CN101267737A - 通过对经工程化而耐受逆境的植物施用新烟碱类化合物增强其逆境耐受性 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及增强植物和其细胞逆境耐受性的方法,其中将新烟碱类化合物(例如但不限于吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、呋虫胺、烯虫灵、吡虫清或噻虫啉)施用于植物或其细胞,其中所述植物或其细胞包含经过修饰从而使所述植物或其细胞更耐受逆境的基因组,即是经工程化从而耐受逆境的植物。与基因修饰型逆境耐受性植物或其细胞联用的特别有效的逆境耐受增效剂是包含氯吡啶侧链的新烟碱类化合物,如吡虫啉、噻虫啉、吡虫清、烯虫灵和6-氯烟酸(6-CNA)。
Description
提供增强植物和其细胞逆境耐受性的方法,其中将新烟碱类化合物(例如但不限于吡虫啉(imidacloprod)、噻虫胺(clothianidin)、噻虫嗪(thiamethoxam)、呋虫胺(dinotefuran)、烯虫灵(nitenpyram)、吡虫清(acetamiprid)或噻虫啉(thiacloprid))施用于植物或其细胞,其中所述植物或其细胞包含经过修饰从而使所述植物或其细胞更耐受逆境的基因组,即是经工程化从而耐受逆境的植株。与基因修饰型逆境耐受性植物或其细胞联用的特别有效的逆境耐受增效剂是包含氯吡啶侧链的新烟碱类化合物,如吡虫啉、噻虫啉、吡虫清、烯虫灵和6-氯烟酸(6-CNA)。
背景技术
经工程化从而耐受逆境的植物在本领域是已知的。植物细胞和植物的逆境耐受性可以通过如降低内源性聚ADP-核糖聚合酶(ParP)或聚(ADP-核糖)糖原水解酶的水平或活性而达到,如WO 00/04173 A1和PCT/EP2004/003995所述。据认为,以这种方式,可以避免或足以延迟经受了逆境条件的植物细胞中的导致创伤性细胞死亡的致死性NAD和ATP缺乏,从而使经受逆境的细胞存活并适应所述逆境条件。
欧洲专利申请第04077624.7号中描述,植物和其细胞的逆境耐受性可以通过使用编码参与NAD拯救合成途径和/或NAD从头合成途径的酶的核苷酸序列,例如在植物中过表达来达到。
为除了昆虫控制以外的目的,在植物中施用新烟碱类化合物,在本领域也是已知的(WO 01/26468 A2,WO 03/096811 A1)。
WO 01/26468 A2公开了一种改善植物生长的方法,其包括在植物或其所在地施用至少一种选自新烟碱类的化合物。
WO03/096811A1描述,可以通过用新烟碱类化合物处理植物种子,可以在昆虫侵袭水平低于显示需要应用杀虫剂以防制昆虫之水平的场所增加或改善农作物的产量和/或活力。该方法被认为可用于非转基因植物和具有编码用于产生修饰型苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)δ-内毒素蛋白的外源基因的植物。
但是,本领域没有提及下述可能性:通过施用化合物,增强诸如本领域所述的逆境耐受性植物的健康状况和活力,此外,还进一步增强已经过工程化而成为逆境耐受性的植物的逆境耐受性。
发明概述
简言之,本发明是涉及一种增强经工程化而成为逆境耐受性植物和植物细胞的逆境耐受性的新方法,其包括用新烟碱类化合物处理植物和/或该植物的生境、植物细胞或培育出该植物的种子。
本发明还涉及一种增强经工程化从而耐受逆境的植物和植物细胞的健康状况和活力的新方法,其包括用新烟碱类化合物处理植物和/或所述植物的生境、植物细胞或用于培育所述植物的种子。
本发明还涉及一种用于培育逆境耐受性植物的新种子,它是被新烟碱类化合物处理过。
详述
在此处,“经工程化从而耐受逆境的植株”或“经工程化从而耐受逆境的植物细胞”,是指含有外源性DNA的植物或细胞和种子,所述外源性DNA包含外源性逆境耐受性增强基因或对应于所述外源性逆境耐受性增强基因的内源基因的变异体,所述变异体导致含有该变异体的植物细胞或植物的逆境耐受性更高。
依据本发明,已经发现:用有效量的新烟碱类化合物处理经工程化从而耐受逆境的植物或所述植物的种子和/或所述植物的生境,可增强所述植物的逆境耐受性、健康状况和活力。令人惊讶的是,这些新烟碱类化合物有能力导致那些已经比相应的野生型有更高逆境耐受性的植物在抗逆性和健康状况方面得到增强。这种效应甚至超过了由仅依赖于下述性能和效应的加性效应所能预期的:新烟碱类化合物施用于植物时的生长增强性能(如WO 01/26468A2中描述的),和给定植株经工程化的耐受逆境性的效应。该效应并不依赖作为上述新烟碱类化合物的靶的昆虫的存在。因此,该效应与植物或植物细胞或用于培育植物的种子的逆境耐受性的生物化学改进相关联。已经发现,该效应提高了这些工程化植物和植物细胞的遗传工程化逆境耐受性。
在此处,“逆境耐受性”是指当植株遭遇逆境时,与非工程化植株相比,具有对逆境的更强耐受性,这些逆境如:施用化合物(如除草剂、杀菌剂、杀虫剂、植物生长调节剂、辅助剂、肥料)、暴露于非生物胁迫(如干旱、强光照条件、极端温度、臭氧和其他大气污染物、土壤盐度或重金属)或生物胁迫(如病原体或病害感染包括感染真菌、病毒、细菌、昆虫、线虫、支原体和支原体样有机体等)。
在本发明的一个实施方式中,描述了可用于提高经工程化从而耐受逆境的植物或植物细胞或用于培育该植物的种子的逆境耐受性和健康状况的方法,所述方法包括对所述植物和/或其生境、植物细胞或用于培育所述植物的种子施用有效量的式(I)新烟碱类化合物,
其中:
Het表示在各种情况下任选被氟、氯、甲基或乙基单取代或多取代的杂环,所述杂环选自以下杂环:
吡啶-3-基、吡啶-5-基、3-吡啶基、1-氧化-5-吡啶基、1-氧化-5-吡啶基、四氢呋喃-3-基、噻唑-5-基,
A 表示C1-C6-烷基、-N(R1)(R2)或S(R2),
其中
R1表示氢、C1-C6-烷基、苯基-C1-C4-烷基、C3-C6-环烷基、C2-C6-烯基或C2-C6-炔基,和
R2表示C1-C6-烷基、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基、-C(=O)-CH3或苄基,
R表示氢、C1-C6-烷基、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基、-C(=O)-CH3或苄基,或者同R2一起表示下列基团:
-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-、-CH2-S-CH2-、-CH2-NH-CH2-,-CH2-N(CH3)-CH2-,
X 表示N-NO2、N-CN或CH-NO2。
饱和或不饱和的烃基,如烷基或烯基,只要可能则在各种情况下可以是直链或支链,包括与杂原子结合,例如,在烷氧基中。
这些化合物已知具有杀虫活性(参见例如EP-A1-192 606、EP-A2-580 533、EP-A2-376 279、EP-A2-235 725)。
可提及的优选式(I)化合物是在“The Pesticide Manual”,第13版,2003(British Crop Protection Council)中列举的新烟碱类化合物。
一种非常特别优选的化合物是例如由EP A 1 0 192 060可知的具有下式的吡虫啉。
再一种非常特别优选的化合物是例如由WO A1 91/04965可知的具有下式的吡虫清。
再一种非常特别优选的化合物是例如由EP A2 0 235 725可知的具有下式的噻虫啉。
再一种非常特别优选的化合物是例如由EP A2 0 302 389可知的具有下式的烯虫灵。
再一种非常特别优选的化合物是例如由EP A2 0 376 279可知的具有下式的噻虫胺。
再一种非常特别优选的化合物是例如由EP A2 0 580 553可知的具有下式的噻虫嗪。
再一种非常特别优选的化合物是例如由EP A1 0 649 845可知的具有下式的呋虫胺。
吡虫啉是用于本发明方法的特别优选的化合物。噻虫胺也将作为一种优选化合物在本发明的内容中被提到。
在本发明的另一个实施方式中,描述了可用于提高经工程化从而耐受逆境的植物或植物细胞或用于培育该植物的种子的逆境耐受性和健康状况的方法,包括对所述植物和/或其生境、植物细胞或用于培育所述植物的种子施用有效量的具有下式的6-氯烟酸(niacin,CASNO:5326-23-8)。
6-氯烟酸可以在上述带有该基团的新烟碱类化合物(如吡虫啉、噻虫啉、吡虫清、烯虫灵)降解期间被释放。例如,吡虫啉被逐步降解为初级代谢物6-氯烟酸,后者最终分解为二氧化碳。发现该代谢产物也能提高经工程化从而耐受逆境的植物或植物细胞或用于培育该植物的种子的逆境耐受性和健康状况。
上述化合物导致了含有外源性DNA的植物或其细胞和其种子的逆境耐受性的增强,所述外源性DNA包括外源性逆境耐受性增强基因或对应于所述外源性逆境耐受性增强基因的内源基因的变异体,所述变异体导致含有该变异体的植物细胞或植物的逆境耐受性更高。
通常,逆境耐受性的增强意味着逆境指示参数至少有显著性减少,可以采用,比较对象是未经处理的经受逆境的、非转基因参比植株或细胞和种子与经处理的转基因参比植株或细胞和种子相比时的形态、生理或生化差异来测量该参数。此处提到的“健康状况”,是指植物、细胞和种子的虫害和病害侵害水平显著性降低,所述侵害水平可以以存在的各种病害的数目或宏观症状表现(如相对叶面积减少、叶面积侵害、叶面积坏死)来计算或估计。显著性用Colby公式来证明。此外,对逆境条件的抗性也可以通过检测在逆境条件下DAD(H)水平(相对于经受逆境的对照植株,在逆境耐受性植株中该水平较高)和活性氧物质水平(相对于经受逆境的对照植株,在经受逆境的耐受性植株中该水平较低)而测量,如欧洲专利申请书EP04077624.7(在此引作参考)。
本发明的优势之一是,本发明化合物和包含所述化合物的组合物的特殊系统性特性,意味着用这些组合物对经工程化而成为逆境耐受性的植物的种子进行的处理,可提高出苗后正发芽植株和所得植株的逆境耐受性。以这种方式,可以不用在播种时或其后不久立即对作物进行处理。
在本发明的另一个实施方式中,描述了可用于提高经工程化从而耐受逆境的植物或植物细胞或用于培育该植物的种子的逆境耐受性和健康状况的方法,包括对所述植物和/或其生境、植物细胞或用于培育所述植物的种子施用有效量的含有具式(I)化合物的组合物。
因此,本发明也涉及用于本发明的这种组合物的含有式(I)化合物的组合物。
式(I)化合物还可以与其它活性化合物(例如杀虫剂、杀细菌剂、杀螨剂、杀真菌剂等)结合的混合物,以其在商业上有效的制剂或以由该制剂制备的应用形式来应用。这样可以得到组合物,该组合物除了依据本发明改进植株的逆境耐受性和健康状况,还可以对抗可能存在的虫害。可被利用的杀虫剂是例如有机磷剂、氨基甲酸酯或盐剂、羧酸类化学物质、氯化烃类化学物质、由微生物产生的杀虫物质,等等。
在许多情况下,这导致协同效应,即混合物的活性超过了各个成分的活性。这种制剂及应用形式是商业上和生态上特别有用的,因为可以使用较低量的活性成分。然而,增效剂不一定本身必须有活性,只要它能增强活性化合物的活性即可。
含有其他已知的活性化合物(如除草剂)或含有安全剂、化肥和生长调节剂的混合物也是可行的。
依据本发明对植物和植物部分用活性化合物进行的处理,可用惯常的处理方法直接进行或通过让化合物作用于其周围、环境或存储空间,所述惯常的处理方法例如为浸渍、喷洒、蒸发、喷雾、撒布、涂抹,以及对繁殖材料,特别是种子,还通过施用一种或多种包衣。
可将活性化合物转变为常规制剂,如溶液、乳剂、可湿性粉剂、混悬剂、粉末(powder)、粉剂(dust)、糊剂、可溶性粉剂、颗粒剂、混悬剂-乳剂浓缩物、浸渍有活性化合物的天然和合成材料,以及封于聚合物质中的微胶囊。
在商业上有用的制剂或应用形式中的本发明活性化合物的含量,可以在宽泛的范围内改变。由商业化制剂制备的使用形式中的活性化合物含量可以在宽的限度内变化。
这些制剂以已知方式生产,例如通过将活性化合物与补充剂(其为液体溶剂和/或固体载体)混合来生产,任选使用表面活性剂,其为乳化剂和/或分散剂和/或起泡剂。
如果所用的补充剂是水,还可以使用例如有机溶剂作为辅助溶剂。基本上,适合的液体溶剂有:芳香烃(如二甲苯、甲苯或烷基萘)、氯化芳香烃或氯化脂族烃(如氯苯、氯乙烯或二氯甲烷)、脂族烃(如环己烷或石蜡,例如石油馏分、矿物油和植物油)、醇类(如丁醇或甘醇以及它们的醚类和酯类)、酮类(如丙酮、甲乙酮、甲基·异丁基酮或环己酮)、强极性溶剂(如二甲基甲酰胺和二甲亚砜)以及水。
合适的固体载体有:例如,铵盐和地面天然矿物(如高岭土、粘土、滑石粉、白垩、石英、绿坡缕石、蒙脱石或硅藻土),和地面合成矿物(诸如高度分散硅石、氧化铝和硅酸盐);作为颗粒的固体载体,合适的有:例如,粉碎的和分级的天然岩石(如方解石、大理石、浮石、海泡石和白云石),无机和有机粗粉的合成颗粒,以及有机物质颗粒(如锯屑、椰子壳、玉米芯和烟草秆);作为乳化剂和/或起泡剂,合适的有:例如非离子和阴离子乳化剂,如聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪醇醚(如烷芳基聚乙二醇醚)、烷基磺酸酯、烷基硫酸酯、芳基磺酸酯以及蛋白质水解物;作为分散剂,合适的有:例如,木质素亚硫酸酯废液和甲基纤维素。
增粘剂,如羧甲基纤维素和粉末、颗粒或胶乳形式的天然的与合成的聚合物(如阿拉伯树胶、聚乙烯醇和聚乙酸乙烯酯)以及天然磷脂(如脑磷脂和卵磷脂)与合成磷脂,可用于制剂中。其他添加剂可以是矿物油和植物油。
可以使用着色剂,如无机色素(如氧化铁、氧化钛和普鲁士蓝)、有机染料(如茜素染料、偶氮染料和金属酞菁染料)以及微量营养素(如铁、锰、硼、铜、钴、钼和锌的盐)。
该制剂一般包含0.1-98%(重量)的活性化合物,优选0.1-90%、特别优选0.5-70%(重量)的活性化合物。
新烟碱类化合物和6-CNA的有益的逆境耐受性增强作用在一定的施用比率下尤为突出。然而,活性化合物的施用比率可在相对宽泛的范围内变动。一般来说,施用比率是每公顷1g至1600g活性化合物,优选每公顷10g至800g活性化合物,特别优选每公顷10g至600g活性化合物。
如前面所提到的,本发明的一个实施方式是可用于增强经工程化从而耐受逆境的植物的逆境耐受性和健康状况的方法,包括将有效量的含具式(I)化合物的组合物施用于植物繁殖材料,包括用于培育所述植物的种子。在种植前处理该植物繁殖材料,例如在播种前进行种子拌药。依据本发明的化合物也可通过或者用液体制剂浸渍谷粒或者用固体制剂给谷粒包衣而施用于谷粒。也可以在种植繁殖材料时(如播种期间)将组合物施用于种植场所。
因此,本发明还涉及植物的种子,该植物是经工程化从而耐受逆境,并经本发明的化合物处理过。
关于对植物繁殖材料如种子的处理,有利的施用比率为一般每100kg待处理的材料0.1-1000g、特别的是1-800g、优选是10-500g所述新烟碱类化合物之一或6-CAN。
可以依据本发明方法得到改善的作物,包括任何经工程化从而耐受逆境的植物、双子叶和单子叶种子、植物细胞,尤其是棉花、菜籽(canola)、油菜(oilseed rape)、小麦、玉米或玉蜀黍、大麦、稻、燕麦、黑麦、荞麦、小黑麦、甘蔗、大豆、向日葵、苜蓿、菜豆、亚麻、芥菜、豌豆、烟草、马铃薯、甘薯、甜菜、草坪草、高粱、小米、芸苔属蔬菜、其他蔬菜(包括洋蓟、芦笋、胡萝卜、芹菜、菊苣、黄瓜、茄子、韭菜、莴苣、甜瓜、黄秋葵、洋葱、胡椒、南瓜、萝卜、芜菁甘蓝、红花、菠菜、西葫芦(squash)、西红柿、西瓜、山药、绿皮南瓜(zucchini))、杏仁、苹果、杏、香蕉、黑莓、蓝莓、可可树、柑桔(包括葡萄柚、柠檬、橙、金橘、酸橙、橘子、桔、柚和温州蜜柑)、樱桃、椰子、蔓越莓、海枣、猕猴桃、葡萄、番石榴、奇异果、芒果、油桃、木瓜、西番莲、桃、花生、梨、凤梨、山核桃、阿月浑子、李子,覆盆子、草莓、茶树、胡桃以及用于园艺、花卉或林业的植物。
所有的植物和植物部分都可以依据本发明进行处理。植物部分应理解为指所有的地上和地下部分以及植物器官如芽、叶、花和根,可以提及的例子有叶、针叶、秆、茎、花、子实体、果实、种子、根、块茎和根茎。植物部分还包括收获的材料、无性繁殖和有性繁殖的材料,例如插条、块茎、根茎、短匐茎(offset)和种子。它们还包括植物细胞,如可以被用于或来源于依据本发明的植物细胞的转化的植物细胞。也可能将上述化合物施用于土壤上或土壤中,如种植或播种前,以达到描述的效果,如使种植后植物和从播种到处理过的土壤中的种子生长后的出苗植物的逆境耐受性得到增强。
本发明中提及的植物、植物细胞和种子以特定方式经工程化而增强了所述植物的逆境耐受性。
在本发明的一个实施方式中,外源性逆境耐受性增强基因能够降低植物细胞或植物中聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)基因的表达和/或活性,如WO 00/04173A1或EP 04077984.5(在此引作参考)所述。
聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP),也被称为聚(ADP-核糖)转移酶(ADPRT)(EC 2.4.2.30),是一种细胞核酶,存在于大局部真核生物中,包括脊椎动物、节肢动物、软体动物、粘菌、腰鞭毛虫、真菌和除了酵母以外的其他低等真核生物。在大量的植物中也发现有该酶活性(Payne等,1976;Willmitzer和Wagner,1982;Chen等,1994,O’Farrell,1995)。
PARP催化来自NAD+的ADP核糖基部分的转移(主要转移至靶蛋白中谷氨酸残基的羧基)和随后的ADP-核糖聚合。主要的靶蛋白是PARP本身,还有组蛋白、高速泳动族染色体蛋白、拓扑异构酶、内切核酸酶和DNA聚合酶也已经被证明受到这种修饰。
在具体实施方式中,逆境耐受性增强基因可包含下列操作性连接的DNA片段:
a)植物可表达启动子;
b)DNA区,其被转录时产生能够降低植物内源性PARP编码基因表达的RNA分子(PARP抑制性RNA分子)。
c)涉及转录终止和聚腺苷酸化的DNA区。
提到的DNA区可产生所谓的反义RNA分子,以转录或转录后后方式降低靶植物或植物细胞中PARP编码基因的表达,所述反义RNA分子包含至少20个或21个连续的核苷酸,它们与所述植物细胞或植物中PARP编码基因的核苷酸序列的互补物有至少95%至100%的序列同一性。
