CN101184991A - 涉及平行和同时分离的电泳方法 - Google Patents

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Abstract

提供一种电泳方法，它涉及在分离腔室(100)内使用多个分离亚空间(136a－136c)的平行和同时的多个工艺。在一个实施方案中，腔室含有在腔室(100)的相对侧壁处平行地排列的单一的阳极(120)和单一的阴极(122)。在腔室内的分离空间用边界(138)分成三个单独的分离亚空间(136a－136c)。每一亚空间具有样品入口(140a－140c)，分离介质入口(126a－126c)和阳极稳定介质入口(128a－128b)和阴极稳定介质入口(130a－130c)。还提供分离的馏分出口(132a－132c)。通过阴极稳定介质和阳极稳定介质，例如入口(130a)和(128b)与入口(130b)和(128c)的相邻流动，确定在相邻的亚空间内的边界(138)。

Description

涉及平行和同时分离的电泳方法
技术领域
本发明涉及牵涉平行和同时分离的电泳方法。
背景技术
由于在DE805399；Barrolier，J等人在Z.Naturforschung，1958，13B，第754-755页；Hannig，K.在Zeitschrift der AnalytischenChemie，1961，181，第244-254页和Roman，M.等人在Journal ofChromatography 1992，592，第3-12页中公开了被称为自由流动电泳(FFE)的方法的原理，因此发现在工业和化学中使用的有效分析和制备方法当中这一技术具有永久的位置。尽管小的离子以及大的颗粒二者均可使用这一技术分离，但主要应用是分级蛋白质，特别是生物技术生产酶和其他生物活性蛋白质、膜颗粒和甚至存活细胞。与能分离单独的样品组分的其他方法相比，FFE提供两个主要的优点：(i)可连续进行分离且能使人获得多达数百mg或者甚至g含量的纯物质/小时，和(ii)分离过程温和且保持被分离组分的酶活性。FFE技术尤其可用于分离和分级复杂蛋白质，因此可应用于proteomics的应急领域，该领域在科学研究、药物、生物技术和临床诊断市场中变得愈加重要。例如，当proteomic研究增长时，愈加需求改进蛋白质的分离性能，特别是相对于离析工艺的可靠度和通用的前端。
一般地，自由流动的分离方法适合于分离任何分子量的离子以及生物颗粒。通常不关心待分离的样品是否本身荷电或者是否通过吸收或吸附离子产生电荷。在例如美国专利5275706中反映了通过稳定介质和逆流介质，连续偏转电泳的方法及其改进，其公开内容在此通过参考引入。根据这一专利，逆流介质与分离介质流动方向相反地引入到分离空间内。这两种介质通过分级出口排放，从而导致具有低空隙体积的分级，和另外维持介质在例如具有非常低湍流的分级出口区域内的层流。可在例如美国专利申请2004/0050697中找到各种模式的自由流动电泳的讨论，其公开内容在此通过参考引入。
等电点聚焦是一种电泳技术，它给缓冲溶液增加pH梯度，且与电场一起集中大多数两性的生物材料。两性生物材料，例如蛋白质、肽和病毒在酸性介质内荷正电和在碱性介质内荷负电。在IEF期间，在横向，即与流动方向相反的方向上建立的pH梯度内这些材料迁移到其等电点(pl)，在此它们不具有净电荷并形成稳定的窄区域。在这一点处，材料终止横向迁移且它们变得集中。在这一技术中，不存在电压的依赖关系。等电点聚焦得到这种高离析带，这是因为通过pH梯度和电场的结合作用，由于扩散或流体运动导致的从其等电点处移开的任何两性生物材料将会返回。聚焦工艺因此纯化并浓缩样品为相对稳定的带。这是得到一些最高离析分离的强有力概念，特别是当在二维凝胶内与电泳结合时。
