CN101184851A - 有亲水聚合物覆盖的覆盖膜层的酶传感器 - Google Patents

Abstract

本发明公开了涉及改进的酶传感器，其包含多孔聚合物材料的覆盖膜层，亲水性聚合物覆盖的多孔聚合材料至少一面的外侧表面和孔口，特别地，亲水性聚合物选自亲水性聚氨基甲酸酯和亲水性聚(甲基)丙烯酸酯。此传感器可用于测定生物分析物的存在或量，所述生物分析物如葡萄糖，乳酸，肌酸，肌酸肝等。

Description

有亲水聚合物覆盖的覆盖膜层的酶传感器

发明领域

本发明涉及改进的酶传感器，其包含多孔聚合物材料的覆盖膜层，亲水性聚合物覆盖的多孔聚合材料至少一面的外层表面和孔口。

发明背景

酶传感器为检测前在传感器中，将测量的化学物质(分析物)经过酶催化反应的传感器。在分析物和酶(对于酶，分析物为底物)之间的反应，或酶的级联，产生了次生物质，其浓度(在理想条件下)与分析物的浓度成比例或者相同。随后，通过传感器检测次生物质的浓度，如电极方法。

酶传感器的酶通常包含在适合与流体样品接触的传感器膜中。最通常的，酶包含在传感器膜的隔开的酶层中，其通过覆盖膜与流体样品分离。因此，分析物在通过传感器的覆盖膜扩散后，与酶接触，随后，酶/分析物反应发生，并且随后次生物质扩散入传感器的检测部分，如，电极，以产生与分析物浓度相关的响应。

在酶传感器中，一方面，覆盖膜应该有合适的空隙，以便分析物以可控的方式从流体样品中扩散至酶层，即，对分析物的扩散阻力应该为优选的，以便分析物至次生物质的转变仅受分析物浓度的限制。

另一方面，覆盖膜两边均应该不渗透或大体上不渗透蛋白质，并且特别的，不渗透酶层的酶，以避免将酶漏入流体样品。

对于酶传感器有用的多孔覆盖膜包括径迹蚀刻的膜(即，膜分离处，原子轰击产生通透孔，然后蚀刻)和有扭曲孔的溶剂铸造膜(即，由连接的孔池形成的孔)。后者可以通过铸造溶解在溶剂中的物质作为分离薄膜或原位而制备，其中物质可包含能易于大量洗出从而形成孔的化合物。

常规上，有径迹蚀刻的覆盖膜的基于酶的传感器具有几点问题，其涉及大分子(即，分子量大于约1,000道尔顿)可透过其孔而扩散。

图4A和4B表明对于基于酶的传感器，有大的径迹蚀刻的孔的覆盖膜存在的问题。可以看出酶(25)如何迁移进入多孔覆盖膜(26)的孔中。改变填充程度(27)导致灵敏度的改变。例如，通过如酶穿透入覆盖膜(28)之外，或因为高和低水平样品中的分析物被两种不同的酶群所降解(在低分析物水平(33)的活性酶和在高分析物水平(32)的活性酶)可破坏传感器线性。样品方面，血蛋白(31)能够进入孔并沉淀在孔壁上，由此降低分析物的扩散系数，因此当测量血样品时传感器灵敏度降低。此外，仅仅在孔中存在的血蛋白可能导致血偏移。还有一个问题涉及在酶层中分析物的分布，特别是当使用径迹蚀刻的膜时。

如果来自于下酶层的活性酶可以迁移入或通过多孔覆盖膜，其可能导致不同的问题。首先，通过覆盖膜(29)的酶的丧失导致传感器装置寿命的减少。第二，如果酶迁移入膜孔(27)，其将导致改变传感器对传感器的灵敏度。此外，传感器的灵敏度还易于在开始的几天中变化，直到沉淀/溶解达到平衡。这些改变是不需要的，因为其导致传感器性能的改变。如果酶在膜外面(28)沉淀，酶将能够在流体样品中执行酶的作用。然而，在这种情况下，转化为次生物质(如，H₂O₂)的分析物(即，葡萄糖，乳酸，肌酸，肌酸肝)的量对于起始分析物浓度不呈线性相关，这由于如Km和其它可能的底物(如，O₂)浓度等其它因素，也影响转化效率。

如果来自于流体样品中的蛋白质(如，血蛋白)能够经过覆盖膜的孔(31)，蛋白质将保留在孔的流体柱中，并因此对于分析物进入酶层，降低面积并增加扩散长度。因此，随着蛋白含量改变，传感器对于流体样品的分析物的灵敏度改变。这种现象涉及血偏移(blood bias)，其是由占据覆盖膜孔的血成分所导致的，由此在覆盖膜孔中提供了一个较高(但变化的)有效的扩散阻力，并且因此在酶膜孔中也是这样。

然而，如果孔表面不是全部为血兼容性的，那么蛋白质会在膜表面，包括孔内面(30)沉淀，并导致分析物扩散通入酶层的面积的逐渐减小(逐渐减小的有效孔径)。这种现象涉及血漂移(blood drift)，其是由沉淀在孔内面的血成分(特别是蛋白质和脂质)所导致的，并且因此降低灵敏度。

这些作用(血偏移和血漂移)在血液分析仪中对于传感器来说都是特别不理想的，因为已知的酶传感器通常用水性流体校正，然而它们要测量血液样品。

常规的溶剂铸造膜也可导致上述类型的问题，如传感器可变性、线性、在酶层不令人满意的分析物分布等。

此外，理想的是使用有效的酶传感器清洗溶液，特别是包含蛋白酶(如，枯草杆菌蛋白酶)的清洗溶液。这种蛋白酶不能渗透入酶层，这点也很重要。

US 4,919,767公开了一种酶传感器，其包含一个酶层和一个充满流体的多孔材料的液膜，其具有在拒绝其它样品物质的同时，使分析物通过的能力。

US 6,413,393公开了一种酶传感器，其包含至少一个功能性的涂层膜，所述涂层膜包括吸收紫外线的聚合物，如聚氨基甲酸酯，聚脲或聚氨基甲酸酯/聚脲共聚物，其包括包含如聚(烯基乙二醇)和聚(环氧烷)的亲水性链段的变体。传感器可包含一个酶层和两个功能性层，如一个分析物限制性层和一个生物兼容性层。

US 2003/0217966 A1公开了一种可植入的膜，以调节分析物的运输，其包括聚氨基甲酸酯(特别的，聚醚氨酯尿素)基质，其与同类型另一个聚合物，即聚醚氨酯尿素构成微域网状结构。

US 6,652,720 B1公开了一种电化学传感器，其有至少一个电极和一个复合膜。复合膜包含一个扩散控制外层，其包含基于聚氨基甲酸酯的化合物，如有不同吸水特性的聚氨基甲酸酯混合物。

US 2002/065332 A1公开了一种聚合物的参比电极膜，包含多孔聚合物，或与亲脂性聚合物，如聚氨基甲酸酯合并的亲水性增塑剂。

US 6,350,524 B1公开了一种氯化物选择性电极用的固态膜，包含不溶性金属盐层和一个亲水性聚氨基甲酸酯形成的保护膜。

US 6,200,772 B1公开了一种传感器装置，其有一个包含用非离子型表面活性剂改良的聚氨基甲酸酯的膜，非离子型表面活性剂如脂肪族聚醚。

US 5,322,063 A公开了一种亲水性聚氨基甲酸酯组分的均质膜。这种膜可用于葡萄糖酶传感器。

WO 2003/076648 A1公开了一种平面的，厚膜生物传感器，其有包含酶和介质的聚合物(如，脂肪族聚醚氨酯)均质膜。

US 2004/0154933 A1公开了一种用于电化学传感器的聚合物膜。这种膜包含羧化的聚氯乙烯，如与聚氨基甲酸酯混合。

WO 2004/062020 A2公开了一种多孔聚合材料的气体扩散层，如，一种泡沫体，用于燃料电池。此材料可以为聚氨基甲酸酯泡沫体或聚醚聚氨基甲酸酯泡沫体。相似的，US 2004/0001993 A1公开了一种用于染料电池的气体扩散层。

EP 1 486 778 A2公开了一种电化学生物传感器，其包含一种有生物活性试剂的聚合物的膜，如，一种酶，嵌入膜中。

WO 92/04438 A1公开了一种电化学生物传感器，其有疏水塑胶层的底物限制层，如，聚氨基甲酸酯层。

EP 0 025 110 A2公开了一种电化学传感器，其有一种不对称的半渗透膜，如聚氯乙烯的半渗透膜。

US 2004/0011671 A1公开了一种可植入装置，其有一个酶层，一个生物保护膜，如聚氨基甲酸酯层，和一个外层血管原性层，如PTFE、PVF、纤维素酯类、PVC、聚丙烯、聚砜类或聚(甲基)丙烯酸甲酯的外层血管原性层。

WO 90/05910 A1公开了一种完全计算机虚拟的生物传感器，其包含一个酶层和一个“分析物弱化层(analyte attenuation layer)”，如，聚氨基甲酸酯层。

WO 96/26668 A1公开了一种可植入的传感器系统，其包含一个可弯曲的毛细管膜，其可涂层聚氨基甲酸酯或硅酮，其中所述的毛细管膜与通道连接，与酶传感器，如葡萄糖传感器接触。

US 5,523,118公开了一种微孔膜，用于经皮肤给药膜片。微孔膜可由，如聚氯乙烯制作，并且其可涂层一种兼容粘性的基于氨基甲酸乙酯的聚合物，如脂肪族聚醚氨酯分散相，形成的大量多孔的涂层。基于氨基甲酸乙酯的聚合物涂层在微孔膜的表面，但是不封闭其孔。

US 6,509,148公开了生物传感器，利用与酶混合的亲水性聚氨基甲酸酯。

JP 2655727 B2公开了一种酶传感器，其有一个聚氨基甲酸酯或醋酸纤维素的底物限制层，或这些物质的双重层，和一个聚乙烯醇(PVOH)的外侧生物体兼容膜。

综上所述，现在仍需要有覆盖膜的改进的酶传感器，对酶和其它蛋白质和次生分析物提供有效的屏障，并提供优秀的和稳定的起始分析物至酶层的扩散控制。

发明简述

已发现本发明减少或甚至消除至少一些或全部的上述提及的有关已知的酶传感器的问题，其通过提供用于测定在流体样品中分析物浓度的酶传感器，所述的传感器包含一个电极，至少一个酶层和对于所述的至少一个酶层的覆盖膜层，其中覆盖膜包含至少一种多孔聚合材料，并且其中由亲水性聚合物覆盖的至少一种多孔聚合材料的至少一面的外侧表面和孔口。示例性的亲水性聚合物包括亲水性聚氨基甲酸酯和亲水性聚(甲基)丙烯酸酯。