提到的DNA区还可产生所谓的有义RNA分子,以转录或转录后方式降低靶植物或植物细胞中PARP编码基因的表达,所述有义RNA分子包含至少20个或21个连续的核苷酸,它们与所述植物细胞或植物中PARP编码基因的核苷酸序列有至少95%至100%的序列同一性。
然而,PARP编码区的大约20nt的反义或有义RNA的最小核苷酸序列,可以包含更大的RNA分子中,后者的长度变化范围从20nt至等同于靶基因的大小。因此,所提及的反义或有义核酸区可以长大约从约21nt至约5000nt,如长度为21nt、40nt、50nt、100nt、200nt、300nt、500nt、1000nt、2000nt或甚至约5000nt或更长。此外,对本发明的目的来说并不要求所用的抑制性PARP RNA分子或外源基因编码区的核苷酸序列,与所述植物细胞中其表达被靶向以便降低的内源PARP基因完全相同或互补。序列越长,对总体序列同一性的要求就越不严格。因此,所述反义或有义核酸区与内源性PARP基因的核苷酸序列或其互补序列的总体序列同一性为大约40%或50%或60%或70%或80%或90%或100%。然而,所提及的反义或有义区应该包含是与内源性PARP基因核苷酸序列有约100%序列同一性的20个连续核苷酸的核苷酸序列。优选约100%序列同一性的序列段长度应该是大约50、75或100nt。
对于本发明的目的,两个相关序列的“序列同一性”(用百分比表示),是指两个最佳比对序列中具有同一残基的位点数目除以被比位点数目(x100)。空位,即序列比对中某个残基存在于一个序列但在另一个序列中不存在的位点,被认为是具有非相同残基的位点。两个序列的序列比对用Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970)进行。计算机辅助序列比对可以很方便地用标准的软件程序,例如GAP(其为Wisconsin Package Version 10.1(Genetics Computer Group,Madision,Wisconsin)的部分),使用默认打分矩阵来进行,其中空位开放罚分为50,空位扩展罚分为3。
很明显,每当RNA分子的核苷酸序列参照相应DNA分子的核苷酸序列来确定时,核苷酸序列中的胸腺嘧啶(T)应改为尿嘧啶(U)。所提及的是RNA分子还是DNA分子,根据本申请的上下文来看将是清楚的。
上述外源基因降低内源性PARP基因表达的效率可以通过包含导致异常的非聚腺苷化PARP抑制性RNA分子表达的DNA元件而得到进一步增强。一种适合该目的的该类DNA元件是编码自我剪接核酶的DNA区,如WO 00/01133A1所述。
上述外源基因降低植物细胞中内源性PARP基因表达的效率还可通过在植物细胞中同时引入本文描述的编码反义PARP抑制性RNA的外源基因和本描述的编码有义PARP抑制性RNA的外源基因而得到进一步增强,其中,反义和有义PARP抑制性RNA分子能通过在上述至少20个连续核苷酸间进行碱基配对而形成双链RNA区,如WO 99/53050A1所述。
如WO 99/53050A1中的进一步描述,能形成双链RNA区的反义和有义PARP抑制性RNA区,可以是存在于一个RNA分子中,优选被间隔区分开。该间隔区可以包含内含子序列。这样的外源基因可方便地通过以倒置重复方式操作性连接DNA片段至植物可表达启动子和参与转录终止和多聚腺苷化的3′端形成区而构建,该DNA片段包含来自分离的或经鉴定的内源性PARP基因(该基因的表达被靶向而被降低)的至少20个核苷酸。为完成这种外源基因的构建,可以使用WO 02/059294A1中描述的载体。
目前的命名是指称为PARP1蛋白(和相应的parp1基因)的典型含锌指聚合酶,而结构上非典型的PARP蛋白目前被称为PARP2蛋白(和相应的parp2基因),本文所用的PARP编码基因可以指任一种类型。
鉴别经实验证明的和推定的聚ADP-核糖聚合酶蛋白序列、其部分或同源序列的以下数据库实体(在此引作参考),可依据目前的发明来使用:BAD53855(稻(Oryza sativa));BAD52929(稻);XP_477671(稻);BAC84104(稻);AAT25850(玉蜀黍(Zea mays));AAT25849(玉蜀黍);NP_197639(拟南芥(Arabidopsis thaliana));NP_850165(拟南芥);NP_188107(拟南芥);NP 850586(拟南芥);BAB09119(拟南芥);AAD20677(拟南芥);Q11207(拟南芥);C84719(拟南芥);T51353(拟南芥);T01311(拟南芥);AAN12901(拟南芥);AAM13882(拟南芥);CAB80732(拟南芥);CAA10482(拟南芥);AAC79704(玉蜀黍):AAC19283(拟南芥);CAA10888(玉蜀黍);CAA10889(玉蜀黍);CAA88288(拟南芥)。
在本发明的特定实施方式中,降低PARP基因表达的基因可以包含下列操作性连接的DNA片段:
a)植物可表达启动子
b)DNA区,其在转录时产生RNA分子,该RNA分子包含:
a.反义核苷酸序列,其包含至少约20个连续核苷酸,所述至少20个连续核苷酸与选自以下的核苷酸序列的约20个连续核苷酸的核苷酸序列有大约96%的序列同一性:SEQ ID 1(拟南芥parp1编码区)、SEQ ID 2(拟南芥parp 2编码区)、SEQ ID 3(玉蜀黍parp1编码区)、SEQ ID 4(另一玉蜀黍parp1编码区)、SEQ ID5(玉蜀黍parp2编码区)或SEQ ID 6(棉花parp2部分cDNA)的核苷酸序列、或编码具有与上述核苷酸序列所编码氨基酸序列相似或相同序列的蛋白的核苷酸序列;
b.有义核苷酸序列,其包含与所述反义核苷酸序列互补的至少约20个连续核苷酸。因此,所述有义核苷酸序列可包含至少约20个连续核苷酸的序列,所述至少20个连续核苷酸的序列与选自以下的核苷酸序列的约20个连续核苷酸的核苷酸序列有大约96%的序列同一性:SEQ ID 1(拟南芥parp1编码区)、SEQID 2(拟南芥parp 2编码区)、SEQ ID 3(玉蜀黍parp1编码区)、SEQ ID 4(另一玉蜀黍parp1编码区)、SEQ ID 5(玉蜀黍parp2编码区)或SEQ ID 6(棉花parp2部分cDNA)的核苷酸序列、或编码具有与上述核苷酸序列所编码氨基酸序列相似或相同序列的蛋白的核苷酸序列;
藉此,所述有义和反义核苷酸序列能够形成双链RNA分子(dsRNA);
c)用于转录终止和聚腺苷酸化的DNA区。
然而,很明显,在WO00/04173或EP 04077984.5中描述的其它PARP编码基因也可使用。
很明显,本发明增强逆境耐受性的目标也可以通过将上述化合物施用于植物或植物细胞而达到,所述植物或植物细胞在其基因组中包含有变异型PARP编码基因,由此与相似植物中的PARP的表达和/或活性比较,该变异型PARP的表达和/或活性被降低,这也将导致带有该变异型PARP的植物的逆境耐受性增强。这种变异型PARP编码基因可通过例如诱变诱导,或者也可以是自然产生的PARP编码基因的等位基因,它与宿主植物增强的逆境耐受性相关。
在本发明的另一个特殊实施方式中,将上述化合物施用于含外源性逆境耐受性增强基因的植物或植物细胞,该基因能降低植物或植物细胞中ParG编码基因的表达和/或活性,如WO 2004/090140所述(在此引作参考)。
PARG(聚(ADP-核糖)糖原水解酶;E.C.3.2.1.143)通过其外切糖原水解酶和内切糖原水解酶活性(PARG)将聚(ADP-核糖)聚合物转化为游离的ADP-核糖。
在植物中,通过对拟南芥基因的时钟控制型转录和从营养生长至开花的光周期依赖性转变(tej)方面受影响的突变体中被失活的野生型基因进行基于图谱的克隆,已经鉴别出一种聚(ADP-核糖)糖原水解酶。该基因的核苷酸序列可以用登录号AF394690从核苷酸数据库获得(Panda等,2002,Dev.Cell.3,51-61;SEQ ID No 7)。
可以在WO 2004/090140A2中找到源自植物的其它植物PARG编码基因的核苷酸序列,如源自马铃薯(Solanum tuberosum)(SEQ IDNo 8)、稻(SEQ ID No 9)或玉蜀黍(SEQ ID No 10)的PARG基因,以及从其它植物中分离其他PARG编码序列和其变异体的方法。
因此,在一个实施方式中,经工程化从而耐受逆境的植物或植物细胞可包含下列操作性连接的DNA片段:
a)植物可表达启动子
b)DNA区,其在转录时产生抑制性RNA分子,该RNA分子包含:
i.反义核苷酸区,其包含至少20个连续核苷酸,所述至少20个连续核苷酸与选自以下的核苷酸序列的大约20个连续核苷酸具有大约96%的序列同一性:编码植物PARG蛋白的核苷酸序列(如SEQ ID7、SEQ ID 8、SEQ ID 9或SEQ ID 10的核苷酸序列)的互补序列、或编码具有与上述核苷酸序列所编码氨基酸序列相似或相同序列的蛋白的核苷酸序列;或
ii.有义核苷酸区,其包含至少20个连续核苷酸,所述至少20个连续核苷酸选自编码植物PARG蛋白的核苷酸序列(如SEQ ID 7、SEQ ID 8、SEQ ID 9或SEQ ID 10的核苷酸序列)、或编码具有与上述核苷酸序列所编码氨基酸序列相似或相同序列的蛋白的核苷酸序列;或
iii.如上述i)或ii)中提到的有义和反义核苷酸序列,由此所述有义和反义核苷酸序列能够形成双链RNA分子;
c)参与转录终止和聚腺苷酸化的DNA区。
技术人员会立即明白,有义和反义核苷酸序列或dsRNA分子长度以及ParG抑制性RNA分子的序列同一性的额外参数,可以如同上文关于PARP抑制性RNA分子所述来应用。
在本发明的再一个实施方式中,外源性逆境耐受性增强基因可包含下列操作性连接的DNA片段:
a)植物可表达启动子
b)编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成途径中的植物功能性酶的DNA区,这些酶选自烟酰胺酶、烟酸磷酸核糖基转移酶、烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶(nicotinic acid mononucleotide adenyl transferase)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶;和
c)参与转录终止和聚腺苷化的3’末端区,参见EP 04077624.7中的描述(在此引作参考)。
本文所用的“烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成途径中的植物功能性酶”是这样一种酶,当其与合适的控制元件(如植物可表达启动子和终止区)连接而导入植物时,可被转录并翻译从而产生在植物细胞中有功能的NAD拯救合成途径的酶。包括得自植物来源的NAD补救合成途径的酶(以及编码基因),也包括得自酵母(酿酒酵母(Saccharomycescereviseae))或其它酵母或真菌的这些酶。认为后几种蛋白可能甚至更适合用于依据本发明的方法中,因为这些蛋白不太可能经受相似的植物源性酶所可能经受的酶反馈调节等。
参与NAD补救合成途径的酶包括以下酶:
-烟酰胺酶(EC 3.5.1.19),其催化烟酰胺的酰胺基团水解,由此释放出烟酸和NH3。该酶也被称为烟酰胺脱氨酶、烟酰胺酰胺酶、YND酶或烟酰胺酰胺水解酶。
-烟酸磷酸核糖基转移酶(EC 2.4.2.11),也被称为烟酸核糖核苷酸酶、烟酸单核苷酸糖原水解酶、烟酸单核苷酸焦磷酸化酶、烟酸磷酸核糖基转移酶,其催化下述反应
烟酸-D-核糖核苷酸+二磷酸=烟酸+5-磷酸-α-D-核糖-1-焦磷酸
-烟酸核苷酸腺苷酰转移酶(EC 2.7.7.18),也被称为脱酰胺-NAD+焦磷酸化酶、烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶、脱酰胺烟酰胺腺嘌呤二核苷酸焦磷酸化酶、NaMT-ATase、烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶,其催化下述反应
ATP+烟酸核糖核苷酸=二磷酸+脱酰胺-NAD+
-NAD-合成酶(EC 6.3.1.5),也被称为NAD合成酶、NAD+合成酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶、二磷酸吡啶核苷酸合成酶,其催化下述反应
脱酰胺-NAD++ATP+NH3=AMP+二磷酸+NAD+
在本发明的一个实施方式中,编码NAD补救合成途径的植物功能性酶的DNA区可包含来自SEQ ID No 11、12、13、14或15的核苷酸序列,或者编码具有与上述核苷酸序列所编码氨基酸序列相似或相同序列的蛋白质的核苷酸序列。
如Hunt等2004所描述的,已经鉴别出这些酶的植物同源物,这些DNA序列可用于类似的效应(Hunt等,2004,New Phytologist163(1):31-44)。所鉴别出的DNA序列有下列登录号:烟酰胺酶:At5g23220(SEQ ID No 16)、At5g23230(SEQ ID No 17)和At3g16190(SEQ ID No 18);烟酸磷酸核糖基转移酶:At4g36940(SEQ ID No 19)、At2g23420(SEQ ID No 20);烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶:At5g55810(SEQ ID No 21);以及NAD合成酶:At1g55090(SEQ ID No 22)。
然而,很明显,经工程化从而耐受逆境的植物也可以包含这些核苷酸序列的变异体,包括其插入、缺失和取代。同样地,可以使用来自不同于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisea)的物种的上述核苷酸序列的同源物。它们包括但不仅限于来自植物的核苷酸序列、编码具相同氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列、以及这些核苷酸序列的变异体。
所述核苷酸序列的变异体与已鉴别的编码NAD补救途径的酶的核苷酸序列(如序列表中所鉴别的序列)有序列同一性,优选至少约80%或85或90%或95%的序列同一性。优选这些变异体将编码与NAD补救合成途径的酶有相同酶活性的功能性蛋白。
本发明的方法可以用于提高植物或植物细胞对不同种类的胁迫诱导条件的逆境耐受性,所述胁迫诱导条件尤其是非生物胁迫条件,包括淹没、高光照条件、高紫外线辐射水平、增加的过氧化氢水平、干旱条件、高温或低温、增加的盐度条件、以及除草剂、农药、杀虫剂的施用等等。本发明的方法还可以用于降低在不利条件下生长的植物的细胞中活性氧水平(ROS),或提高细胞中NAD+、NADH+或ATP的水平,所述不利条件尤其是非生物胁迫条件,包括淹没、高光照条件、高紫外线辐射水平、增加的过氧化氢水平、干旱条件、高温或低温、增加的盐度条件等等。ROS水平或NADH水平可用本领域技术人员已知的方法,包括在实施例中描述的那些方法来测定。植物逆境耐受性的增强也可用测定线粒体电子流的方法进行分析,如WO97/06267或WO02/066972中描述的。
尽管无意限制本发明的具体作用模式,但是预期新烟碱类(尤其是包含氯吡啶侧链的新烟碱类化合物)的代谢产物进入NAD补救途径,并导致较高的NAD水平。从这个角度来说,预期将这类化合物施用于经工程化从而抗逆境的植物不会产生任何效应,因为在胁迫条件下,这类植物细胞中的NAD水平已显著性高于未经工程化从而抗逆境的植物细胞。
本发明的通过对植物或植物细胞施用新烟碱类化合物以提高逆境抗性的方法,可以适用于任何经工程化从而抗逆境的植物,即双子叶和单子叶植物细胞和植物,包括但不限于:棉花、芸苔属蔬菜、油菜、小麦、玉米或玉蜀黍、大麦、向日葵、稻、燕麦、甘蔗、大豆、蔬菜(包括菊苣、莴苣、番茄)、烟草、马铃薯、甜菜、木瓜、菠萝、芒果、拟南芥,以及用于园艺、花卉或林业的植物,谷类植物,包括小麦、燕麦、大麦、黑麦、水稻、草坪草、高粱、小米或甘蔗植物。本发明的方法还可以于任何植物,包括但不限于:棉花、烟草、油菜籽(canola)、欧洲油菜(rape)、大豆、蔬菜、马铃薯、浮萍属植物(Lemnaspp.)、烟草属植物(Nicotiana spp.)、甘薯、拟南芥、苜蓿、大麦、菜豆、玉米、棉花、亚麻、豌豆、油菜、水稻、黑麦、红花、高粱、大豆、向日葵、烟草、小麦、芦笋、甜菜、青花椰菜、甘蓝、胡萝卜、花椰菜、芹菜、黄瓜、茄子、莴苣、洋葱、油菜(oilseed rape)、胡椒、马铃薯、南瓜、萝卜、菠菜、西葫芦、西红柿、绿皮南瓜、杏仁、苹果、杏、香蕉、黑莓、蓝莓、可可树、樱桃、椰子、蔓越莓、海枣、葡萄、葡萄柚、番石榴、奇异果、柠檬、酸橙、芒果、甜瓜、油桃、橙、木瓜、西番莲、桃、花生、梨、凤梨、阿月浑子、李子、覆盆子、草莓、柑橘、山核桃和西瓜。
本文所用的“包含”或“包括”应被解释为限定所述特征、整数、步骤或组分的存在,但并不排除一个或多个特征、整数、步骤或组分或它们的群体的存在或添加。因此,例如,包含核苷酸序列或者氨基酸序列的核酸或蛋白质,可以包含比实际记载的的更多的核苷酸或者氨基酸,即嵌入更大的核酸或蛋白质中。包含功能上或结构上限定的DNA区的外源基因,可以包含额外的DNA区等。
除非在实施例中另有说明,否则所有重组DNA技术依照,如下列文献中描述的标准程序进行:Sambrook等(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY和Ausubel等(1994)Current Protocols in Molecular Biology,第一卷和第二卷,Current Protocols,USA。用于植物分子研究的标准材料和方法在下列文献中有描述:Plant Molecular Biology Labfax(1993)R.D.D.Croy,由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell ScientificPublications,UK联合出版。标准分子生物学技术的其它参考文献包括:Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY;Brown(1998)Molecular Biology LabFax,第二版,第一卷和第二卷,Academic Press(UK)。聚合酶链式反应的标准材料和方法可以在下列文献中找到:Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR Primer:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press;McPherson等,(2000)PCR-Basics:From Background to Bench,第一版,Springer Verlag,Germany。