区域电泳是可在FFE中使用的另一种分离模式。区域电泳主要基于电荷，且在较小的程度上基于形式与尺寸来分离生物颗粒。可在FFE中使用的进一步的模式是等速电泳(ITP)。ITP FFE涉及使用非均质的分离介质。当各组分与起始样品的主要带分离时，基于局部的条件，这些组分与本体样品流动相反地进入当它们加速或减速时的区域内。然后利用这一所谓的聚焦效果从本体样品中分级所得的组分。
典型地，FFE方法涉及通过使样品流经在腔室内的单一分离空间进行分离，其中这一空间被两个电极从侧面包围(flank)。在美国专利申请US 2004/045826中反映了在单一的腔室内允许平行和同时聚焦的改进方法。这一专利申请公开了具有多个电极的单一分离腔室，以便在单一腔室内提供多个分离空间。希望在单一腔室内涉及平行、同时分离的进一步改进。
发明内容
在一个实施方案中，本发明提供一种方法，该方法包括下述步骤：
(a)提供含第一端壁、第二端壁、第一侧壁、第二侧壁和两块板的分离腔室，其中端壁、侧壁和板确定分离空间；位于分离腔室内分别与第一侧壁和第二侧壁邻近的单一阳极和单一阴极；与第一端壁相邻地布置的至少两个样品入口；与第一端壁相邻地布置的至少两个分离介质入口；与第一端壁相邻且与阳极相邻的第一阳极稳定介质入口；与第一端壁相邻且与阴极相邻的第一阴极稳定介质入口；和一个或更多个额外的阳极稳定介质入口和一个或更多个额外的阴极稳定介质入口，其中额外的阳极和阴极稳定介质入口与第一端壁相邻地布置且进一步位于第一阳极稳定介质入口和第一阴极稳定介质入口之间，
(b)通过至少两个分离介质入口引入至少一种分离介质到分离腔室内，
(c)通过至少两个样品入口引入一种或更多种待分离的样品到分离腔室内，和
(d)通过第一和额外的阳极稳定介质入口引入阳极稳定介质到分离腔室内，和通过第一和额外的阴极稳定介质入口引入阴极稳定介质到分离腔室内，其中通过阳极和阴极稳定介质经额外的阳极稳定介质入口和额外的阴极稳定介质入口的相邻流动，提供确定分离亚空间的一个或更多个边界。
在进一步的实施方案中，本发明提供一种方法，该方法包括下述步骤：
(a)提供含第一端壁、第二端壁、第一侧壁、第二侧壁和两块板的分离腔室，其中端壁、侧壁和板确定分离空间；位于分离腔室内分别与第一侧壁和第二侧壁邻近的阳极和阴极；与第一端壁相邻地布置的至少两个样品入口；与第一端壁相邻地布置的至少两个分离介质入口；与第一端壁相邻且与阳极相邻的第一阳极稳定介质入口；与第一端壁相邻且与阴极相邻的第一阴极稳定介质入口；和一个或更多个额外的阳极稳定介质入口和一个或更多个额外的阴极稳定介质入口，其中额外的阳极和阴极稳定介质入口与第一端壁相邻地布置且进一步位于第一阳极稳定介质入口和第一阴极稳定介质入口之间，
(b)通过至少两个分离介质入口引入至少一种分离介质到分离腔室内，
(c)通过至少两个样品入口引入一种或更多种待分离的样品到分离腔室内，和
(d)通过第一和额外的阳极稳定介质入口引入阳极稳定介质到分离腔室内，和通过第一和额外的阴极稳定介质入口引入阳极稳定介质到分离腔室内，其中通过阳极和阴极稳定介质经额外的阳极稳定介质入口和额外的阴极稳定介质入口的相邻流动，提供确定分离亚空间的一个或更多个边界，其中阳极稳定介质包括单质子酸，所述单质子酸中的阴离子的电泳迁移率小于或等于约40m2/V/s，和其中阴极稳定介质包括一元碱，其中所述一元碱中的阳离子的电泳迁移率小于或等于约40m2/V/s。
