JP2566934B2 - 血小板凝集抑制作用を有するコラ−ゲン特異性酵素 - Google Patents
血小板凝集抑制作用を有するコラ−ゲン特異性酵素Info
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は血小板凝集抑制作用を有するコラーゲン特異
性酵素に関する。以後かかる酵素をコラゲナーゼと略称
する。
性酵素に関する。以後かかる酵素をコラゲナーゼと略称
する。
コラーゲンという名前はコラーゲンが本来の（変性さ
れない）状態にあるときのラセン領域のペプチド結合の
加水分解切断によつてコラーゲンを特異的に分解する一
群の重要な酵素に付されている。基本的に２つのタイプ
のコラゲナーゼがある。
れない）状態にあるときのラセン領域のペプチド結合の
加水分解切断によつてコラーゲンを特異的に分解する一
群の重要な酵素に付されている。基本的に２つのタイプ
のコラゲナーゼがある。
（ａ） コラーゲン分子を多くの非特異的加水分解で切
断するもの。この種のコラゲナーゼはそれ自身中にはコ
ラーゲンを含んでいない微生物によつてつくられる。
断するもの。この種のコラゲナーゼはそれ自身中にはコ
ラーゲンを含んでいない微生物によつてつくられる。
（ｂ） コラーゲン分子あたり非常に限られた数の、代
表的には１つの切断をするもの。この種のコラゲナー
ゼ、いわゆる組織コラゲナーゼは組織の主な細胞外成分
としてコラゲナーゼを現に有する哺乳類や他の進化した
動物によつて生産される（Harris,E.D.and E.C.Cartwri
ght 1977、哺乳類の細胞及び組織中のプロテイナーゼ、
Proteinase in Mammalin Cells and Tissues,Elsivier,
pp 249−282）。
表的には１つの切断をするもの。この種のコラゲナー
ゼ、いわゆる組織コラゲナーゼは組織の主な細胞外成分
としてコラゲナーゼを現に有する哺乳類や他の進化した
動物によつて生産される（Harris,E.D.and E.C.Cartwri
ght 1977、哺乳類の細胞及び組織中のプロテイナーゼ、
Proteinase in Mammalin Cells and Tissues,Elsivier,
pp 249−282）。
コラーゲンは人体及び高等動物の体の事実上いたるとこ
ろにある構造タンパクである。コラーゲンはアミノ酸の
小さなくり返し配列の領域であつて、結果として分子間
にラセン鎖を形成する領域によつて特徴づけられる。こ
れらのラセンはコラーゲンの並はずれた構造安定性及び
強度のもととなる。結合組織及び皮膚及び細胞同志を結
合する細胞外マトリツク（セメント）の主な構成成分と
して、又血小板凝集の主な引きがねとしてコラーゲンは
生理的にかなりの重要性を有する。コラーゲンを特異的
に分解する酵素は医療的に又科学的に様々な適用性を有
している。
ろにある構造タンパクである。コラーゲンはアミノ酸の
小さなくり返し配列の領域であつて、結果として分子間
にラセン鎖を形成する領域によつて特徴づけられる。こ
れらのラセンはコラーゲンの並はずれた構造安定性及び
強度のもととなる。結合組織及び皮膚及び細胞同志を結
合する細胞外マトリツク（セメント）の主な構成成分と
して、又血小板凝集の主な引きがねとしてコラーゲンは
生理的にかなりの重要性を有する。コラーゲンを特異的
に分解する酵素は医療的に又科学的に様々な適用性を有
している。
コラゲナーゼは自然界例えばバクテリア中や脊椎動物
組織中に広く分布している。バクテリア性のコラゲナー
ゼ、例えばClostridium hystolyticumによつて生産され
るコラゲナーゼは最初のタイプのコラゲナーゼであり、
コラーゲン分子を約200の部分に開裂する。このタイプ
は宿主の浸潤に関与し、コラーゲン分子の劣化を通し栄
養に関与している。哺乳類及び他の脊椎動物のコラゲナ
ーゼは第２のタイプである。すなわちこれらのコラゲナ
ーゼは１つの特定部位しか開裂しない。このタイプは組
織の修復に関与しており、傷ついたコラーゲンを取り去
つたり、特定時期の発生や生理的発現において、特定の
組織を改造したり（例えばおたまじやくしの尾を吸収し
たり、分娩後の子宮を退縮させたり）する。生化学的抽
出及び精製に付した後の組織コラゲナーゼは特定の活性
化を必要とする潜伏性の形で存在している（Harris,E.
D.及びE.C.Cartwright、哺乳類の細胞及び組織中のプロ
テイナーゼ、エルセヴイール、第249-282頁、1999;Caws
ton,T.E.およびG.Murphy1981.Methods Enzymol.,80、第
711-734頁参照）。この性質は既知の組織コラゲナーゼ
の商業的有用性を強く制限している。事実、純粋な形で
活性酵素を得ることの技術的困難さゆえに組織コラゲナ
ーゼについては比較的少ししか知られていない。
組織中に広く分布している。バクテリア性のコラゲナー
ゼ、例えばClostridium hystolyticumによつて生産され
るコラゲナーゼは最初のタイプのコラゲナーゼであり、
コラーゲン分子を約200の部分に開裂する。このタイプ
は宿主の浸潤に関与し、コラーゲン分子の劣化を通し栄
養に関与している。哺乳類及び他の脊椎動物のコラゲナ
ーゼは第２のタイプである。すなわちこれらのコラゲナ
ーゼは１つの特定部位しか開裂しない。このタイプは組
織の修復に関与しており、傷ついたコラーゲンを取り去
つたり、特定時期の発生や生理的発現において、特定の
組織を改造したり（例えばおたまじやくしの尾を吸収し
たり、分娩後の子宮を退縮させたり）する。生化学的抽
出及び精製に付した後の組織コラゲナーゼは特定の活性
化を必要とする潜伏性の形で存在している（Harris,E.
