CN1768733A - 芳香硝基化合物在制备治疗艾滋病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及芳香硝基化合物在制药领域的新用途。特别是芳香硝基化合物在制备治疗艾滋病药物中的应用。芳香硝基化合物单用或合并常用抗艾滋病药物有效地抑制或杀死艾滋病毒。本发明的物质药理作用强，采用常规药物制备方法，即可制得药学上可接受形式的组合物。

Description

芳香硝基化合物在制备治疗艾滋病药物中的应用

技术领域

本发明涉及一般药物治疗领域。更具体的是，本发明涉及一种芳香硝基化合物在抗艾滋病中的应用。

背景技术

艾滋病(Acquired Immuno-deficiency Syndrome，AIDS，获得性免疫缺损综合症，简称艾滋病)是当今世界主要威胁人类健康的不可根治的致死疾病之一。导致艾滋病的病原体即人类免疫缺损病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)，1983年获得分离确证，有两种亚型HIV-1和HIV-2，若干变异株。HIV繁殖过程大致可分为步骤：吸附、穿入、脱壳、早期蛋白合成、病毒基因组核酸的复制、晚期蛋白合成、核壳体装配、病毒体成熟、释放等。从理论上说，上述过程中的每一个步骤都能作为筛选抗HIV药物的靶点。并且每一步骤都发现了许多相应的抑制剂，不同类型的化合物被相继研究和用于抗艾滋病病毒。然而其中病毒基因组核酸的复制和蛋白质的合成是HIV繁殖最关键的步骤，且需要有某些特异性酶的参与，故抗HIV药物的研制热点主要集中在寻找这些特异性酶的抑制剂方面，包括逆转录酶(RT)抑制剂(它抑制HIV从mRNA转录DNA)，蛋白质合成酶抑制剂，逆转录启动因子(TAT)抑制剂等。全世界已对约20000个化合物进行了抗HIV的研究，目前已成功地研制出了逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂等抗HIV药物。如逆转录酶抑制剂(AZT，DDC，DDI，D4T，3TC，Nevirapine，Delavirdine，Efavinavir)和蛋白酶抑制剂(Sequanavir，Ritonavir，Indinavir，Nelfinavir，Amprenavir)，虽然被批准用于临床，客观上延长了艾滋病患者的生命，但同时又带来了严重的毒副作用如骨髓抑制和健忘等以及更严重的导致耐药性病毒株的出现。

因而临床上急需研制出具有不同化学结构和作用机理的新类型抗HIV病毒的新药物。

核壳蛋白p7抑制剂是与常用抗艾滋病药物化学结构和作用机理不同的新型抗HIV病毒药物。其作用原理为：HIV核壳蛋白7(nucleocapside protein 7，NCp7)来源于水解pr55gag前体多聚蛋白，由于它具有的锌指结构，成为一个在病毒复制中来源于病毒本身的靶点。这个锌指位于成熟的核壳蛋白，pr55gag和pr160gag-pol前体蛋白中。成熟的病毒颗粒中含有大约2000个和病毒RNA结合的NCp7分子，NCp7形成了病毒的核壳。除了Spumvirus没有锌指结构外，所有的逆转录病毒都具有极其保守的Cys-Xaa2-Cys-Xaa2-Hys-Xaa4-Cys(CCHC)锌指结构，完整的锌指结构是病毒保持感染性所必须的。和锌络合的任何一个氨基酸残基发生突变，都会导致NCp7功能和HIV感染性的丢失。用不同种类的锌指抑制剂在体外做了三年的实验，也未发现产生耐药的病毒株。因而，NCp7提供了一个HIV复制环节上的非常关键和不可突变的靶点。