这些实施方案还涉及借助阳极和阴极产生电场。分离亚空间允许在总的装置内平行和同时分离，其中每一亚空间基本上充当单独的分离腔室。本发明因此能借助平行和同时的工艺提供例如分离增加量的样品，且不需要多个分离腔室和仪器。
(在以上这两个实施方案中，可同时进行一个或更多个引入和发生步骤，或者与以上列出的不同顺序进行)。
附图说明
图1是进行平行和同时的无载流子电泳的现有技术装置的示意图，它包括三个分离空间，其中每一空间由两个电极来定义。
图2是本发明实施方案的示意图。
图3示出了根据本发明的实施方案，自由流动的电泳腔室的特征。
具体实施方式
图1示出了现有技术的分离腔室10，它分成三个分离空间，其中每一个空间被阳极和阴极(即阳极20a和阴极22a，阴极22a和阳极20b，以及阳极20b和阴极22b的电极对)从侧面包围。(还提供电极膜24a-24f)。每一分离空间含有：样品入口40a、40b、40c；阳极稳定介质入口28a、28b、28c；阴极稳定介质入口30a、30b、30c；和分离介质入口26a、26b和26c。因此，由第一端壁14、第二端壁12和侧壁16与18以及两块平行板(未示出)确定的分离腔室，含有三个分离亚空间，所述分离亚空间允许同时发生三个分离操作。在每一亚空间内，如上所述，基于例如其等电点，一部分注入的样品在与流动方向相反的方向上分离。通过与第二端壁相邻地排列的收集出口32a、32b、32c收集分离的馏分。典型地收集的分析物通过单独的管道导出到单独的收集容器、壁、微滤(microfiter)板或类似物(未示出)上。腔室形状典型地为矩形，其中端壁12、14和侧壁16、18形成矩形并支持形成分离空间而紧密地隔开的相反的平行板。在腔室内与侧壁平行地排列电极。
根据本发明的实施方案，可在单一的阳极和单一的阴极之间产生多个分离亚空间。以下的实施方案涉及具有单一阳极和阴极的分离腔室，但例如可具有多个阳极和阴极，其中多个分离亚空间在每一阳极-阴极对之间。
图2图示了根据本发明的实施方案进行平行和同时无载流子分离的分离腔室100。类似于现有技术的腔室构造分离腔室100，但包含在腔室100的相对侧壁处平行地排列的仅仅单一的阳极120和单一的阴极122。在腔室内的分离空间被分成三个单独的分离亚空间136a-136c，且通过元件138鉴定边界。每一亚空间具有样品入口140a-140c，分离介质入口126a-126c，阳极稳定介质入口128a-128b和阴极稳定介质入口130a-130c。还提供被分离的馏分出口132a-132c。箭头示出了从入口开始流动的方向。
正如以下更详细地描述的，通过阴极稳定介质和阳极稳定介质，例如入口130a和128b，和入口130b和128c的相邻流动，来确定在两个相邻的亚空间之间的边界138。所有介质典型地通过它们各自的入口经泵，例如多通道蠕动泵引入。电极膜124a和124b典型地导电，且隔开电极空间与分离空间，以防止因流体动力学流动引起的介质交换。(膜典型地非常靠近电极布置，但为了清楚起见，附图示出了与电极隔开的膜)。
上述实施方案的方法能提供两个电极分离腔室，其中x个单独的分离亚空间被x+1个电极稳定介质流体从侧面包围。根据一个实施方案，为了在分离腔室内产生分离亚空间，提供s-1对相邻的阳极/阴极稳定介质入口，提供至少s个注入样品的入口，提供至少s个分离介质入口，和提供至少s个，典型地至少3s个分级出口。取决于分离腔室的尺寸，所产生的分离亚空间s的数量可以是2-7个。显然将因此调节引入样品的泵、分离介质和电极稳定介质的数量，以及在每一泵内包括的通道数量。
根据本发明的实施方案，通过选择用于阳极和阴极介质的单质子酸和一元碱，可降低不同的分离亚空间之间的横向污染(例如，跨过边界138的污染)。通常有用的是提供具有高分子量和低电泳迁移率的这种酸和碱。