在整个说明书和实施例中,提及下列序列:
SEQ ID No.1:拟南芥的parp1编码区。
SEQ ID No.2:拟南芥的parp2编码区。
SEQ ID No.3:玉蜀黍的parp1编码区1。
SEQ ID No.4:玉蜀黍的parp1编码区2。
SEQ ID No.5:玉蜀黍的parp2编码区。
SEQ ID No.6:棉花的parp2部分编码区。
SEQ ID No.7:拟南芥的parG编码区。
SEQ ID No.8:马铃薯(Solarium tuberosum)的parG编码区。
SEQ ID No.9:稻(Oryza sativa)的parG编码区。
SEQ ID No.10:玉蜀黍的parG编码区。
SEQ ID No.11:酿酒酵母的烟酰胺酶(PNC1)的核苷酸序列。
SEQ ID No.12:酿酒酵母的烟酸磷酸核糖基转移酶(NPT1)的核苷酸序列(互补)。
SEQ ID No.13:酿酒酵母的烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶1(NMA1)的核苷酸序列。
SEQ ID No.14:酿酒酵母的烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶2(NMA2)的核苷酸序列。
SEQ ID No.15:酿酒酵母的NAD合成酶(QNS1)的核苷酸序列。
SEQ ID No.16:拟南芥烟酰胺酶(同种型(isoform)1)的核苷酸序列。
SEQ ID No.17:拟南芥烟酰胺酶(同种型2)的核苷酸序列。
SEQ ID No.18:拟南芥烟酰胺酶(同种型3)的核苷酸序列。
SEQ ID No.19:拟南芥烟酸磷酸核糖基转移酶(同种型1)的核苷酸序列。
SEQ ID No.20:拟南芥烟酸磷酸核糖基转移酶(同种型2)的核苷酸序列。
SEQ ID No.21:拟南芥烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶的核苷酸序列。
SEQ ID No.22:拟南芥NAD合成酶的核苷酸序列。
实施例
实施例1;测量NADH含量和超氧化物含量的程序
用水溶性四氮鎓盐进行胞内NAD(P)H定量
参考文献:Jun Nakamura,Shoji Asakura,Susan D.Hester,Gilbertde Murcia,Keith W.Caldecott和James A.Swenberg(2003):Quantitationof intracellular NAD(P)H can monitor an imbalance of DNA single strandbreak repair in base excision repair deficient cells in real time(对胞内NAD(P)H)的定量测定可以实时监测碱基切除修复缺陷型细胞中的DNA单链断裂修复的失衡).Nucleic Acids Research 31(17),e104。
植物材料
大多数植物材料都可以被使用,例如,体外生长的14-18日龄但未开花的拟南芥苗,或油菜(oilseed rape)的下胚轴外植体。
细胞计数试剂盒-8(CCK-8)
Sopachem n.v./Belgium,72A,Avenue du Laarbeeklaan,1090
Brussels,Belgium内容物
5mL瓶,内含5mMol/L WST-8(四氮鎓盐),0.2mMol/L1-Methoxy PMS,15mMol/L氯化钠;
反应液:10mL 25mM磷酸钾缓冲液pH7.4;0.5mL CCK-8;0.1mM甲基硫酸1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓(=甲基硫酸1-甲氧基吩嗪):1μL/mL 100mM贮存液(MW=336.4;100mg,于2.973mL水中);1滴吐温20/25mL。
操作程序
收获植物材料并放入25mM磷酸钾缓冲液pH7.4中(如,150个油菜下胚轴外植体或1克拟南芥苗(无根))。用反应液替换缓冲液(1克拟南芥苗15mL,或150个油菜下胚轴外植体15mL)。黑暗中于26℃温育约1/2小时(后续反应(follow reaction))。测量反应液在450nm的吸光度。
通过定量XTT的还原来测量超氧化物产量
参考文献:De Block,M.,De Brouwer,D.(2002),A simple androbust in vitro assay to quantify the vigour of oilseed rape lines andhybrids(量化油菜系和杂交种活力的一种简单而强有力的体外测定法),Plant Physiol.Biochem.40,845-852
A.欧洲油菜(Brassica napus)
培养基和反应缓冲液
播种培养基(培养基201):半浓缩的Murashige和Skoog盐;2%蔗糖,pH 5.8;0.6%琼脂(Difco Bacto Agar);250mg/l triacillin。
愈伤组织诱导培养基A2S3:MS培养基,0.5g/l Mes(pH 5.8),3%蔗糖,40mg/l腺嘌呤-SO4,0.5%琼脂,1mg/l 2,4-D,0.25mg/l NAA,1mg/l BAP,250mg/l triacillin。
反应缓冲液:25mM磷酸钾缓冲液pH 8;1mM3′-{1-[苯氨基羰基]-3,4-四唑鎓)-二(4-甲氧基-6-硝基)钠=XTT(BioVectra,Canada)(MW 674.53)。小心加热溶液(±37℃)以溶解XTT(在使用前冷却至室温)。25mL缓冲液加入1滴吐温20。
种子消毒-种子预萌发-籽苗生长
将种子在70%乙醇中浸泡2分钟,随后在含0.1%吐温20的次氯酸钠溶液(具有约6%活性氯)中进行表面消毒15分钟。最后,用1升无菌自来水漂洗种子。让种子在无菌自来水中温育至少1小时(以让可能抑制发芽的组分从种子中扩散出)。将种子放入含有50ml无菌自来水(+250mg/l triacillin)的250mL锥形烧瓶中。振荡约20小时。将有胚根伸出的种子从Duchefa放入含有约125mL播种培养基的VitroVent容器中(10种子/容器,不要太多,以便降低污染所致的种子损失)。种子在±24℃、10-30μEinstein s-1W-2和16小时日照的条件下进行萌发。为了计算必须播种的种子数目:5个下胚轴节段/籽苗。
下胚轴外植体的预培养及逆境的诱导
在播种后12-14天,将下胚轴切割成7-10mm的节段。下胚轴外植体(2个下胚轴/Optilux培养皿,Falcon S1005,Denmark)在培养基A2S3上于25℃培养5天(在10-30μEinstein s-1m-2)。每种条件使用150个下胚轴外植体。
逆境的诱导
将下胚轴外植体转移至分别含有0、25和50mg/l乙酰水杨酸的A2S3培养基。在25℃、10-30μEinstein s-1W-2和16小时日照的条件下培养24小时。
XTT测定
将150个下胚轴外植体转移至一个50ml Falcon试管中。用反应液(不含XTT)清洗。加入20mL反应缓冲液+XTT。必须将外植体淹没,但不能真空渗透。在黑暗中于26℃培养。在反应后,测量反应培养基在470nm的吸光度。
B.拟南芥(Arabidopsis thalina)
培养基和反应缓冲液
植株培养基:半浓缩的Murashige和Skoog盐;维生素B5;1.5%蔗糖,pH 5.8;0.7%Difco琼脂。
温育培养基:1/2浓缩MS盐;1%蔗糖;0.5g/l MES pH 5.8;25mL培养基加入1滴吐温20。
反应缓冲液:25mM磷酸钾缓冲液pH 8;1mM 3′-{1-[苯氨基羰基]-3,4-四唑鎓)-二(4-甲氧基-6-硝基)钠=XTT(BioVectra,Canada)(MW 674.53)。小心加热溶液(±37℃)以溶解XTT(在使用前冷却至室温)。25mL缓冲液加入1滴吐温20。
拟南芥属(Arabidopsis)植物
拟南芥属品系:对照系(受试系所来源的母系);受试系。
拟南芥属种子的消毒:2分钟,70%乙醇;10分钟,漂白水(6%活性氯)+每20mL溶液1滴吐温20;用无菌自来水清洗5次;在2mLeppendorf管内进行消毒。拟南芥属种子下沉至管底部,允许用1mLpipetman(移液器)除去液体。
种子预萌发:在含12mL无菌自来水的9cm Optilux培养皿(Falcon)中进行。弱光通宵至24小时。
拟南芥属植物的培养:将种子播在含±125mL植株培养基的Falcon Intergrid Tissue Culture盘(nr.3025):1粒种子/格。植物在24℃、30μEinstein s-1W2、16小时光照-8小时黑暗的条件下生长约18天(在抽苔前)。进行测定时需要每种条件每品系1g植物材料(无根的苗)。1g苗对应40-60棵植株。
逆境诱导
百草枯(Paraquat):收获拟南芥属苗(不带根)。将1g苗放入分别含有0、5、10μM百草枯的温育培养基中(必须将苗淹没,但不能真空渗透)。温育培养基:±150mL Falcon Intergrid Tissue Culture盘(nr.3025)。在24℃黑暗中、10-30μEinstein s-1W2和16小时日照的条件下培育±24小时。
光照:将一半的平板移至强光照(250μEinstein s-1W2)下,培育4至20小时。
XXT测定
从琼脂平板(强光照逆境)或从液体温育培养基收获苗(不带根),将其置入含反应缓冲液(不含XTT)的50ml Falcon试管中。用含XTT的缓冲液(15mL/g)置换反应缓冲液。必须将苗淹没,但不能真空渗透。在黑暗中于26℃培养。在反应后,测量反应培养基在470nm的吸光度(大约1小时)。
实施例2:在对包含增强逆境耐受性的转基因的植株施用新烟碱类化合物后的逆境耐受性分析
用不同浓度的吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、吡虫清、烯虫灵、呋虫胺、6-氯烟酸和噻虫啉,处理如WO 00/04173A1所述的(例如,在实施例8中)包含转基因的芸苔属(Brassica)植株,并使其经受各种逆境条件,特别是高低温、高光强或干旱胁迫或它们的任何组合,所述转基因编码能降低内源性PARP基因的双链RNA分子。
在处理后,目测记录所述植株的存活和损害,并与下列植株比较:未经处理的转基因对照植株,和用上述化合物以类似方式处理的非转基因同基因植株。测定活性氧物质、NAD和ATP的水平,并与对照植株比较。
经所述化合物处理的转基因芸苔属植株可比未经处理的转基因对照植株更好地经受住逆境条件。与在未经处理的转基因芸苔属植株中的情况相比,在经处理的转基因芸苔属植株中ROS水平较低,而其NAD或ATP水平较高。
用不同浓度的吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、吡虫清、烯虫灵、呋虫胺、6-氯烟酸和噻虫啉,处理如WO 00/04173A1所述的包含转基因的玉米植株,并让其经受各种逆境条件,特别是高低温、高光强或干旱胁迫或它们的任何组合,其中所述转基因编码能降低内源性PARP基因的双链RNA分子。
在处理后,目测记录植株的存活和损害,并与下列植株比较:未经处理的转基因对照植株,和用上述化合物以类似方式处理的非转基因同基因植株。测定活性氧化物种类、NAD和ATP的水平,并与对照植株比较。
经所述化合物处理的转基因玉米植株可比未经处理的转基因对照植株更好地经受住逆境条件。与在未经处理的转基因玉米植株中的情况相比,在经处理的转基因玉米植株中ROS水平较低,而其NAD或ATP水平较高。
用不同浓度的吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、吡虫清、烯虫灵、呋虫胺、6-氯烟酸和噻虫啉,处理如EP 04077984.5所述的包含转基因的棉花植株,并使其经受各种逆境条件,特别是高低温、高光强或干旱胁迫或它们的任何组合,其中所述转基因编码能降低内源性PARP基因的双链RNA分子。
在处理后,目测记录植株的存活和损害,并与下列植株比较:未经处理的转基因对照植株,和用上述化合物以类似方式处理的非转基因同基因植株。测定活性氧物质、NAD和ATP的水平,并与对照植株比较。
经所述化合物处理的转基因棉花植株可比未经处理的转基因对照植株更好地经受住逆境条件。与在未经处理的转基因棉花植株中的情况相比,在经处理的转基因棉花植株中ROS水平较低,而其NAD或ATP水平较高。
用不同浓度的吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、吡虫清、烯虫灵、呋虫胺、6-氯烟酸和噻虫啉,处理如WO2004/090140所述的包含转基因的芸苔属或水稻植株,并使其经受各种逆境条件,特别是高低温、高光强或干旱胁迫或它们的任何组合,其中所述转基因编码能降低内源性PARG基因的双链RNA分子。
在处理后,目测记录植株的存活和损害,并与下列植株比较:未经处理的转基因对照植株,和用上述化合物以类似方式处理的非转基因同基因植株。测定活性氧物质、NAD和ATP的水平,并与对照植株比较。
经所述化合物处理的转基因芸苔属或水稻植株可比未经处理的转基因对照植株更好地经受住逆境条件。与在未经处理的转基因芸苔属或水稻植株中的情况相比,在经处理的转基因芸苔属或水稻植株中ROS水平较低,而其NAD或ATP水平较高。
用不同浓度的吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、吡虫清、烯虫灵、呋虫胺、6-氯烟酸和噻虫啉,处理如EP0477624.7所述的包含转基因的拟南芥属植株,并且使其经受各种逆境条件,特别是高低温、高光强或干旱胁迫或它们的任何组合,其中所述转基因编码参与NAD拯救途径的植物功能性酶。
在处理后,目测记录植株的存活和和损害,并与下列植株比较:未经处理的转基因对照植株,和用上述化合物以类似方式处理的非转基因同基因植株。测定活性氧物质、NAD和ATP的水平,并与对照植株比较。
经所述化合物处理的转基因拟南芥属植株可比未经处理的转基因对照植株更好地经受住逆境条件。与在未经处理的转基因拟南芥属植株中的情况相比,在经处理的转基因拟南芥属植株中ROS水平较低,而其NAD或ATP水平较高。
序列表
<110>Bayer CropScience AG
<120>通过对经工程化而耐受逆境的植物施用新烟碱类化合物增强其逆境耐受性
<130>BCS 04-3083
<160>22
<170>PatentIn version 3.0
<210>1
<211>3187
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Arabidopsis thaliana的parp1编码区
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(2962)
<223>可读框
<400>1
taccggagaa atggcaagcc cacataagcc gtggagggcg gagtatgcaa agtcgtcgag 60
gtcttcatgt aaaacttgca agtccgtcat taacaaggag aactttcgtc ttggaaagtt 120
ggttcaatct actcacttcg atggcatcat gcccatgtgg aaccatgctt cttgtatact 180
gaagaagacg aagcagataa aatcagttga tgatgttgaa ggcatagaat cacttcgttg 240
ggaagatcag caaaagatta gaaaatatgt cgaatctgga gcagggagta acacaagcac 300
aagcacaggc acaagcacga gcagtaccgc taataatgcc aaactagaat atgggattga 360
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ggtacgtata ttctccaagc ctgaaggccc gggtaacaaa ggtttgatgt ggcatcacgc 480
taaatgtttc cttgaaatgt cttcctctac tgaactggaa agtttgtctg gatggagaag 540
tataccagac tcagaccaag aagctcttct tcccttagtg aagaaagctc tgccggcagc 600
caaaactgag acagcagaag cacgtcaaac aaattcaaga gcaggcacaa aacgaaaaaa 660
tgattctgtt gataacgaga agtcgaaact agcaaaaagt agttttgaca tgtctacaag 720
tggtgcttta caaccttgta gcaaagaaaa ggaaatggag gcccaaacta aggaattgtg 780
ggacctgaag gatgatctga aaaaatatgt aacatcagct gagttgcggg aaatgcttga 840
agtaaatgaa caaagtacaa gaggatctga acttgatctg cgtgataaat gtgctgatgg 900
catgatgttt ggcccactcg ctctctgccc aatgtgctct gggcatcttt ctttctccgg 960