现已开发了很多的NCp7抑制剂。3-亚硝基苯甲酰胺是发现最早的化合物，是直接作用于NCp7锌指结构，具有直接杀灭病毒作用的小分子化合物。Disulfide-based 2’2-dithiobis(benzamide)dsulfides(DIBA)是第二个被发现的锌指结构抑制剂。DIBA也是一个小分子化合物，治疗指数为5-10。DIBA类化合物可以在多个环节上抑制病毒复制，而且可以直接杀灭病毒(EC₅₀是纳摩尔级)。可以抑制急性期，慢性期和潜伏期病毒；可以抑制多个HIV-1，HIV2和SIV病毒分离株，在慢性感染7-30天的人巨嗜细胞中，DIBA可以使病毒感染性丢失，这些感染性丢失的病毒，在没有抑制剂的情况下，需要经过很长时间的培养才能从新恢复病毒的感染性。带有二硫键的化合物还有cyclic 2’2dithiobisbenzamide(SRS-SB3)，dithianes和isothiazolone(PD-16B74)。PD-161374是Parke-Davis公司研究开发的一个锌指结构抑制剂，已经进行了一期临床实验，在实验过程发现毒性太大而终止。上面提到的二硫化合物经过修饰反应生成了一系列thioester和pyridniolkanoyl derivatized thioesters(PATES)，Tioesters和PATES类化合物在转基因小鼠模型上研究有强大的抗HIV活性。Tioester口服可以利用，抗病毒活性与indinavir一样，但毒副作用比它小的多。

芳香硝基化合物作为核壳蛋白p7抑制剂，在抗艾滋病药物中的应用还未在任何出版物中公开。芳香硝基化合物的制备已在US 5464871中公开。

发明内容

本发明提供了芳香硝基化合物在制备治疗艾滋病药物中的应用，该应用的特征是单独给予芳香硝基化合物或其药学上可接受形式的组合物，或与常用抗艾滋病药物合并给药，芳香硝基化合物的给药量达到足以有效地抑制或退行艾滋病病毒生长的作用，其中芳香硝基化合物具有下列通式结构式：

或其药学上可接受形式的组合物，其中：

R₁，R₂和R₃各自独立地选自：氢基、羟基、卤素、氰基、硝基、(C₁-C₆)烷基、(C₁-C₆)烷氧基、(C₃-C₇)环烷基或苯基。其中一个特别优选的化合物为4-碘-3-硝基苯甲酰胺(I-NO₂BA)。

芳香硝基化合物在制备治疗艾滋病药物中的应用是基于其对HIV核壳蛋白P7(NCp7)的抑制作用。HIV核壳蛋白P7(NCp7)的锌指结构，从生物学上讲，锌指结构在感染期和病毒复制的合成期都是必须的；从化学上讲，这些锌指结构具有亲核性，易于亲电基团攻击而发生化学改变，这种性质表明锌指结构作为靶点的合理性。此外，三个半胱氨酸和一个组氨酸(CCHC)组成的与锌结合的锌指结构是绝对保守的。这说明这个结构突变的能力是非常有限的。因而如果锌指结构发生突变，使HIV产生耐药。假如发生这种情况，那么，其锌指结构本身的突变，就会使病毒复制能力下降。选择NCp7和它的锌指结构作为抗病毒的靶点是非常关键而且也是非常新颖的。其后，对其性质的进一步了解，使开发芳香硝基化合物得到进一步保证。

逆转录病毒的锌指结构最显著的特点是它的络合残基(三个cys和一个His)和由cys-x2-cys-x4-his-x4-cys(CCHC)序列构成的空间绝对保守性。除了Spumaretrovirus在它的NCp7结构中没有锌指结构外，在其它的逆转录病毒中，它都是非常保守的。研究已经清楚的证明，把CCHC之中任何一个突变成其他氨基酸残基都会导致生成的病毒没有感染性，包括将逆转录病毒的CCHC序列转变成真核细胞典型的CCCC或者CCHH锌指结构。因此，由此看出，逆转录病毒的CCHC是不允许突变的。