特别地，根据一个实施方案，阳极和阴极介质中的单质子酸和一元碱的分子量为至少约100，和在另一实施方案中，范围为约150-约300。在另一实施方案中，单质子酸和一元碱二者的有效浓度(彼此独立的浓度)为至少约50mmol/l。
根据另一实施方案，阳极稳定介质含有单质子酸，其中所述单质子酸中的阴离子的电泳迁移率≤约40×10-9m2/V/s，和阳极稳定介质含有一元碱，其中所述一元碱中阳离子的电泳迁移率≤约40×10-9m2/V/s。在进一步的实施方案中，这种阴离子和这种阳离子的电泳迁移率为约25×10-9m2/V/s-约30×10-9m2/V/s。
此处所使用的电泳迁移率(EM)是指在电场内，在给定的场强下，在含水介质内单位时间中阴离子和阳离子的迁移速度。可如下所述计算电泳迁移率u：
u＝s/H×t
其中s表示迁移距离(m)，H表示电场强度(V/m)和t表示时间(s)。
在本发明的一些实施方案中，阳极稳定介质(它典型地含水)含有选自葡糖酸、葡糖醛酸、乙酰基水杨酸、2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)和两性离子缓冲液(也称为Goods缓冲液-参见Good等人的Biochemistry5,467(1966))中的酸。在本发明的一些实施方案中，阴极稳定介质(它典型地含水)含有选自N-甲基-D-葡糖胺、三-异丙醇胺和2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙-1，3-二醇(BISTRIS)中的碱。
图3示出了图2所反映的工艺效果，其中示出了分离亚空间136b和136c的各方面。粗的虚线138描述了在亚空间之间的边界，其中较轻的虚线示出了来自各种入口处的介质流动路径。术语REC表示介质的相对导电率。图3示出了阳极120和阴极122。阳极稳定介质通过入口128b和128c引入，阴极稳定介质通过入口130b和130c引入，和分离介质通过入口126b和126c引入，其中流动如箭头所示的方向。
正如图3所反映的，控制阴极稳定介质中的阳离子(B+)和越过空间136a和136b之间(在阳极和阴极分离介质的相邻流线之间)的界面的阴离子(A-)的交叉(crossover)，从而维持单独的分离亚空间的完整性。特别地，如上所述，选择具有相对低电泳迁移率的阴离子和阳离子的单质子酸和碱将降低交叉。
另外，如图3中的REC图表所反映的，介质的相对导电率也可有助于分离亚空间的完整性。在一个实施方案中，来自入口128c和130c的阳极和阴极稳定介质的导电率是来自入口126c的分离介质的导电率的至少5倍，且有助于维持在分离介质内的样品流动。然而，当选择较高的导电率稳定介质时，可遇到较高的热量耗散和增加的密度与粘度(和因此较低的流速)。于是，通常达成各种参数和考虑因素之间的平衡。
在IEF模式的情况下，有用地选择具有特定pH值的介质，以促进感兴趣的组分分离。一般地，基于感兴趣的一种或多种组分的等电点，选择pH值，以确保合适地分离各组分。在一些实施方案中，有用地提供比分离介质的最低pH成分的pH小约0.5-约3个pH单位的阳极稳定介质。类似地，有用地提供比分离介质的最高pH成分的pH高约0.5-约3个pH单位的阴极稳定介质。在一些实施方案中，这些范围为约0.8-约2个pH单位。在图3所反映的实施方案中，对于亚空间136c来说，横跨来自入口126c的分离介质，在来自入口130c的阴极稳定介质和来自入口128c的阳极分离介质之间，产生pH梯度152。典型地，横跨分离介质产生的梯度152的pH跨度可在约0.3至约8.5之间变化。