然而，例如，当亲水性聚氨基甲酸酯和亲水性聚(甲基)丙烯酸酯用于覆盖至少一种多孔聚合材料的外侧表面和孔口时，可能配合亲水性聚合物的扩散特性，以获得理想的扩散限制，从而使酶膜适合于不同的样品分析物浓度范围，其依赖于多孔聚合材料的不同性质。

除上述改进之外，还发现有所述的覆盖膜的传感器可使用包含蛋白酶的流体清洗，然而，已知的传感器通常要求清洗流体无蛋白酶。

本发明还提供了新的膜和清洗所述酶传感器覆盖膜的方法。

附图简述

图1说明常规的酶传感器包含一个电极和一个膜。

图2说明图1中传感器的膜。

图3说明示例性的平面，厚膜传感器构造。

图4A和4B说明常规包含径迹蚀刻的膜的基于酶的传感器的相关问题。

图5A和5B说明亲水性聚合物(如，但不限制于，亲水性聚氨基甲酸酯和亲水性聚(甲基)丙烯酸酯)的(双层)涂层是如何解决包含径迹蚀刻的膜常规传感器相关的问题。

图6表明可以通过使用相同的多孔聚合材料，改变亲水性聚氨基甲酸酯涂层的组分，改良径迹蚀刻的膜的扩散系数。

图7说明乳酸传感器一段时间的灵敏度。从出现开始，相对灵敏度(即，所测量的灵敏度相对于所测量的“稳态”灵敏度，其在2-6天后获得(依赖于传感器类型))对时间做图。无涂层的传感器用黑方块作图，有涂层的传感器用空心圆作图。

图8表示肌酸酐传感器一段时间的灵敏度。从出现开始，相对灵敏度对时间做图。无涂层的传感器用黑方块作图，有涂层的传感器用空心圆作图。

图9说明对于乳酸传感器，来自真实样品浓度的血液测量偏差(血偏移)。无涂层的传感器用黑方块作图，有涂层的传感器用空心圆作图。

图10说明使用平面传感器在用于一系列血液测量的葡萄糖传感器中，信号的减少(血漂移)。

图11说明覆盖有两种类型的亲水性聚(甲基)丙烯酸酯的肌酸酐传感器，暴露于含200μM肌酸酐的校正溶液的传感器响应。

发明详述

如此处所述，本发明提供了用于测定流体样品中分析物浓度的新的酶传感器。

如此处所定义的，术语“酶传感器”通常包括包含酶(或酶级联)的电化学传感器，其可将感兴趣的分析物转化为次生物质。感兴趣的分析物可能为流体样品的成分，即，酶传感器通常用于测定在流体样品中的分析物浓度。“分析物”有时也指“酶底物”，或简称“底物”。

本发明的传感器通常为多用途传感器。理解多用途传感器为一种用于多于一种测量，并因此暴露于多于一体积样品的传感器，并且其可能与校正流体，清洗流体等断续接触。这种传感器通常使用较长的时间。因此，上述提及的问题，如，寿命，由于酶迁移，血漂移和血偏移导致的样品对样品的灵敏度等，将在已知的多用途传感器中尤其突出。对于单用途传感器，本发明将解决或减少血偏移、分析物分布等问题。

原则上，流体样品可以为任何流体(优选水性流体)，其与传感器兼容，且别是，与覆盖膜兼容。流体样品包括生理流体，例如尿液，唾液，组织液，脊髓液和血液。血液包括全血样品，稀释的血液样品，血液馏分，预处理的血液样品等。传感器特别适合于全血样品。

本发明的传感器可能为常规类型或平面类型的，如厚膜传感器或薄膜传感器。这种传感器的酶膜通常为分层结构，指分层膜。

关于常规类型的酶传感器，膜，如多层膜包含，例如支持层，酶层，和覆盖膜，其通常装配为分离的物体，随后该物体与电极连接(即，通常包埋在电极头部)。见图1。这种多层膜的构建方法在本领域是众所周知的。见WO 98/21356。常规类型的酶传感器可包括径迹蚀刻的膜和溶解铸造膜。

关于平面类型酶传感器情况，如厚膜传感器和薄膜传感器，通过(通常连续地和独立地)将对应于电极、任何间隔层和中间层的材料、酶层、至少一种多孔聚合材料和亲水性聚合物沉积到固态电解质底物上，即陶瓷或晶片物质而设置电极和包含酶层和覆盖层的酶膜。平面传感器构建的示例见图3。构建平面类型传感器，如厚膜传感器和薄膜传感器的方法，在本领域众所周知。见，如WO 01/90733，WO 01/65247和WO 90/05910。对应于这种传感器层膜的物质常通过溶剂铸造沉积而成。

本发明的酶传感器包含一个电极，至少一个酶层和一个对所述的至少一个的酶层的覆盖膜，其中覆盖膜包含至少一种多孔聚合材料，并且其中亲水性聚合物覆盖至少一种多孔聚合材料的至少一面的外侧表面和孔口。示例性的亲水性聚合物包括亲水性聚氨基甲酸酯和亲水性聚(甲基)丙烯酸酯。

覆盖膜

酶传感器的覆盖膜在酶传感器的质量中起到十分重要的作用，如通过确保使限制性的，明确的，代表性的量的分析物扩散入酶层，即在可控条件下。这种分析物限制的转化对于获得传感器响应和在合理范围内的分析物浓度之间的基本线性关系是必须的。

因此，本发明的酶传感器包含覆盖膜形式的扩散限制层，其适合于从流体样品中隔开酶层。覆盖膜为多孔膜，其限制分析物扩散入酶层，以便对于分析物转化的固定酶量不过量，并且从而在酶层中存在用于分析物酶转化的充足的氧气(O₂)。例如丹麦专利号170103描述了扩散限制层的原理。

此外，理想的是分析物通过覆盖膜的扩散不随时间和不同样品改变，以便用于两种分离的流体样品的相同分析物浓度产生明确的传感器响应。并且，理想的是覆盖膜能够允许少量分析物通过膜的快速扩散，由此促进了分析物在酶层的分布，以便酶层的酶立即将分析物转化为次生物质，产生快速的传感器响应。这种几乎为通过酶使分析物同时转化而导致线性的改进。此外，理想的是在流体样品中存在大分子，如蛋白质和酶，基本阻止了通过覆盖膜的迁移。值得注意的是，如果这种蛋白酶可迁移进入并通过覆盖膜，则存在于，如清洗溶液或血液样品中的蛋白酶将具有对酶层的不利作用。

另一方面，也是重要的是覆盖膜能够提供次生物质(即，H₂O₂和O₂)在传感器中的高滞留，以便源自次生物质的响应不受通过覆盖膜孔扩散出的物质的实际量的影响而偏移，并且以便有充足量的O₂保留在酶层内，从而保持分析物的限制性转化。如果有扩散限制作用的中间层位于酶层和电极之间，则特别要考虑有关这些的特征(见下文)。

当亲水性聚合物覆盖至少一种多孔聚合材料的至少一面的外侧表面和孔口时，得到有几个有利特性的覆盖膜，亲水性聚合物包括，但不局限于亲水性聚氨基甲酸酯和亲水性聚(甲基)丙烯酸酯。

至少一种多孔聚合材料可选自一个相当宽范围的物质。例示性实例包括聚酯类(例如聚对苯二甲酸乙二醇酯(PETP)、乙二醇修饰的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PETG)和乙二醇修饰的聚对苯二甲酸环己烯二甲酯(PCTG))、聚碳酸酯、纤维素(再生的，醋酸酯、三乙酸酯、醋酸丁酸酯)、聚烯烃和它们的衍生物、氟代烃聚合物和共聚物(如聚氯三氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚四氟乙烯、聚乙烯氯三氟乙烯、聚乙烯四氟乙烯、氟化的乙烯-丙烯共聚物)、聚酰亚胺(即，Kapton)、聚苯乙烯、聚(甲基)丙烯酸酯、聚氯乙烯和它们的衍生物(包括共聚物，例如氯乙烯-(甲基)丙烯酸酯型共聚物)、聚酰胺、聚氨基甲酸酯、聚砜、聚醚砜、聚苯硫醚、硅酮和有机硅氧烷-聚碳酸酯共聚物(即，US 3,189,662中公开)。

本发明一方面，至少一种多孔聚合材料选自聚对苯二甲酸乙二醇酯(PETP)、聚氯乙烯和聚碳酸酯。

在一个实施方案中，多孔聚合材料为聚对苯二甲酸乙二醇酯(PETP)。

在另一个实施方案中，多孔聚合材料为聚氯乙烯(PVC)。

优选的是至少一种多孔聚合材料不包含亲水性聚氨基甲酸酯，因为认为这种材料将提供过量水平的H₂O₂扩散，特别是如果包含有扩散限制作用的中间层。

覆盖膜(和至少一种多孔聚合材料)包含两个面：一个面紧邻酶层，和一个面远离酶层，当使用酶传感器时后者还面对流体样品。如上所述，亲水性聚合物覆盖至少一种多孔聚合材料的至少一面。

本发明一方面，亲水性聚合物至少覆盖远离酶层的面。这方面提供了关于减少或甚至消除血偏移和血漂移的优点，并延长了传感器的寿命。

另一方面，亲水性聚合物至少覆盖紧邻酶层的面。期望有关改变灵敏度，缺乏线性，分析物在酶层中的分布和减少寿命的问题能够用这种方式减少或消除。如果正确的选择至少一种多孔聚合材料，如，通过选择一种有合适的血兼容性的多孔聚合材料，有关血偏移和血漂移的问题可能至少部分减少，甚至在缺乏亲水性聚合物覆盖远离酶层的至少一种多孔聚合材料的一面的外侧表面和孔口时。

在一个优选的实施方案中，两面均覆盖亲水性聚合物。这种实施方案提供了关于减少或甚至消除血偏移和血漂移、酶层中的分析物分布、灵敏度和线性的改进、延长了传感器的寿命、限制酶迁移和改进线性的优点。

图5A和5B说明-与图4A和4B比较-(双面)覆盖亲水性聚合物，如亲水性聚氨基甲酸酯或亲水性聚(甲基)丙烯酸酯，如何解决有径迹蚀刻的膜的常规传感器的问题。如果覆盖膜嵌入亲水性聚合物层内，如亲水性聚氨基甲酸酯，(34)，因为大分子，即来自酶层的酶和血蛋白或其它来自流体样品的蛋白质不能通过或进入亲水性聚合物层，所以上述提及的问题均得到缓解。