aggactttac cgatgccatg gatacatctc agaatggagc aaatgttctc attccacttt 1020
ggatccagac cgcatcaaag ggaagtggaa aatccctgac gaaacagaaa atcaattcct 1080
tctgaagtgg aataagtctc aaaagagtgt gaagccaaaa cgtattctgc gtcctgtatt 1140
gtctggcgag acatctcagg gtcaaggttc taaagatgca actgactcct caaggagtga 1200
aaggctagca gatcttaaag tttcaattgc tggaaatact aaggaaaggc aaccatggaa 1260
gaagagaatt gaggaagctg gtgcagagtt tcatgctaat gttaaaaaag gtacaagctg 1320
tttggttgtt tgtggactga cagatatcag agacgctgaa atgagaaagg caaggaggat 1380
gaaagtggca atcgtgagag aggattattt ggttgattgt tttaaaaaac agaggaaact 1440
tccatttgac aagtacaaaa ttgaagacac tagtgagagc cttgtcactg ttaaagtaaa 1500
aggacgaagc gctgtgcatg aagcgtctgg cctccaagag cactgtcaca ttcttgaaga 1560
tgggaacagt atctataaca caactctgag catgtctgat ctctctaccg gtatcaatag 1620
ttattacata ctccagataa tccaagaaga taaaggttca gattgttacg tatttcgtaa 1680
atggggccga gttggaaatg aaaagattgg tggtaacaaa gtggaggaaa tgtcaaagtc 1740
tgatgcggtt cacgaattca aacgtctatt tcttgaaaaa accggaaaca catgggaatc 1800
ttgggaacaa aaaacgaatt tccagaaaca acctggaaaa tttctcccgt tggacattga 1860
ttatggagtt aataagcaag tagccaaaaa agagccattt cagaccagta gcaaccttgc 1920
tccatcatta atagaattga tgaagatgct ttttgatgtg gaaacttaca gatctgcaat 1980
gatggagttc gagataaata tgtcagagat gccacttggg aagctcagca aacataatat 2040
acagaagggt tttgaggcat tgacggagat acagaggcta ttgactgaaa gcgaccccca 2100
gcctactatg aaagaaagct tgcttgttga tgctagtaac agatttttta ccatgatccc 2160
ttctattcat cctcatatta tccgagatga agatgacttt aagtcaaagg tgaaaatgct 2220
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cgaatctctt gatgataagt ataagaagct gcattgcgat atctcaccac ttcctcatga 2340
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gggagaaata catgagctaa caaaagctaa gtatatggat aaacctccga gagggaaaca 2760
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gtacaatgag tatatcgtct acgatacagc ccaggtgaag ttgcagttct tgttgaaagt 2940
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tggttttaaa agagcgtact ctacattttg ttatgctttt tctcagtaat gacacttctt 3180
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<212>DNA
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<220>
<223>Arabidopsis thaliana的parp2编码区
<220>
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<222>(129)..(2042)
<223>可读框
<400>2
attgatgaag aagaaaacga agaagaagac tcttcaaatg ctcgcgcgaa ctcacttctg 60
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atgaatcgaa caaattgatt gcaattggcg aatttcgtgg gatgattgtg aaggaattgc 360
gtgaggaagc tattaagaga ggcttagata caacaggaac caaaaaggat cttcttgaga 420
ggctttgcaa tgatgctaat aacgtttcca atgcaccagt caaatccagt aatgggacag 480
atgaagctga agatgacaac aatggctttg aagaagaaaa gaaagaagag aaaatcgtaa 540
ccgcgacaaa gaagggtgca gcggtgctag atcagtggat tcctgatgag ataaagagtc 600
agtaccatgt tctacaaagg ggtgatgatg tttatgatgc tatcttaaat cagacaaatg 660
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catacatggt ttacactaga tggggaagag ttggtgtgaa aggacaaagt aagctagatg 780
ggccttatga ctcatgggat cgtgcgatag agatatttac caataagttc aatgacaaga 840
caaagaatta ttggtctgac agaaaggagt ttatcccaca tcccaagtcc tatacatggc 900
tcgaaatgga ttacggaaaa gaggaaaatg attcaccggt caataatgat attccgagtt 960
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cgaagaacag gatgctactc tggcacggtt cacgtctcac taactgggct ggtattttat 1620
ctcaaggtct gcgaatagct cctcctgaag cgcctgtaac tggttacatg tttggaaaag 1680
gggtttactt tgcggatatg ttctccaaga gtgcgaacta ttgctatgcc aacactggcg 1740
ctaatgatgg cgttctgctc ctctgcgagg ttgctttggg agacatgaat gaacttctgt 1800
attcagatta taacgcggat aatctacccc cgggaaagct aagcacaaaa ggtgtgggga 1860
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<220>
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acctacctga atacgtcatc cctaagtgtt ccgcttcctc tgtcgtccgg cctccaactc 60
catcgaaggg gctagggaga ggagggaacc cgaaccacag caggccggcg caatggcggc 120
gccgccaaag gcgtggaagg cggagtatgc caagtctggg cgggcctcgt gcaagtcatg 180
ccggtcccct atcgccaagg accagctccg tcttggcaag atggttcagg cgtcacagtt 240
cgacggcttc atgccgatgt ggaaccatgc cagcgttgac gatgttgaag ggatagatgc 300
acttagatgg gatgatcaag agaagatacg aaactacgtt gggagtgcct cagctggtac 360
aagttctaca gctgctcctc ctgagaaatg tacaattgag attgctccat ctgcccgtac 420
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caaatctcaa aaggttaaga aaccagagag ggttcttcca ccaatgtcac ctgagaaatc 1200
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tgctggtgcc aacttctatg ccagggttgt caaagatatt gattgtttaa ttgcatgtgg 1380
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ctatgtactc cagatcattg aacaggatga tgggtctgag tgctacgtat ttcgtaagtg 1740
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atactgttat gtggatagga ataatcctgt aggtttgatg cttctttctg aggttgcttt 2760
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ttcgaccaag ggattaggca aaaccgtgcc actggagtca gagtttgtga agtggaggga 2880
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gtacaatgag tacatcgtct acaacacatc ccaggtgaag atgcagttct tgctgaaggt 3000
gcgtttccat cacaagaggt agctgggaga ctaggcaagt agagttggaa ggtagagaag 3060
cagagttagg cgatgcctct tttggtatta ttagtaagcc tggcatgtat ttatgggtgc 3120
tcgcgcttga tccattttgg taagtgttgc ttgggcatca gcgcgaatag caccaatcac 3180
acacttttac ctaatgacgt tttactgtat a 3211
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<211>3212
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Zea mays的parp1编码区2
<220>
<221>misc_feature
<222>(81)..(3020)
<223>可读框
<400>4
gcttcctctg tcgtccggcc tccaactcca tcgaaggggc tagggagagg agggaacccg 60
aaccacagca ggccggcgca atggcggcgc cgccaaaggc gtggaaggcg gagtatgcca 120
agtctgggcg ggcctcgtgc aagtcatgcc ggtcccctat cgccaaggac cagctccgtc 180
ttggcaagat ggttcaggcg tcacagttcg acggcttcat gccgatgtgg aaccatgcca 240
ggtgcatctt cagcaagaag aaccagataa aatccgttga cgatgttgaa gggatagatg 300
cacttagatg ggatgatcaa gagaagatac gaaactacgt tgggagtgcc tcagctggta 360
caagttctac agctgctcct cctgagaaat gtacaattga gattgctcca tctgcccgta 420
cttcatgtag acgatgcagt gaaaagatta caaaaggatc ggtccgtctt tcagctaagc 480
ttgagagtga aggtcccaag ggtataccat ggtatcatgc caactgtttc tttgaggtat 540
ccccgtctgc aactgttgag aagttctcag gctgggatac tttgtccgat gaggataaga 600
gaaccatgct cgatcttgtt aaaaaagatg ttggcaacaa tgaacaaaat aagggttcca 660
agcgcaagaa aagtgaaaat gatattgata gctacaaatc cgccaggtta gatgaaagta 720
catctgaagg tacagtgcga aacaaagggc aacttgtaga cccacgtggt tccaatacta 780
gttcagctga tatccaacta aagcttaagg agcaaagtga cacactttgg aagttaaagg 840
atggacttaa gactcatgta tcggctgctg aattaaggga tatgcttgag gctaatgggc 900
aggatacatc aggaccagaa aggcacctat tggatcgctg tgcggatgga atgatatttg 960
gagcgctggg tccttgccca gtctgtgcta atggcatgta ctattataat ggtcagtacc 1020
aatgcagtgg taatgtgtca gagtggtcca agtgtacata ctctgccaca gaacctgtcc 1080
gcgttaagaa gaagtggcaa attccacatg gaacaaagaa tgattacctt atgaagtggt 1140
tcaaatctca aaaggttaag aaaccagaga gggttcttcc accaatgtca cctgagaaat 1200
ctggaagtaa agcaactcag agaacatcat tgctgtcttc taaagggttg gataaattaa 1260
ggttttctgt tgtaggacaa tcaaaagaag cagcaaatga gtggattgag aagctcaaac 1320
ttgctggtgc caacttctat gccagggttg tcaaagatat tgattgttta attgcatgtg 1380
gtgagctcga caatgaaaat gctgaagtca ggaaagcaag gaggctgaag ataccaattg 1440
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ggggacgggt tgggagtgag aaaattggag ggcaaaaact ggaggagatg tcaaaaactg 1800
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ctcaattgct agaactcatg aagatgcttt tcaatgtgga gacatataga gctgctatga 2040
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cactggctgt tagagaaagc ttaattgttg ctgcgagcaa tcgctttttc actcttatcc 2220
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atagtgaaga ttacaagtta attgagcagt atctcctcaa cacacatgct cctactcaca 2460
aggactggtc gctggaactg gaggaagttt tttcacttga tcgagatgga gaacttaata 2520
agtactcaag atataaaaat aatctgcata acaagatgct attatggcac ggttcaaggt 2580
tgacgaattt tgtgggaatt cttagtcaag ggctaagaat tgcacctcct gaggcacctg 2640
ttactggcta tatgttcggc aaaggcctct actttgcaga tctagtaagc aagagcgcac 2700
aatactgtta tgtggatagg aataatcctg taggtttgat gcttctttct gaggttgctt 2760
