1×107细胞/mL的PBMC 2个小时并收集粘附细胞，分离单核细胞。利用尼龙毛柱从PBMC分离T淋巴细胞。简单来说，PBMC在尼龙毛柱上37℃孵育1小时，利用RPMI完全生长培养基从尼龙毛柱洗掉非粘附细胞。这些细胞包含大约95％T淋巴细胞。
T淋巴细胞趋化性：通过盲孔Boyden小室技术定量T淋巴细胞的迁移。在添加0.5％BSA的RPMI 1640中悬浮T淋巴细胞，浓度为1×106细胞/mL。包含不同浓度化合物(沙拉丁素)的200微升(200μL)孔置于Boyden小室的顶部孔。小室底部孔载有100ng/mL MIP-1α。在顶部孔和底部孔之间放置8-μm孔聚碳酸酯滤纸。在分析中，使用前聚碳酸酯滤纸分别用10μg/mL IV型胶原、1mg/mL IV型胶原、0.01mg/mL纤维连接蛋白或者1mg/mL纤维连接蛋白在4℃包被过夜。滤纸还用10μg/mL或者1mg/mL BSA包被。小室在37℃，5％CO2中孵育2小时。孵育后，去除顶部孔中的细胞，然后滤纸用甲醇固定并用吉姆萨染色剂染色。通过计数迁移通过滤纸的细胞总数来定量细胞的运动。
结果：当使用100ng/mL时，MIP-1α显著地(P＜0.02)诱导位于10μg/mL胶原包被滤纸上的T淋巴细胞的趋化性(图3A)。当随细胞放入滤纸的上层孔中时，若干种浓度的沙拉丁素抑制MIP-1α诱导的T淋巴细胞趋化性。10μg/mL胶原包被滤纸上抑制趋化性的IC50是6.863nM(图3B)。但是，当使用10μg/mL BSA作为底物时，没有观察到明显的抑制(图3C)。
我们还研究了沙拉丁素对置于滤纸上的T淋巴细胞的趋化性的作用，所述滤纸包被了1mg/mL胶原、BSA或者纤维连接蛋白。沙拉丁素抑制这些细胞MIP-1α诱导的趋化性。对于细胞迁移通过1mg/mL胶原、BSA或者纤维连接蛋白包被滤纸的作用的IC50分别是7.9pM、184.9nM和3.69nM(图4A，B和C)。
实施例5：测定沙拉丁素对MCP-1诱导迁移的影响的体内研究
利用小鼠气囊模型测定沙拉丁素对MCP-1诱导迁移和细胞因子产生的体内影响。
材料：小鼠TNF-α的ELISA试剂盒(Biosource，目录#_CMC3013)，小鼠TGF-β的ELISA试剂盒(Biosource，目录#_CHC1683)，小鼠IL-1β的ELISA试剂盒(Biosource，目录#_CMC0813)，小鼠IL-8的ELISA试剂盒(Biosource，目录#_CMC1063)，人碱性FGF的Duoset ELISA试剂盒(R&D，目录#_DY233)，重组人MCP-1(Peprotech Inc.，目录#_300-04)，PBS(Mediatech，目录#_21-031-CV)
方法：第0天对雌性BALB/c小鼠皮下注射6mL无菌空气产生背部气囊，3天后第二次注射3mL无菌空气。第6天，溶于100μl无菌PBS的1μg MCP-1被注入气囊，或者在分开的注射中，使用100μl PBS作为对照。2分钟后，溶于900μL PBS的100μg沙拉丁素被注入气囊，900μl PBS作为对照。两小时后，用1mL PBS冲洗气囊，测量回收体积，并通过血细胞计数器测定回收细胞的数目。根据厂商说明书，利用渗出液的上清评定TNF-α，IL-I β，IL-8，TGF-β和碱性FGF的分泌。
结果：为了证明体外观察到的活性是否能转换到体内，研究沙拉丁素对体内细胞迁移的影响。气囊模型是用于细胞迁移研究的大家公认的技术。为了这项研究，气囊中注入1μg MCP-1，2小时后通过抽吸收集细胞。图5证明在小鼠气囊中给药1μg MCP-1导致细胞显著地被募集到这些气囊中(P＜0.0037，与接受介质治疗的动物相比)。但是，在MCP-1注射后2分钟施用沙拉丁素(0.1mg)显著地抑制MCP-1募集细胞进入气囊(P＜0.0028)。
随后，我们研究了沙拉丁素对小鼠气囊中积聚的细胞因子水平的影响。测量促炎性和炎性细胞因子和趋化因子IL-8，TGF-β，TNF-α，IL-1β和碱性FGF的水平。在MCP-1给药到气囊中之后，IL-8，TNF-α和IL-1β的水平增加，而在对照和MCP-1治疗动物之间没有观察到TGF-β或者碱性FGF水平的差异(图6)。结果还显示0.1mg沙拉丁素的给药将IL-8、TNF-α和IL-1β的水平降低到刺激前水平，但是，这种减少在统计上没有显著意义(图6)。尽管能够证明沙拉丁素给药对碱性FGF没有效果，但是沙拉丁素给药伴随着TGF-β水平显著降低到低于未刺激的介质组的基础水平(P＜0.001，当在赋形剂治疗和沙拉丁素治疗动物之间比较时)。但是，受刺激的比较组的差异使我们不能确定这种降低是归因于MCP-1给药、沙拉丁素给药还是这两个方面。