再次参考图2，在分离腔室的第二端处，在每一单独的分离腔室内在不同路径上流动的单独的分离分析物通过收集出口132a-132c收集，所述收集入口132a-132c通常沿着垂直于流动方向的线排列。典型地，每一分离亚空间含有相同的收集出口布局。若分离相同的样品和希望相同的馏分，则可合并来自每一分离亚空间的含有相同分析物的收集出口流出液。
单独的分析物经多个收集出口132a-132c流出分离腔室，且通常经单独的管线导出到任何合适类型的单独的收集容器中。在收集容器中，一起收集分析物与分离介质和逆流介质。在一列收集出口的单独收集出口之间的距离通常应当尽可能小，以便提供合适的分级/分离。从收集出口中心处测量的单独的收集出口之间的距离可以是约0.1mm-约2mm，更典型地约0.3mm-约1.5mm。
根据本发明的实施方案，可在腔室中使用逆流。例如，在图2中，将逆流介质经逆流元件134以与样品和分离介质引入其内的方向相反的方向引入到分离腔室中。通过允许在收集出口132a-132c处调节和控制流速与压力条件，逆流将加快分离。
典型地选择逆流介质能改性或者超越接近分级出口的分离介质的缓冲能力，因此它可以是具有相同粘度和密度但不同导电率和/或pH值和/或其化学成分的材料。典型的逆流和分离介质选自相同组的介质，并典型地含有诸如脲、甘油、碳水化合物葡萄糖和类似化合物之类的组分。这种介质通常含有可变等电点的两性物质的混合物，以便单独的组分在腔室内的电场影响下变得有序。这些介质商购于数种来源，例如获自General Electric的ImmobilineTM、AmpholineTM和PharmalyteTM，获自SERVA Electrophoresis GmbH的ServalytTM和获自Becton，Dickinson and Company的类似材料。
分离介质的流速和逆流介质的流速的有效比值为约1∶10到约10∶1，更典型地约1∶3到约3∶1。分离介质和逆流介质的实际流速取决于各种考虑因素，其中包括仪器的几何尺寸，所使用的特定的分离模式(它可在所要求的通行(transit)时间内变化)、待分离的样品、所使用的分离介质和所使用的一种或多种逆流介质，以便获得分析物的最佳分离。在体系内所有介质(稳定和逆流介质)的典型流速因此可宽泛地在0.3ml/h-3000ml/h内变化。
根据本发明的实施方案的装置进一步包括分离介质用的多通道泵，样品用的多通道泵，和一种或多种逆流介质用的多通道泵。该装置进一步包括馏分收集出口和出口管道。典型地，泵是多通道的蠕动泵。
根据本发明的实施方案，可结合该方法与自由流动的电泳工艺和装置的变体。例如，可使用多个装置，然后平行和/或串联地排列。或者，在装置的收集出口处收集的各组分流体可循环回到相应的样品入口处，形成可通过增加样品组分的停留时间来改进离析的循环工艺。
分离腔室的底板和顶板可独立地由玻璃或者合适的塑料，例如PVC，聚烯烃，聚碳酸酯，树脂玻璃，聚卤代烃或Lucite_(基本上由聚合的甲基丙烯酸甲酯组成的丙烯酸类树脂)制造，其中优选聚合物涂布的玻璃。顶板和底板典型地通过充当垫圈或密封垫的隔板隔开。
电极典型地由在电场内不容易氧化的金属，例如铂构成。电极典型地通过离子交换的尼龙或乙酸纤维素膜与分离腔室隔开。典型地通过盐或缓冲溶液恒定地洗涤电极，以除去在该工艺过程中产生的电解产物。
分离空间(在板之间的空间)的厚度典型地为约0.1-约1.5mm，优选约0.3至约1.0mm。
