CN1040117C - 色谱式电泳分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于分离蛋白质不同组分的色谱式电泳分离方法，属生物化学技术领域。本方法是在二个平行的窄长电极之间，沿电极长度方向平行设置三个以上凝胶膜，凝胶模将电极之间的空间隔成电极室、样品室、冲洗室等若干不同腔室。随后采用脉冲进样方式，利用待分离组分在凝胶膜中的电迁移速率差异作为分离基础，在与电场方向相垂直的方向上施加一冲洗载流，将从膜中先后移出的组分依次冲出，从而实现分离。
Description
本发明涉及一种用于分离蛋白质不同组分的色谱式电泳分离方法，属生物化学技术领域。
已有技术中，有一种反向作用色谱电泳，名称为″Counter ActionChromatographic E1ectrophoresis″，出处为；O’Farrell，P.H″Separation Technique Based on teh Opposition Two CounteractingForces to Produce a Dynamic Equifrium″，Scientc，Vol 227，1586(1985)该技术将体积排阻色谱原理与电泳原理相结合，并提出了相应的分离设备，其核心部分为长圆柱形电泳槽，电泳柱垂直放置，内部装有多层不同规格的凝胶，上层为小孔凝胶，下层为大孔凝胶(足允许所有的蛋白质进入孔中)。分离时，蛋白质被载流从上层凝胶颗粒间冲入下层凝颗粒内孔中，其下移速率将减慢；调整电场强度，使目标蛋白质在电场作用下向上移动的速率与其被载流冲洗下移的速率相同，此时其净迁移速率为零，在两层凝胶的接界处聚焦，而其余的蛋白质则因为向上的电迁移速率与向下移动的速率不同而不被聚焦，因此从电泳柱的上端或下端出口流出。这样在两层凝胶的接界处就可获得目标组分了。该技术的缺点是；(1)每次分离仅能获取一个目标组分，而其余组分均被稀释冲出；因而当目标组分不只一个或目标组分为同具有多个等电点的酶或蛋白质时，应用此方法就难取得高的产品收率。因此，此方法的适用范围有很大的局限性；(2)由于蛋白质的迁移速率低，电极距离大，而提高电场强度又受到装置换热能力的限制，造成该方法的分离速度低，上样量小，因此，此方法的分离处理量较低。
本发明的目的是提出一种新型电泳分离方法，它是将色谱分离操作与电泳分离原理结合，利用待分离组分在分离介质中的电迁移速率差异或等电点差异进行分离。
本发明的目的是这样实现的：在二个平行的窄长电极之间，沿长度方向平行设置(包括三个)以上凝胶膜，凝胶膜将电极之间的空间隔成几个腔室。最两端的两个腔室分别是阳极室和阴极室，中间的腔室按功能不同分为进样室和冲冼室，进样式和冲洗室互相间隔。分离进行时，向阳极室和阴极室分别施加电极液循环流。采用脉冲进样的方式，将样品液用泵注入到进样室中。在电极上施加一与腔室中液流方向相垂直的电场。腔室内的液流在与其方向相垂直的电场的作用下，样品液中的蛋白质将通过膜移向冲洗室。由于不同蛋白质在膜中的电迁移速率不同，迁移速率大的蛋白质先从膜中移出进入到冲洗室而被冲出，迁移速率小的蛋白质则需要更长一些的时间才能从膜中移出，迁入到冲洗室而被冲出这样不同的蛋白质因为它们在膜中的电迁移速率不同而被分离。当样品液中的蛋白质全部从冲洗室中被冲出后，一个分离周期即告结束，也就实现了分离不同蛋白质的目的。
附图说明：
图1中a、b、c是色谱式电泳分离过程原理图。
图1中，1和2是电极板，3是凝胶膜，4是阳极室，5是阴极室，6是样品室，7是冲洗室，8是样品中的快组分，9是样品中的慢组分。A为电极液，B为电阻液。其分离过程是：图1a为进样，图1b为快组分被分离后冲出，图1c为慢组分被分离后冲出。
本发明中，电极之间的距离为0.1Cm～10Cm，电极之间的电压为10V～400V，根据中间腔室的数量，适当调整电极电压。本发明所用的电极液和冲洗液为普通缓冲溶液，如曲瑞斯-甘氨酸、曲瑞斯一醋酸等。电极液的循环流速不小于200ml/h，冲洗液和样品液的流速为1ml/h～300ml/h。本发明所用的凝胶膜厚度为0.1mm～5mm。
本发明的效果是由于分离过程中电场的方向与冲洗载流的方向相互垂直，因而可以通过缩短电极间的距离，以低电压产生高电场强度，加快了组分的迁移速率，缩短了电迁移路径，减小了电泳热效应。
下面介绍本发明的几个实施例。
实施例1：
分离牛血红蛋白一牛血清蛋白混合物。
1.电极电压：50V
2.电极液和冲洗液：曲瑞斯-甘氨酸(PH＝8.09，0.02M)
3.样品液：含牛血红蛋白2mg/ml
含牛血清蛋白4mg/ml
用曲瑞斯—甘氨酸配制样品液。
4.二电极之间设置3张凝胶膜，凝胶膜为美国Gelman Sciences公司出品的TH Tuffryn膜。
5.各液流流量：
电解液：200ml/h
样品液：120ml/h
冲洗液：10ml/h
6.膜厚度：2.0mm
7.结果：可获得电泳纯牛血红蛋白和牛血清蛋白，产量达到10毫克/小时。
实施例2：
分离细胞色素C粗品
1.电极电压：200V
2.电极液和冲洗液：曲瑞斯-甘氨酸(PH＝5.90，0.02M)
3.样品液：样品浓度为5mg/ml，用曲瑞斯一醋酸配制。
4.电极之间设置5张凝胶膜，6个腔室依次是：阳极室、进样室、冲洗室、进样室、冲洗室和阴极室。
5.各液流流量：
电解液：250ml/h样品液：10ml/h
冲洗液：180ml/h
6.膜厚度：3.0mm
7.结果：可从细胞色素C粗品中获得纯的还原型细胞色素C，处理量为50mg/h(单个腔室)总处理量：100ml/h。
实施例3：分离尿激酶粗品。
1.电极电压：150V
2.电极液和冲洗液：曲瑞斯-甘氨酸(PH＝8.9，0.02M)
3.样品液：以人尿中获得的尿激酶粗品，比活力≤4000iu/mgpr用曲瑞斯-甘氨酸制备。
4.电极之间设置3张凝胶膜。
5.各液流流量：
电极液：200ml/h
样品液：10ml/h
冲洗液：200ml/h
6.膜厚度：2.0mm
7.结果：产品比活力≥4000iu/mgpr，比原始样品提高10倍，处理量为10万单位/小时，A产品的比活力达到卫生部颁发的尿激酶素制剂标准。
Claims (1)
1、一种色谱式电泳分离方法，其特征在于该方法是在二个平行的电极之间，沿长度方向平行设置3张以上凝胶膜，凝胶膜将电极之间的空间隔成互相平行的腔室，紧靠两端电极的腔室为阳极室和阴极室，中间的腔室为进样室和冲洗室，两者相互间隔；对阳极室和阴极室施加电极液循环流，对进样室施加样品液流，对相邻的冲洗室施加冲洗液流，在电极上施加一与腔室中液流方向相互垂直的电场；所述的电极之间的距离为0.1cm～10cm；电极的电压为10V～400V，电极液的循环流速为200～250ml/h；所述的凝胶膜厚度为0.01mm～5mm。
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