CN101190211A - 芳香硝基化合物在制备治疗病毒性肝炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及芳香硝基化合物在制药领域的新用途。特别是芳香硝基化合物在治疗病毒性肝炎中的应用。芳香硝基化合物单用或合并常用抗病毒性肝炎药物能有效地抑制肝炎病毒的复制和分泌。芳香硝基族化合物可以显著抑制肝炎病毒在哺乳类动物身上的复制和分泌。该类化合物特别适用于治疗乙型肝炎病毒和丙型肝炎所导致的疾病。该发明描述了治疗乙型肝炎和丙型肝炎病人的具体方法。

Description

芳香硝基化合物在制备治疗病毒性肝炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及病毒性肝炎的治疗领域，更具体的是本发明涉及3-硝基-4-碘-苯甲酰胺及其衍生物单独和合并其他抗病毒化合物在治疗病毒性肝炎中的应用。

背景技术

病毒性肝炎(viral heptitis)是由多种肝炎病毒引起的常见传染病，具有传染性强、传播途径复杂、流行面广泛，发病率较高等特点。临床上主要表现为乏力、食欲减退、恶心、呕吐、肝肿大及肝功能损害，部分病人可有黄疸和发热。有些患者出现荨麻疹、关节痛或上呼吸道症状。病毒性肝炎分甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎五种。以往所谓的非甲非乙型肝炎(NANBH)经血行感染者称输血后非甲非乙型肝炎(PT-NANBH)，通过粪-口感染的称为肠道传播的非甲非乙型肝炎(ET-NANBH)，近年来经分子生物学技术研究，证实上述非甲非乙型肝炎的病原引起病毒性肝炎者有二种类型，前者称丙型肝炎(hepatitis C；HC)，后者称戊型肝炎(hepatitis E；HE)。急性肝炎病人大多在6个月内恢复，乙型、丙型和丁型肝炎易变为慢性，少数可发展为肝硬化，极少数呈重症经过。慢性乙型、丙型肝炎与原发性肝细胞癌的发生有密切关系。

病毒性肝炎的治疗应根据不同病原、不同临床类型及组织学损害区别对待。各型肝炎的治疗原则均以足够的休息、营养为主，辅以适当药物，避免饮酒、过劳和损害肝脏药物。

急性肝炎：急性肝炎一般为自限性，多可完全康复。以一般治疗及对症支持治疗为主，一般不采用抗病毒治疗，急性丙型肝炎则是例外，因急性丙型肝炎容易转为慢性，早期应用抗病毒药能显著降低转慢率。

慢性肝炎：根据病人具体情况采用综合性治疗方案，包括合理的休息和营养，心理平衡，改善和恢复肝功能，调节机体免疫，抗病毒，抗纤维化等治疗。药物治疗的原则是合理用药，避免损害肝脏药物。药物种类包括：

(1)改善和恢复肝功能类，如维生素类、还原型谷胱甘肽、肝泰乐、五味子类(联苯双酯等)、山豆根类(苦参碱等)、甘草提取物(甘草酸苷等)、垂盆草、齐墩果酸、丹参、茵枝黄、门冬氨酸钾镁、前列腺素E1、腺苷蛋氨酸、低分子右旋糖酐、苯巴比妥、山莨菪碱、皮质激素等。

(2)免疫调节类，如胸腺素或胸腺肽、转移因子、特异性免疫核糖核酸等。

(3)抗肝纤维化类，主要有丹参、冬虫夏草、核仁提取物、γ干扰素等。

(4)抗病毒类：目的是抑制病毒复制，减少传染性，改善或减轻肝损害，提高生活质量，减少或延缓肝硬化、肝衰竭或HCC的发生。符合适应症者应尽可能进行抗病毒治疗。最近发表的亚太慢性肝病治疗共识(2005)认为，持续的病毒抑制是减少肝损害和病情进展的关键。抗病毒类药物主要有：

a、干扰素α(α-IFN)：是目前国内外公认的抑制病毒复制有效、治疗慢性乙型肝炎和丙型肝炎的药物，但疗效不满意，持久有效率约20～40％。α-IFN的抗病毒作用主要通过两方面，一是作用于靶细胞膜上的受体，激活一系列蛋白酶基因，这些酶具有抑制病毒蛋白合成的作用，从而抑制病毒核酸合成，起到抑制病毒复制的作用；另一方面是α-IFN具有免疫调节作用，可通过提高特异性CTL的活性，杀伤清除病毒感染细胞。α-IFN的缺点是抗病毒作用比较弱，而毒副作用比较多，除了可能引起流感样症候群之外，还可引起白细胞、血小板减少，且有脱发、抑郁等情况发生，患者耐受性较差，适应证较窄，肝功能失代偿患者不能应用。