根据本发明的实施方案，控温也是有用的。当电流流经电解质溶液时，根据被称为焦耳加热的现象，传导介质的温度增加。为了降低因这种加热引起的流动介质的层流曲线的干扰，通常希望耗散焦耳热量到周围环境中。在一个实施方案中，分离腔室在金属载体上与其底板一起排列，所述金属载体含有与控温装置相连的流体流动腔室，例如控制分离腔室温度的恒温体系。有用的温度范围为约2℃至约35℃，更典型地约5℃-室温(约25℃)。
本发明尤其适合于，但不限于分析和制备分离离子、肽、生物聚合物、生物颗粒以及合成聚合物和颗粒。
另外，各种FFE模式是可能的，例如I EF和等速电泳。认为在单一腔室内的所有亚空间使用单一的FFE模式，或者在相同腔室内的不同亚空间可使用不同的模式。
上述描述性实施方案仅仅是本发明的例举，和存在落在本发明范围内的许多改性和替代模式，本发明的范围在所附的权利要求中列出。

Claims (27)

1.一种电泳方法，该方法包括下述步骤：
(a)提供含第一端壁、第二端壁、第一侧壁、第二侧壁和两块板的分离腔室，其中端壁、侧壁和板确定分离空间；位于分离腔室内分别与第一侧壁和第二侧壁邻近的单一阳极和单一阴极；与第一端壁相邻地布置的至少两个样品入口；与第一端壁相邻地布置的至少两个分离介质入口；与第一端壁相邻且与阳极相邻的第一阳极稳定介质入口；与第一端壁相邻且与阴极相邻的第一阴极稳定介质入口；和一个或更多个额外的阳极稳定介质入口和一个或更多个额外的阴极稳定介质入口，其中额外的阳极和阴极稳定介质入口与第一端壁相邻地布置且进一步位于第一阳极稳定介质入口和第一阴极稳定介质入口之间，
(b)通过所述至少两个分离介质入口引入至少一种分离介质到分离腔室内，
(c)通过所述至少两个样品入口引入一种或更多种待分离的样品到分离腔室内，
(d)借助阳极和阴极产生电场；和
(e)通过第一和额外的阳极稳定介质入口引入阳极稳定介质到分离腔室内，和通过第一和额外的阴极稳定介质入口引入阳极稳定介质到分离腔室内，其中通过阳极和阴极稳定介质经额外的一个或更多个附加阳极稳定介质入口和所述一个或更多个额外的阴极稳定介质入口的相邻流动，提供确定分离亚空间的一个或更多个边界。
2.权利要求1的方法，其中阳极稳定介质包括单质子酸，所述单质子酸中的阴离子的电泳迁移率≤约40×10-9m2/V/s，和其中阴极稳定介质包括一元碱，其中所述一元碱中的阳离子的电泳迁移率≤约40×10-9m2/V/s。
3.权利要求2的方法，其中单质子酸中阴离子的电泳迁移率为约25×10-9m2/V/s-约30×10-9m2/V/s，和其中一元碱中阳离子的电泳迁移率为约25×10-9m2/V/s-约30×10-9m2/V/s。
4.权利要求1的方法，其中阳极稳定介质的pH比分离介质的最低pH成分的pH小约0.5-约3个pH单位，和其中阴极稳定介质的pH比分离介质的最高pH成分的pH高约0.5-约3个pH单位。
5.权利要求1的方法，其中阳极稳定介质包括选自葡糖酸、葡糖醛酸、乙酰基水杨酸、2-(N-吗啉代)乙磺酸和两性离子缓冲液中的酸。
6.权利要求1的方法，其中阴极稳定介质包括选自N-甲基-D-葡糖胺、三-异丙醇胺和2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙-1，3-二醇中的碱。
7.权利要求1的方法，其中分离腔室包括s个分离亚空间，s-1对阳极稳定介质和阴极稳定介质入口，至少s个样品入口，和至少s个分离介质入口，其中s为2-7。
8.权利要求1的方法，进一步包括下述步骤：将逆流介质从与分离腔室的第二壁相邻地布置的一个或更多个逆流入口处引入到每一分离亚空间内。
9.权利要求1的方法，其中第一和第二端壁，第一和第二侧壁和两块板确定矩形腔室。
10.权利要求9的方法，其中阳极和阴极基本上平行于第一和第二侧壁布置。