taggagacat gtatgaacta aagaaagcca cgtccatgga caaacctcca agagggaagc 2820
attcgaccaa gggattaggc aaaaccgtgc cactggagtc agagtttgtg aagtggaggg 2880
atgatgtcgt agttccctgc ggcaagccgg tgccatcatc aattaggagc tctgaactca 2940
tgtacaatga gtacatcgtc tacaacacat cccaggtgaa gatgcagttc ttgctgaagg 3000
tgcgtttcca tcacaagagg tagctgggag actaggcaag tagagttgga aggtagagaa 3060
gcagagttag gcgatgcctc ttttggtatt attagtaagc ctggcatgta tttatgggtg 3120
ctcgcgcttg atccattttg gtaagtgttg cttgggcatc agcgcgaata gcaccaatca 3180
cacactttta cctaatgacg ttttactgta ta 3212
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<220>
<223>Zea mays的parp2编码区
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acgggtggcg gacgtccgcg cggagcttca gcgccgcggc ctcgatgtat ccggcaccaa 180
gcctgctctc gtgcggaggc tggacgccgc aatttgcgag gcggagaagg ccgtggtggc 240
tgctgcgcca accagtgtgg caaatgggta tgacgtagcc gtagatggca aaaggaactg 300
cgggaataat aagaggaaaa ggtccgggga tgggggtgaa gagggaaacg gcgatacgtg 360
tacagatgtg acaaaactag agggcatgag ctatcgtgag ctgcagggat tggccaaggc 420
acgtggagtt gcggcaaatg ggggcaagaa agatgttatc cagaggttgc tctcggcgac 480
tgctggtcct gctgcagttg cagatggtgg tcctctgggc gccaaggaag tcataaaagg 540
tggtgatgag gaggttgagg tgaaaaagga gaagatggtt actgccacga agaagggagc 600
tgcagtgctg gatcagcaca ttcccgatca cataaaagtg aactatcatg tcttgcaagt 660
gggcgatgaa atctatgatg ccaccttgaa ccagactaat gttggagaca acaacaataa 720
gttctatatc attcaagttt tagaatctga tgctggtgga agctttatgg tttacaatag 780
atggggaaga gttggggtac gaggtcaaga taaactacat ggtccctccc caacacgaga 840
ccaagcaata tatgaatttg aggggaagtt ccacaacaaa accaataatc attggtctga 900
tcgcaagaac ttcaaatgtt atgcaaagaa atacacttgg cttgaaatgg attatggtga 960
aactgagaaa gaaatagaga aaggttccat tactgatcag ataaaagaga caaaacttga 1020
aactagaatt gcgcagttca tatccctgat ctgcaatatt agcatgatga agcaaagaat 1080
ggtggaaata ggttataatg ctgaaaagct tccccttgga aagctaagga aagctacaat 1140
acttaagggt tatcatgttt tgaaaaggat atccgatgtt atttcaaagg cggacaggag 1200
acatcttgag caattgactg gggaattcta caccgtgatt cctcatgact ttggtttcag 1260
aaagatgcgt gaatttatta tcgatactcc tcagaaacta aaagctaagc tggagatggt 1320
tgaagccctt ggtgagattg aaattgcaac taaacttttg gaggatgatt caagtgacca 1380
ggatgatccg ttgtatgctc gatacaagca acttcattgt gatttcacac ctcttgaagc 1440
tgattcagat gagtactcta tgataaaatc atatttgaga aatacacatg gaaaaacaca 1500
ctctggttat acggtggaca tagtgcaaat atttaaggtt tcaaggcatg gtgaaacaga 1560
gcgatttcaa aaatttgcta gtacaagaaa taggatgctt ttgtggcatg gttctcggtt 1620
gagcaactgg gctgggatcc tttctcaggg tctgcgaatc gctcctcctg aagcacctgt 1680
tactggttac atgtttggca agggtgttta ctttgctgac atgttttcaa agagtgcaaa 1740
ctattgctac gcctctgaag catgtagatc tggagtactg cttttatgtg aggttgcatt 1800
gggcgatatg aatgagctac tgaatgcaga ttacgatgct aataacctgc ccaaaggaaa 1860
attaagatcc aagggagttg gtcaaacagc acctaacatg gtcgagtcta aggtcgctga 1920
cgatggtgtt gttgttcccc ttggcgaacc caaacaggaa ccttccaaaa ggggtggctt 1980
gctttataat gagtacatag tgtacaacgt agaccagata agaatgcggt atgtcttaca 2040
tgttaacttc aatttcaaga gacggtagat gttgcaaaga gctgaaactg ttgctgagat 2100
cttagcagaa catatgtgga cttatagcac caggtgccct cagcctcatt ttctgagcaa 2160
atttggtagc ctttgcattt cgattttggt ttcagcttct agccccattg atgattgata 2220
ctgagtgtat atatgaacca ttgatatcca ccttccatgt acttaagttt ttttaacatg 2280
tcccatgcat aataa 2295
<210>6
<211>1384
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>棉花的parp2部分编码区
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(460)
<223>可读框
<400>6
gagaagatbg ttacagcgac gaggaagggg tggctgttct ggatcaaggg atcccagatg 60
acataaaggc tcattatcat gttctacaaa agggtgatga tatctatgat gccatgttaa 120
atcagacgaa tgttgggcaa aacaataaca aattctttgt gatccagctt ctagaatctg 180
atgactcgaa gacatacatg gttcataaca gatggggtag agttggtgtg aagggtcaaa 240
ttaagttaca tggccccttt acttcacgac aagccgcaat tgatgagttt caaaccaaat 300
tctttaacaa gaccaaaaac tattggtaca acagaaaaga ctttgtttgt cacccaaagt 360
gctacacctt gctggagatg gactatgatg aaaaagaaaa ggaatctgat gtcaaaagaa 420
aggctaactc ttccattggt gctcaattgc gggagacaaa gcttgaacaa cgtgttgcta 480
agtttatctc tattatatgc aatatcagca tgatgaagca acaaatgatg gaaataggat 540
acaatgctga caagttgcct cttggtaagc taagcaaatc cacaatttta aaggggtatg 600
atgtcttaaa gaaaattgct gatgtgattg accagtcaaa caggagcaag cttgagcaat 660
taagttcgga attttacacc gtgattccac atgattttgg atttagaaaa atgcgtgatt 720
ttgtcatcga cacacctcag aagttgaaaa agaagttgga aatggttgaa gccctgggag 780
aaatagaggt cgcatcaaaa ttattaatgg atgacattac gatggaggaa gatcctttat 840
attatcggta ccaacagctt cactgtgaac tgtttcctct tgacaatgat actgaggagt 900
tcgctttgat tgtaaagtat attcagaata ctcatgctca gacacattca aattatacag 960
ttgatgttgt tcaaatattc aaggtgacaa gagacggtga aagtgaacgc tttaaaaagt 1020
tttctggaac aaaaaataga atgctgttgt ggcatggttc tcggcttact aactggactg 1080
gcattctgtc ccaaggtttg cgcattgctc cacctgaagc gcctgccacg ggttatatgt 1140
ttgggaaggg ggtttacttt gctgatatgt tctccaaaag tgcaaattat tgctatacta 1200
attctgcctt cacaacaggg gtgttgcttc tatgtgaggt tgccctgggt gacatggctg 1260
agcttctaca agctaaaagc gatgctgata agctgccgga tgggaagttg agcacaaaag 1320
gtgttggtgc aactgcaccg gatccttctg aagcccagtc acttgatgat ggtgttgttg 1380
ttcc 1384
<210>7
<211>1647
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>7
atggagaatc gcgaagatct taactcaatt cttccgtacc ttccacttgt aattcgttcg 60
tcgtcgctgt attggccgcc gcgtgtggtg gaggcgttaa aggcaatgtc tgaaggacca 120
tctcacagcc aagttgactc aggagaggtt ctacggcaag ctattttcga tatgagacga 180
tccttatctt tctctactct cgagccatct gcttctaatg gctacgcatt tctctttgac 240
gaattgattg atgagaaaga atcaaagaga tggttcgatg agattatccc agcattggcg 300
agcttacttc tacagtttcc atctctgtta gaagtgcatt tccaaaatgc tgataatatt 360
gttagtggaa tcaaaaccgg tcttcgtttg ttaaattccc aacaagctgg cattgttttc 420
ctcagccagg agttgattgg agctcttctt gcatgctctt tcttttgttt gtttccggat 480
gataatagag gtgcaaaaca ccttccagtc atcaactttg atcatttgtt tgcaagcctt 540
tatataagtt atagtcaaag tcaagaaagc aagataagat gtattatgca ttactttgaa 600
aggttttgct cctgcgtgcc tattggtatt gtttcatttg aacgcaagat taccgctgct 660
cctgatgctg atttctggag caagtctgac gtttctcttt gtgcatttaa ggttcactct 720
tttgggttaa ttgaagatca acctgacaat gctctcgaag tggactttgc aaacaagtat 780
ctcggaggtg gttccctaag tagagggtgc gtgcaggaag agatacgctt catgattaac 840
cctgaattaa tcgctggcat gcttttcttg cctcggatgg atgacaatga agctatagaa 900
atagttggtg cggaaagatt ttcatgttac acagggtatg catcttcgtt tcggtttgct 960
ggtgagtaca ttgacaaaaa ggcaatggat cctttcaaaa ggcgaagaac cagaattgtt 1020
gcaattgatg cattatgtac accgaagatg agacacttta aagatatatg tcttttaagg 1080
gaaattaata aggcactatg tggcttttta aattgtagca aggcttggga gcaccagaat 1140
atattcatgg atgaaggaga taatgaaatt cagcttgtcc gaaacggcag agattctggt 1200
cttctgcgta cagaaactac tgcgtcacac cgaactccac taaatgatgt tgagatgaat 1260
agagaaaagc ctgctaacaa tcttatcaga gatttttatg tggaaggagt tgataacgag 1320
gatcatgaag atgatggtgt cgcgacaggg aattggggat gtggtgtttt tggaggagac 1380
ccagagctaa aggctacgat acaatggctt gctgcttccc agactcgaag accatttata 1440
tcatattaca cctttggagt agaggcactc cgaaacctag atcaggtgac gaagtggatt 1500
ctttcccata aatggactgt tggagatctg tggaacatga tgttagaata ttctgctcaa 1560
aggctctaca agcaaaccag tgttggcttc ttttcttggc tacttccatc tctagctacc 1620
accaacaaag ctatccagcc gccttga 1647
<210>8
<211>598
<212>DNA
<213>Solanum tuberosum
<400>8
gcaatggaga atagagaaga cgtgaagtca atccttccct ttttgccggtgtgtctccga 60
tcatcttctc ttttctggcc gccgctagtt gttgaagcac tgaaagccct ctctgaaggc 120
cctcattaca gcaatgttaa ctccggccaa gtcctcttcc tcgcaatctc cgacattcgg 180
aattcccttt cactacctga ttcttcaatt tcctcttctg cttcagacgg attttctctc 240
ttatttgatg atttaattcc tagggatgaa gctgttaaat ggttcaaaga agtggtgccg 300
aaaatggcgg atttgctatt gcggttgcct tccttattgg aggctcacta tgagaaggct 360
gatggtggaa ttgttaaagg agtcaacact ggtcttcgct tattggaatc acaacagcct 420
ggcattgttt tcctcagtca ggaattagtc ggtgctcttc ttgcatgttc cttcttttgc 480
tattccctac caatgataga ggtatctgta tgatcagtat gacgagaaat ttgaaaataa 540
attgaagtgc attcttcact attttgagag gattggctca ttgatacctg cgggctac 598
<210>9
<211>1530
<212>DNA
<213>Oryza sativa
<400>9