表述“外侧表面和孔口”指至少一种多孔聚合材料的两面中的每一面，多孔聚合材料代表被孔口(孔开口)阻断的表面。

在本文中，表述“被...覆盖”指亲水性聚合物不仅覆盖至少一种多孔聚合材料的表面，还覆盖孔口。

此处所用术语“亲水性聚合物”指一种单独的亲水性聚合物，也指两种或更多亲水性聚合物的混合物。需理解上述的亲水性聚合物可与高达30％其它非亲水性聚合物混合。在一个优选的实施方案中，在至少一种多孔聚合材料上的涂层包含选自亲水性聚氨基甲酸酯和亲水性聚(甲基)丙烯酸酯的亲水性聚合物。

对于平面传感器，亲水性聚合物涂层通常通过分散法、喷雾法、丝网印刷等方式，将亲水性聚合物溶液涂于至少一种多孔聚合材料的表面(和孔口)而获得。本发明一方面，亲水性聚合物覆盖至少一种多孔聚合材料的最远离酶层的至少一面的外侧表面和孔口。另一个实施方案，即提出在建立至少一种多孔聚合材料(和用相同或其它亲水性聚合物随意涂层多孔聚合材料)之前，用亲水性聚合物涂层酶层，正如涂层至少一种多孔聚合材料两面的实施方案。

对于常规传感器，至少一种多孔聚合材料上的涂层可以通过分散法、喷雾法、丝网印刷等方式，将亲水性聚合物溶液涂于至少一种多孔聚合材料的表面(和孔口)(两面或仅一面)，或者将至少一种多孔聚合材料浸入亲水性聚合物的溶液中等而获得。

因此，特别是对于有径迹蚀刻的多孔材料的常规传感器，至少一种多孔聚合材料的两面可覆盖亲水性聚合物。相信至少一种多孔聚合材料紧邻酶层的一面也覆盖亲水性聚合物的事实提供了特殊的优点，特别是对于径迹蚀刻的多孔材料，因为在缺乏亲水性聚合物涂层时，各个孔之间的相对较大的距离产生一种非线性响应。在这种情况下，分析物(酶底物)将不得不扩散至酶层内的非酶占据的分子，并且更长的扩散距离导致非同时的转化。相反，至少一种多孔聚合材料紧邻酶层一面涂层亲水性聚合物促进了层中分析物的扩散，并使分析物更均衡地至酶层，由此获得更高或更加呈线性的反应。因此，在一个实施方案中，至少一种多孔聚合材料紧邻酶层一面涂层亲水性聚合物，分析物不得不在密集的酶层中仅迁移很短的距离，直到它到达可用的酶分子。

本发明的一些方面，不仅亲水性聚合物覆盖至少一种多孔聚合材料的外侧表面和孔口，而且亲水性聚合物还至少部分的渗透入至少一面的多孔聚合材料的孔中。

在这些特殊的实施方案中，覆盖膜层的至少一种多孔聚合材料为至少部分的用亲水性聚合物浸渍。

在本文中，术语“浸渍”指亲水性聚合物覆盖至少一种多孔聚合材料双面的外侧表面和孔口，并还渗透入多孔聚合材料的孔中。

术语“至少部分浸渍”指亲水性聚合物覆盖至少一种多孔聚合材料的至少一面的外侧表面和孔口，并还至少部分的渗透入至少一面的多孔聚合材料的孔中。

本发明的另一方面，在使用传感器时亲水性聚合物在水中基本不溶。然而，应该理解亲水性聚合物优选的是当应用于覆盖膜时不交联以覆盖相同的膜，并且优选的是无随后交联的发生。取而代之，通过适当的组合亲水性聚合物的亲水性链断和疏水性链断/部分，获得组合的亲水性和亲水性聚合物的水不溶性。由于完全省略交联步骤，这种安排提供了相当简化的生产程序。

术语“水不溶性”指在水性溶液中，亲水性聚合物覆盖的覆盖膜在25℃储存4小时后，在水中基本不溶的聚合物。

在本发明的一个实施方案中，至少一种多孔聚合材料的孔隙度在0.002-30％(vol/vol)范围内。

多孔聚合材料的理想孔隙度在一定程度上，依赖于检测范围的理想上限。非常高的检测范围的上限要求相当低的孔隙度，以获得较宽的线性范围，以使覆盖膜应当对分析物有相当高的扩散阻力。当孔隙度(％(vol/vol))和线性检测范围上限(mM的分析物)以数学产物表述，该值优选为在0.01-50[％(vol/vol)·mM]的范围内，例如0.05-10[％(vol/vol)·mM]或，优选的0.1-2[％(vol/vol)·mM]。

本发明的各方面，多孔聚合材料的平均孔径在0.05-250nm的范围，例如1-150nm，或10-110nm。

在一个实施方案中，特别是在，传感器为常规类型时，多孔聚合材料为径迹蚀刻的材料，例如，孔密度在40,000-40,000,000孔每平方厘米。

对于有径迹蚀刻的覆盖膜的肌酸酐/肌酸和尿传感器，孔隙度优选为在0.05-0.1％的范围内，例如0.2-0.25％。对于有径迹蚀刻的覆盖膜的乳酸传感器，孔隙度优选为在0.0005-0.015％的范围内，例如0.003-0.004％。对于有径迹蚀刻的覆盖膜的葡萄糖传感器，孔隙度优选为在0.001-0.05％的范围内，例如0.01-0.02％。径迹蚀刻的膜的孔隙度确定为：孔隙度(％)＝π×(孔直径/2)²×(孔密度)×100％。

作为当膜用水润湿时水占据的体积更容易确定溶剂铸造膜的孔隙度。溶剂铸造膜的孔隙度通常在1-40％范围内，例如3-30％。在径迹蚀刻的膜和溶剂铸造膜的孔隙度之间的至少有一个数量级的不同，可解释为径迹蚀刻膜只有“有效“ 孔(即，通过孔)才计数，然而在确定溶剂铸造膜的孔隙度时包括了所有的孔和洞。

在一个实施方案中，亲水性聚合物为亲水性聚氨基甲酸酯。

聚氨基甲酸酯为最广泛应用的血接触表面用的生物医学聚合物，例如，用于植入物和医学装置。  聚氨基甲酸酯高弹体为多相块状的共聚物，它由硬和软链段的变化的块状体组成。疏水性的硬链段由脂肪族、脂环族或芳香二异氰酸酯与二醇、二胺或水反应形成。软的亲水性或相对亲水性链段由低分子量的末端羟基的聚醚、聚酯或脂肪族聚烯烃组成。亲水性多元醇用作扩链剂或能选择性的合并入前聚合物。聚氨基甲酸酯中硬与软链段之间和疏水性与亲水性链段之间的化学不兼容性导致相分离。与次级键互连，并分散于软链段基质中的硬链段区域，起到物理性交联从而增强整个系统的作用。通过使用不同亲水性的聚醚或聚酯的混合物调节软基质的亲水性。对于十分亲水性的聚氨基甲酸酯，经常使用聚乙二醇，并用较高的聚烷基醚如聚丙二醇和聚丁二醇，实现聚氨基甲酸酯的亲水性质的调节(tailoring)。这样，聚氨基甲酸酯可生产为亲水性，疏水性，亲水性/疏水性，硬和坚硬或软和弹性的，水解稳定的或可降解的。由于聚氨基甲酸酯的硬和软区分的结构，它为机械性坚固的，撕裂抵抗的并且显示出很好的弯曲性质。这些特性使聚氨基甲酸酯适于作为传感器膜的亲水性涂层。由于亲水性链段的含量和很好的使用稳定性，涂层具有较高的吸水性。由于假交联区分的结构，涂层在水中也是不可溶的。

亲水性的聚氨基甲酸酯可选自有亲水性部分的聚氨基甲酸酯，此处包括如聚乙二醇、聚环氧丙烷部分等。这些亲水性聚氨基甲酸酯可由有羟基或氨基末端的聚亚烷基二醇(聚环氧烷)制备，从而通过与二异氰酸酯反应形成线性聚合物链。这种亲水性聚氨基甲酸酯的实例公开于US 4,789,720；4,798,876；和5,563,233。其它合适的实例为用亲水性基团，如脂肪族聚醚改良的聚氨基甲酸酯(见，如US 6,200,772 B1)。

亲水性部分通常从聚乙二醇，氨基末端的聚乙二醇、聚丙二醇、氨基末端的聚丙二醇、聚环氧乙烷、聚环氧丙烷和聚乙烯亚胺，特别是聚乙二醇得到。

在一些实施方案中，亲水性聚氨基甲酸酯选自脂肪族聚醚氨酯、脂肪族聚醚氨酯尿素、环脂肪族聚醚氨酯、环脂肪族聚醚氨酯尿素、芳香族聚醚氨酯、芳香族聚醚氨酯尿素、脂肪聚酯型聚氨酯、脂肪族聚酯型聚氨酯尿素、环脂肪族聚酯型聚氨酯、环脂肪族聚酯型聚氨酯尿素、芳香族聚酯型聚氨酯、和芳香族聚酯型聚氨酯尿素。当使用线形或环状脂肪二异氰酸酯时，脂肪聚醚氨酯或脂肪环聚醚氨酯(如环己基聚醚氨酯)为优选的膜涂层。天然来源的异氰酸酯(如赖氨酸二异氰酸酯)也适用。认为环己基聚醚氨酯可提供良好的对膜的生物兼容性并抑制或甚至消除膜的污损。

本发明一方面，亲水性聚氨基甲酸乙酯包含聚乙二醇的主链链段，-(CH₂-CH₂-O)n-，聚乙二醇链段示例重量比为至少5％(w/w)，如至少7％(w/w)或至少10％(w/w)。聚乙二醇部分的显著含量提供了合适的亲水性特性并改进了血兼容性。

优选的聚氨基甲酸乙酯的合适的实例公开于，例如US 5,322,063，此处全部引用作为参考。

本发明的一方面，亲水性聚氨基甲酸乙酯包含多糖(如藻酸盐、角叉藻聚糖、果胶和葡聚糖)，聚(HEMA)，部分水解的聚醋酸乙烯酯(PVA)或纤维素衍生物(如羟乙基甲基纤维素，和羧甲基纤维素)的主链链段，多糖，聚醋酸乙烯酯或纤维素衍生物链段的示例性重量比分别至少为5％(w/w)，例如至少为7％(w/w)或至少为10％(w/w)。