逆转录病毒编码的NCp7蛋白的锌指结构来自于gag基因。对于HIV-1来说，NCp7锌指结构位于Gag(Pr55^gag)的C末端以及Gag-Pol(Pr160^gag-pol)前体多肽比较中心的位置。HIV-1前病毒DNA整合进宿主细胞DNA后(图8-3)，全长病毒RNA转录体产生，被翻译成Pr55^gag和Pr160^gag-pol前体多聚蛋白。作为前体多聚蛋白的组分，逆转录病毒的锌指结构在正确选择全长的基因组分RNA，包装成为新病毒颗粒的过程中起着重要作用。RNA：前体复合物在细胞摸内表面聚合，前病毒颗粒(不成熟，还不具有感染性)就会产生。

伴随着宿主细胞产生不成熟的前病毒颗粒，Pr160gag-pol形成二聚体，HIV-1蛋白酶自动从前体蛋白切割分离出来，继续把前体加工成成熟蛋白和有活性的病毒酶。作为成熟病毒颗粒的组分，成熟的NCp7蛋白的CCHC逆转录病毒锌指结构区继续参与HIV-1的复制循环。HIV吸附以及和靶细胞融合后，逆转录的锌指结构参与其后的转录启始，模板转换以及延长。另外在前病毒DNA转运入核的过程中，NCp7还有保护DNA的作用。这也说明，在新一轮病毒感染时，NCp7也是必须的。因而，这个逆转录病毒锌指结构在病毒复制过程中的多个阶段都扮演着重要的作用。逆转录锌指结构在病毒复制中重要性以及它突变后病毒感染能力的丧失，都说明逆转录病毒锌指结构保持完整的重要性。HIV复制依靠逆转录病毒锌指结构的忠实性说明这个部位是HIV病毒一个极其脆弱的位点。

芳香硝基化合物作为核壳蛋白p7抑制剂，在单用抗艾滋病病毒试验中显示了较强的病毒生长抑制活性。

但是，发明安全有效和使用方便的芳香硝基化合物合并常用抗艾滋病药的方案，能协同抑制和/禁止艾滋病病毒的繁殖和生长，从而达到更佳的抗艾滋病效果是本发明的另一目的。

在当今的艾滋病治疗方案中，比较流行的是“鸡尾酒疗法”，即几种抗艾滋病药物的联合用药，只要他们之间不产生拮抗作用，就是比较可行的治疗方案。本发明中与芳香硝基化合物合并使用的常用抗艾滋病药包括逆转录酶类和蛋白酶类抗艾滋病药物，这些药物都是已知的，并且在临床上有应用，这些药物包括拉米夫定、齐多夫定、去羟肌苷、司他夫定、阿巴卡韦、奈韦拉平、依非韦伦、茚地那非、利托那韦、奈非那韦、沙奎那韦等。本发明中，齐多夫定(AZT)是优选的合并用药抗艾滋病药物。

本发明还提供在艾滋病治疗中合并芳香硝基化合物以及常用抗艾滋病药给药的方式，可以同时、分别或按顺序使用。

本发明进一步的一个方面是提供了治疗哺乳动物(包括人类)艾滋病治疗的方法，其包括单独给予芳香硝基化合物以及合并常用抗艾滋病药物，其中给予芳香硝基化合物的量，达到足以有效地抑制或退行艾滋病毒的生长。

本发明所称“协同抗艾滋病作用”是指抑制艾滋病毒的生长，其包括合并给与哺乳动物有效量的芳香硝基化合物以及常用抗艾滋病药物。

本发明所称“给药”是指口服或/和非胃肠道给药方式。“非胃肠道”是指静脉，皮下以及肌肉内给药。在本发明中芳香硝基化合物可以单独或与常用抗艾滋病药物同时给药，或者也可以任意的顺序，依次给与这些化合物。比较可取的做法是根据以下因素对实际中所采用的方法以及给药的顺序进行适当变化，这些因素包括：所应用的芳香硝基化合物的可以含有能增加其溶解度的药学上可接受的载体、溶剂和赋形物的特定配方，所应用的常用抗艾滋病药物的特定配方，所治疗的特定艾滋病模型以及所治疗的特定宿主。