D.及びE.C.Cartwright、哺乳類の細胞及び組織中のプロ
テイナーゼ、エルセヴイール、第249-282頁、1999;Caws
ton,T.E.およびG.Murphy1981.Methods Enzymol.,80、第
711-734頁参照）。この性質は既知の組織コラゲナーゼ
の商業的有用性を強く制限している。事実、純粋な形で
活性酵素を得ることの技術的困難さゆえに組織コラゲナ
ーゼについては比較的少ししか知られていない。
本発明は抽出後活性な形で存在する、新しいタイプの
組織コラゲナーゼに関する。この活性タイプのコラゲナ
ーゼはヒルの頭部組織から得ることができる。本発明者
はヒルデイニダエ（Hirudinidae）科のメンバー、例え
ばヒルドメデイシナリス（Hirudomedicinalis）、ヒル
デイナリス・マニレンシス（Hirudinaris manillensi
s）；ポシロデラ・グラヌロサ（Poecilobdella granulo
sa）；ヘマデイプシダエ（Haemadipsidae）科のメンバ
ー、例えばヘマデイプサ・ゼイラニカ（Haemadipsa Zey
lanica）及びヘマデイプサ・ピクタ（picta）；及びグ
ロシフオニダエ（Glossiphoniidae）科のメンバー、例
えばヘメンテリア・ギリアニ（Haementeria ghiliani
i）を含む広範なアリンコデリド（arhynchobdellid）及
びリンコデリド（rhychobdellid）ヒル種からこの新し
いタイプの組織コラゲナーゼを単離した（上記のものは
すべてDr.R.T.Sawyer「ヒルの生物学及び行動」（Leech
Biology and Behaviour）、オツクスフオード大学出版
局、1986に定義されている）。
組織コラゲナーゼに関する。この活性タイプのコラゲナ
ーゼはヒルの頭部組織から得ることができる。本発明者
はヒルデイニダエ（Hirudinidae）科のメンバー、例え
ばヒルドメデイシナリス（Hirudomedicinalis）、ヒル
デイナリス・マニレンシス（Hirudinaris manillensi
s）；ポシロデラ・グラヌロサ（Poecilobdella granulo
sa）；ヘマデイプシダエ（Haemadipsidae）科のメンバ
ー、例えばヘマデイプサ・ゼイラニカ（Haemadipsa Zey
lanica）及びヘマデイプサ・ピクタ（picta）；及びグ
ロシフオニダエ（Glossiphoniidae）科のメンバー、例
えばヘメンテリア・ギリアニ（Haementeria ghiliani
i）を含む広範なアリンコデリド（arhynchobdellid）及
びリンコデリド（rhychobdellid）ヒル種からこの新し
いタイプの組織コラゲナーゼを単離した（上記のものは
すべてDr.R.T.Sawyer「ヒルの生物学及び行動」（Leech
Biology and Behaviour）、オツクスフオード大学出版
局、1986に定義されている）。
従つて、本発明によつて、生来の（未変性）コラーゲン
を１つの部位で開裂し、ヒル由来のコラゲナーゼが供さ
れる。
を１つの部位で開裂し、ヒル由来のコラゲナーゼが供さ
れる。
本発明のヒルコラゲナーゼは組織タイプのコラゲナー
ゼに属し、コラーゲン分子の主要な部位を１ケ所だけ開
裂する。例を示すと、子牛の皮膚からのタイプＩコラー
ゲンに対するヒルコラゲナーゼの作用がSDS-PAGEによつ
て明らかにされた。それによるとα鎖が大きなαA断片
と小さなαB断片に進行的に開裂する（第１図）。この
例は哺乳類や他の脊椎動物からのコラゲナーゼと異な
り、ヒルコラゲナーゼは活性形で存在することを示して
いる。
ゼに属し、コラーゲン分子の主要な部位を１ケ所だけ開
裂する。例を示すと、子牛の皮膚からのタイプＩコラー
ゲンに対するヒルコラゲナーゼの作用がSDS-PAGEによつ
て明らかにされた。それによるとα鎖が大きなαA断片
と小さなαB断片に進行的に開裂する（第１図）。この
例は哺乳類や他の脊椎動物からのコラゲナーゼと異な
り、ヒルコラゲナーゼは活性形で存在することを示して
いる。
本発明のヒルコラゲナーゼはインビトロでコラーゲン
由来の血小板凝集を抑制するが、血小板計数や血小板サ
イズには実質的影響を与えない。この活性は特異性が高
く、ある間接的な作用によるのでなく、コラーゲンによ
る血小板凝集誘導への直接的作用による（バクテリア由
来のコラゲナーゼはこれと異なり、血小板凝集を抑制し
ない）。
由来の血小板凝集を抑制するが、血小板計数や血小板サ
イズには実質的影響を与えない。この活性は特異性が高
く、ある間接的な作用によるのでなく、コラーゲンによ
る血小板凝集誘導への直接的作用による（バクテリア由
来のコラゲナーゼはこれと異なり、血小板凝集を抑制し
ない）。
コラーゲンが２つのメカニズムの血小板凝集のアクチ
ベーターであることが知られている。アラキドン酸経路
として知られる第１のメカニズムにおいて、コラーゲン
は血小板内のホスホリパーセＡ2を刺激する。この反応
はアラキドン酸を放出し、アラキドン酸はついでシクロ
オキシゲナーゼ酵素の作用によりトロンボキサンＡ2に
変換される。トロンボキサンＡ2は血小板内カルシウム
を結集して、血小板顆粒から他のタンパク、例えばセロ
トニン及び血小板由来の成長因子を放出させ、又ヌクレ
オチド例えばアデノシン二リン酸（ADP）を放出させ
る。
ベーターであることが知られている。アラキドン酸経路
として知られる第１のメカニズムにおいて、コラーゲン
は血小板内のホスホリパーセＡ2を刺激する。この反応
はアラキドン酸を放出し、アラキドン酸はついでシクロ
オキシゲナーゼ酵素の作用によりトロンボキサンＡ2に
変換される。トロンボキサンＡ2は血小板内カルシウム
を結集して、血小板顆粒から他のタンパク、例えばセロ
トニン及び血小板由来の成長因子を放出させ、又ヌクレ
オチド例えばアデノシン二リン酸（ADP）を放出させ
る。
２つ目のメカニズムにおいては、内皮下のコラーゲン
及びトロンビンが血小板を活性化して、カルシウムの顆
粒放出及び血小板由来の成長因子４の放出が起こり、そ
して血小板が内皮下層に直接接着する。
及びトロンビンが血小板を活性化して、カルシウムの顆
粒放出及び血小板由来の成長因子４の放出が起こり、そ
して血小板が内皮下層に直接接着する。
本発明のヒルコラゲナーゼの作用はこれら２つのメカ
ニズムのいずれかにそつて進行する血小板凝集を抑制す
ることである。
ニズムのいずれかにそつて進行する血小板凝集を抑制す
ることである。
本発明のヒル由来コラゲナーゼは以下の性質によつて
さらに特徴づけられる。
さらに特徴づけられる。
（ａ） Fractogel TSK HW（55F）を用いてゲルクロマ
トグラフイーによつて測定したとき、分子量50,000±5,
000のポリペプチドよりなる（第２図）、 （ｂ） 溶媒抽出の後、有意な活性を保持しているよう
である。哺乳類タイプのコラゲナーゼは保持していな
い、 （ｃ） 生来のコラーゲン及び変性コラーゲン（ゼラチ
ン）を容易に消化する。
トグラフイーによつて測定したとき、分子量50,000±5,
000のポリペプチドよりなる（第２図）、 （ｂ） 溶媒抽出の後、有意な活性を保持しているよう
である。哺乳類タイプのコラゲナーゼは保持していな
い、 （ｃ） 生来のコラーゲン及び変性コラーゲン（ゼラチ
ン）を容易に消化する。
（ｄ） 主活性はコラーゲンタイプＩの消化である。タ
イプIIまたはタイプIVコラーゲンに対して活性は少な
い。
イプIIまたはタイプIVコラーゲンに対して活性は少な