合适的市售亲水性聚氨基甲酸乙酯实例包括，但是不局限于，HydromedD4(润湿时水含量：50％(w/w))和Hydromed D640(润湿时水含量：93％(w/w))。这两种聚氨基甲酸乙酯为Cardiotech International Inc.(Wilminton，MA，USA)的商品名称。

Hydromed D4和D640产品包含中心的聚环氧丁烷部分和聚环氧烷末端。聚环氧烷基团可以为聚环氧乙烷，也可为聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷。两个例子中，聚环氧乙烷链段优选为长于聚环氧丁烷和聚环氧丙烷部分。这似乎可促进充分的亲水性和吸水性，还有利于合适的血兼容性。

在另一个实施方案中，亲水性聚合物为亲水性聚(甲基)丙烯酸酯。

亲水性聚(甲基)丙烯酸酯的实例包括丙烯酸共聚物，它的第一个单体单位由有聚环氧乙烷取代基的丙烯酸酯组成，作为部分酯的醇部分，并且一个或多个第二个单体单位选自甲基丙烯酸酯和丙烯酸酯。第一个单体单位聚环氧乙烷的取代基通常平均分子量为200至2000，如500-1500。第一个单体单位的实例包括甲氧基聚环氧乙烷、甲基丙烯酯、甲氧基聚环氧乙烷丙烯酸酯等。第二个单体单位的实例包括甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯等。

优选的亲水性聚(甲基)丙烯酸酯包括丙烯酸共聚物，公开于WO93/15651 A1，此处全部引用作为参考。

优选的单体组合为甲氧基聚环氧乙烷甲基丙烯酸酯，丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯。

其它优选的亲水性聚(甲基)丙烯酸酯包括那些有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的链段或侧链。

本发明的一方面，亲水性聚合物的亲水性为润湿时水含量，在5-100％(w/w)或10-95％(w/w)的范围内，例如25-95％(w/w)或45-95％(w/w)。水含量通常为亲水性聚合物例如分别在亲水性聚氨基甲酸乙酯和亲水性聚(甲基)丙烯酸酯中的类型和含量的函数，亲水性链段的较高含量产生较高的水含量(当润湿时)。孔隙度也可在水含量的优选范围方面发挥一定的作用，即对于有小孔的膜，水含量的优选范围为5-80％(w/w)或8-40％(w/w)，例如10-30％(w/w)。就扩散而言，扩散速率和排除特别是大分子的能力的覆盖膜性质是十分重要的。

还考虑到覆盖膜允许葡萄糖扩散和，另一方面，限制H₂O₂扩散的能力。因此，在一个实施方案中，H₂O₂通过覆盖膜的扩散速率相对于葡萄糖通过覆盖膜的扩散速率在3-20的范围内，例如3-15，或3-10。扩散速率的测定如“实验”部分的描述。值得注意的是，对覆盖膜的相对扩散速率优于通常相同的已知的聚氨基甲酸酯覆盖膜的扩散速率。

对于葡萄糖传感器，葡萄糖通过覆盖膜的表观扩散系数应该优选为在0.1-5.0×10^-9范围内，如0.3-1.5×10⁹，或0.5-1.1×10^-9。对于对应的乳酸传感器，通过覆盖膜的表观扩散系数应该优选为在0.5-5×10^-10的范围内，如1.2-3.2×10^-10。表观扩散系数按“实验”部分描述测量。

当同时允许相关分析物的扩散时，如乳酸、葡萄糖、肌酸、肌酸酐等，还有关联性的是覆盖膜排除“大”分子(如肽，蛋白质和酶，例如酶层的酶(如葡萄糖氧化酶和乳酸氧化酶))的能力。这种分析物通常有高达约200的分子量，而肽、蛋白质和酶的分子量从约小肽的300至蛋白质的几千或更多，如葡萄糖氧化酶约30,000。

对于常规传感器，覆盖膜层(润湿形式)通常厚度在5-40μm范围内，例如6-30μm或10-17μm。对于厚膜传感器，覆盖膜层(润湿形式)通常厚度在1-20μm范围内，例如2-10μm，或3-5μm。

干燥形式的覆盖膜的亲水性聚合物层的厚度在0.1-5μm范围内，例如0.25-3μm，或0.5-1μm，特别是对于厚膜传感器。

干燥形式的覆盖膜的亲水性聚合物层的厚度通常为聚合材料平均孔径的100-2000％范围内，例如100-1000％，或200-500％。

考虑到优选的吸水特性，润湿形式的覆盖膜厚度和干燥形式的覆盖膜厚度的比率优选为在2∶1至1∶1的范围内。

润湿形式的覆盖膜的亲水性聚合物层的厚度和干燥形式的覆盖膜的亲水性聚合物层的厚度的比率可在100∶1至1∶1或80∶1至2∶1的范围内。

在一些实施方案中，特别是对于常规传感器，润湿形式的覆盖膜的亲水性聚合物层的厚度和干燥形式的覆盖膜的亲水性聚合物层的厚度的比率在20∶1至1.5∶1的范围内，例如在10∶1至2∶1的范围内。在其它一些实施方案中，特别是对于常规传感器，如有径迹蚀刻的膜的传感器，润湿形式的覆盖膜的亲水性聚合物层的厚度和干燥形式的覆盖膜的亲水性聚合物层的厚度的比率优选为在80∶1至10∶1的范围内，例如在50∶1至30∶1的范围内。

对于平面传感器，如有溶剂铸造膜的传感器，润湿形式的覆盖膜的亲水性聚合物层的厚度和干燥形式的覆盖膜的亲水性聚合物层的厚度的比率优选为在10∶1至2∶1的范围内，例如在6∶1至3∶1的范围内。

在其它实施方案中，至少一种多孔聚合材料和亲水性聚合物(非润湿)的重量比应该在100∶1至1∶1的范围内，如80∶1至10∶1，或50∶1至30∶1。

在本发明的一个实施方案中，覆盖膜为酶传感器的最外层。

通过使用，例如亲水性聚氨基甲酸酯覆盖至少一种多孔聚合材料的至少一面的外侧表面(和孔口)已经确定的几个优点。首先，聚氨基甲酸酯有较小的孔，它有效的阻断多孔聚合材料的孔对酶/蛋白质的渗透/迁移，同时仍允许较小的亲水性和疏水性分子的扩散。此外，亲水性聚氨基甲酸酯通常不溶于水，尽管聚氨基甲酸酯在水中溶胀，并能够储藏大量的水。因此，在传感器寿命时间内，基本无聚氨基甲酸酯涂层的渗漏和变质。也可相同的应用于例如亲水性聚(甲基)丙烯酸酯。

电极

根据分析物和酶的反应产物选择酶传感器的电极，如对于肌酸酐传感器的酶级联。电极可由贵金属制备，如金、钯、铂、铑、铟或铱，优选金和铂，或它们的混合物。其它合适的电导材料为MnO₂、普鲁士蓝、石墨、铁、镍和不锈钢。

在一些例子中，还优选的包括另外的电极，如内参比电极和/或邻近命令电极(mandatory electrode)的平衡电极。见图3。

酶层

酶传感器的酶层(或多个酶层)发挥十分重要的作用，因为一种或多种酶促进了分析物向在电极表面可检测的次生物质的转化。在一些实施方案中，使用一种单独的酶(如葡萄糖氧化酶，乳酸氧化酶，脲酶)，然而多数酶(如肌酸酶和肌氨酸氧化酶)可能用于促进反应级联，导致电极上能够检测的物质生成。

酶(多种酶)既可如此放置，也可以直接或间接固定的形式，例如嵌入或混合入聚合物，或交联，或固定到底层或覆盖层，以便减少或消除迁移。在一些实施方案中，许多酶可排布于分离的层。酶层也可由环或垫圈支持，以避免酶的使用过量并且可确保准确量的酶位于传感器膜明确的区域内。

酶层可包含至少一种酶，包括，但不局限于，碳水化合物氧化酶、葡萄糖氧化酶、半乳酸氧化酶、葡糖酸氧化酶、醛糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、乳酸氧化酶、α羟酸氧化酶、肌氨酸氧化酶、醇氧化酶、丙三醇氧化酶、胺氧化酶、氨基酸氧化酶、胆固醇氧化酶、脲酶、胆红素氧化酶、漆酶、过氧物酶、葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、P-450、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、肌酸酐酶、肌酸酶和相关的辅酶。

对于肌酸的检测，酶层优选的包含肌酸酶和肌氨酸氧化酶。对于肌酸酐的检测，酶层优选的包含肌酸酐酶、肌酸酶和肌氨酸氧化酶。对于葡萄糖的检测，酶层优选的包含葡萄糖氧化酶。对于乳酸的检测，酶层优选的包含乳酸氧化酶。对于脲的检测，酶层优选的包含脲酶。

其它层

在本发明的一个实施方案中，酶层不是直接与电极接触。因此，酶传感器优选的还包含1-3层将电极和酶层隔开。这种层(几层)通常包括中间层，如干扰限制层。这种层(几层)还可包括含水的多孔间隔层，隔开电极和中间层。

在一个实施方案中，隔开电极与酶层的至少一层为包括，但不局限于，乙酸纤维素(CA)，Nafion^TM，硬PVC，Baytron^TM，电聚合聚合物(如聚噻吩、1，3-苯二胺、苯酚)，和SPEES-PES(聚芳香基-醚砜/聚醚砜共聚物)的材料层。这种层可能作用为干扰限制层。在一个实施方案中，中间层为干扰限制乙酸纤维素(CA)层。

在另一个实施例中，(可能与上述实施例组合)，至少隔开电极与酶层的至少一层为含水的多孔间隔层。

当传感器用于检测以非常低的浓度存在的分析物时(如检测限范围在1-20μM以内的肌酸酐、肌酸或其它分析物)，已发现无分析物的流体样品能够引起电极的错误信号。错误信号可能与来自-25μM至25μM分析物的信号相符，并且错误信号源于与酶传感器接触的各种流体组分的区别(而不是分析物，其为0)，流体组分如：血液样品，清洗流体，润湿流体，校正流体等。所发现的错误信号很可能由于两个因素的组合：首先，非离子物质通过干扰限制层的扩散快于离子物质。因此，存在于样品中而不在清洗溶液中的碳酸氢盐/CO₂导致干扰限制层下面的pH值降低。相同的这种作用可见于存在于大多数清洗溶液而不是样品中的咪唑/H-咪唑。pH值的降低将导致源于水的氧化作用的零点电流的降低。

第二点，随着不同样品导致在阳极表面离子物质的浓度变化。这种变化导致在电极上离子组分的变化，由此导致一种电流，通常所说的非法拉第电流。以非法拉第电流输送的电荷总量仅依赖于离子组分的不同；然而，能改变扩散时间常数。