实施例6；确定炎性病症中沙拉丁素影响的研究
沙拉丁素对多发性硬化症的影响
为了检验沙拉丁素对脑脊髓炎的影响，尤其是多发性硬化，一种或者多种此处描述的化合物可以施用于实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的小鼠模型，一种CD4+T-辅助细胞(Th1)介导的、中枢神经系统(CNS)的炎性髓鞘脱失病，用作多发性硬化的模型。
材料和方法
动物
雌性SJL小鼠(H-2s)购自Harlan Sprague Dawley(Indianapolis，Indiana)。在实验开始时小鼠通常是6到7周龄。
抗原和抗体
PLP 139-151肽(HSLGKWLGHPDKF)购自Peptides International(Louisville，Kentucky)。利用质谱法确认氨基酸组成，并利用高效液相色谱测定纯度(＞98％)。用于MIP-1α，MCP-1，MIP-2，TNF-α，IL-1β，IL-8，TGF-β，FGF-2，RANTES，IL-1α，IL-2，IL-6，MIP-1β和ENA-78的ELISA检测的抗体是商品化供应的。
供体淋巴细胞的初免，细胞培养，和EAE的转移
利用25μg PLP139-151对正常SJL/J小鼠进行皮下免疫，引发供体淋巴细胞进行初免，所述PLP139-151溶于包含4mg/mL结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(Difco，Detroit，Michigan)的CFA中。7天后，收集引流淋巴结细胞，在完全Dulbecco′s极限必需培养基(Biowhitaker，Bethesda，Maryland)中体外培养，所述培养基包含5×10-5M 2-ME(GIBCO)，2mM L-谷氨酰胺(GIBCO)，100U/mL青霉素(GIBCO)，100μg/mL链霉素(GIBCO)，0.1mM非必需氨基酸(GIBCO)，和5％胎牛血清(Hy-Clone)，细胞浓度为6×106细胞/mL，在50μg/mLPLP 139-151存在条件下培养72小时。收集并洗涤细胞，3×106个活T淋巴细胞团转移到正常SJL/J受体的腹膜内。细胞转移后，评价小鼠的EAE发展。
细胞因子ELISA
MIP-1a，MCP-1，MIP-2，TNF-α，IL-1β，IL-8，TGF-β，FGF-2，RANTES，IL-1α，IL-2，IL-6，MIP-1β和ENA-78以及其他趋化因子的评定，可以利用ELISA从组织样品和培养物上清中定量。脊髓样品在1mL磷酸盐缓冲盐水中匀浆，通过离心(400×g)澄清10分钟。ELISA板用稀释在PBS中的2μg/mL捕获抗体包被，并在4℃包被过夜。样品在封闭缓冲液中稀释，室温下在ELISA板中孵育2小时。碱性磷酸酶偶联的二抗用作检测试剂。通过构建已知值的标准曲线并计算样品中趋化因子的皮克/毫升，确定细胞因子浓度。
临床评价
通过转移3×106个体外-刺激的PLP139-151-特异性T淋巴细胞团，诱导继承性R-EAE，所述T淋巴细胞团来自PLP 139-151肽-初免的小鼠。每日观察单个动物，根据它们的临床严重程度分级如下：0＝无异常；1＝尾不举；2＝尾不举和部分后肢无力(步态蹒跚)；3＝完全后肢麻痹；4＝死亡。在大多数实验中，最高严重程度的范围在1和3级之间。小鼠很少死于EAE；但是，当死亡没有其他原因可以造成时，使用评分4。在稳定或者改善一段时间后，当小鼠发展出其他神经病学缺陷(增加至少一个临床等级)时，被评为复发。
利用上述方法可以确定沙拉丁素治疗是否阻断或者改善了小鼠的EAE，或者改变样品中产生的细胞因子浓度。这可以证明沙拉丁素在这类疾病治疗中的有效性。
沙拉丁素对哮喘的影响
为检验沙拉丁素对哮喘的影响，一种或者多种此处描述的化合物施用于哮喘的鼠模型，例如OVA-免疫的BALB/c小鼠，或者具有α-GalCe诱导的气道高应答性(AHR)的小鼠。
材料和方法
动物：BALB/cByJ小鼠可以从Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME获得。