い。
（ｅ） 少なくともpH8.5でその活性は増大する。
（ｆ） 生理的温度（約37℃）より実質的に低いか高い
温度よりこの温度で一層活性がある。
温度よりこの温度で一層活性がある。
（ｇ） Ca++（適当には10-50mMのカルシウムイオン）
およびMg++（適当には50mMのマグネシウムイオン）によ
り活性化される。60℃/1時間の培養により不活性化され
る。
およびMg++（適当には50mMのマグネシウムイオン）によ
り活性化される。60℃/1時間の培養により不活性化され
る。
本発明のヒルコラゲナーゼは数多くの潜在的用途、例
えば以下のごとき用途を有している。
えば以下のごとき用途を有している。
（ａ） 生化学研究のための使用、例えば生来のコラー
ゲンとその他の細胞外成分との関係の研究；コラーゲン
の同定、特徴化及び定量のための使用、 （ｂ） 例えば組織を解離するための組織培養、例えば
ワクチン等の生産のためのヒルコラゲナーゼ消化細胞に
おける使用、 （ｃ） コラーゲン誘導血小板凝集及び血栓症のメカニ
ズムを研究するに際し、インビボでの血小板凝集を抑制
するための研究道具としての使用、 （ｄ） 獣皮、毛皮、肉の処理における使用（例えば獣
皮、毛皮、肉を柔らかくしたり、ソーセージ被覆材を処
理したりするための使用）、 （ｅ） 写真廃物から銀の回収のための使用、 （ｆ） 治療上の使用。
ゲンとその他の細胞外成分との関係の研究；コラーゲン
の同定、特徴化及び定量のための使用、 （ｂ） 例えば組織を解離するための組織培養、例えば
ワクチン等の生産のためのヒルコラゲナーゼ消化細胞に
おける使用、 （ｃ） コラーゲン誘導血小板凝集及び血栓症のメカニ
ズムを研究するに際し、インビボでの血小板凝集を抑制
するための研究道具としての使用、 （ｄ） 獣皮、毛皮、肉の処理における使用（例えば獣
皮、毛皮、肉を柔らかくしたり、ソーセージ被覆材を処
理したりするための使用）、 （ｅ） 写真廃物から銀の回収のための使用、 （ｆ） 治療上の使用。
治療上の使用に関し、本発明のコラゲナーゼは次の用
途を有する。
途を有する。
1.眼中のコラーゲンの選択的分解による傷跡組織［例え
ば、白内障手術、網膜剥離及び毛様体輪ヴイトレトミイ
（pars plana vitretomy）の後の］の分解、 2.潰瘍ややけどで生じた壊死組織を除去し、正常組織の
成長を誘導すること、 3.瘢痕（例えばアクネ瘢痕、ケロイド、しわ及び蜂巣
炎）の治療と予防、 4.医薬的活性物質の経皮浸透性を高めること（ヨーロツ
パ特許明細書第193330号に記述のヒル由来のヒアルロデ
イナーゼを併用してもよい）、 5.歯移植や歯根管の処置、例えば象牙芽細胞の除去、 6.注射によるヘルニア様椎骨間円板の治療、 7.脈管形成の刺激又は抑制、 8.病気の進行中に形成される斑に直接コラゲナーゼを投
与することによるペイロニー病（peyronie's disease）
の治療、 9.インビボでの血小板凝集の抑制。
ば、白内障手術、網膜剥離及び毛様体輪ヴイトレトミイ
（pars plana vitretomy）の後の］の分解、 2.潰瘍ややけどで生じた壊死組織を除去し、正常組織の
成長を誘導すること、 3.瘢痕（例えばアクネ瘢痕、ケロイド、しわ及び蜂巣
炎）の治療と予防、 4.医薬的活性物質の経皮浸透性を高めること（ヨーロツ
パ特許明細書第193330号に記述のヒル由来のヒアルロデ
イナーゼを併用してもよい）、 5.歯移植や歯根管の処置、例えば象牙芽細胞の除去、 6.注射によるヘルニア様椎骨間円板の治療、 7.脈管形成の刺激又は抑制、 8.病気の進行中に形成される斑に直接コラゲナーゼを投
与することによるペイロニー病（peyronie's disease）
の治療、 9.インビボでの血小板凝集の抑制。
後者に関して、血小板凝集抑制剤として用いられる多
くの合成医薬（例えば、ジピリダモール、アスピリン、
スルフインピラゾン、チクロピジン、プロスタサイクリ
ン及びトロンボキサンシンセターゼ阻害剤）は非特異的
で血小板凝集に加え多くの代謝過程に影響を与える。本
発明のヒルコラゲナーゼは望ましくない副作用が少なく
（これは恐らくヒルが宿主の体にできるだけ損傷を与え
ないよう進化してきたからであろう）、血小板凝集の基
礎的な誘導剤の１つに直接に作用する。
くの合成医薬（例えば、ジピリダモール、アスピリン、
スルフインピラゾン、チクロピジン、プロスタサイクリ
ン及びトロンボキサンシンセターゼ阻害剤）は非特異的
で血小板凝集に加え多くの代謝過程に影響を与える。本
発明のヒルコラゲナーゼは望ましくない副作用が少なく
（これは恐らくヒルが宿主の体にできるだけ損傷を与え
ないよう進化してきたからであろう）、血小板凝集の基
礎的な誘導剤の１つに直接に作用する。
血小板凝集（インビボ又はインビトロ）の抑制のため
のコラゲナーゼの使用は本発明の非常に重要な面であ
る。本発明者の知る限りでは、この目的のために組織タ
イプコラゲナーゼ（それは１つの部位でコラーゲンを開
裂するコラゲナーゼである）を使用することを誰も以前
に示唆しなかつた。それゆえ本発明のさらに先の面によ
れば、１つの部位でコラーゲンを開裂し、血小板凝集抑
制に使用するためのコラゲナーゼが提供される。
のコラゲナーゼの使用は本発明の非常に重要な面であ
る。本発明者の知る限りでは、この目的のために組織タ
イプコラゲナーゼ（それは１つの部位でコラーゲンを開
裂するコラゲナーゼである）を使用することを誰も以前
に示唆しなかつた。それゆえ本発明のさらに先の面によ
れば、１つの部位でコラーゲンを開裂し、血小板凝集抑
制に使用するためのコラゲナーゼが提供される。
これに関し、コラゲナーゼは単独又は他の活性因子と共
に以下の目的のために用いることができる。
に以下の目的のために用いることができる。
（ｉ） マイクロサージエリーにおいて局所出血をひき
のばし、うつ血した移植片又は皮膚弁もしくは組織弁に
血液循環を与える目的、 （ii） 移植組織、例えば冠バイパス手術で用いた静脈
の予防処置として、コラーゲン性の血小板凝集を予防す
るため、 （iii） 血液にさらされた生のコラーゲンの変性によ
る術後凝血塊の危険を、手術部位でのコラゲナーゼ処理
及びさらされたコラーゲンを不活性化するために血液中
にコラーゲンを循環させることにより減ずるため、 （iv） アテローム斑にそつての又血管損傷（そこでは
コラーゲンがさらされる）にそつての血小板凝集を減ず
るため、 （ｖ） コラーゲン関連人工器官又は移植が採用される
ときの血小板凝集の危険を減ずるため。
のばし、うつ血した移植片又は皮膚弁もしくは組織弁に
血液循環を与える目的、 （ii） 移植組織、例えば冠バイパス手術で用いた静脈
の予防処置として、コラーゲン性の血小板凝集を予防す
るため、 （iii） 血液にさらされた生のコラーゲンの変性によ
る術後凝血塊の危険を、手術部位でのコラゲナーゼ処理
及びさらされたコラーゲンを不活性化するために血液中
にコラーゲンを循環させることにより減ずるため、 （iv） アテローム斑にそつての又血管損傷（そこでは
コラーゲンがさらされる）にそつての血小板凝集を減ず
るため、 （ｖ） コラーゲン関連人工器官又は移植が採用される
ときの血小板凝集の危険を減ずるため。
本発明のヒルコラゲナーゼは実質上純粋な形で又は／
もしくはそれ以上の別の血小板凝集抑制剤（それは同じ
又は別の因子によつて引き起こされる血小板凝集を抑制
する）と共に用いることができる。他のメカニズムによ
る血小板凝集抑制剤と共にヒルコラゲナーゼを用いるこ
とは時として好ましい。そのような抑制剤のいくつかは