b、核苷类似物：核苷类似物是一类抗病毒药物，通过核苷酸的竞争性作用掺入病毒的DNA链，抑制DNA多聚酶和逆转录酶，起到抑制病毒复制的作用。此类药物有拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替比夫定、衣曲西他滨、克拉夫定、替诺夫定等，前3种已在国内、外被批准上市。核苷(酸)类似物的优点为抗乙肝病毒作用快而强，不良反应少，适应症广，可口服，缺点是无固定疗程，须长期用药，停药后易复发且可能发生病情恶化，甚至出现危及生命的肝功能失代偿，还易发生病毒耐药变异，导致耐药，尤其以拉米夫定导致病毒变异率最高(第一年服药后，17％患者发生病毒变异)。

c、其他抗病毒药物：泛昔洛韦(famciclovir)：效果逊于拉米夫定，每日口服三次，每次0.5mg。

抗病毒治疗是慢性病毒性肝炎治疗的关键，但目前的抗病毒药物效果并不令人满意，因此，人们希望能够发现更加有效、更加安全、副作用更少的能针对性杀灭肝炎病毒的药物。我们发明的这组化合物能够有效地杀灭肝炎病毒，而且不会产生耐药。

中国专利申请CN200410067715披露了芳香硝基化合物用于艾滋病的治疗，其作用机理不同于目前用于艾滋病治疗的逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂。芳香硝基化合物作为核壳体蛋白p7抑制剂，作用于HIV病毒核壳体蛋白p7的锌指结构，而完整的锌指结构对于保持HIV病毒的感染性是必须的。锌指结构被芳香硝基化合物破坏后，HIV病毒就失去了感染性。

4-碘-3-硝基苯甲酰胺属于芳香硝基化合物类的核壳体蛋白p7抑制剂，结构式如下图所示，具有抗HIV病毒的活性，但是其在肝炎治疗领域的应用目前还没有报导。

因此，发明更加有效，更加安全和副作用更小的药物，能够更有效的抑制病毒繁殖和生长是本发明的目的。

发明内容

本发明提供了芳香硝基化合物在制备治疗病毒性肝炎药物中的应用，该应用的特征是单独给予芳香硝基化合物药学上可接受形式的组合物，其中芳香硝基化合物具有下列通式结构式：

或其药学上可接受形式的组合物，其中：

R₁，R₂和R₃各自独立地选自：氢基、羟基、卤素、氰基、硝基、(C₁-C₆)烷基、(C₁-C₆)烷氧基、(C₃-C₇)环烷基或苯基。其中一个特别优选的化合物为4-碘-3-硝基苯甲酰胺。

本发明主要用于治疗病毒性肝炎。该药主要通过作用于病毒核壳体蛋白的锌指结构，抑制肝炎病毒的复制、装配，显著而特异的抑制病毒的增生；而且锌指结构是病毒核壳体蛋白的保守结构，不能突变，因而，该药的使用不会使病毒出现耐药现象。因此，该化合物可以用来治疗各种病毒引起的各类急慢性肝炎。

在实际使用中，这些化合物和它们药理上可以接受的盐类，在有效剂量上可以单独或者合并使用，通过合适的剂型显著而有效的抑制各种肝炎病毒复制和分泌或者防止病毒的在哺乳动物中的感染。

关于使用的剂型，可以根据治疗目的采用各种临床上可以接收到的剂型，例如口服、静脉、局部、皮下用药的方式。这里优选的剂型是口服和静脉。根据所采用的剂型，剂型可以采用固体，半固体，液体的形式，可以做成片剂，胶囊，缓释剂，粉剂，针剂等。在口服剂型中，除了本发明的活性化合物之外，还可以使用各种医药上可以允许使用的辅料例如：甘露糖，果糖，淀粉，纤维等。液体制剂，特别是针剂一般是把活性物质例如4-碘-3-硝基苯甲酰胺溶解或者分散在药用溶剂如水，盐，液体右旋糖酐，甘油，乙醇等做成溶解液或者悬浮液。

如果需要，剂型里也可以适当加上一些添加剂如增湿剂或者乳化剂，PH缓冲剂等。如果需要，也可制成脂质体。

上面的任何剂型药物活性成分占整个剂型的1-99％。

制备以上剂型的方法，对于这方面的专业人员来说，都是非常熟悉的，这些方法有关专业书籍上都是非常明白和详细的。不管采用任何剂型，都要保证能够到达有效治疗病人的剂量。所谓有效剂量就是能够阻止病人疾病发展或者减轻病人症状的用药量。实际使用的剂量将依据病人的具体情况而决定，这些境况包括病人的体质，体重，疾病的严重程度等。然而，有效地剂量可能在1-20mg/kg，优选1-10mg/kg。