使用芳香硝基化合物药学上可接受形式的组合物。该组合物含有能增加药物溶解度的药学上可接受的载体、溶剂和赋形物。

在本发明的应用中，其中给与芳香硝基化合物的量，达到足以有效地抑制或退行艾滋病病毒的生长。

本发明的芳香硝基化合物可以采用美国专利5464871公开的方法制备得到。

附图说明

4-碘-3-硝基苯甲酰胺(I-NO₂BA)合并齐多夫定(AZT)抗HIV活性。

具体实施方式

下列实施例列举了本发明的特征，它将说明但不限制本发明。

实施例1：制剂

1.胶囊

                            每1000粒用量

主药                        150g

乳糖                        80g

预胶化淀粉                  65g

7％PVP或淀粉浆或HPMC        适量

低取代羟丙基纤维素          18g

微粉硅胶                    2.0g

主药研细过筛后与乳糖、预胶化淀粉混合均匀，加入粘合剂溶液制成软材，制粒，湿颗粒干燥。整粒后加入处方中其余组分混匀，装胶囊即可。

2.注射剂

按下列配方制备注射剂(1000ml)：

                            按1000ml计

主药                        10g

PEG400                      400ml

乙醇                        100

生理盐水                    加至1000ml

按处方配制PEG400：乙醇溶剂，主药加入该溶剂中，加热使溶解，分装，灭菌后即得。

实施例2：4-碘-3-硝基苯甲酰胺对人单核/巨噬细胞中HIV复制的抑制作用

在单核/巨噬细胞体系中，用HIV-1_ADA和HIV-1_Ba-L嗜单核细胞病毒株，检测4-碘-3-硝基苯甲酰胺抗病毒活性。4-碘-3-硝基苯甲酰胺可以有效地抑制HIV-1在单核/巨噬细胞中的复制，对HIV-1_ADA毒株的抑制EC₅₀为2-10uM，对HIV-1_Ba-1的EC₅₀为0.3-10uM，在高达200uM的浓度下也未观察到细胞毒性，说明本品是安全有效的。

每一株病毒分为三组，感染病毒的细胞两组，不感染病毒细胞一组。感染病毒的两组一组用药一组不用药，用来测定药物作用的EC₅₀。不感染病毒的用药，用来测定药物对细胞的IC₅₀。

分离人单核/巨噬细胞，将分离的单核/巨噬细胞稀释成1×10⁴个/ml，加入96孔板，每空1000个细胞/100ul，药物分8个浓度，每个浓度3个复孔，用MOI为1∶10的病毒感染，同时加入药物，培养7天，要定量PCR测定p24的量，根据测定的结果绘制剂量反应曲线，得出EC₅₀和IC₅₀。

4-碘-3-硝基苯甲酰胺可以有效地抑制HIV-1在单核/巨噬细胞中的复制，对HIV-1_ADA毒株的抑制EC₅₀是2-10uM，对HIV-1_Ba-1的EC₅₀是0.3-10uM，在高达200uM的浓度下也未观察到细胞毒性。说明本品对人单核/巨噬细胞中HIV复制有显著抑制作用，并且安全。(结果见表1)。

表14-碘-3-硝基苯甲酰胺抗HIV-1研究(宿主为人巨噬细胞和单核细胞)

细胞线	病毒	基于P-24的抗病毒测定(μM)
			单核细胞/巨噬细胞	HIV-1ADA	EC50 2.0-10 IC50 230
单核细胞/巨噬细胞	HIV-1Ba-L	EC50 0.3-10 IC50 ＞200

实施例3：4-碘-3-硝基苯甲酰胺(I-NO₂BA)合并齐多夫定(AZT)对HIV复制的抑制作用

在单核/巨噬细胞体系中，用HIV-1_ADA嗜单核细胞病毒株，检测4-碘-3-硝基苯甲酰胺合并AZT的抗病毒活性。4-碘-3-硝基苯甲酰胺合并AZT可以加强4-碘-3-硝基苯甲酰胺抑制HIV-1在单核/巨噬细胞中的复制，这说明4-碘-3-硝基苯甲酰胺合并AZT的作用是协同作用，而不是拮抗作用。