（それ自体新規と思われる）ヒル唾液中に存在すること
が見い出されている。実際少なくとも３つの抑制剤がヒ
ル唾液中に見い出されており、１つは分子量約400,000
のアピラーゼ（apyrase）（ADP誘導血小板凝集抑制剤）
であり、２番目は分子量約45,000のアピラーゼであり、
３番目は血小板凝集因子放出の抑制剤で分子量約600で
ある。本発明のヒルコラゲナーゼはこれらの抑制剤の１
種又はそれ以上と共に用いることができる。
もしくはそれ以上の別の血小板凝集抑制剤（それは同じ
又は別の因子によつて引き起こされる血小板凝集を抑制
する）と共に用いることができる。他のメカニズムによ
る血小板凝集抑制剤と共にヒルコラゲナーゼを用いるこ
とは時として好ましい。そのような抑制剤のいくつかは
（それ自体新規と思われる）ヒル唾液中に存在すること
が見い出されている。実際少なくとも３つの抑制剤がヒ
ル唾液中に見い出されており、１つは分子量約400,000
のアピラーゼ（apyrase）（ADP誘導血小板凝集抑制剤）
であり、２番目は分子量約45,000のアピラーゼであり、
３番目は血小板凝集因子放出の抑制剤で分子量約600で
ある。本発明のヒルコラゲナーゼはこれらの抑制剤の１
種又はそれ以上と共に用いることができる。
本発明がさらに十分理解されるようにすべく、以下の
実施例を単に例示として掲げる。
実施例を単に例示として掲げる。
実施例１ ヒルコラゲナーゼを含有する粗抽出液を飢えさせたヒ
ルド・メデイシナリス（Hirudo medicinalis）から以下
の方法で得た。ヒルを0.1mMアルギニンの食塩溶液上の
乾燥子牛腸管膜で飼育した。食物摂取したヒルはついで
吐き戻させられ、吐き出し物は粗抽出液よりなつてい
た。コラゲナーゼ以外に、該抽出液は他の検出可能なプ
ロテアーゼを含んでいなかつた。この点は微生物由来の
コラゲナーゼと明確な対照をなしており、微生物由来の
コラゲナーゼはタンパク分解性の酵素を沢山含んでい
た。
ルド・メデイシナリス（Hirudo medicinalis）から以下
の方法で得た。ヒルを0.1mMアルギニンの食塩溶液上の
乾燥子牛腸管膜で飼育した。食物摂取したヒルはついで
吐き戻させられ、吐き出し物は粗抽出液よりなつてい
た。コラゲナーゼ以外に、該抽出液は他の検出可能なプ
ロテアーゼを含んでいなかつた。この点は微生物由来の
コラゲナーゼと明確な対照をなしており、微生物由来の
コラゲナーゼはタンパク分解性の酵素を沢山含んでい
た。
粗抽出液を２×90cmフラクトゲル（Fractogel）ISK H
W（55F）カラム上0.2M重炭酸アンモニウムで分別した。
溶出液を41ml/hrの流速で2mlずつ回収した。
W（55F）カラム上0.2M重炭酸アンモニウムで分別した。
溶出液を41ml/hrの流速で2mlずつ回収した。
ヒルフラクシヨンを0.05％牛血清アルブミン/5mM CaC
l2/75mM HEPESバツフアー中の125Ｉ−コラーゲン−セフ
アロースでpH7.5、温度25℃で５時間インキユベートす
ることにより力価検定した。活性はセルロース結合コラ
ーゲンから125Ｉの放出によつて測定した。１コラゲナ
ーゼ単位（CU）は１μｇのヨード化コラーゲン−セフア
ロースを分解するコラゲナーゼの量である。力価検定は
５時間に亘つて直線である。
l2/75mM HEPESバツフアー中の125Ｉ−コラーゲン−セフ
アロースでpH7.5、温度25℃で５時間インキユベートす
ることにより力価検定した。活性はセルロース結合コラ
ーゲンから125Ｉの放出によつて測定した。１コラゲナ
ーゼ単位（CU）は１μｇのヨード化コラーゲン−セフア
ロースを分解するコラゲナーゼの量である。力価検定は
５時間に亘つて直線である。
ヒルコラゲナーゼはピークフラクシヨン115に見い出
された（第２図）。既知分子量のマーカーとの比較によ
り、ヒルコラゲナーゼの分子量は約50,000±5,000ダル
トンであると考えられる。同様の結果がペシロデラ・グ
ラニユロサ（Poecilobdella granulosa）から抽出した
コラゲナーゼを用いて得られた。
された（第２図）。既知分子量のマーカーとの比較によ
り、ヒルコラゲナーゼの分子量は約50,000±5,000ダル
トンであると考えられる。同様の結果がペシロデラ・グ
ラニユロサ（Poecilobdella granulosa）から抽出した
コラゲナーゼを用いて得られた。
実施例２ ヒルコラゲナーゼによる開裂のメカニズムを次のごと
く決定した。粗抽出液を実施例１のごとく調製した。粗
抽出液（Ａ2800.077）を1.5mM CaCl2/10mMトリス−HCl
バツフアー（合計量100μｌ）中の子牛皮膚からのタイ
プＩコラーゲン（1mg/ml）でpH7.8、37℃で１、５及び2
4時間インキユベートした。コラーゲン単独及びクロス
トリデイウム コラゲナーゼ（0.1mg/ml）をコントロー
ルとして用いた。可溶化混合物（120μｌ、Nature227、
680頁）を加え、混合物を水浴中に３分間置いた。50μ
ｌの混合物をSDS−PAGEゲルの各くぼみに置いた。
く決定した。粗抽出液を実施例１のごとく調製した。粗
抽出液（Ａ2800.077）を1.5mM CaCl2/10mMトリス−HCl
バツフアー（合計量100μｌ）中の子牛皮膚からのタイ
プＩコラーゲン（1mg/ml）でpH7.8、37℃で１、５及び2
4時間インキユベートした。コラーゲン単独及びクロス
トリデイウム コラゲナーゼ（0.1mg/ml）をコントロー
ルとして用いた。可溶化混合物（120μｌ、Nature227、
680頁）を加え、混合物を水浴中に３分間置いた。50μ
ｌの混合物をSDS−PAGEゲルの各くぼみに置いた。
結果を第１図に示す。レーンＡ及びＦはコラーゲンコ
ントロール、Ｂ、Ｃ及びＤはそれぞれ１、５及び24時間
インキユベートした粗抽出液、Ｅは１時間インキユベー
トしたクロストリジウムコラゲナーゼ、Ｇは分子量マー
カーである。
ントロール、Ｂ、Ｃ及びＤはそれぞれ１、５及び24時間
インキユベートした粗抽出液、Ｅは１時間インキユベー
トしたクロストリジウムコラゲナーゼ、Ｇは分子量マー
カーである。
単離されたα鎖が大きなαA断片とαB断片に進行的に
開裂することが分る。この高度に特異的な開裂パターン
はヒルコラゲナーゼが組織タイプコラゲナーゼであるこ
とを特徴づけており、微生物からのコラゲナーゼによる
非特異的開裂に明確な対照をなしている。又、哺乳類か
らの組織コラゲナーゼの潜在的形態と対照的にヒルコラ
ゲナーゼは粗抽出液中で活性形として存在することが分
る。
開裂することが分る。この高度に特異的な開裂パターン
はヒルコラゲナーゼが組織タイプコラゲナーゼであるこ
とを特徴づけており、微生物からのコラゲナーゼによる
非特異的開裂に明確な対照をなしている。又、哺乳類か
らの組織コラゲナーゼの潜在的形態と対照的にヒルコラ
ゲナーゼは粗抽出液中で活性形として存在することが分
る。
実施例３ コラーゲン誘導血小板凝集のコラゲナーゼ抑制の検出
を内容とする、組織タイプコラゲナーゼを測定するため
の感度検定が工夫された。
を内容とする、組織タイプコラゲナーゼを測定するため
の感度検定が工夫された。
（ａ） 組織タイプコラゲナーゼ（人滑液線維芽細胞コ
ラゲナーゼ）（３コラゲナーゼ単位又はCU）及びクロス
トリデイウム コラゲナーゼ（50μｇ、12CU）の血小板
凝集に対する作用を調べた。組織タイプコラゲナーゼは
コラゲナーゼ誘導血小板凝集を著しく減じたが、クロス
トリデイウム コラゲナーゼはテスト混合物中のコラゲ