本发明提供了一个治疗抑制肝炎病毒的方法。该方法使病人体内病毒量减少，特别是对乙型肝炎和丙型肝炎。活性化合物或者活性物质的代谢物和病毒相互作用，抑制病毒复制，或者灭活病毒。所谓减少包括把病毒完全从病人体内排除，或者病人体内感染病毒滴度降低。其中一个最优体现就是病人血中病毒数量的降低；另外一个体现是可以降低耐药病毒的滴度。还有一个体现就是降低病人细胞内病毒颗粒数目。

具体实施方式

实施例1硝基芳香化合物的合成

4-碘-3-硝基苯甲酰胺制备

1025mg 4-碘-3-硝基苯甲酸(由Chemica Alta Ltd.，Edmonton，Alberta，Canada提供)溶解于10ml N，N-二甲基甲酰胺中，冷却到10℃，然后加入0.76ml氯化亚砜，室温下搅拌1小时，然后加入到预先冷却的20ml浓氨水中，得黑黄色混合物，搅拌5分钟后加入50ml预先冷却的去离子水，出现亮黄色沉淀，冰浴条件下冷却10分钟，抽滤出沉淀，冷水淋洗后真空干燥，得500.4mg粗品，乙腈中重结晶得415.2mg 4-碘-3-硝基苯甲酰胺，熔点：152-155℃。HNMR(DMSO)δ7.67(bs，1H，酰胺基团中的一个非等价质子)，7.84，7.85和7.86，7.87(dd，1H，芳环第5位氢)，8.22和8.24(d芳环第6位氢)，8.22(酰胺基团中的另一个非等价质子)，8.35和8.36(d，芳环第2位氢)

实施例2：抗乙型肝炎的体外实验研究

材料

4-碘-3-硝基苯甲酰胺实验时用DMSO配成适当浓度，检测时用培养液3倍稀释，共8个稀释度。

阳性对照药：拉咪夫定由葛兰素威康公司生产。

方法

药物对细胞毒性试验用0.6％胰蛋白酶将HepG2.2.15细胞分散成单个细胞悬液，用含10％胎牛血清的DMEM培养基配成浓度为3×10⁵个/ml的细胞悬液，按0.1ml/孔分种于96孔板，置37℃、饱和湿度、5％CO₂培养箱内培养，2天后换含药培养液0.1ml/孔，每个浓度四孔。将药物原液作系列倍比稀释成8个浓度。置37℃、饱和湿度、5％CO₂培养箱内继续培养，并设不加药物的对照；12天后收集上清，备作ELISA法测定HBsAg、HBeAg。所余细胞用MTT法测药物细胞毒性。

测定药物对细胞生长的半数毒性浓度：按Mosmann建立的MTT法检测[2]。向吸去上清的细胞孔中加入0.4g/LMTT的无血清培养液0.1ml/孔，37℃培养4h，去上清，用二甲基亚砜溶解甲月替颗粒，测570nm波长下的吸光度A值。细胞破坏百分率：distroy＝(A细胞组-A实验组)/(A细胞组-A空白组)×100％，50％毒性浓度(TC₅₀)为细胞半数毒性浓度。

细胞上清中HBsAg、HBeAg的检测用所留取第12d的细胞上清液，做ELISA法测定，采用华美生物工程公司生产的酶联检测试剂盒检测。药物对抗原的抑制百分率：inhibitory＝(A细胞组-A实验组)/(A细胞组-A空白组)×100％，50％抑制浓度(IC₅₀)为HBsAg或HBeAg以抑制率为50％时的药物浓度。

细胞DNA抽提液检测HBV-DNA：裂解细胞，离心，.加RNAase，离心沉淀核心颗粒，然后提取病毒DNA，用DNA信号扩增技术，定量检测HBV DNA。

结果

本实验选择HBsAg、HBeAg作为药物效果的初步筛选指标，通过MTT法检测细胞毒性，并相应计算出选择指数(SI)来评价药物临床应用前景，SI＝TC₅₀/IC₅₀。其中SI＞2为有效低毒，2＞SI＞1为低效有毒，SI＜1为毒性作用。

对HepG2.2.15细胞的毒性作用对细胞半数毒性浓度为64.15ug/ml，对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用实验结果见表1。