已发现上述问题可通过在阳极和干扰限制层之间引入含水多孔间隔层而缓解。含水多孔间隔层中的水会缓冲阳极离子组分的改变。因此，非法拉第电流扩大更长的时间间隔，并因此具有较小的振幅。在小距离内，扩散是一个非常快速的过程(即，O₂扩散约50μm以上少于约1s)。因此，间隔层所起作用仅与扩散阻力联合(即，干扰限制层)，以便系统作用如有电阻串联的电容器。因此十分重要的是干扰限制层对离子不能渗透，否则间隔层应当十分厚。

合适的形成常规传感器(径迹蚀刻的或溶剂铸造)的含水多孔间隔层的多孔聚合基质的材料实例与上述多孔聚合材料相同。在一个实施方案中，材料包括，但是不局限于，聚对苯二甲酸乙二醇酯(PETP)、聚氯乙烯、和聚碳酸酯。在一个特殊的实施方案中，这种传感器的间隔层材料为聚对苯二甲酸乙二醇酯(PETP)。这种间隔层可以为径迹蚀刻的的并起到含水多孔间隔层的从中间层或酶层隔开电极的作用。

合适的形成平面传感器，如厚膜传感器(溶剂铸造)的含水多孔间隔层的多孔聚合基质的材料实例，包括不限制于亲水性聚氨基甲酸乙酯，亲水性聚(甲基)丙烯酸酯，聚乙烯吡咯烷酮，聚氨基甲酸乙酯，Nafion^TM-聚合物，电聚合聚合物(如聚噻吩，1，3-苯二胺，苯酚)，和SPEES-PES(聚芳香基-醚砜/聚醚砜共聚物)材料。或者，形成多孔聚合基质的材料可选自上述用于多孔聚合材料的相同材料与这种孔隙度形成化合物(如：去污剂或水溶性亲水性聚合物)混合，特别是聚氯乙烯，和聚碳酸酯与孔隙度形成化合物混合。这种层起到含水多孔间隔层的从中间层或酶层隔开电极的作用。

术语“ 含水多孔间隔层”指当使用传感器时，提供缓冲作用使电极表面的pH不稳定性减少的层。

在本文中，与多孔间隔层相关的术语“含水”指多孔聚合基质包含大量的水，如基于对孔聚合基质重量至少6％的水量。水含量可能甚至更高，如至少8％，至少10％，至少20％，至少25％，至少40％或至少50％或更高。对于溶剂铸造平面传感器，要考虑溶胀(吸水)总程度，因为过度的吸水可能对于酶膜的结构完整性是有害的。因此，对于平面传感器，水含量应该优选不超过200％，如150％。

应该理解任选的酶传感器的间隔层通常描述为随时可用的形式，即含水多孔间隔层含有大量的水，并且其中酶传感器能够测量流体样品中分析物的形式。在一个实施方案中，酶传感器以干燥的形式，即间隔层基本干燥的形式储存并运输至最终用户，。因此，最终用户将不得不用水性流体润湿酶传感器的膜，使能够吸收大量水的间隔层转变为含水多孔间隔层。其它层(如，覆盖层)也能够吸收大量的水。

在常规酶传感器构建方面，可通过酶传感器内部流体进行润湿。见图1。平面传感器通常由特定的润湿液、清洗流体或校正液等润湿。

认为包括缓冲液、阳离子交换材料或电解质盐的间隔层进一步限制在流体样品和其它流体中碳酸氢盐(HCO₃ ^-)的作用是有利的。因此，在一个实施方案中，含水多孔间隔层还包括一种或多种选自，例如缓冲液，电解质盐(如电解质聚合物)和阳离子交换材料的成分。

对于径迹蚀刻的材料，间隔层可能具有的孔隙度在0.0005-2％(vol/vol)范围内，且对于溶解铸造材料在1-90％范围内。

对于常规的有径迹蚀刻的膜间隔层的肌酸酐/肌酸和脲传感器，孔隙度优选的范围在0.05-0.1％，例如0.2-0.25％。对于常规的有径迹蚀刻的膜间隔层的乳酸传感器，孔隙度优选的范围在0.0005-0.015％，如0.003-0.004％。对于常规的有径迹蚀刻的膜间隔层的葡萄糖传感器，孔隙度优选的范围在0.001-0.05％，如0.01-0.02％。对于径迹蚀刻的膜的孔隙度确定为：孔隙度(％)＝π×(孔直径/2)²×(孔密度)×100％。间隔层的平均孔径在0.05-250nm范围内，例如1-150nm，或10-110nm，并且孔密度在40,000-40,000,000孔每平方厘米的范围内。

对于溶剂铸造间隔层的孔隙度可作为当膜用水润湿时水占据的体积最容易的测定。溶剂铸造间隔层的孔隙度优选为在1-90％范围内，例如3-85％。在径迹蚀刻的膜和溶剂铸造膜的孔隙度之间的至少一个数量级的不同，可解释为只有径迹蚀刻的膜的“有效“孔才计数，然而在测定溶剂铸造膜的孔隙度时包括了所有的孔和洞。

含水多孔间隔层厚度可在0.2-20μm的范围内，例如0.5-15μm。对于平面传感器，厚度可在0.2-10μm的范围内，例如0.5-5μm。对于常规传感器，厚度可在1-20μm的范围内，例如2-15μm。

含水多孔间隔层可为溶剂铸造层或径迹蚀刻的膜的形式。本发明一方面，平面传感器，如厚膜传感器的间隔层，通过上述聚合物质与孔隙度形成化合物(如去污剂，水溶性亲水性聚合物等)混合，以获得合适的孔隙度。

关于常规传感器，优选径迹蚀刻的膜，因为认为将孔定向为基本垂直于电极表面是十分重要的(见图1)，以便电极上将检测的次生物质更准确的定向于电极表面。

传感器可为常规类型并且含水多孔间隔层可为径迹蚀刻的聚对苯二甲酸乙二醇酯材料。可选择的，传感器可为平面类型并且含水多孔间隔层可为例如亲水性聚氨基甲酸酯或亲水性聚(甲基)丙烯酸酯，溶剂铸造层，优选的，与孔隙度形成化合物，如去污剂，水溶性亲水性聚合物等混合。

含水多孔间隔层和中间层可组合到对于中间层和间隔层所述类型材料的异质层中。以间隔层材料分散于连续相的中间层材料的方式形成层。

对于上述定义的各个实施方案，优选的是1-3层将电极和酶层隔开，其能够以起始时期15秒，信号减少至少90％，例如至少95％的方式限制例如对乙酰氨基酚，抗坏血酸和尿酸的化合物的扩散。

优选实施方案

本发明一方面涉及用于检测在流体样品中肌酸浓度的酶传感器，所述传感器包含金属电极(如铂电极)、接触所述金属电极的含水多孔间隔层(如聚对苯二甲酸乙二醇酯(PETP)的)、接触所述间隔层的干扰限制层(如乙酸纤维素的)、包含肌氨酸氧化酶和肌酸酶，接触所述乙酸纤维素层的酶层、和所述酶层的覆盖膜层，其中所述的覆盖层包含多孔聚对苯二甲酸乙二醇酯材料，并且其中外侧表面和至少一种多孔聚合材料的至少一面的孔口覆盖有例如包含重量比为至少5％(w/w)的聚乙二醇链段的聚乙二醇主链链段的亲水性聚氨基甲酸酯，和/或在润湿时含量至少25％(w/w)的水。优选的，覆盖膜的多孔聚合材料至少部分的渗透亲水性聚氨基甲酸酯。

本发明另一方面涉及用于测定流体样品中肌酸酐浓度的酶传感器，所述传感器包含金属电极(如铂电极)、接触所述金属电极的含水多孔间隔层(如聚对苯二甲酸乙二醇酯(PETP)的)、接触所述间隔层的干扰限制层(如乙酸纤维素的)、接触所述干扰限制层包含例如肌氨酸氧化酶、肌酸酐酶和肌酸酶的酶层、和所述酶层的覆盖层，其中所述的覆盖层包含例如多孔聚对苯二甲酸乙二醇酯材料，并且其中至少一种多孔聚合材料的至少一面的外侧表面和孔口覆盖有例如包含以重量比至少5％(w/w)的聚乙二醇链段的聚乙二醇主链链段的亲水性聚氨基甲酸酯，和/或在润湿时含量至少25％(w/w)的水。优选的，覆盖膜的多孔聚合材料至少部分的渗透例如亲水性聚氨基甲酸酯。

本发明的另一方面涉及用于测定流体样品中乳酸浓度的酶传感器，所述的酶传感器包含金属电极(如铂电极)、接触所述金属电极的干扰限制层(如乙酸纤维素的)、接触所述干扰限制层包含例如乳酸氧化酶的酶层、和所述酶层的覆盖层，其中所述的覆盖层包含例如多孔聚对苯二甲酸乙二醇酯材料，并且其中至少一种多孔聚合材料的至少一面的外侧表面和孔口覆盖有例如包含以重量比为至少5％(w/w)的聚乙二醇链段的聚乙二醇主链链段的亲水性聚氨基甲酸酯，和/或在润湿时含量至少25％(w/w)的水。优选的，覆盖膜的多孔聚合材料至少部分的渗透例如亲水性聚氨基甲酸酯。

本发明的另一方面涉及用于测定流体样品中葡萄糖浓度的酶传感器，所述酶传感器包含金属电极(如铂电极)、接触所述金属电极的干扰限制层(如乙酸纤维素的)、接触所述干扰限制层包含葡萄糖氧化酶的酶层、和所述酶层的覆盖层，其中所述的覆盖层包含例如多孔聚对苯二甲酸乙二醇酯材料，并且其中至少一种多孔聚合材料的至少一面的外侧表面和孔口覆盖有例如包含以重量比为至少5％(w/w)的聚乙二醇链段的聚乙二醇主链链段的亲水性聚氨基甲酸酯，和/或在润湿时含量至少25％(w/w)的水。优选的，覆盖膜的多孔聚合材料至少部分的渗透例如亲水性聚氨基甲酸酯。

覆盖膜

本发明一方面涉及径迹蚀刻的材料膜，至少部分渗透亲水性聚合物。示例性的亲水性聚合物包括亲水性聚氨基甲酸酯和亲水性聚(甲基)丙烯酸酯，特别是亲水性聚氨基甲酸酯。

本发明的另一方面涉及多孔聚对苯二甲酸乙二醇酯材料膜，至少部分渗透亲水性聚合物。示例性的亲水性聚合物包括亲水性聚氨基甲酸酯和亲水性聚(甲基)丙烯酸酯，特别是亲水性聚氨基甲酸酯。材料优选为径迹蚀刻的的。并且优选的，示例性的聚对苯二甲酸乙二醇酯材料具有孔隙度范围在0.003-2％。