ナーゼ単位が４倍濃度であるにも拘らず実際上効果を示
さなかつた。
ラゲナーゼ）（３コラゲナーゼ単位又はCU）及びクロス
トリデイウム コラゲナーゼ（50μｇ、12CU）の血小板
凝集に対する作用を調べた。組織タイプコラゲナーゼは
コラゲナーゼ誘導血小板凝集を著しく減じたが、クロス
トリデイウム コラゲナーゼはテスト混合物中のコラゲ
ナーゼ単位が４倍濃度であるにも拘らず実際上効果を示
さなかつた。
よつて上記検定は組織タイプコラゲナーゼに特異的で
あることが明らかである。
あることが明らかである。
（ｂ） 粗ヒル抽出液を実施例１のごとく調製し、検定
した。粗抽出液を1mMアルギニン／食塩水で洗浄した0.2
mlGTP−アガロースカラムに通塔してアピラーゼを除い
た。アピラーゼフリーの抽出液はコラーゲンによつて誘
導される血小板凝集を強く抑制する。測定されたヒルコ
ラゲナーゼ活性は2.25コラゲナーゼ単位であつた。上記
はヒルコラゲナーゼがコラーゲン誘導血小板凝集を特異
的に抑制することを示している。上記実施例（ａ）、
（ｂ）において、血小板リツチ血漿（Platelet Rich Pl
asma、PRP）（400μｌ）HEPESバツフアーpH7.35及びテ
スト溶液は1.2μg/mlのコラーゲンを加えたとき（最終
反応容積500μｌ）、１分間プレインキユベートした。
凝集が起こると時間に対する光透過率が増すが、このこ
とは血小板凝集計チヤートに記録された。テスト混合物
中の粗抽出液のＡ280値（×103）は血小板凝集計の記録
をたどつて評価した。測定されたコラゲナーゼ活性は1.
0A280あたり15.3CUであつた。
した。粗抽出液を1mMアルギニン／食塩水で洗浄した0.2
mlGTP−アガロースカラムに通塔してアピラーゼを除い
た。アピラーゼフリーの抽出液はコラーゲンによつて誘
導される血小板凝集を強く抑制する。測定されたヒルコ
ラゲナーゼ活性は2.25コラゲナーゼ単位であつた。上記
はヒルコラゲナーゼがコラーゲン誘導血小板凝集を特異
的に抑制することを示している。上記実施例（ａ）、
（ｂ）において、血小板リツチ血漿（Platelet Rich Pl
asma、PRP）（400μｌ）HEPESバツフアーpH7.35及びテ
スト溶液は1.2μg/mlのコラーゲンを加えたとき（最終
反応容積500μｌ）、１分間プレインキユベートした。
凝集が起こると時間に対する光透過率が増すが、このこ
とは血小板凝集計チヤートに記録された。テスト混合物
中の粗抽出液のＡ280値（×103）は血小板凝集計の記録
をたどつて評価した。測定されたコラゲナーゼ活性は1.
0A280あたり15.3CUであつた。
（ｃ） バツフアローヒルの頭部組織から粗ヒル抽出液
（ステージＩ）を以下のごとく分別した。40のバツフア
ローヒル、ペシロデラ・グラニユロサ（Poecilobdella
granulosa）の頭部領域を切り離し重さを測つた（32.8g
生重量）。これらを蒸留水中で４℃で10分間ホモジナイ
ズした。懸濁液を650gで４℃で10分間遠心した。上清を
とつておき、沈澱を再懸濁し、再び遠心した。上清を合
わせてステージＩ酵素を得た。
（ステージＩ）を以下のごとく分別した。40のバツフア
ローヒル、ペシロデラ・グラニユロサ（Poecilobdella
granulosa）の頭部領域を切り離し重さを測つた（32.8g
生重量）。これらを蒸留水中で４℃で10分間ホモジナイ
ズした。懸濁液を650gで４℃で10分間遠心した。上清を
とつておき、沈澱を再懸濁し、再び遠心した。上清を合
わせてステージＩ酵素を得た。
単離されたタンパク様物質の血小板凝集に対する作用
を、インビトロで、新鮮血を800gで５分遠心して得た血
小板リツチ血漿（PRP）を用いて調べた。PRPを純度の段
階を変化させた等張性ヒル抽出液でプレインキユベート
した。コントロールはヒル抽出液に代え等張性食塩水を
用いて行つた。このプレインキユベーシヨンの後、PRP
を種々の血小板凝集誘導剤、すなわちコラーゲン、ADP
及びリストセチンと共にインキユベートした。結果はEE
L血小板凝集計を用いて、インキユベートされた混合物
の経時光学密度を測定することによつて得られる。すな
わち、混合物は血小板凝集が進行するにつれて、濁りが
少なくなる。血小板プア血漿のブランク標品を用いて血
小板を欠く溶液の光学密度を測定した。
を、インビトロで、新鮮血を800gで５分遠心して得た血
小板リツチ血漿（PRP）を用いて調べた。PRPを純度の段
階を変化させた等張性ヒル抽出液でプレインキユベート
した。コントロールはヒル抽出液に代え等張性食塩水を
用いて行つた。このプレインキユベーシヨンの後、PRP
を種々の血小板凝集誘導剤、すなわちコラーゲン、ADP
及びリストセチンと共にインキユベートした。結果はEE
L血小板凝集計を用いて、インキユベートされた混合物
の経時光学密度を測定することによつて得られる。すな
わち、混合物は血小板凝集が進行するにつれて、濁りが
少なくなる。血小板プア血漿のブランク標品を用いて血
小板を欠く溶液の光学密度を測定した。
ステージＩをG75セフアデツクスゲル（1.6×75cm）で
分別した。溶出は50mM−トリス塩酸、20mM NaCl、pH7.0
を用い、1.0ml/minの速度で行つた。フラクシヨンは５
分間隔で集め、それらのタンパク含量を分光光度計を用
い280nmの吸収によつて測定した。タンパクはフラクシ
ヨン４及び26で測定されるピークで溶出した。集めた各
フラクシヨン及び粗抽出液のコラーゲン誘導血小板凝集
抑制を上記した方法で調べた。フラクシヨン４及び６及
び粗抽出液のみが１μg/ml2コラーゲンによつて誘導さ
れた凝集を実質上抑制することができる活性を含んでい
ることが見い出された。フラクシヨン26はコラゲナーゼ
活性を含んでいた。フラクシヨン４はアピラーゼ活性を
含んでいた（10μg/mlADP）。連続した希釈の粗抽出液
が0.1、0.01及び0.001希釈で、１μg/mlコラーゲンによ
つて誘導される血小板凝集を有意に抑制することが分つ
た。
分別した。溶出は50mM−トリス塩酸、20mM NaCl、pH7.0
を用い、1.0ml/minの速度で行つた。フラクシヨンは５
分間隔で集め、それらのタンパク含量を分光光度計を用
い280nmの吸収によつて測定した。タンパクはフラクシ
ヨン４及び26で測定されるピークで溶出した。集めた各
フラクシヨン及び粗抽出液のコラーゲン誘導血小板凝集
抑制を上記した方法で調べた。フラクシヨン４及び６及
び粗抽出液のみが１μg/ml2コラーゲンによつて誘導さ
れた凝集を実質上抑制することができる活性を含んでい
ることが見い出された。フラクシヨン26はコラゲナーゼ
活性を含んでいた。フラクシヨン４はアピラーゼ活性を
含んでいた（10μg/mlADP）。連続した希釈の粗抽出液
が0.1、0.01及び0.001希釈で、１μg/mlコラーゲンによ
つて誘導される血小板凝集を有意に抑制することが分つ
た。
粗抽出液それ自体は40μg/mlのコラーゲン濃度（イン
ビトロで血小板凝集を誘導するのに通常用いるよりも10
倍高い濃度）でさえも血小板凝集を強く抑制した。リス
トセチン（Ristocetin）誘導血小板凝集は本発明のヒル
抽出液によるプレインキユベーシヨンによつて抑制され
なかつた。さらに、ヒル抽出液は血小板計数及び血小板
サイズに影響を与えなかつた。ADP誘導血小板凝集がヒ
ルアピラーゼやヒルコラゲナーゼにより完全には阻止さ
れないという本発明者の知見は又血小板凝集の別の抑制