单克隆抗体：单克隆抗体可以通过硫酸铵沉淀和离子交换层析从腹水纯化。可以使用下列杂交瘤：R46A2(抗-IFN-γmAb)XMG1.2(抗-IFN-γ抗体)；BVD4-1D11，BVD6-24G2(抗-IL-4mAb)。这些杂交瘤可以从ATCC(美国典型微生物菌种保藏中心，American Type CultureCollection，Rockville，MD)获得。抗-38C13独特型mAb 4G10(大鼠IgG2a)可以用作同种型对照。
免疫：BALB/c小鼠在足垫用吸附到200μg明矾(Al[OH]3)的OVA(100μg/小鼠)初免。7、8和9天后，小鼠用溶于50μl NaCl 0.9％的50μg OVA鼻内攻击。在最后一次用OVA鼻内攻击的一天后，在全身体积描记器中测量清醒小鼠吸入增加浓度的乙酰甲胆碱后的气道高反应性。如所述进行利用α-GalCer的免疫。
为了在鼻内抗原给药期间促进肺吸气，可以通过腹膜内(i.p.)注射溶于生理盐水的0.25mL氯胺酮(0.44mg/mL)/甲苯噻嗪(6.3mg/mL)对小鼠进行轻度麻醉。通常，随后在肺中能够检测到75％的鼻内给药的抗原(J.Exp.Med.1997；185：1671-9)。
细胞因子ELISA。可以按照前面所述进行ELISA。可以使用如下抗体对，按照捕获/生物素化的检测所列：IL-4，BVD4-1D11/BVD6-24G2；IFN-γ，R4-6A2/XMG1.2。重组细胞因子可以用作标准品，从IL-4的500到39pg/m和IFN-γ的20-2,156ng/mL进行1∶2稀释产生曲线。
抗OVA抗体同种型的测量：可以在处死时从小鼠取血，利用改进的抗原-特异性ELISA测量OVA-特异抗体。为了OVA特异IgG的测量，板用5μg/mL OVA包被过夜。在洗涤和封闭后，在板中可以添加系列稀释的血清。过夜孵育后，可以利用HRPO-偶联的山羊抗-IgG亚类特异性抗体(Southern Biotechnology Associates，Birmingham，ALA)进行反应。在再次洗涤后，添加OPD底物，板进行反应，在492nm测定OD。抗OVA IgG1 mAb 6C1和抗OVA IgG2a mAb 3A11可以用作各IgG亚类定量的标准品。利用大鼠抗小鼠IgE mAb EM95(5.0μg/ml)包被板，通过ELISA可以进行OVA特异IgE的测定。在施加样品和孵育过夜后，洗涤板并添加生物素化的OVA(10μg/mL)。两小时后，洗涤板并可以添加HRPO-偶联的链霉亲和素(Southern BiotechnologyAssociates)。板可以与OPD底物反应，在492nm测定OD。可以定量来自明矾中OVA超免小鼠血清中的IgE，并用作OVA特异IgEELISA的标准品。
气道应答的测量：通过来自有清醒小鼠的乙酰甲胆碱诱导的气流阻塞，可以评定气道应答，所述小鼠置于全身体积描记器(model PLY3211，Buxco Electronics Inc.，Troy，NY)中。利用下列公式可以计算肺部气流阻塞为Penh：
Penh = ( Te RT - 1 ) × ( PEF PIF ) ,
其中Penh＝提高的间歇(无量纲)，Te＝呼气时间，RT＝弛豫时间，PEF＝峰值呼气流(mL/s)，和PIF＝峰值吸气流(mL/s)(Am.J.Respir.Crit.Care Med.，1997；156：766-75)。提高的间歇(Penh)，分钟容量，潮气量，和呼吸频率可以从小室压力获得，利用连接到前置放大器模块(MAX2270型)的传感器(TRD5100型)测量，并用XA软件系统(SFT1810型)进行分析。通过将小鼠暴露于NaCl 0.9％2分钟，可以获得对乙酰甲胆碱应答的测量。
BAL液体的收集和肺部组织学：动物可以腹腔注射致死剂量的苯巴比妥(450mg/kg)。气管插管，然后用0.8mL PBS灌洗肺3次，收集液体。利用血细胞计数器计数灌洗液体中的细胞，在用Hansel Stain染色的载玻片制品上(Lide Laboratories，Florissant，MO)可以确定BAL细胞差异。通过光学显微镜检，根据常规形态学标准，可以至少区分200个细胞。在一些动物中，没有进行BAL但是肺部被去除，用PBS洗涤，10％福尔马林固定并用苏木精和曙红染色。