atggaggcgc gcggcgacct gcgctcgatc ctgccctacc tccccgtcgt gctccgcggc 60
ggcgcgctct tctggccgcc ggcggcgcag gaggcgctca aggcgctggc gctgggcccc 120
gacgtgagcc gcgtctcctc cggcgacgtc ctcgccgacg ccctcaccga cctccgcctc 180
gcgctcaacc tcgacccact cccgcgccgc gccgccgagg gcttcgcgct cttcttcgac 240
gacctcctgt cgcgggcgca ggcgcgggac tggttcgacc acgtcgcccc ctccctcgcc 300
cgcctcctcc tccgcctccc cacgctgctc gagggccact accgcgccgc cggcgacgag 360
gctcgcgggc tccgcatcct gagctcgcag gatgccgggc tcgtgctcct cagccaggag 420
ctcgccgccg cgctgctcgc ctgcgcgctc ttctgcctgt tccccaccgc cgatagggcc 480
gaggcgtgcc tcccggcgat caatttcgat agcctatttg cggcactgtg ttataattcg 540
aggcaaagcc aggagcagaa ggtgaggtgc cttgttcact attttgacag ggtgaccgct 600
tctacaccta ctggttccgt ttcgtttgag cgtaaggttc ttcctcgccg tcctgaatct 660
gatggcatta cgtaccctga catggatact tggatgaaat ctggtgttcc cctttgcaca 720
ttccgggtat tttcctcagg cttgatagaa gatgaggaac aagaagccct tgaagttgac 780
tttgcaaata gatatttggg aggtggcgca ctttccagag gctgcgtgca ggaagaaatc 840
cggttcatga taaacccaga attgatcgtg ggcatgctct tcatggtttc aatggaagat 900
aatgaagcta tagaaattgt tggtgcagaa aggttctcac agtacatggg gtatggttcc 960
tcattccgtt ttactggtga ctacttagat agcaaaccct ttgatgcgat gggtagacgg 1020
aaaactagga tagtggcaat tgatgctttg gactgtccaa ctaggttaca gtttgaatct 1080
agtggtcttc taagggaagt gaacaaggct ttttgtggat ttttggatca atcaaatcat 1140
cagctctgtg caaagcttgt ccaggattta aatacaaagg ataactgtcc aagtgtcatt 1200
cctgatgaat gcataggagt ttcaactgga aactggggtt gcggggcttt tggtggaaac 1260
cctgaaatca agagcatgat tcaatggatt gctgcatcac aggcactccg atcttttatt 1320
aactactaca cttttgagtc cgaatcactg aaaagattag aagaggtgac ccagtggata 1380
ttgcgccata ggtggacggt tggcgagttg tgggacatgc ttgtggagta ttcatcccag 1440
aggctaagag gagacaccaa tgagggcttt ttaacatggc tacttcccaa ggacatcccc 1500
aatggtgatg tagattacat gtgtgaatag 1530
<210>10
<211>603
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>10
tagggctgtg tgcaggagga aatccgcttc atgataaacc ccgaattgat tgtgggtatg 60
ctattcttgt cttgtatgga agataacgag gctatagaaa tctttggtgc agaacggttc 120
tcacagtata tgggttatgg ttcctccttt cgctttgttg gtgactattt agataccaaa 180
ccctttgatt cgatgggcag acggagaact aggattgtgg ctatcgatgc tttggactgt 240
ccagctaggt tacactatga atctggctgt ctcctaaggg aagtgaacaa ggcattttgt 300
ggatttttcg atcaatcgaa acaccatctc tatgcgaagc ttttccagga tttgcacaac 360
aaggatgact tttcaagcat caattccagt gagtacgtag gagtttcaac aggaaactgg 420
ggttgtggtg cttttggtgg aaaccctgaa atcaagagca tgattcagtg gattgctgca 480
tcacaggctc ttcgcccttt tgttaattac tacacttttg agaacgtgtc tctgcaaaga 540
ttagaggagg tgatccagtg gatacggctt catggctgga ctgtcggcga gctgtggaac 600
ata 603
<210>11
<211>651
<212>DNA
<213>Saccharomyces cerevisiae
<400>11
atgaagactt taattgttgt tgatatgcaa aatgatttta tttcaccttt aggttccttg 60
actgttccaa aaggtgagga attaatcaat cctatctcgg atttgatgca agatgctgat 120
agagactggc acaggattgt ggtcaccaga gattggcacc cttccagaca tatttcgttc 180
gcaaagaacc ataaagataa agaaccctat tcaacataca cctaccactc tccaaggcca 240
ggcgatgatt ccacgcaaga gggtattttg tggcccgtac actgtgtgaa aaacacctgg 300
ggtagtcaat tggttgacca aataatggac caagtggtca ctaagcatat taagattgtc 360
gacaagggtt tcttgactga ccgtgaatac tactccgcct tccacgacat ctggaacttc 420
cataagaccg acatgaacaa gtacttagaa aagcatcata cagacgaggt ttacattgtc 480
ggtgtagctt tggagtattg tgtcaaagcc accgccattt ccgctgcaga actaggttat 540
aagaccactg tcctgctgga ttacacaaga cccatcagcg atgatcccga agtcatcaat 600
aaggttaagg aagagttgaa ggcccacaac atcaatgtcg tggataaata a 651
<210>12
<211>1290
<212>DNA
<213>Saccharomyces cerevisiae
<400>12
ttaggtccat ctgtgcgctt cgttatcacc actccaactt cgttcagtat atcccaattc 60
ctctttcact ctcttcacag tggcaggatc tcccatattt ttacctaagt tatcagaaat 120
tttgatagcg tgattaccat ttacttctaa tagtttgata acgatgttta acggctcact 180
tttaacctgg ggttctgact tcttacgaaa atcattagta aagtttgtgc caataccgaa 240
tgtggctagc attccattct ctttagctgc atgggagtaa gttattgcct tttcgacgtt 300
caaagaatcg gaataacaga taatcttcga gaatttaggc aatttcaaca cgtcatggta 360
atggtgggaa atctttttgg tatactcaac tgggtctcca gaatcttgtc taacaccgac 420
gtaagcatca gaatatggtg gacggaatga ttttaaaaag tcatcagttc caaaagtatc 480
cgttaatgct aaaccagcat tttttgcacc aaaagtattg atccaacaat ccattgcatt 540
tttattggca tgcaaataat cttcactaat agaagcgact cccataaccc actcgtgagc 600
cacagtaccg attggcttga ctccatattt cttggcaaat aaaatatttg atgtgcctaa 660
taatagcgat ttgtttctgt ctgggttacc gttcacagct ttcatgattc cttgcataat 720
tagatcttga gccttcagag atctacgacg tcttgtacca aattcactga atctaatacc 780
attatcaaac aaagtttccg ccttcttctc agcttgttct aattggtttt cgtagtccca 840
gtcgatgtca acaaatttaa aatacgcttc tgatattagg gacagtaagg ggatctcata 900
aaggatagta tccttccaac taccactgac taaaattttc aatttgtagt gggtgggctt 960
gccctcgatt tcttctgaag tgaaggaaat ctgctcttca gggtgtagtt tgtaattaga 1020
actgctaata tacttaatat atgccgatgg caaatatggg atttcctgtt ttaagtattc 1080
aatttcctct tctgtgaacc tcaaatttcc caaatacgaa aattgctctt tcaaccaatt 1140
aatggcttcc ttattgaagg tcaattggga cgacctgttg gtatatttat aagtaactgt 1200
aacatctgga aaattagtga agacagcagc atgcatcgta atcttgtaca tgtctgtgtc 1260
caaaagagac tttatcactg gttctgacat 1290
<210>13
<211>1206
<212>DNA
<213>Saccharomyces cerevisiae
<400>13
atggatccca caagagctcc ggatttcaaa ccgccatctg cagacgagga attgattcct 60
ccacccgacc cggaatctaa aattcccaaa tctattccaa ttattccata cgtcttagcc 120
gatgcgaatt cctctataga tgcacctttt aatattaaga ggaagaaaaa gcatcctaag 180
catcatcatc accatcatca cagtcgtaaa gaaggcaatg ataaaaaaca tcagcatatt 240
ccattgaacc aagacgactt tcaaccactt tccgcagaag tgtcttccga agatgatgac 300
gcggatttta gatccaagga gagatacggt tcagattcaa ccacagaatc agaaactaga 360
ggtgttcaga aatatcagat tgctgattta gaagaagttc cacatggaat cgttcgtcaa 420
gcaagaacct tggaagacta cgaattcccc tcacacagat tatcgaaaaa attactggat 480
ccaaataaac tgccgttagt aatagtagca tgtgggtctt tttcaccaat cacctacttg 540
catctaagaa tgtttgaaat ggctttagat gcaatctctg aacaaacaag gtttgaagtc 600
ataggtggat attactcccc tgttagtgat aactatcaaa agcaaggctt ggccccatcc 660
taccatagag tacgtatgtg tgaattggcc tgcgaaagaa cctcatcttg gttgatggtg 720
gatgcatggg agtcattgca accttcatac acaagaactg ccaaggtctt ggatcatttc 780
aatcacgaaa tcaatattaa gagaggtggt gtagctactg ttactggaga aaaaattggt 840
gtgaaaataa tgttgctggc tggtggtgac ctaatagagt caatgggtga accaaacgtt 900
tgggcggacg ccgatttaca tcacattctc ggtaattacg gttgtttgat tgtcgaacgt 960
actggttctg atgtaaggtc ttttttgtta tcccatgata ttatgtatga acatagaagg 1020
aatattctta tcatcaagca actcatctat aatgatattt cttccacgaa agttcgtcta 1080
tttatcagac gcgccatgtc tgtacaatat ttgttaccta attcggtcat caggtatatc 1140
caagaacata gactatatgt ggaccaaacc gaacctgtta agcaagttct tggaaacaaa 1200
gaatga 1206
<210>14
<211>1188
<212>DNA
<213>Saccharomyces cerevisiae
<400>14
atggatccca ccaaagcacc cgattttaaa ccgccacagc caaatgaaga actacaacca 60
ccgccagatc caacacatac gataccaaaa tctggaccca tagttccata tgttttagct 120
gattataatt cttcgatcga tgctcctttc aatctcgaca tttacaaaac cctgtcgtca 180
aggaaaaaaa acgccaactc aagcaaccga atggaccata ttccattaaa tactagtgac 240
ttccagccac tatctcggga tgtatcatcg gaggaggaaa gtgaagggca atcgaatgga 300
attgacgcta ctctacagga tgttacgatg actgggaatt tgggggtact gaagagccaa 360
attgctgatt tggaagaagt tcctcacaca attgtaagac aagccagaac tattgaagat 420
tacgaatttc ctgtacacag attgacgaaa aagttacaag atcctgaaaa actgcctctg 480
atcatcgttg cttgtggatc attttctccc ataacatacc tacatttgag aatgtttgaa 540
atggctttag atgatatcaa tgagcaaacg cgttttgaag tggttggtgg ttatttttct 600
ccagtaagtg ataactatca aaagcgaggg ttagccccag cttatcatcg tgtccgcatg 660
tgcgaattag catgcgagcg gacatcatct tggttaatgg ttgatgcctg ggaatcttta 720
caatcaagtt atacaaggac agcaaaagtc ttggaccatt tcaatcatga aataaatatc 780
aagagaggtg gaatcatgac tgtagatggt gaaaaaatgg gcgtaaaaat catgttattg 840
gcaggcggtg atcttatcga atccatgggc gagcctcatg tgtgggctga ttcagacctg 900
caccatattt tgggtaatta tggatgtttg atcgtggaaa ggactggttc tgatgttagg 960
tccttcttgc tttcccatga tatcatgtat gaacacagaa gaaatatcct tattatcaaa 1020
caacttattt acaatgatat ttcctctacg aaagtgcggc ttttcatcag acgtggaatg 1080
tcagttcaat atcttcttcc aaactctgtc atccgttaca tccaagagta taatctatac 1140