成分がヒル中に存在することを示している。
ビトロで血小板凝集を誘導するのに通常用いるよりも10
倍高い濃度）でさえも血小板凝集を強く抑制した。リス
トセチン（Ristocetin）誘導血小板凝集は本発明のヒル
抽出液によるプレインキユベーシヨンによつて抑制され
なかつた。さらに、ヒル抽出液は血小板計数及び血小板
サイズに影響を与えなかつた。ADP誘導血小板凝集がヒ
ルアピラーゼやヒルコラゲナーゼにより完全には阻止さ
れないという本発明者の知見は又血小板凝集の別の抑制
成分がヒル中に存在することを示している。
酵素は以下の方法によりさらに精製した。酵素を含有
する40％上清液に硫酸アンモニウムを80％飽和で加え
た。懸濁液を800g、４℃で20分間遠心した。得られたペ
レツトをバツフアー溶液に再懸濁し、４℃で蒸留水に対
して３回透析した。
する40％上清液に硫酸アンモニウムを80％飽和で加え
た。懸濁液を800g、４℃で20分間遠心した。得られたペ
レツトをバツフアー溶液に再懸濁し、４℃で蒸留水に対
して３回透析した。
再懸濁した80％ペレツトを実施例３に記述した、コラ
ゲナーゼがコラーゲン誘導血小板凝集を抑制する感度手
法により力価検定した。コラーゲンによつて誘導された
血小板凝集は80％ペレツトにより強く抑制されることが
分つた。
ゲナーゼがコラーゲン誘導血小板凝集を抑制する感度手
法により力価検定した。コラーゲンによつて誘導された
血小板凝集は80％ペレツトにより強く抑制されることが
分つた。
80％上清液は有意に減じたコラーゲン誘導血小板凝集
抑制能しか有していなかつた。
抑制能しか有していなかつた。
実施例４に従つてコラゲナーゼ活性を検定したとき、
80％ペレツトはコラゲナーゼ活性を有していたが、80％
上清液は有していなかつた。
80％ペレツトはコラゲナーゼ活性を有していたが、80％
上清液は有していなかつた。
80％上清がある程度の血小板抑制を有していたがコラ
ゲナーゼを有していなかつたことは、80％フラクシヨン
中に、コラゲナーゼによらない、血小板凝集の低分子量
抑制が存在することの証拠として解釈することができよ
う。さらなる証拠は高濃度（100mg/ml）と中濃度（50mg
/ml）のADPの存在下での凝集の第２波の、80％ペレツト
でなく80％上清による抑制によつて示される。
ゲナーゼを有していなかつたことは、80％フラクシヨン
中に、コラゲナーゼによらない、血小板凝集の低分子量
抑制が存在することの証拠として解釈することができよ
う。さらなる証拠は高濃度（100mg/ml）と中濃度（50mg
/ml）のADPの存在下での凝集の第２波の、80％ペレツト
でなく80％上清による抑制によつて示される。
実施例４ ヒルコラゲナーゼをさらに以下のごとく特徴づけた。
冷凍したバツフアローヒルペシロデラ・グラニユロサ
の頭部領域の重量を計つた（114g新鮮重量）。該組織を
蒸留水中４℃で10分間ホモジナイズした。該懸濁液を65
0g、４℃で10分間遠心した。上清を保存しておき、沈澱
を再懸濁し、再び遠心した。上清同志を合してステージ
Ｉ酵素とした（全量146ml）。ステージＩ上清に40％飽
和硫酸アンモニウムを加えることにより酵素をさらに精
製した。該懸濁液を800g、４℃で20分間遠心した。該40
％上清に80％飽和硫酸アンモニウムを加えた。上清を上
記のごとく遠心した。該80％ペレツトを懸濁し、ついで
50％硫酸アンモニウムを加えた。蒸留水に対する４℃で
の透析に続き、ステージＩ酵素、40％、80％及び50％ペ
レツト、及び各上清を全タンパク及びコラゲナーゼ活性
について検定した。煮沸したステージＩをコントロール
とした。
の頭部領域の重量を計つた（114g新鮮重量）。該組織を
蒸留水中４℃で10分間ホモジナイズした。該懸濁液を65
0g、４℃で10分間遠心した。上清を保存しておき、沈澱
を再懸濁し、再び遠心した。上清同志を合してステージ
Ｉ酵素とした（全量146ml）。ステージＩ上清に40％飽
和硫酸アンモニウムを加えることにより酵素をさらに精
製した。該懸濁液を800g、４℃で20分間遠心した。該40
％上清に80％飽和硫酸アンモニウムを加えた。上清を上
記のごとく遠心した。該80％ペレツトを懸濁し、ついで
50％硫酸アンモニウムを加えた。蒸留水に対する４℃で
の透析に続き、ステージＩ酵素、40％、80％及び50％ペ
レツト、及び各上清を全タンパク及びコラゲナーゼ活性
について検定した。煮沸したステージＩをコントロール
とした。
100μｌのコラーゲン（２％ゼラチン）中で100μｌの
各フラクシヨンを24時間インキユベートすることによつ
て、各フラクシヨンをコラゲナーゼ活性について検定し
た。インキユベーシヨン後、各溶液を氷上に30分間置い
た。溶液が冷却によつてゲル化しないのはコラゲナーゼ
活性による。
各フラクシヨンを24時間インキユベートすることによつ
て、各フラクシヨンをコラゲナーゼ活性について検定し
た。インキユベーシヨン後、各溶液を氷上に30分間置い
た。溶液が冷却によつてゲル化しないのはコラゲナーゼ
活性による。
結果は以下の通りであつた。
上記実験からヒルコラゲナーゼは80％硫酸アンモニウ
ム及び50％硫酸アンモニウムの双方によつて沈澱する分
子であることが分る。該コラゲナーゼは40％硫酸アンモ
ニウムには部分的に溶解する。
ム及び50％硫酸アンモニウムの双方によつて沈澱する分
子であることが分る。該コラゲナーゼは40％硫酸アンモ
ニウムには部分的に溶解する。
50％硫酸アンモニウムペレツトの2mlサンプルを5lの
蒸留水に対し強く透析し、ついで1M NaCl濃度とし、さ
らに予め50mM−トリスHCl、20mA-NaCl、pH7.5で平衡化
したG75スーパーフアイン セフアデツクスカラムに通
塔した。ゲル床は高さ70cm、直径1.6cmで流速は20ml/hr
とした。フラクシヨンを20分間隔で集めた。
蒸留水に対し強く透析し、ついで1M NaCl濃度とし、さ
らに予め50mM−トリスHCl、20mA-NaCl、pH7.5で平衡化
したG75スーパーフアイン セフアデツクスカラムに通
塔した。ゲル床は高さ70cm、直径1.6cmで流速は20ml/hr
とした。フラクシヨンを20分間隔で集めた。
各フラクシヨンのタンパク含量を280nmでの吸収を測
定することにより推定した。クマシー（coomassie）ブ
ルー染料によるフラクシヨン０−20測定により、フラク
シヨン７及び14の間の、フラクシヨン９及び11に極大を
有する２つのピークよりなるＡ280ピークが明らかにな
つた（第３図）。
定することにより推定した。クマシー（coomassie）ブ
ルー染料によるフラクシヨン０−20測定により、フラク
シヨン７及び14の間の、フラクシヨン９及び11に極大を
有する２つのピークよりなるＡ280ピークが明らかにな
つた（第３図）。
コラゲナーゼ活性は各フラクシヨン100μｌを４％ゼ
ラチン100μｌで37℃で３時間インキユベートすること
により検定した。該各サンプルを氷上に10分間保持し、
混合物の液化の度合を倒置により観察した。フラクシヨ
ンの代りにバツフアーを含有するコントロールは液化を
示さなかつた。カラムからの各フラクシヨンの一部を10
0℃で10分間加熱し、同様の方法でコラゲナーゼについ
て力価検定した。結果を第４図に示す。コラゲナーゼ活
性はフラクシヨン８及び９の最初のタンパクピークと対
応し、そして又フラクシヨン20と40の間の低分子量のタ
ンパクと対応することが分る。
ラチン100μｌで37℃で３時間インキユベートすること
により検定した。該各サンプルを氷上に10分間保持し、