本发明的另一方面还涉及例如聚氯乙烯材料的溶剂铸造膜，至少部分渗透亲水性聚合物。示例性的亲水性聚合物包括亲水性聚氨基甲酸酯和亲水性聚(甲基)丙烯酸酯，特别是亲水性聚氨基甲酸酯。优选的，示例性的聚氯乙烯材料具有孔隙度范围在2-30％。

上述示例性膜的详细说明也可应用于上述定义的覆盖膜，加上改变。

酶传感器的使用

在第一次使用前，本发明的酶传感器可暴露于润湿或校正液中，通常至信号稳定。

如在生理流体样品中肌酸酐、肌酸、葡萄糖、乳酸等的测量可能在各种自动化的或半自动化的分析仪中进行，它们中许多使用多重传感器以测量多重参数。一个例子为临床分析仪，特别为血液分析仪。流体样品手动或自动引入分析仪的流动系统，或引入暗盒的流动系统以引入分析仪。因此，针对生理样品的一种或多种参数的传感器暴露于引入流动系统的流体样品中。

因此，本发明还提供了用于测定流体样品中分析物浓度的仪器，所述仪器包含一种或多种此处定义的酶传感器。

此外，本发明还提供了测定流体样品中分析物浓度的方法，所述方法包含此处所述的酶传感器与流体样品接触的步骤，和在酶传感器电极中进行至少一种测量。

传感器通常暴露于流体样品和其它导入和来自传感器的流体，如润湿液，清洗液，校正液等。

清洗酶传感器的方法

已发现，令人惊奇的是，本发明的原理致使在酶传感器的清洗流体中利用蛋白酶成为可能。因此，本发明还涉及清洗酶传感器的方法，所述传感器包含一个电极，至少一个酶层和至少一个酶层的覆盖层，该方法包含将覆盖膜表面与包含蛋白酶的清洗溶液相接触的步骤。

用于清洗酶传感器的覆盖膜的合适的蛋白酶实例为枯草杆菌蛋白酶A。

应该理解清洁步骤在测量流体样品的测量步骤之前和之后(没必要在测量之前或之后立即进行)。因此，优选的方法还包含在用清洗溶液接触覆盖膜步骤之前，和之后，测量分析物浓度的步骤。

优选的，覆盖膜包含至少一种多孔聚合材料，其中亲水性聚合物覆盖至少一种多孔聚合材料的至少一面的外侧表面和孔口。示例性的亲水性聚合物包括亲水性聚氨基甲酸酯和亲水性聚(甲基)丙烯酸酯。

上述说明书不是为以任何方式限制本发明。

此外，所讨论的特性的组合对于解决创造性不是绝对必要的。另外，所有专利或公开申请在此全部引用作为参考。

本发明在下面的实施例中将进一步说明。然而，需理解这些实施例仅为说明性目的，并且应该不用于以任何方式限制本发明的范围。

实施例

材料

来自Pseudomonas putida的肌酸酐酶获得自Roche Diagnostics，Mannheim，德国。Hydromed D4，Hydromed D640和Hydromed TP获得自Cardiotech International Inc.，Wilminton，MA，USA。

一般程序

扩散性质的测量

扩散性质可在扩散池中测量，从总孔隙度和水中底物扩散系数结果获得底物的表观扩散系数值。“表观扩散系数”指“有效的”整个膜区的扩散系数，不考虑膜的孔隙度。

扩散池(直径15mm，有O形圈)在使用前应该为绝对洁净的。为了减少污染，在有O形圈的半池排布有高底物浓度的溶液是理想的。用于分析的流体样品装入没有O形圈的半池。膜样品比半池切割处和排布于O形圈顶部之间的开口大约1/2cm。之后关闭并封紧池。有膜和磁性棒(10mm)的扩散池置于磁力搅拌器上(320±30r.p.m.)。30mL底物的清洗流体(S4970)溶液和30mL的纯清洗流体(S4970)同时装入扩散池的两个半池。分别在48和72小时后通过用注射器取出1mL样品并加入1mL纯清洗流体，测量在纯清洗流体中的底物浓度。在样品中的底物浓度用ABL^TM 735血气分析仪(RadiometerMedical ApS，Copenhagen，丹麦)测量。

表观扩散系数由以下方法测定。流量：在所有系统中，如果在系统中化合物的分布与化合物的热力学平衡分布不相符，将发生化合物的被动转运过程。流量定义为每秒钟通过单位面积(垂直于转运方向的面积)的化合物的量，并且单位为J＝量·cm^-2·s^-1。

Fick第一定律对于稳定扩散是有效的，即建立线性浓梯度。

$J=-D\frac{\mathrm{dC}}{\mathrm{dx}}$

其中D为化合物的扩散系数，即在一定条件下，扩散分子类型的特性值(不仅包括测定转运速率的因素，如大小和形状，还包括周围介质的特性，如粘度)；dC/dx在点x的浓度斜率(dC/dx值也指x方向的浓度梯度，其中符号字符表明浓度增加的方向，即dC/dx正值表明在x轴正方向浓度增加)。

分析物在涂层覆盖膜上的表观扩散系数的确定。

通过将150×200mm大的片完全浸入1％的PUR的96％EtOH的溶液，大约12μm聚对苯二甲酸乙二醇酯(PETP)层的多孔膜(孔直径约0.1μm；孔密度：1.6·10⁶孔/平方厘米)渗透亲水性聚氨基甲酸酯(PUR；Hydromed D4和/或Hydromed D640)。5秒后，以约50mm/s的恒定速度从溶液中去除膜。之后，干燥膜直到乙醇蒸发(少于30分钟)。随后若需要，将片切割至合适的块。

膜置于扩散池中(见上)，以确定各种分析物的表观扩散系数(平方厘米/s)。结果见图6。结果表明通过改变亲水性聚氨基甲酸酯涂层的组分而控制PETP膜的扩散系数是可能的。

一般传感器构建(常规传感器类型)

参见图1，传感器1包含电极2，电极2上附带膜环3。电极2包含铂阳极4，与铂电线5连接，铂电线5通过微塞6与银质阳极接触体7连接。铂阳电极4和铂电线5的下部密封入玻璃体8。在玻璃体8和微塞6之间，铂电线5受热收缩管保护。管状的银质参比电极10环绕玻璃体8的上部，且以电极2长度中延伸至阳极接触体7，接触体7通过固定体11和环氧树脂12固定入参比电极。玻璃体8的下部围绕有电极基底13，此处附带膜环3。

参见图1和2，参比电极10的上部围绕有塞部14，从而在相应的分析仪器的塞中(未显示)安置电极2，并固定套膜15。垫圈16和17置于电极2和套膜15之间，以便确保任何位于电极2测量表面的电解质不会蒸发。膜环3，安置于套膜15的一端，包含环20。膜21延伸出环20的下端开口。膜21详见图2并在实施例2和3中详细描述。

一般传感器构建(厚膜传感器类型)

图3说明示例性的平面，厚膜传感器构建，形成于电解质底物(110)上，其上有工作电极(120)和参比电极(130；140)。双层的电解质密封剂(150；160和151；161)包围电极。如本文公开的含水多孔间隔层(121)，中间层(170)，酶层(180)和覆盖膜(190)覆盖工作电极。

参考图3，有直径为1000μm且厚度10μm环状铂工作电极120，外径为3000μm，内径为2000μm和厚度10μm的环状铂对应电极130，覆盖工作电极外周的角方位为30-330°，以及直径为50μm位于工作电极外周的角方位为0°的表面的环状银/氯化银参比电极140，提供了厚度200μm的氧化铝底物110。这三种电极结构与传感器电子设备(未显示)相连接，其穿过氧化铝底物110，通过铂，穿过孔(未显示)到底物。操作中，工作电极120相对与参比电极140极化至+675mV。

此外，氧化铝底物110为两层的玻璃和聚合物密封剂结构。这些两层的结构包括，外径为1800μm，内径为1200μm和厚度为50μm，包围工作电极120的环状结构160、161，和厚度为50μm的，包围完整电极系统的结构150，151。这些两层结构均由内层150、160和外层151、161组成，所述内层150、160面对厚度为20μm的来自英国的ESL Europe的ESL glass 4904的氧化铝底物110，所述外层151、161，来自美国加州的SenDx Medical Inc.的聚合物密封剂，公开于SenDx Medical Inc.of California，USA的国际专利中请WO97/43634，其包含重量为28.1％的聚甲基丙烯酸乙酯(Elvacite，部分号2041，来自DuPont)、重量为36.4％的乙酸卡必醇、重量为34.3％的硅烷化的高岭土(部分号HF900，来自Engelhard)、重量为0.2％的火成二氧化硅和重量为1.0％的三甲氧基甲硅烷。

醋酸纤维素和醋酸丁酸纤维素的环状内膜170，直径为1200μm，且厚度为10μm，覆盖工作电极120。

直径为1200μm，厚度为2μm的戊二醛交联的葡萄糖氧化酶的环状酶层180，覆盖内膜170。

酶层180通过在醋酸纤维素膜170上经戊二醛的交联的0.4μl的葡萄糖氧化酶缓冲液制备。酶层在37℃，干燥30分钟。

直径为4000μm和厚度为10μm的PVC/三甲基壬基-三乙二醇/二乙二醇的环状覆盖膜层190以工作电极120为中心，覆盖完整电极系统。

将1.35克的聚氯乙烯(Aldrich 34，676-4)，0.0149克的三甲基壬基-三乙二醇(Tergitol TMN3 from Th.Goldschmidt)和0.134克的二乙二醇，加入到21.3克的四氢呋喃和7.58克的环己酮制备覆盖膜。搅拌混合物至PVC溶解，并且获得均匀溶液。加入28.5克的四氢呋喃，以获得2％的90/1/9的PVC/表面活性剂/亲水性化合物组分的溶液。该溶液分配于传感器区域，以覆盖所有三种电极，并与聚合物密封剂151形成约0.5mm的重叠。覆盖膜在23±2℃干燥30分钟，并在40℃干燥11/2小时。

将0.3μL的5％的亲水性聚氨基甲酸酯(Hydromed D640/Hydromed D4混合物，含水量80％)的96％的EtOH溶液(见实施例1)分配于干燥的外膜表面。