试验分为三组，AZT一组，4-碘-3-硝基苯甲酰胺一组，合并用药一组。分离人单核/巨噬细胞，将分离的单核/巨噬细胞稀释成1×10⁴个/ml，加入96孔板，每空1000个细胞/100ul，AZT药物浓度是没有作用的0.01nm/ml，4-碘-3-硝基苯甲酰胺分为5个浓度，0.01，0.1，1.0，10，100um分5个浓度，每个浓度3个复孔。另设空白为对照，用MOI为1∶10的病毒感染，同时加入药物，培养7天，要定量PCR测定p24的量，根据测定的结果绘制剂量反应曲线(见图1)。

为了解4-碘-3-硝基苯甲酰胺与常用抗艾滋病药物合并使用时的相互作用，就选择了治疗AIDS最常用药物AZT，在体外观察它们联合使用抗HIV的活性。这种试验要求在细胞水平上来检测它们的抗病毒活性。此外合并试验还要确定它们各自的EC₅₀，在试验中药物浓度的选择一定要涵盖它们的EC₅₀，试验结果要通过统计分析来得出它们是相加，协同还是拮抗作用。

4-碘-3-硝基苯甲酰胺具有抗肿瘤活性，因此任何抗病毒活性分析必须使用新鲜的人单核/巨噬细胞系统。因此，典型的用肿瘤细胞系所作的合并试验不能进行。虽然有这样的困难，我们仍然努力尝试用人新鲜的单核/巨噬细胞培养做了4-碘-3-硝基苯甲酰胺和AZT的联合治疗。众所周知，每次细胞培养都有一定的可变性，因而药物的EC₅₀也会随着细胞的不同而变化。因此，基于以上情况，我们将一般的合并治疗方案进行了修改，AZT浓度的选择不是选择它的EC₅₀，而是选用没有抗病毒活性的浓度(10E-11M)，而4-碘-3-硝基苯甲酰胺的浓度包含了EC₅₀。合并治疗的结果见附图，从图中可以看出，二者在4-碘-3-硝基苯甲酰胺的0.1-100uM之间具有协同作用。因而，这个改进的合并研究说明了4-碘-3-硝基苯甲酰胺可以和常用抗艾滋病药物合并用于抗艾滋病。

Claims (9)

1.芳香硝基化合物在制备治疗艾滋病药物中的应用，其中芳香硝基化合物具有下列通式结构式：

或药学上可接受形式的组合物，其中：

R₁，R₂和R₃各自独立地选自：氢基、羟基、卤素、氰基、硝基、(C₁-C₆)烷基、(C₁-C₆)烷氧基、(C₃-C₇)环烷基或苯基。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述的芳香硝基化合物为4-碘-3-硝基苯甲酰胺。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其中给予芳香硝基化合物的途径为口服或/和非胃肠道给药方式。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其中芳香硝基化合物药学上可接受形式的组合物，其特征在于含有能增加药物溶解度的药学上可接受的载体、溶剂或赋形物。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其中给予芳香硝基化合物可以单独进行或在给予常用抗艾滋病药物同时、分别或按顺序进行。

6.根据权利要求5所述的应用，其中给予芳香硝基化合物是在给予常用抗艾滋病药物同时、分别或按顺序进行。

7.根据权利要求1或2所述的应用，其中给予芳香硝基化合物的量，达到足以有效地抑制或退行艾滋病病毒的生长。

8.根据权利要求5所述的应用，其中常用抗艾滋病药物是指拉米夫定、齐多夫定、去羟肌苷、司他夫定、阿巴卡韦、奈韦拉平、依非韦伦、茚地那非、利托那韦、奈非那韦、沙奎那韦等。

9.根据权利要求8所述的应用，其中优选的常用抗艾滋病药物为齐多夫定。

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