11.权利要求9的方法，其中所述板隔开约0.1mm-约1.5mm的距离。
12.权利要求1的方法，其中腔室进一步包括与第二端壁相邻地布置的多个收集出口。
13.权利要求1的方法，其中通过等电点聚焦分离所述一种或更多种样品。
14.权利要求1的方法，其中通过等速电泳分离所述一种或更多种样品。
15.一种电泳方法，该方法包括下述步骤：
(a)提供含第一端壁、第二端壁、第一侧壁、第二侧壁和两块板的分离腔室，其中端壁、侧壁和板确定分离空间；位于分离腔室内分别与第一侧壁和第二侧壁邻近的阳极和阴极；与第一端壁相邻地布置的至少两个样品入口；与第一端壁相邻地布置的至少两个分离介质入口；与第一端壁相邻且与阳极相邻的第一阳极稳定介质入口；与第一端壁相邻且与阴极相邻的第一阴极稳定介质入口；和一个或更多个额外的阳极稳定介质入口和一个或更多个额外的阴极稳定介质入口，其中额外的阳极和阴极稳定介质入口与第一端壁相邻地布置且进一步位于第一阳极稳定介质入口和第一阴极稳定介质入口之间，
(b)通过所述至少两个分离介质入口引入至少一种分离介质到分离腔室内，
(c)通过所述至少两个样品入口引入一种或更多种待分离的样品到分离腔室内，
(d)借助阳极和阴极产生电场；和
(e)通过第一和额外的阳极稳定介质入口引入阳极稳定介质到分离腔室内，和通过第一和额外的阴极稳定介质入口引入阴极稳定介质到分离腔室内，其中通过阳极和阴极稳定介质经所述一个或更多个额外的阳极稳定介质入口和所述一个或更多个额外的阴极稳定介质入口的相邻流动，提供确定分离亚空间的一个或更多个边界，其中阳极稳定介质包括单质子酸，所述单质子酸中的阴离子的电泳迁移率小于或等于约40m2/V/s，和其中阴极稳定介质包括一元碱，其中所述一元碱中的阳离子的电泳迁移率小于或等于约40m2/V/s。
16.权利要求15的方法，其中单质子酸中阴离子的电泳迁移率为约25×10-9m2/V/s-约30×10-9m2/V/s，和其中一元碱中阳离子的电泳迁移率为约25×10-9m2/V/s-约30×10-9m2/V/s。
17.权利要求15的方法，其中阳极稳定介质的pH比分离介质的最低pH成分的pH小约0.5-约3个pH单位，和其中阴极稳定介质的pH比分离介质的最高pH成分的pH高约0.5-约3个pH单位。
18.权利要求15的方法，其中阳极稳定介质包括选自葡糖酸、葡糖醛酸、乙酰基水杨酸、2-(N-吗啉代)乙磺酸和两性离子缓冲液中的酸。
19.权利要求15的方法，其中阴极稳定介质包括选自N-甲基-D-葡糖胺、三-异丙醇胺和2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙-1，3-二醇中的碱。
20.权利要求15的方法，其中分离腔室包括s个分离亚空间，s-1对阳极稳定介质和阴极稳定介质入口，至少s个样品入口，和至少s个分离介质入口，其中s为2-7。
21.权利要求15的方法，进一步包括下述步骤：将逆流介质从与分离腔室的第二壁相邻地布置的一个或更多个逆流入口处引入到每一分离亚空间内。
22.权利要求15的方法，其中第一和第二端壁，第一和第二侧壁和两块板确定矩形腔室。
23.权利要求22的方法，其中阳极和阴极基本上平行于第一和第二侧壁布置。
24.权利要求22的方法，其中板隔开约0.1mm-约1.5mm的距离。
25.权利要求15的方法，其中腔室进一步包括与第二端壁相邻地布置的多个收集出口。
26.权利要求15的方法，其中通过等电点聚焦分离所述一种或更多种样品。
27.权利要求15的方法，其中通过等速电泳分离所述一种或更多种样品。
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