所有三层170，180，190分配在x，y，z-平板上，其装有自动分散单元(IVEK泵)。

实施例1-常规葡萄糖传感器的覆盖膜的制备

通过将150×200mm大的片完全浸入1％的PUR的96％的EtOH溶液，约12μm聚对苯二甲酸乙二醇酯(PETP)层的扩散限制多孔膜(孔直径接近0.1μm；孔密度：1.6·10⁶孔/平方厘米)渗透亲水性聚氨基甲酸酯(HydromedD4)。5秒后，以约50mm/s的恒定速度从溶液中去除膜。之后，干燥膜直到乙醇蒸发(少于30分钟)。随后若需要，将片切割至合适的块。

实施例2-示例性的肌酸和肌酸酐传感器构建

每种肌酸和肌酸酐传感器均建成为已知的电流计传感器。图1表示这种传感器1(上述)适于安装在测量生物样品中分析物浓度的仪器，如ABL^TM735血气分析仪(Radiometer Medical ApS，Copenhagen，丹麦)。图2表示膜21的细节，其包含四层：面对电极2的铂阳极4的含水多孔间隔层22、干扰限制层23、环绕酶层25的垫圈、和渗透水含量约80％的亲水性聚氨基甲酸酯的扩散限制多孔聚合材料26。涂层膜层26面对分析样品。

间隔层22可为21±2μm的对苯二甲酸乙酯(PETP)径迹蚀刻的膜(孔直径约1.3-1.5μm；孔密度：2.2·10⁷孔/平方厘米)。干扰限制膜层23可为6±2μm的多孔乙酸纤维素(CA)膜。

垫圈24可为30±5μm的有直径为1500μm的中心孔的双面吸盘。粘的垫圈24以一定程度附着于干扰限制层23和扩散限制层26，以阻止酶从层间漏出。

肌酸传感器的酶层25通常为戊二醛交联的肌酸酶和肌氨酸氧化酶与合适的添加剂，如缓冲液，混合的约20μm的层。肌酸酐传感器的酶层25通常为戊二醛交联的肌酸酐酶，肌酸酶和肌氨酸氧化酶与合适的添加剂，如缓冲液，混合的约20μm的层。

扩散限制多孔聚合材料26可为渗透亲水性聚氨基甲酸酯(HydromedD640/Hydromed D4混合物，含水量80％)的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PETP)的约12μm的层(孔直径约0.1μm；孔密度：3·10⁷孔/平方厘米)(见实施例1)。

在肌酸酐传感器中，肌酸和肌酸酐都转化为过氧化氢。在肌酸传感器中，只有肌酸转化为过氧化氢。

在电流计电极上，过氧化氢在+675mV的Ag/AgCl对应阳极被氧化。其导致的电流与样品中肌酸酐/肌酸浓度成比例。

肌酸酐的浓度通过肌酸酐传感器信号(代表肌酸+肌酸酐)和肌酸传感器信号(代表肌酸)之间的差而确定。

实施例3-示例性的乳酸传感器构建

在乳酸和氧之间的酶催化反应产生过氧化氢(H₂O₂)和丙酮酸。随后，电流计电极检测过氧化氢。传感器1(图1)适于安装在测量生物样品中分析物浓度的仪器，如ABL^TM 735血气分析仪(Radiometer Medical ApS，Copenhagen，丹麦)。

参照图2，其中省去层22，乳酸传感器的膜21包含三层：面对电极2的铂阳极4的干扰限制层23，酶层25，和面对流体样品的扩散限制多孔膜层26。干扰限制膜层23可为6±2μm的多孔乙酸纤维素(CA)膜。酶层通常为约1-2μm的乳酸氧化酶交联层(7单位/膜)。如实施例1所述，渗透亲水性聚氨基甲酸酯(Hydromed D4)的扩散限制多孔膜层26可为约12μm的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PETP)层(孔直径约0.1μm；孔密度：8·10⁵孔/平方厘米)。

实施例4-实施例3的乳酸传感器结果

线性

有和没有涂层亲水性聚氨基甲酸酯的传感器安置于ABL735中，并有定期校正(每1/2至4小时一次)。在传感器安装后第一天，将它暴露于在合适流体(Radiometer清洗液S4970)中不同浓度的分析物中。

图9中在计算浓度和真实浓度之间的偏差对真实浓度作图。实心方块代表未涂层膜的传感器，空心圆代表涂层膜的传感器。如图所示，观察到与涂层膜的传感器相比，未涂层膜的传感器有更高的偏差。

寿命

有和无亲水性聚氨基甲酸酯涂层的传感器安置于ABL735，并有定期校正(每1/2至4小时一次)。一天一次使用Radiometer QC5注射剂测量控制传感器质量。传感器寿命指传感器至不能在QC限制内工作的时间。

灵敏度

有和无亲水性聚氨基甲酸酯涂层的传感器安置于ABL735，并有定期校正(每1/2至4小时一次)。从启动开始，所测量的灵敏度相对于“稳态”灵敏度，在2-6天后获得(依赖于传感器类型)，对时间做图，见图7乳酸传感器(实施例3)和图8肌酸酐传感器(实施例2)。

血偏移/血漂移

有和无亲水性聚氨基甲酸酯涂层的传感器安置于ABL735，并有定期校正(每1/2至4小时一次)。在传感器安装后第一天，将它暴露于在合适流体(Radiometer QC5水平3)中相同浓度的分析物中，加入和不加入BSA(50g/L)(将BSA加入QC液以模拟血样品)。血偏移可引起传感器测量得到有蛋白质样品的浓度相等或低于无蛋白质样品的浓度。

实施例5-一系列样品信号的减少

本研究的目的是表明有关平面传感器(此处指葡萄糖传感器-见“一般传感器构建(厚膜传感器))”使用的涂层亲水性聚合物(此处指亲水性聚氨基甲酸酯)的膜导致对系列样品的可能获得少于0.5％的样品测量信号的减少。

所有传感器经经历一系列20个连续的有10mM葡萄糖的血测量，无校正或清洗间隔。

结果

血测量

图10说明对于20个连续样品，相对于第一次血测量(＝100)的测量值。涂层(实线)和未涂层(虚线)分别表示出每两个测量的均值。

表现出通过涂层Hydromed D4(实线)获得显著的改进。在系列测试过程中的减少仅为未涂层(虚线)传感器的一半。

总结

发现相对于未涂层的传感器，有亲水性聚氨基甲酸酯(Hydromed D4，来自Cardiotech Inc.)涂层的覆盖膜的传感器导致显著的信号减少的降低。对于有涂层传感器，10个血液测量中10mM葡萄糖测定值的降低约2％，而对应的未涂层传感器的降低为约6％。

这种作用与血漂移相关，由于沉淀在孔内表面的血液成分(特别是蛋白质和脂质)，血漂移将引起电极测量的不同(下降)。

实施例6-用包含蛋白酶的溶液清洗葡萄糖传感器

在这个实验中，葡萄糖传感器(如实施例1中所述制备-两个未涂层(“ 无PUR”)和3个涂层(“有PUR”))(高测量水平1(S7570)RadiometerMedical Aps；一种QC水平1流体)在测量号1和7前进行校正，并用清洗流体(S4706 Radiometer Medical Aps)在2-6和8-12每个测量前进行清洗。这种清洗溶液含有蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶A)。见表A，没有涂层亲水性聚氨基甲酸酯(PUR)的装置灵敏度增加。因此，结果表明当亲水性聚氨基甲酸酯覆盖覆盖膜时，使用包含蛋白酶的清洗溶液，没有灵敏度的丧失。

测量号	没有PUR	没有PUR	有PUR	有PUR	有PUR
						1	26.7	26.7	26.0	26.7	26.4
2	30.0	30.1	25.9	26.7	26.4
						3	29.5	29.7	25.4	26.5	25.8
4	30.0	30.5	25.5	26.9	26.1
						5	29.8	30.0	25.7	26.8	25.9
6	30.8	31.0	25.7	26.5	26.1
						7	27.0	26.6	25.5	26.3	26.0
8	26.4	27.8	25.1	25.9	25.6
						9	26.7	27.3	25.1	26.0	25.6
10	27.2	28.5	24.9	26.3	25.9
						11	27.2	29.6	25.3	26.3	25.9
12	28.2	30.4	25.2	26.2	25.7

表A

实施例7-酶通过亲水性聚合物覆盖的覆盖膜的扩散

确定了通过PETP覆盖膜(涂层亲水性聚氨基甲酸酯和未涂层)的酶溶液的活性比例(表B)。表明涂层亲水性聚氨基甲酸酯的膜有效的阻断了酶的迁移，由此改进了有这种涂层的覆盖膜的酶传感器的线性，寿命和样品对样品的灵敏度。

	未涂层	PUR涂层
			GOD	99％	-1％
LOD	100％	0％
			脲酶	103％	0％

表B

实施例8-常规酶传感器的覆盖膜的制备

使用表D中描述的起始材料的量用以下方法制备亲水性聚(甲基)丙烯酯。

甲基丙烯酸甲酯(MMA)，丙烯酸乙酯(EA)和甲氧基聚环氧乙烷单(甲基)丙烯酸酯(M-PEG-MMA；Aldrich#44，795-1)(表D中的量)，12.5mg的2，2′-偶氮二甲基丙腈和12.5mL的醋酸乙氧基乙酯在圆底烧瓶中搅拌下混合。用氮气冲洗溶液15分钟。烧瓶加热到75℃24小时，之后溶液冷却至室温。粘稠的溶液用12.5mL丙酮稀释，通过将溶液倒入375mL己烷沉淀聚合物。滤过聚合物，并在25mL丙酮中再溶解。聚合物在375mL己烷中再沉淀并在125mL己烷中持续1 6小时。通过过滤收集聚合物，在真空干燥箱中50℃干燥16小时。

	MMA	EA	M-PEG-MMA	PEG的近似量	吸水(估计值)/测量值
							克[摩尔％]	克[摩尔％]	克[摩尔％]	％	％
A(L555-1)	3.14[70]	1.27[28]	1.08[2]	16	(10)/17
						B(L555-2)	3.15	1.88	1.92	24	(38)/39
C(L555-3)	3.14	2.50	2.62	28	(50)/47
						D(L555-4)	3.13[53]	2.51[42]	3.42[4.8]	32	(＞100％)/60

表D

通过将150×200mm大的片完全浸入1％的亲水性聚(甲基)丙烯酸酯的96％的EtOH溶液，约12μm聚对苯二甲酸乙二醇酯(PETP)层的扩散限制多孔膜(孔直径接近0.1μm；孔密度：3·10⁷孔/平方厘米)渗透亲水性聚(甲基)丙烯酸酯(聚合物A-D；见表D)。5秒后，以约50mm/s的恒定速度从溶液中去除膜。之后，干燥膜直到乙醇蒸发(少于30分钟)。随后若需要，将片切割至合适的块。