利用上述方法可以确定沙拉丁素治疗是否阻断α-GalCer诱导的AHR，减少OVA/明矾诱导的AHR，或者改变α-GalCe诱导AHR后血清中产生的细胞因子浓度。这可以证明沙拉丁素在这类疾病治疗中的有效性。
实施例7：沙拉丁素的制备
沙拉丁素制备的实例描述于美国专利6,774,107和6,881,722。在本文所述的研究中，疏水性相互作用层析(HIC)被描述为减少表3所述培养物上清中存在的蛋白水解活性的替代步骤。在该程序中，在接种培养步骤，酵母样品在摇瓶中培养，观察培养物中的污染物。然后按美国专利6,774,107和6,881,722所述进行主发酵步骤。按照表3细胞分离步骤取出上清和分离细胞。为进一步从上清去除微粒和细胞碎片，按表3过滤步骤所述过滤上清。过滤步骤后，上清直接上样到HIC(不需要更换缓冲液)。HIC去除上清中存在的蛋白酶，使不再需要如美国专利6,774,107和6,881,722所述添加热休克蛋白。然后将流过HIC的流体用DEAE上样缓冲液1∶1稀释，再上样到DEAE柱中。洗涤DEAE柱，然后用线性梯度洗脱，如美国专利6,774,107和6,881,722所述。，按照表3的渗滤和过滤步骤所述进行具有至少90％纯度的捕获级分的重组和过滤。然后将沙拉丁素在合适的介质中稀释到所需浓度。
表2：规划的沙拉丁素GMP过程的概述
  规划的GMP过程   附注
  接种培养   摇瓶
  主发酵(补料分批)   如美国专利6,774,107，50L规格，在收集前在发酵罐内培养物冷却到15℃
  细胞分离(离心)   10℃批量离心，每次6L，运行2次，为时1小时
  过滤   生物负载减少，10L滤出液，为时0.25小时，此刻总共不少于2.5g沙拉丁素
  HIC，非结合   150mL/分钟上样，为时1.5小时(大概更高的流速量也可能)
  稀释   添加一份DEAE缓冲液A
  产物纯化(IEC)   室温下样品上样过夜，400到500ml柱，第二天如美国专利6,774,107梯度洗脱
  渗滤(TFF)   5kDa ultracell膜，0.1m2面积，为时2小时
  0.2μm过滤
  批量(API)   2-8℃储存于PETG瓶中
尽管此处已经展示和描述了本发明的优选实施方式，本领域技术人员都清楚提供这类实施方式只是为了举例。在不脱离本发明的情况下本领域技术人员将会产生众多的变化、改变和取代。应了解对此处描述的本发明实施方式的不同替换可用于实现本发明。下列权利要求旨在限定了本发明的范围和这些权利要求范围内的方法和结构以及因此涵盖的它们的等同物。

Claims (33)

1.一种治疗白细胞介导的炎性病症的方法，包括将有效量的沙拉丁素施用于需要其的患者。
2.如权利要求1所述的方法，其中炎性病症选自急性肺病，哮喘，内毒素血症，脓毒病，类风湿性关节炎，牛皮癣，动脉粥样硬化，肾小球肾炎，脑脊髓炎，接触性皮炎，特应性皮炎，滑囊炎，狼疮，急性播散性脑脊髓炎(ADEM)，阿狄森氏病，抗磷脂抗体综合征(APS)，再生障碍性贫血，自身免疫肝炎，乳糜泄，克罗恩氏病，糖尿病(1型)，古德帕斯彻氏综合征，葛瑞夫兹氏病，Guillain-Barre综合征(GBS)，桥本病，红斑狼疮，重症肌无力，眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)，视神经炎，ord′s甲状腺炎，天疱疮，多发性关节炎，原发性胆汁性肝硬化，莱特尔氏综合征，多发性大动脉炎，颞动脉炎，温自身免疫性溶血性贫血，韦格纳肉芽肿病，普秃，查加斯氏病，慢性疲劳综合征，家族性自主神经异常，子宫内膜异位，化脓性汗腺炎，间质性膀胱炎，神经性肌强直，结节病，硬皮病，溃疡性结肠炎，白癜风，外阴痛，阑尾炎，动脉炎，关节炎，睑缘炎，细支气管炎，支气管炎，子宫颈炎，胆管炎，胆囊炎，绒毛膜羊膜炎，结肠炎，结膜炎，膀胱炎，泪腺炎，皮肌炎，心内膜炎，子宫内膜炎，肠炎，小肠结肠炎，上髁炎，附睾炎，筋膜炎，纤维织炎，胃炎，肠胃炎，齿龈炎，肝炎，汗腺炎，回肠炎，虹膜炎，喉炎，乳腺炎，脑膜炎，脊髓炎，心肌炎，肌炎，肾炎，脐炎，卵巢炎，睾丸炎，骨炎，耳炎，胰腺炎，腮腺炎，心包炎，腹膜炎，咽炎，胸膜炎，静脉炎，肺炎，直肠炎，前列腺炎，肾盂肾炎，鼻炎，输卵管炎，窦炎，口腔炎，滑膜炎，腱炎，扁桃腺炎，葡萄膜炎，阴道炎，血管炎和外阴炎。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述治疗包括抑制血小板粘附，血白细胞粘附或者血白细胞迁移。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述血白细胞是淋巴细胞，巨噬细胞，单核细胞或者多形核白细胞。