attaatcaaa gtgaaccggt caagcaggtc ttggatagca aagagtga 1188
<210>15
<211>2145
<212>DNA
<213>Saccharomyces cerevisiae
<400>15
atgtcacatc ttatcacttt agctacatgc aacttgaatc aatgggccct agattttgaa 60
ggtaatagag accgtatcct acagtccatt aagattgcca aagagagggg tgccaggtta 120
cgtgtcggcc cagaactgga aataactggc tacggatgtt tagatcattt tttagaaaat 180
gacgtttgcc ttcattcatg ggaaatgtat gctcaaatca ttaagaataa agaaacccat 240
ggattaatac ttgacattgg tatgcccgtt ctacacaaga atgttcgtta taattgtcgt 300
ttgttatcct tggatggtga gatattgttc ataagaccta agatttggtt agctaatgat 360
ggtaactata gggaaatgag atttttcaca ccttggatga aacctggcgt ggtggaggac 420
tttatccttc cacctgagat tcagaaagtt accggccaga gacttgtgcc atttggggac 480
gctgtgataa attcattgga tacatgcatt ggtacagaaa cttgtgaaga attgtttaca 540
cctcaatccc cccacatcgc catgtcttta gatggtgtgg aaatcatgac aaactcatct 600
ggttctcatc atgaactgcg taagttaaat aaaaggttag acctaatttt aaatgccact 660
aaacgttgtg gtggtgttta cttgtatgca aatcaaagag gttgtgatgg tgacagatta 720
tattatgatg gctgtgcact aattgccatc aatggtacaa ttgtagccca aggttcacaa 780
ttttcgctag atgatgtgga agtagttact gctactgtgg acctagaaga ggtgaggagt 840
tatcgtgcag ctgtcatgtc tcgtggccta caagcctcct tggcagaaat aaagttcaag 900
cgtattgata ttcctgtaga attggcttta atgacctcca gatttgatcc tacagtgtgt 960
ccaacaaaag tccgcgagcc tttctatcac tctcctgagg aagaaattgc actgggacct 1020
gcttgctgga tgtgggatta tttaagacgt tgtaacggaa cagggttttt ccttccctta 1080
tctgggggca ttgactcttg tgcaactgca atgattgtcc actctatgtg ccgtttagtg 1140
accgacgctg ctcaaaatgg aaatgagcaa gttatcaaag acgttcgtaa gataacacgt 1200
agcggcgatg attggattcc agacagtcca caggatctag cctcaaaaat atttcactcc 1260
tgtttcatgg gtacggaaaa ttcatccaag gagacaagaa acagagcaaa ggacctttcc 1320
aatgcaattg gatcttacca cgtggattta aagatggact cattggtatc cagtgtggtg 1380
tccttattcg aagtagccac tggcaaaaaa ccaatataca aaatatttgg gggatctcaa 1440
atcgagaact tggctttaca aaacatccag gcgcgtctaa gaatggttct ttcttatctt 1500
tttgcgcaac tgttgccgtg ggttcgtggt atcccaaact cgggtggatt gttagtactt 1560
ggtagcgcaa atgttgatga gtgcttacgt gggtatctaa caaaatatga ctgctcctcc 1620
gcagatatca accctattgg gggtatttca aaaactgact tgaaaagatt cattgcctac 1680
gcatcaaaac aatataacat gccaatcttg aatgactttt taaacgctac accaactgca 1740
gaattagaac ctatgactaa agattacgtt caatcggatg agatagatat ggggatgacg 1800
tatgaagaat tgggcgtgtt tggttaccta agaaaggttg aaaaatgtgg tccttattct 1860
atgttcttaa aacttcttca tcaatggtcc ccaaagttaa cacctcgtca aatatctgaa 1920
aaggtgaaaa gatttttctt cttctatgcc atcaacagac acaagcaaac tgttttaact 1980
cctagttatc atgctgaaca gtattcacca gaagacaaca gatttgactt acgtcctttc 2040
ttaatcaacc caagatttcc atgggcttca agaaaaattg atgaagttgt cgagcagtgt 2100
gaagcacata aaggctcaac gcttgacatt atgtctattg attag 2145
<210>16
<211>597
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>16
atggcttcct catcaacgag aaagtacgag acacgaaagc gagatccaaa ctctaaaatc 60
gcagctcttc tcgttatcga catgcagaat cacttctcct ccatggccaa acccatcctc 120
aacaacgttc tcaccaccat cgacatctgc cgacgcgcct cagtccccgt attctttacg 180
cgtcacaacc acaaatcccc gaccgaccac ggcatgctcg gcgagtggtg taacggcgat 240
gtaatccttg acggaaccac cgattctgaa atcatccagg agatacaagg ccaagtaacc 300
ggaccagacg agatggtgga gaagaacacg tacagtgcgt ttaacaaaac ccgcctccag 360
gaaaacctgg aaaagatcgg agtaaaggag gtgatcgtga tcggagtgat gacgaacttg 420
tgctgtgaga caacggcgcg tgaagcgttt attaagggtt ttagggtttt tttctcgacg 480
gacgcgactg cgacgtttaa tgaggagctt cacgaggcta cgctaatgaa tctcgctttt 540
ggcttcgctt atctcgtcga ttgcgataaa ctccggcgaa gtctactcgg taactaa 597
<210>17
<211>597
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>17
atggcttctt catcatcgag aacgtacgag acacgaaagc gagagccaaa tcctaaaatc 60
gcagctcttc tcgtcatcga tatgcagaat cacttctact ctatggctga accaatcctc 120
caaaacgctc tcaccaccat cgacatctgc cgacgcgctt caatccccgt attcttcacg 180
cgccacaacc acaaatcccc aaccgaccac ggcatgctcg gagagtggtg gaacggcgat 240
ctaatcctcg acggaaccac tgattccgaa atcatcccgg aaatcaatcg ccaggtcacc 300
ggaccagacg aaatcgtgga gaagagcacg tacagtgcgt ttaacaacac gcaccttcag 360
gagaagctgg acaagatcgg agtgaaggag gtgatcgtta tcggagtgat gacgaaccta 420
tgctgtgaga cgacggcgcg tgaagcgttt gtaaaggggt ttagggtttt tttctcgacg 480
gacgcgactg cgacggttaa tgaagagctt cacgaggcta ctctaatgaa tctcgcgtat 540
ggctttgctt atctcgtcga ttgcgataga ctccggcgag gtctactcag tagttaa 597
<210>18
<211>591
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>18
atggccgaga gatggaggaa cacggctcta ctcgtcatcg acatgcagaa cgatttcata 60
gaggaaggtg ctgtgacgca agtgaaagga ggaaaatcta tagttcctaa tgttatcaga 120
gtcgtcgaac tcgcgaggca gcgtggtatt ctcgtaattt gggttgttcg agaacatgat 180
cgtcaaggaa gagatgttga attattcagg cgccataact acagttctga gaaagtcggg 240
ccagttatta aaggcaccgt aggagcagaa ttggttgatg gattgatgat caacgaagaa 300
gatgactata agattgtgaa aactcgtttc agtgctttct ttagtaccaa tcttcattcc 360
ttcttgcaaa cttcaggggt taccaagtta gtgattgctg gtgtgcaaac gccgaactgt 420
atccggcaaa cggtgtttga tgcagtggcg ctggattatc ccaatgtgac tgttattaca 480
gatgccacag ctgctgcaac accagagatc catactgcga atattcttga catgaagaat 540
attggagtca agactcctac attacacgag tggtccgaag aacttgcttg a 591
<210>19
<211>1680
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>19
atggagaaga aagaaaatgg tctcgatgga aagcaatcgg gtcgggtcat taacggaccc 60
actaacccga tggtcacacc tctgctcaac gatctttacc aattcaccat ggcttatgct 120
tattggaaag ctggcaaaca atctgagcga tctgtgtttg atctgtattt tcgtaagaat 180
ccttttggtg gagaatacac tatctttgct ggtttagaag aatgcatcaa atttctcgct 240
aatttcaatt tgactgatga agagatcgat ttcgttcgtg attcgttacc tggatgtgag 300
gaagctttct gtgattatct tcgagggctt gattgttctg acattgaagt gtatgccatt 360
tcggaaggat cagttgtttt tcctaaagtt cctttactca gaatcgaagg tcctgttgct 420
gtggtgcaat tgttggaaac tccattcctc aatctcatca attacgcatc tttggttgct 480
acaaatgcag caagacatcg gtttgttgca ggaaaatcta agcttctgct tgagtttggt 540
gctagaagag ctcagggacc cgatggtgca ataagcgcat caaagtattg ctaccttgga 600
ggttttgatg caacaagtaa tgttgcagcg ggaaaactgt ttgggatacc cctccgtggt 660
actcattccc atgcttttgt tagctcattc atgagccttg atgaaattgt tgacaaagtg 720
cttcgaagtt ctgatgggaa aagcacttgt aaggatttta tatgtttggt ccaaacttgc 780
ctaacaaaga ttcagaattc atcttcatta caaggaattt tttccgagac aaatcaaagc 840
gagcttgcag cgttcatttc atatgcactg gcattcccaa actcctttct cgctcttgta 900
gacacttatg atgtgatgaa gagtggtatt ccaaacttct gtgctgttgc tctagcactt 960
aatgaattgg gatacaaagc agtaggcatt agactggatt caggtgactt agcctatctt 1020
tctactgagg tcaggaaatt cttttgtgcc atagagagag acctcaaagt tcctgatttc 1080
gggaagatga tcgtcactgc tagtaacgat ctaaacgaag agacagtcga tgctctaaat 1140
aaacagggtc atgaagtaga tgcatttgga attggaacca acttagtgac ttgctatgcg 1200
caagctgcgt taggttgtgt tttcaaactt gtggaaataa acaatcagcc tcggatcaaa 1260
ctttctgaag atgttactaa ggtatcgatt ccatgtaaaa agcgtactta cagattgttc 1320
ggaaaagagg gttaccctct tgttgatata atgactggag agaacgaacc acctccaaag 1380
gtcggtgaaa ggttactttg ccgtcatcca ttcaatgaat caaaaagggc ttatgtggtt 1440
ccacaacgcg ttgaagagct tctgaaatgt tattggcgtg gcaatgcaga tgaagctagg 1500
gaagagctag agccattgaa agagctaaga aatcgttgca tcaaacagct cgaaaatatg 1560
cgacccgatc atatgagaag attaaaccct actccttata aggttagtgt cagcgccaag 1620
ttgtatgact tcatccactt cctctggctc aacgaagctc ctgtcggtga actgcattga 1680
<210>20
<211>1674
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>20
atggagccga aagagaacgg ctcagaattg ggtcagaaga tcattgacgg accaacgaat 60
ccaatggtca cacctttact caatgatctt tatcaattca ccatggctta tgcttattgg 120
aaagctggca aacacaacga acgatccgtt ttcgatctgt attttcgtaa gaacccattt 180
ggtggtgagt acactgtgtt tgctggatta gaagagtgtg ttaagttctt agccaatttc 240
aaattgactg atgaagaaat cgatttcgtt caagagtgtt tgcctggatc tgaggaagct 300
ttttgtgatt atcttagagg gcttgattgt tctgatgttg aagtttatgc aattccggaa 360
ggatcagttg tttttcctaa agtacctctc atgagagttg aaggacctgt tggtgttgtt 420
caattgttgg aaactccatt cctcaatctt gtcaattttg catctttggt agctactaac 480
gcagctaggc atcgctttgt tgccggaaaa tctaagagtc tactcgagtt tggtgctcga 540
agggctcagg gtccggatgg tgcaataagc gcatcaaaat attgctacct tggaggtttt 600
gatgcaacaa gtaatgtagc agctggaaaa ctttttggga ttcctcttcg tggaacacac 660