如表E所示膜的表观扩散系数

涂层聚合物的膜	表观扩散系数平方厘米/s
		A(L555-1)	1.35·10-8
B(L555-2)	6.15·10-9
		C(L555-3)	4.56·10-9
D(L555-4)	9.62·10-9
		未涂层	1.73·10-8/1.56·10-8

表E

考虑孔密度的不同，从表E可看出涂层(甲基)丙烯酸酯型的亲水性聚合物的膜的扩散特性与涂层聚氨基甲酸酯型(见图6)的亲水性聚合物的膜的扩散特性是可比的。

实施例9-示例性的肌酸和肌酸酐传感器构建

除根据实施例10使用亲水性聚(甲基)丙烯酸酯A(L555-1)和D(L555-4)制备扩散限制多孔聚合材料26外，根据实施例2制备肌酸酐和肌酸传感器。

实施例10-肌酸和肌酸酐传感器的结果

测试如实施例9方法制备的两种类型的肌酸酐传感器(2×4传感器)，并且测定对肌酸酐的灵敏度。有亲水性聚(甲基)丙烯酸酯A(L555-1)覆盖层的传感器在几小时内获得了理想的灵敏度，然而有亲水性聚(甲基)丙烯酸酯A(L555-4)覆盖层的传感器“启动”稍慢，见图11。

Claims (35)

1.用于测定流体样品中分析物的浓度的酶传感器，包括

电极，至少一个酶层，和

用于至少一个酶层的覆盖膜层，

其中覆盖膜包括至少一种多孔聚合物材料，且

其中所述至少一种多孔聚合物材料的至少一面的外侧表面和孔口被亲水性聚合物覆盖，所述亲水性聚合物选自亲水性聚氨基甲酸酯和亲水性聚(甲基)丙烯酸酯。

2.权利要求1的酶传感器，其中所述覆盖膜层的至少一种多孔聚合物材料至少部分地用亲水性聚合物浸渍。

3.上述权利要求任意一项的酶传感器，其中所述至少一种多孔聚合物材料孔隙率在0.002-30％(vol/vol)的范围。

4.上述权利要求任意一项的酶传感器，其中所述至少一种多孔聚合物材料是径迹蚀刻的。

5.权利要求4的酶传感器，其中所述至少一种多孔聚合物材料的孔密度在每平方厘米有40,000-40,000,000个孔的范围。

6.权利要求4-5中任意一项的酶传感器，其中所述至少一种多孔聚合物材料的平均孔径在0.05-250nm的范围。

7.上述权利要求任意一项的酶传感器，其中所述亲水性聚合物选自亲水性聚氨基甲酸酯。

8.权利要求7的酶传感器，其中所述亲水性聚氨基甲酸酯选自脂肪族聚醚氨酯、脂肪族聚醚氨酯尿素、环脂肪族聚醚氨酯、环脂肪族聚醚氨酯尿素、芳香族聚醚氨酯、芳香族聚醚氨酯尿素、脂肪族聚酯型聚氨酯、脂肪族聚酯型聚氨酯尿素、环脂肪族聚酯型聚氨酯、环脂肪族聚酯型聚氨酯尿素、芳香族聚酯型聚氨酯、和芳香族聚酯型聚氨酯尿素。

9.权利要求1-6中任意一项的酶传感器，其中所述亲水性聚合物选自亲水性聚(甲基)丙烯酸酯。

10.上述权利要求任意一项的酶传感器，其中所述亲水性聚合物可润湿于含量范围为10-95％(w/w)的水。

11.上述权利要求任意一项的酶传感器，其中当传感器为常规传感器时，所述覆盖膜层是以润湿的形式且厚度范围为5-40μm。

12.权利要求1-10中任意一项的酶传感器，其中当传感器为平面传感器时，所述覆盖膜层是以润湿的形式且厚度范围为1-20μm。

13.上述权利要求任意一项的酶传感器，其中所述覆盖膜的亲水性聚合物膜层是以干燥的形式且厚度范围为至少一种多孔聚合物材料的孔的平均孔径的100-2,000％。

14.上述权利要求任意一项的酶传感器，其中所述覆盖膜的亲水性聚合物膜层是以干燥的形式且厚度范围为0.1-5μm。

15.上述权利要求任意一项的酶传感器，其中所述覆盖膜是以干燥形式或润湿形式，且润湿形式的覆盖膜的厚度与干燥形式的覆盖膜的厚度的比例范围为2∶1至1∶1。

16.上述权利要求任意一项的酶传感器，其中所述覆盖膜是以干燥形式或润湿形式，且润湿形式的覆盖膜的亲水性聚合物层厚度与干燥形式的覆盖膜的亲水性聚合物层厚度的比例范围为100∶1至1∶1。

17.上述权利要求任意一项的酶传感器，其中当亲水性聚合物为非润湿形式时，所述至少一种多孔聚合物材料和亲水性聚合物的重量比例范围为100∶1至1∶1。

18.上述权利要求任意一项的酶传感器，其中所述覆盖膜为传感器的最外层。

19.上述权利要求任意一项的酶传感器，其中至少一种多孔聚合物材料选自聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚氯乙烯、聚碳酸酯及其混合物。

20.上述权利要求任意一项的酶传感器，其中还包括1-3层将电极和所述至少一个酶层隔开。

21.权利要求20的酶传感器，其中将电极和所述至少一个酶层隔开的至少一层为含水多孔间隔层。

22.用于测定流体样品中肌酸浓度的酶传感器，包括

金属电极，

与金属电极接触的含水多孔间隔层，

与多孔间隔层接触的干扰限制层，

与干扰限制层接触的包括肌氨酸氧化酶和肌酸酶的酶层，和

用于酶层的覆盖层，

其中所述覆盖层包括多孔聚对苯二甲酸乙二醇酯材料，且

其中多孔聚对苯二甲酸乙二醇酯材料的至少一面的外表面和孔口被亲水性聚氨基甲酸酯覆盖，所述聚氨基甲酸酯包括聚乙二醇主链链段，聚乙二醇链段重量比例为至少5％(w/w)，和/或所述的聚氨基甲酸酯润湿时水含量至少为25％(w/w)。

23.用于测定流体样品中肌酸酐浓度的酶传感器，包括

金属电极，

与金属电极接触的含水多孔间隔层，

与多孔间隔层接触的干扰限制层，

与干扰限制层接触的包括肌氨酸氧化酶、肌酸酐酶和肌酸酶的酶层，和

用于酶层的覆盖层，

其中所述覆盖层包括多孔聚对苯二甲酸乙二醇酯材料，且

其中多孔聚对苯二甲酸乙二醇酯材料的至少一面的外表面和孔口被亲水性聚氨基甲酸酯覆盖，所述聚氨基甲酸酯包括聚乙二醇主链链段，聚乙二醇链段重量比例为至少5％(w/w)，和/或所述的聚氨基甲酸酯润湿时水含量至少为25％(w/w)。

24.用于测定流体样品中乳酸浓度的酶传感器，包括

金属电极，

与金属电极接触的干扰限制层，

与干扰限制层接触的包括乳酸氧化酶的酶层，和

用于酶层的覆盖层，

其中所述覆盖层包括多孔聚对苯二甲酸乙二醇酯材料，且

其中多孔聚对苯二甲酸乙二醇酯材料的至少一面的外表面和孔口被亲水性聚氨基甲酸酯覆盖，所述聚氨基甲酸酯包括聚乙二醇主链链段，聚乙二醇链段重量比例为至少5％(w/w)和/或所述的聚氨基甲酸酯润湿时水含量至少为25％(w/w)。

25.用于测定流体样品中葡萄糖浓度的酶传感器，包括

金属电极，与金属电极接触的干扰限制层，

与干扰限制层接触的包括葡萄糖氧化酶的酶层，和

用于酶层的覆盖层，

其中所述覆盖层包括多孔聚对苯二甲酸乙二醇酯材料，且

其中多孔聚对苯二甲酸乙二醇酯材料的至少一面的外表面和孔口被亲水性聚氨基甲酸酯覆盖，所述聚氨基甲酸酯包括聚乙二醇主链链段，聚乙二醇链段重量比例为至少5％(w/w)和/或所述的聚氨基甲酸酯润湿时水含量至少为25％(w/w)。

26.包含径迹蚀刻的多孔聚合物材料的膜，其中多孔聚合物材料的至少一面的外侧表面和孔口至少部分地用亲水性聚合物浸渍，所述亲水性聚合物选自亲水性聚氨基甲酸酯和亲水性聚(甲基)丙烯酸酯。

27.包含多孔聚对苯二甲酸乙二醇酯材料的膜，其中多孔聚对苯二甲酸乙二醇酯材料的至少一面的外侧表面和孔口为至少部分地用亲水性聚合物浸渍，所述亲水性聚合物选自亲水性聚氨基甲酸酯和亲水性聚(甲基)丙烯酸酯。

28.包含多孔聚氯乙烯材料的膜，其中多孔聚氯乙烯材料的至少一面的外侧表面和孔口为至少部分地用亲水性聚合物浸渍，所述亲水性聚合物选自亲水性聚氨基甲酸酯和亲水性聚(甲基)丙烯酸酯。

29.权利要求26-28中任意一项的膜，其中所述亲水性聚合物为亲水性聚氨基甲酸酯。

30.清洁酶传感器的方法，所述传感器包括电极、至少一个酶层和用于至少一个酶层的覆盖层，所述方法包括将覆盖层的表面与含有蛋白酶的清洁溶液接触的步骤。

31.权利要求30的方法，其中蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶。

32.权利要求30-31中任意一项的方法，还包括在将覆盖膜与清洁溶液接触的步骤之前和之后，检测分析物的浓度的步骤。

33.权利要求30-32中任意一项的方法，其中所述覆盖膜包括至少一种多孔聚合物材料，其中至少一种多孔聚合物材料的至少一面的外侧表面和孔口被亲水性聚合物覆盖，所述亲水性聚合物选自亲水性聚氨基甲酸酯和亲水性聚(甲基)丙烯酸酯。

34.用于测定流体样品中分析物的浓度的设备，包括一种或多种如权利要求1-25中任意一项所定义的酶传感器。

35.用于测定流体样品中分析物的浓度的方法，包括将流体与权利要求1-25中任意一项的酶传感器接触，和传导至少一个包括酶传感器的电极的检测的步骤。

Images