混合物の液化の度合を倒置により観察した。フラクシヨ
ンの代りにバツフアーを含有するコントロールは液化を
示さなかつた。カラムからの各フラクシヨンの一部を10
0℃で10分間加熱し、同様の方法でコラゲナーゼについ
て力価検定した。結果を第４図に示す。コラゲナーゼ活
性はフラクシヨン８及び９の最初のタンパクピークと対
応し、そして又フラクシヨン20と40の間の低分子量のタ
ンパクと対応することが分る。
各フラクシヨンの、コラーゲン誘導血小板凝集を抑制
する能力の測定も又検討した。４μg/mlコラーゲンの50
μｌをフラクシヨン100μｌ及び血小板リツチ血漿［（3
00±50）×103／m3］400μｌの混合物に加え、血小板凝
集計を用いて、抑制の程度を研究した。各場合における
凝集はフラクシヨンを同様な量の等張食塩水で置き代え
たときに同様な量のコラーゲンによつて誘導される凝集
のパーセントとして表わした。得られた結果の断面図を
第４図に示す。フラクシヨン８及び９はコラーゲン誘導
活性の完全な抑制を示した。他のすべてのフラクシヨン
はコラーゲン誘導血小板凝集に対し有為な作用を示さな
かつた。
する能力の測定も又検討した。４μg/mlコラーゲンの50
μｌをフラクシヨン100μｌ及び血小板リツチ血漿［（3
00±50）×103／m3］400μｌの混合物に加え、血小板凝
集計を用いて、抑制の程度を研究した。各場合における
凝集はフラクシヨンを同様な量の等張食塩水で置き代え
たときに同様な量のコラーゲンによつて誘導される凝集
のパーセントとして表わした。得られた結果の断面図を
第４図に示す。フラクシヨン８及び９はコラーゲン誘導
活性の完全な抑制を示した。他のすべてのフラクシヨン
はコラーゲン誘導血小板凝集に対し有為な作用を示さな
かつた。
同様の結果はヒルド・メデイシナリス（Hirudo medic
inalis）から抽出した酵素についても得られた。
inalis）から抽出した酵素についても得られた。
実施例５ ヒルコラゲナーゼがリンコデリド（rhynchobdellid）
ヒル類中に存在することはゴロツシーホニイド ヘメン
テリア・ギリアニイ（glossi−phoniid Haementeria gh
ilianii）についての以下の実施例によつて示される。
ヒル類中に存在することはゴロツシーホニイド ヘメン
テリア・ギリアニイ（glossi−phoniid Haementeria gh
ilianii）についての以下の実施例によつて示される。
中ぐらいの大きさ（5cm）のヘメンテリア・ギリアニ
イ２個体から唾液腺／長吻（proboscis）複合物全体を
切り出した。冷凍した腺を乳鉢及び乳棒で均質化し蒸留
水1.5mlを加えた。全抽出液を１分間遠心した。上清及
びペレツトの両方から各100μｌのサンプルをとり、こ
れを３％ゼラチン100μｌを入れたくぼみに加えた。得
られる溶液を22℃で24時間消化させた。コラゲナーゼ活
性、すなわち、ゼラチンの消化はペレツトのみに存在
し、上清はコラゲナーゼ活性を示さなかつた。
イ２個体から唾液腺／長吻（proboscis）複合物全体を
切り出した。冷凍した腺を乳鉢及び乳棒で均質化し蒸留
水1.5mlを加えた。全抽出液を１分間遠心した。上清及
びペレツトの両方から各100μｌのサンプルをとり、こ
れを３％ゼラチン100μｌを入れたくぼみに加えた。得
られる溶液を22℃で24時間消化させた。コラゲナーゼ活
性、すなわち、ゼラチンの消化はペレツトのみに存在
し、上清はコラゲナーゼ活性を示さなかつた。
実施例６ 血小板凝集抑制剤としてのヒルコラゲナーゼの潜在的
能力を以下の実施例によつて示す。
能力を以下の実施例によつて示す。
薬用ヒル ヒルド・メデイシナリス（Hirudo medicin
alis）（2.6g）の成虫を人の前腕の多血で育てた。血液
及び他のパラメーターを実験の前、中、後に亘り注意深
く監視した。給餌前の、切開した母指からの基線血液パ
ラメーターを基線コントロールとして役立たせた。すな
わち凝固は3 1/2分で起こり、血液凝集はその約半分の
時間で顕微鏡下にスミア（塗沫）の上にはつきりと見る
ことができた。
alis）（2.6g）の成虫を人の前腕の多血で育てた。血液
及び他のパラメーターを実験の前、中、後に亘り注意深
く監視した。給餌前の、切開した母指からの基線血液パ
ラメーターを基線コントロールとして役立たせた。すな
わち凝固は3 1/2分で起こり、血液凝集はその約半分の
時間で顕微鏡下にスミア（塗沫）の上にはつきりと見る
ことができた。
ヒルは58分間給餌し、その間4.5mlの血液を吸つた。
傷口からは150μl/minの流速で３時間以上に亘り出血が
続いた。傷口からの血を頻繁にサンプルした。凝固時間
は以下の通りであつた。
傷口からは150μl/minの流速で３時間以上に亘り出血が
続いた。傷口からの血を頻繁にサンプルした。凝固時間
は以下の通りであつた。
これらの及び関連のデータは、近時の見解に反し、ヒ
ルが咬んでからの長びく出血はヒルジン（ヒル抗トロン
ビン物質）によるのではないことを示している。すなわ
ち、凝固（フイブリン形成）能力に関し、該血液は10分
以内に正常に戻る、しかし出血はつづく。
ルが咬んでからの長びく出血はヒルジン（ヒル抗トロン
ビン物質）によるのではないことを示している。すなわ
ち、凝固（フイブリン形成）能力に関し、該血液は10分
以内に正常に戻る、しかし出血はつづく。
本発明者の研究は長びく局所出血は血小板凝集の抑制
によるものであることを示している。実施例において、
該新鮮血中の血小板を、ガラススライド上に血液を塗沫
すること及び血小板を計数するキヤナリジー（canalyze
e）を含むいくつかの方法で調べたところ、血小板が１
時間以上凝集する傾向を示さないことを見い出した。
によるものであることを示している。実施例において、
該新鮮血中の血小板を、ガラススライド上に血液を塗沫
すること及び血小板を計数するキヤナリジー（canalyze
e）を含むいくつかの方法で調べたところ、血小板が１
時間以上凝集する傾向を示さないことを見い出した。
150分での代表的な観察によつて示されるごとく、少
なくとも１時間後に血小板それ自体が正常になると考え
られる。皮膚及び古い血液と接触してきた数分古い血液
は96,000の血小板数を有していたが、その減少分は血小
板集塊／凝集を示している。ヒルが咬んだあとの長びく
局所出血は実施例１−３に照らし、次のごとき理由と解
するのがもつとも適当である。すなわち、ヒルが咬んで
いる間及び給餌中に唾液中に分泌されたヒルコラゲナー
ゼが、損傷された血液壁をとりまく、さらされた生のコ
ラーゲンを、それが通りすぎていく血液中の血小板の凝
集を刺激することができないようにする方法で修飾す
る。コラーゲンは血小板凝集のもつとも潜在的な誘導剤
である。
なくとも１時間後に血小板それ自体が正常になると考え
られる。皮膚及び古い血液と接触してきた数分古い血液
は96,000の血小板数を有していたが、その減少分は血小
板集塊／凝集を示している。ヒルが咬んだあとの長びく
局所出血は実施例１−３に照らし、次のごとき理由と解
するのがもつとも適当である。すなわち、ヒルが咬んで
いる間及び給餌中に唾液中に分泌されたヒルコラゲナー
ゼが、損傷された血液壁をとりまく、さらされた生のコ
ラーゲンを、それが通りすぎていく血液中の血小板の凝
集を刺激することができないようにする方法で修飾す
る。コラーゲンは血小板凝集のもつとも潜在的な誘導剤
である。
上記に示したようなヒルコラゲナーゼによる血小板凝