tctcatgctt atgttagctc attcatgagt actgatgaga ttgttgacaa agtacttcgt 720
agtgctgatg ggaaaaccac gtgcgaggat tttgttagtc atgttcagac atggttaaaa 780
aagattcagt attcaccatc tctaagtggc attttctctg agacaaatca aagcgagcta 840
gcagctttca cctcatatgc actggcattc cccaaaactt ttcttgccct c9tagataca 900
tacgatgtga tgaagagtgg aatccctaac ttctgtgcag ttgctttagc actcaatgac 960
tttggatata aagcattagg tattagactg gattcaggtg atttagctta tctatctaga 1020
gaggccagaa atttcttctg cacggtagag agagaactaa aagtgcctgg ttttgggaag 1080
atggtcgtca ctgctagtaa tgatctaaat gaagagacga ttgacgcttt aaataaacag 1140
ggacatgagg tggatgcttt tggcatcggg acctacttgg tcacttgcta ttcacaagcg 1200
gccttaggtt gcgttttcaa acttgtggag ataaacaatc agcctcggat taaactttct 1260
gaagatgtta caaaggtatc aataccgtgt aaaaagcgaa gttacagatt atacggcaaa 1320
gaaggttacc ctctggtaga tataatgact ggagagaacg aaccacctcc aaaggttggt 1380
gagcgtttac tttgtcgtca cccattcaac gaatccaaaa gagcatatgt agtgccacaa 1440
cgtgtcgaag agctcctcaa atgttattgg cgtggaagtg cagatgaagc aagagaagta 1500
ttaccgcctt tgaaagagat aagagaccgt tgcatcaaac agctcgaaaa catgcgacct 1560
gatcatatga ggagattaaa cccaactcct tataaggtta gtgtaagcgc aaagctgtac 1620
gatttcatcc acttcttatg gctaaacgaa gcacctgttg gtgaattgca gtga 1674
<210>21
<211>717
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>21
atggatgtcc cgttaccagt cgagaaatta tcttatggat caaacactga ggacaaaact 60
tgtgtagtgc ttgtggcaac tgggagtttc aatcctccta ctttcatgca tttacgcatg 120
tttgagctgg cgagagatga attacgctca aaaggatttc atgttcttgg aggatatatg 180
tctcctgtta atgatgcata taagaagaag ggccttttat ctgcagaaca tcgtttagag 240
atgtgtaatg tatcatgtca aagctctgac tttgtaatgg ttgatccgtg ggaggcatct 300
caaagcaact accaacgaac tttgacggtt ttatcaaggg tcaagacttt cttaacaaca 360
aatcgacatg tacccgagga atctctcaaa gtcatgctac tatgtggctc ggatttactg 420
ctatctttct gcactcccgg tgtttggatc cctgaacagt taagaactat ttgcaaagat 480
tatggcattg tgtgcatccg tagagaagga caagatgttg aaaatatgat ctctggtgac 540
gaaatcttaa acgaaaactg tgctaacgtc aaaatcgttg acaatactgt tcctaatcaa 600
atcagttcga gtagattaag gcaatgcatt tcgcgagggt tatcggttaa atacttgact 660
gaagatggag taatagatta tatcagacaa catcaactat acactgagct cacatga 717
<210>22
<211>2178
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>22
atgaggctgt tgaaggttgc tacgtgtaac ttgaaccaat gggccatgga tttcgagagc 60
aacatgaaga acatcaaggc ttcgatcgct gaggcaaagg ctgctggtgc tgttatcagg 120
cttggacccg agctcgaggt cactggctat ggttgcgagg atcacttctt ggaactcgac 180
actgtcactc atgcgtggga gtgtttgaag gaattgctgc ttggtgattg gacggatgat 240
attttgtgca gcataggaat gcctgtgatt aaaggagcag agcgttataa ctgccaggtt 300
ctctgtatga acagaagaat catcatgatt cgaccgaaaa tgtggctcgc aaacgatgga 360
aactataggg agctacggtg gttcacagct tggaagcaga gagaagagct agaggaattt 420
cagctcccca ttgaaatttc agaggctttg gagcagaaat cagtcccttt tggttatggt 480
tacatccagt ttatcgacac ggctgttgca gctgaagtct gtgaggaact gtttagtcca 540
cttcctcctc atgccgagct cgcattgaat ggtgttgaag tatttatgaa tgcaagtggg 600
agtcatcacc aacttaggaa actagatatt cgtctgaatg cttttatggg ggctactcat 660
gctcgtggtg gggtgtatat gtacagtaat caacaaggat gcgatggtag ccgcttatac 720
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gactatttga gaagaagtgg cgcttcagga tttttgcttc ctctttctgg cggagcagac 1080
agctcctccg tggcagctat tgttggctgc atgtgccaac ttgttgttaa agagattgca 1140
aagggagatg agcaagtaaa agctgatgcg aaccgaattg ggaattatgc taatgggcag 1200
tttcctactg atagcaaaga gtttgccaaa cgaatatttt acactgtctt tatgggttct 1260
gaaaacagtt ctgaggagac aaaaaggcgt tcaaagcagc tggcagacga gattggtgct 1320
tggcatcttg atgtttgcat agatggtgtt gtctctgcag ttttatcatt atttcaaaca 1380
gttacaggca agcgaccaag gtataaggtt gatggaggat caaatgctga gaaccttggg 1440
ttgcagaaca ttcaagcccg gatgagaatg gtgttagcat ttatgttagc gtctctcttg 1500
ccttgggttc atagcaaacc aggcttttac cttgttctag gcagctccaa cgttgatgaa 1560
ggacttcgtg gttacctgac aaagtatgat tgcagctcag cagacataaa tcctatagga 1620
agtatcagta aaatggattt gaggttgttc ttaaaatggg ctgcaacgaa tctcggatat 1680
ccatccttgg cagagataga agctgctcca ccaacagctg agcttgagcc cattcgttct 1740
gactattctc agctcgatga agtcgacatg ggaatgacat atgaagagct ttcagtctat 1800
ggaaggatga ggaagatatt ccgttgtgga ccagtatcta tgttcaagaa tctatgttac 1860
aagtggggaa caaagctaag cccagcagaa gtagctgaga aagtgaagta tttcttcaaa 1920
tattattcga tcaatcgaca caaaatgact gtcctcacac cgtcttatca cgctgagagt 1980
tactccccag aggacaacag attcgatctg aggcagtttc tgtacaacag caagtggcca 2040
taccagttta agaagattga cgagattgtt gacagcttaa atggtgactc agttgctttc 2100
ccggaagaag aagcaaactc caacaaagaa attggagttg tagcagcaaa ctccggagac 2160
ccaagtgcgg gtctctga 2178
Claims (27)
1. 一种用于增强植物逆境耐受性的方法,包括将有效剂量的6-氯烟酸或具有式(I)的化合物,
其中:
Het表示在各种情况下任选被氟、氯、甲基或乙基单取代或多取代的杂环,所述杂环选自以下杂环:
吡啶-3-基、吡啶-5-基、3-吡啶基、1-氧化-5-吡啶基、1-氧化-5-吡啶基、四氢呋喃-3-基、噻唑-5-基,
A表示C1-C6-烷基、-N(R1)(R2)或S(R2),
其中
R1表示氢、C1-C6-烷基、苯基-C1-C4-烷基、C3-C6-环烷基、C2-C6-烯基或C2-C6-炔基,和
R2表示C1-C6-烷基、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基、-C(=O)-CH3或苄基,
R表示氢、C1-C6-烷基、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基、-C(=O)-CH3或苄基,或者同R2一起表示下列基团:
-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-、-CH2-S-CH2-、-CH2-NH-CH2-,-CH2-N(CH3)-CH2-,和
X表示N-NO2、N-CN或CH-NO2
施用于所述植物或其所在地、或所述植物的种子,其特征在于,所述植物是经工程化从而耐受逆境的植物。
2. 权利要求1所述的方法,其中所述经工程化从而耐受逆境的植物是转基因植物,其包含增强逆境耐受性的外源基因。
3. 权利要求2所述的方法,其中所述外源基因编码PARP抑制性RNA分子。
4. 权利要求3所述的方法,其中所述外源基因包含以下操作性连接的DNA片段:
a.植物可表达启动子;
b.编码PARP抑制性RNA分子的DNA区,其包含从SEQ ID No1的核苷酸序列、SEQ ID No 2的核苷酸序列、SEQ ID No 3的核苷酸序列、SEQ ID No 4的核苷酸序列、SEQ ID No 5的核苷酸序列或SEQID No 6的核苷酸序列中选择的20个连续核苷酸中的至少19个核苷酸;和
c.转录终止和聚腺苷酸化DNA区。
5. 权利要求3所述的方法,其中所述外源基因包含以下操作性连接的DNA片段:
a.植物可表达启动子;
b.编码PARP抑制性RNA分子的DNA区,其包含从SEQ ID No1的核苷酸序列、SEQ ID No 2的核苷酸序列、SEQ ID No 3的核苷酸序列、SEQ ID No 4的核苷酸序列、SEQ ID No 5的核苷酸序列或SEQID No 6的核苷酸序列的互补序列中选择的20个连续核苷酸中的至少19个核苷酸;和
c.转录终止和聚腺苷酸化DNA区。
6. 权利要求3所述的方法,其中所述外源基因包含以下操作性连接的DNA片段:
a.植物可表达启动子;
b.编码PARP抑制性RNA分子的DNA区,所述RNA包括:
i.有义核苷酸序列,其包含选自SEQ ID No 1的核苷酸序列、SEQID No 2的核苷酸序列、SEQ ID No 3的核苷酸序列、SEQ ID No 4的核苷酸序列、SEQ ID No 5的核苷酸序列或SEQ ID No 6的核苷酸序列的20个连续核苷酸中的至少19个核苷酸;和
ii反义核苷酸序列,其包含与所述有义核苷酸序列中的所述至少20个连续核苷酸互补的核苷酸序列;
iii.其中所述有义和反义核苷酸序列能够形成双链RNA区;和
c.转录终止和聚腺苷酸化DNA区。
7. 权利要求6所述的方法,其中所述反义核苷酸序列与所述有义核苷酸序列有大约95%的序列同一性或是完全相同的。
8. 权利要求2所述的方法,其中所述外源基因编码ParG抑制性RNA分子。
9. 权利要求8所述的方法,其中所述外源基因包含以下操作性连接的DNA片段:
a.植物可表达启动子;
b.编码PARG抑制性RNA分子的DNA区,其包含选自SEQ IDNo 7的核苷酸序列、SEQ ID No 8的核苷酸序列、SEQ ID No 9的核苷酸序列或SEQ ID No10的核苷酸序列的20个连续核苷酸中的至少19个核苷酸;和
c.转录终止和聚腺苷酸化DNA区。
10. 权利要求3所述的方法,其中所述外源基因包含以下操作性连接的DNA片段:
a.植物可表达启动子;
b.编码PARG抑制性RNA分子的DNA区,其包含选自SEQ IDNo 7的核苷酸序列、SEQ ID No 8的核苷酸序列、SEQ ID No 9的核苷酸序列或SEQ ID No 10的核苷酸序列的20个连续核苷酸中的至少19个核苷酸;和
c.转录终止和聚腺苷酸化DNA区。
11. 权利要求3所述的方法,其中所述外源基因包含以下操作性连接的DNA片段:
a.植物可表达启动子;
b.编码PARG抑制性RNA分子的DNA区,所述RNA分子包含:
i.有义核苷酸序列,其包含选自SEQ ID No 7的核苷酸序列、SEQID No 8的核苷酸序列、SEQ ID No 9的核苷酸序列或SEQ ID No 10的核苷酸序列的20个连续核苷酸中的至少19个核苷酸;和
ii.反义核苷酸序列,其包含与所述有义核苷酸序列中的所述至少20个连续核苷酸互补的核苷酸序列;
iii.其中所述有义和反义核苷酸序列能够形成双链RNA区;和
c.转录终止和聚腺苷酸化DNA区。
12. 权利要求11所述的方法,其中所述反义核苷酸序列与所述有义核苷酸序列有大约95%的序列同一性或是完全相同的。
13. 权利要求2所述的方法,其中所述外源基因编码选自以下的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸拯救合成途径的植物功能性酶:烟酰胺酶、烟酸磷酸核糖基转移酶、烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶。
14. 权利要求13所述的方法,其中所述外源基因包含选自以下的核苷酸序列:SEQ ID 11核苷酸序列、SEQ ID 12核苷酸序列、SEQ ID13核苷酸序列、SEQ ID 14核苷酸序列、SEQ ID 15核苷酸序列、SEQID 16核苷酸序列、SEQ ID 17核苷酸序列、SEQ ID 18核苷酸序列、SEQ ID 19核苷酸序列、SEQ ID 20核苷酸序列、SEQ ID 21核苷酸序列、或SEQ ID 22核苷酸序列。
15. 权利要求1-14中任一项的方法,其中所述选自新烟碱类的化合物为吡虫啉。
16. 权利要求1-14中任一项的方法,其中所述选自新烟碱类的化合物为噻虫胺。
17. 权利要求1-14中任一项的方法,其中所述选自新烟碱类的化合物为噻虫啉。
18. 权利要求1-14中任一项的方法,其中所述选自新烟碱类的化合物为烯虫灵。
19. 权利要求1-14中任一项的方法,其中所述选自新烟碱类的化合物为吡虫清。
20. 权利要求1-14中任一项的方法,其中所述化合物为6-氯烟酸。
21. 权利要求1的化合物用于按照权利要求2-14中任一项的增强经工程化从而耐受逆境的植物的逆境耐受性的用途。
22. 权利要求2-14中任一项所述的经工程化从而耐受逆境的植物的种子,其中所述植物已经用权利要求1所述的化合物处理过。
23. 增强植物逆境耐受性的方法,包括用有效剂量的6-氯烟酸或权利要求1中的式(I)化合物,处理权利要求2-14中任一项所述的经工程化从而耐受逆境的植物的种子种植于其中的土壤。
24. 权利要求1所述的方法,其中所述植物是所述的转基因双子叶或单子叶植物、植物细胞或其种子。
25. 权利要求1所述的方法,其中所述种子用0.1g/100kg种子-1000g/100kg种子的量的权利要求1中所述的化合物处理。
26. 权利要求1所述的方法,其中所述植物用权利要求1中的化合物以每公顷10g-1600g的施用比例处理。
27. 包装产品,其至少包含
a.权利要求1中所述的化合物,和
b.权利要求2-14中任一项所述的经工程化从而耐受逆境的植物或所述植物的种子。
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