5.一种抑制血白细胞迁移和/或血白细胞粘附至细胞外基质蛋白的方法，包括将有效量的沙拉丁素施用于需要其的患者。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述有效量的沙拉丁素作为局部药剂或者植入物上的涂层给药。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述植入物是天然或者人工植入物。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述人工植入物是医疗装置。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述医疗装置是整形手术植入物，心血管植入物或者矫形外科植入物。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述医疗装置是心脏瓣膜，支架，移植物，导管，椎间盘，杆，螺钉，板，软骨，或者粘附屏障。
11.如权利要求7所述的方法，其中所述天然植入物是器官，组织或者细胞植入物。
12.如权利要求7所述的方法，其中所述天然植入物是血管移植物。
13.如权利要求5所述的方法，其中所述细胞外基质蛋白是胶原，白蛋白，弹性蛋白或者纤维连接蛋白。
14.一种治疗手术诱导的并发症的方法，包括将有效量的沙拉丁素施用于需要其的患者。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述手术诱导的并发症是手术诱导的炎症或者手术诱导的粘附。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述有效量的沙拉丁素作为局部药剂或者植入物上的涂层给药。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述植入物是天然或者人工植入物。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述人工植入物是医疗装置。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述医疗装置是整形手术植入物，心血管植入物或者矫形外科植入物。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述医疗装置是心脏瓣膜，支架，移植物，导管，椎间盘，杆，螺钉，板，软骨，或者粘附屏障。
21.如权利要求17所述的方法，其中所述天然植入物是器官，组织或者细胞植入物。
22.如权利要求17所述的方法，其中所述天然植入物是血管移植物。
23.如权利要求15所述的方法，其中所述手术诱导的粘附包括血小板或者血白细胞的粘附。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述血白细胞是淋巴细胞，巨噬细胞，单核细胞或者多形核白细胞。
25.如权利要求14所述的方法，其中所述手术是矫形外科手术，整形手术，移植手术或者心血管手术。
26.如权利要求14所述的方法，其中所述手术是肌腱重建手术或者心脏手术。
27.一种治疗和/或预防疤痕和/或瘢痕疙瘩的方法，包括将有效量的沙拉丁素施用于需要其的患者。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述疤痕和/或瘢痕疙瘩是手术诱导的，烧伤诱导的或者炎性皮肤病造成的。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述疤痕和/或瘢痕疙瘩归因于整形手术，重建和/或移植手术。
30.一种治疗凝胶制剂，包括大约0.01mg/mL到大约5.0mg/mL沙拉丁素和至少一种治疗上可接受的赋形剂。
31.如权利要求30所述的制剂，还包括至少一种染料。
32.一种包括植入物和涂层的装置，所述涂层包括沙拉丁素。
33.如权利要求32所述的装置，其中所述植入物是心血管植入物。
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