集の抑制は療法上非常に有用である、例えば手術による
移植及び組織弁の後において、及び血腫においてうつ血
個所に循環を与えるマイクロサージエリーにおいて、有
用である。
集の抑制は療法上非常に有用である、例えば手術による
移植及び組織弁の後において、及び血腫においてうつ血
個所に循環を与えるマイクロサージエリーにおいて、有
用である。
フロントページの続き (72)発明者 ソウヤー，ロイ，トーマス イギリス国 エスエー３ ５イーエフ ウェスト グラモーガン，スウォンシ ー，マヤルズ，ウェストポート アベニ ュー 63 (72)発明者 リグビ，メイヤー イギリス国 イエルサレム，ヤボティン スキー ストリート，46 イシウム リ サーチ デベロップメント カンパニー オブ ザ ヘブリュー ユニバーシテ ィー オブ イエルサレム 気付 (72)発明者 レビイ，ハイム イギリス国 イエルサレム，ヤボティン スキー ストリート，46 イシウム リ サーチ デベロップメント カンパニー オブ ザ ヘブリュー ユニバーシテ ィー オブ イエルサレム 気付 (72)発明者 イラキ，ファウド イギリス国 イエルサレム，ヤボティン スキー ストリート，46 イシウム リ サーチ デベロップメント カンパニー オブ ザ ヘブリュー ユニバーシテ ィー オブ イエルサレム 気付
Claims (3)
- 【請求項１】ヒル組織あるいはヒル分泌物から単離した
実質的に純粋なコラゲナーゼであって、このコラゲナー
ゼは（イ）未変性コラーゲン分子のラセン領域のペプチ
ド結合を加水分解的切断をし、（ロ）このコラーゲン分
子鎖当たり只１つを切断しそして（ハ）ゼラチンを消化
することができ、そしてこのコラゲナーゼは45〜55キロ
ダルトンの分子量を有する、上記コラゲナーゼ。 - 【請求項２】コラゲナーゼはコラーゲン誘導の血小板凝
集も阻害しうる、請求項１記載のコラゲナーゼ。 - 【請求項３】（イ）未変性コラーゲン分子のラセン領域
のペプチド結合を加水分解的切断をし、（ロ）このコラ
ーゲン分子鎖当たり只１つを切断しそして（ハ）ゼラチ
ンを消化し得、そして45〜55キロダルトンの分子量を有
する、ヒル組織あるいはヒル分泌物から単離した実質的
に純粋なコラゲナーゼを単離する方法であって、（ａ）
ヒルによりは吐き戻された流動物をゲル分画法により分
画し、そして（ｂ）コラゲナーゼを含む溶出液フラクシ
ョンを集めることを特徴とする、コラゲナーゼを単離す
る方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8520121 | 1985-08-10 | ||
| GB858520121A GB8520121D0 (en) | 1985-08-10 | 1985-08-10 | Platelet aggregation inhibitor |
| GB8616900 | 1986-07-11 | ||
| GB868616900A GB8616900D0 (en) | 1985-08-10 | 1986-07-11 | Collagenase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63500842A JPS63500842A (ja) | 1988-03-31 |
| JP2566934B2 true JP2566934B2 (ja) | 1996-12-25 |
Family
ID=26289640
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61504355A Expired - Lifetime JP2566934B2 (ja) | 1985-08-10 | 1986-08-11 | 血小板凝集抑制作用を有するコラ−ゲン特異性酵素 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0233908B1 (ja) |
| JP (1) | JP2566934B2 (ja) |
| WO (1) | WO1987000860A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2052486A1 (en) * | 1990-10-09 | 1992-04-10 | Thomas M. Connolly | Protein for inhibiting collagen-stimulated platelet aggregation |
| US7691839B2 (en) | 2005-09-28 | 2010-04-06 | Biovascular, Inc. | Methods and compositions for blocking platelet and cell adhesion, cell migration and inflammation |
| US8784896B2 (en) | 2012-09-17 | 2014-07-22 | Biopep Solutions, Inc | Antioxidant therapy with a whole, leech saliva extract |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3646195A (en) * | 1966-08-26 | 1972-02-29 | Astra Ab | Method of reducing adhesiveness and aggregation of blood platelets |
| ES367241A1 (es) * | 1968-05-15 | 1971-07-16 | Worthington Biochem Corp | Metodo de preparar colagenasa purificada que esta esencial-mente exenta de actividad proteolitica y elastolitica. |
| US4390630A (en) * | 1980-10-28 | 1983-06-28 | The Regents Of The University Of California | Hementin--a fibrinolytic agent |
-
1986
- 1986-08-11 WO PCT/GB1986/000481 patent/WO1987000860A1/en active IP Right Grant
- 1986-08-11 EP EP86904880A patent/EP0233908B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-11 JP JP61504355A patent/JP2566934B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| METHODS ENZYMOL=1981 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0233908A1 (en) | 1987-09-02 |
| EP0233908B1 (en) | 1991-06-12 |
| JPS63500842A (ja) | 1988-03-31 |
| WO1987000860A1 (en) | 1987-02-12 |
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