表1 对HepG2.2.15细胞的毒性作用实验

实验通过4-碘-3-硝基苯甲酰胺直接作用于HepG2.2.15细胞，培养12d后观察其对HBsAg和HBeAg分泌的抑制情况来初步评价其体外抗HBV作用。结果显示，4-碘-3-硝基苯甲酰胺对HepG2.2.15细胞半数毒性浓度为64.15μg/ml，对HBsAg抑制IC₅₀为18.48μg/ml，SI为3.47；对DNA复制的抑制IC₅₀为6.65μg/ml，SI为9.65，显示其对HBsAg和病毒得复制均有显著的抑制作用。目前广泛使用的拉米夫定抑制病毒DNA复制的IC₅₀为81.18μg/ml.SI为24.64，通过比较说明，4-碘-3-硝基苯甲酰胺比拉米夫定具有更低的起效浓度，另外，拉米夫定只是抑制病毒DNA的复制，而4-碘-3-硝基苯甲酰胺除了抑制病毒DNA的复制外，还能够抑制HbsAg的分泌，因此比拉米夫定具有更好的抑制乙肝病毒的作用。

实施例2：抗丙型肝炎的体外实验研究

主要材料

4-碘-3-硝基苯甲酰胺实验时用DMSO配成适当浓度，检测时用含2％血清的培养液10倍稀释，共5个稀释度。

干扰素a2b由广东丽珠生物公司生产。

实验方法

取Replicon细胞生长良好的培养瓶，用0.25％胰酶消化，制成单细胞悬液；计数调整为1*10⁵cell/ml。接种24孔板，1ml/孔。置入培养箱37℃过夜，弃去上清，然后再加入4-碘-3-硝基苯甲酰胺，样品从10um/L开始，10倍稀释5个浓度；干扰素10⁴IU/ml，继续培养。培养过程中始终保持培养液总体积不变。作用72小时后，收集细胞。Trizol法提取病毒总RNA。

在每个孔中加入0.5mlTrizo液，打碎后吸入1.5ml的离心管中。加入0.2ml的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。静止后取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。弃去上清液，按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75％乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟。贮存于70％乙醇并保存于-70℃。

荧光定量PCR反应：在反应体系内加入以下试剂：5＊R-PCR Buffer 5.0ul，250mM Mg²⁺0.3ul，10mM dNTP 0.75ul，2*SYBPGreen I荧光染料1.0ul，10-3*Calibration 1.0ul，5U/ul HSEx-Taq酶0.25ul，模板1.0ul，10uM引物(HCVs：5’-TgTggAACCggTgTAC-3’HCVas：5’-CTTAAggTTAggATTCgTgCTCAT-3：)1.0ul，补充双蒸水至25ul体系。按照以下程序进行PCR反应：

95℃：90sec；95℃：5sec，60℃：30sec，40个循环；

95℃：1min，55℃：1min，55℃：10sec，80个循环；

4℃：保温

数据处理

数据结果取得是三个复孔的平均值。EC₅₀使用Logit法计算。

结果

各反应组收获的HCV Replecon细胞的HCV RNA拷贝数结果如下，并于对照组比较，计算抑制率和EC₅₀。结果见表2。

表2 7721细胞内和培养上清中HCV RNA的检测

-：阴性对照

结论：

该实验结果表明4-碘-3-硝基苯甲酰胺在体外体系对HCV病毒的复制具有一定的抑制作用，可以抑制HCV病毒的复制。尽管其对HCV的抑制效果不如干扰素，但是与干扰素相比，干扰素是一个大分子的生物制品，其生产工艺复杂，产品本身不稳定，产品的保藏和运输都需要特殊的设备，生产成本高昂，另外干扰素的毒副作用很多，临床使用剂型主要为注射剂，因而病人的顺应性较低；而4-碘-3-硝基苯甲酰胺是一个小分子化合物，性质稳定，大规模生产的成本很低，其可以制成片剂、胶囊等常规剂型，病人服用非常方便，另外，由于其核干扰素的作用机理不同，可以和干扰素合用，治疗效果更好。

Claims (5)

1.芳香硝基化合物在制备治疗病毒性肝炎药物中的应用，其中芳香硝基化合物具有下列通式结构式：

或其药学上可接受形式的组合物，其中：

R₁，R₂和R₃各自独立地选自：氢、羟基、卤素、氰基、硝基、(C₃-C₆)烷基、(C₁-C₆)烷氧基、(C₃-C₇)环烷基或苯基。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征是所述的芳香硝基化合物为4-碘-3-硝基苯甲酰胺。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征是所述病毒性肝炎为乙型肝炎。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征是所述病毒性肝炎为丙型肝炎。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征是给予芳香硝基化合物的途径为口服或非胃肠道给药方式。