CN107810409B

CN107810409B - 校正针对钙抑制的crea传感器的方法

Info

Publication number: CN107810409B
Application number: CN201680038026.2A
Authority: CN
Inventors: T.S.汉森; T.P.尼高
Original assignee: Radiometer Medical ApS
Current assignee: Radiometer Medical ApS
Priority date: 2015-07-06
Filing date: 2016-06-20
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2036-06-20
Also published as: CN107810409A; DK3320333T3; JP2018518681A; EP3320333A1; CA2989948A1; CA2989948C; WO2017005479A1; JP6557740B2; EP3320333B1; US20180202963A1; US10969358B2

Abstract

本发明提供了一种校准用于测量包含一种或多种酶调节剂的样品中的肌酸酐的浓度的设备的方法，该设备包括酶层，该方法包括：确定设备对于一种或多种校准溶液中的每种校准溶液的灵敏度；确定待测量的样品的调节度，确定每种校准溶液的调节度；其中所述确定调节度中的每个调节度包括估计设备的酶层中的酶调节剂的浓度；以及计算设备对于样品的灵敏度，其中所述计算包括将设备对于每种校准溶液的灵敏度调节某个因数，该因数包括样品和校准溶液的所确定的调节度。

Description

校正针对钙抑制的CREA传感器的方法

技术领域

本发明涉及用于校准肌酸和肌酸酐测量设备的方法，尤其是在存在酶调节剂的情况下进行校准的方法。

背景技术

用于测量肌酸酐(Crn)和肌酸(Cr)的浓度的技术在医学方面例如在监测肾病和监测竞技运动员方面有用途。可通过安培测量法来确定水溶液中的Cr的浓度(cCr)和Crn的浓度(cCrn)。可在对cCrn的测量中使用两种传感器：检测Cr的Crea A传感器；以及检测Cr和Crn两者的Crea B传感器。该cCrn基于Crea A传感器测量与Crea B传感器测量之间的差值。

传感器通常使用酶来将Crn和Cr转化为可测量的产物，诸如可在安培型系统中检测到的过氧化氢。为了以足够的精确度来确定未知样品中的cCrn和cCr，必须校准Crea A传感器和Crea B传感器以便确定其实际灵敏度。

然而，在样品中存在酶调节剂可调节(即，提高或降低)传感器中的酶的活性，并且因此调节其灵敏度。因此，利用具有与待测量的样品不同量或类型的酶调节剂的校准溶液来校准的传感器可能产生不准确的结果。

酶调节剂可天然存在于待测量的样品中，并且可以不可预知的量存在。例如，钙(Ca²⁺)和碳酸氢根(HCO₃ ^-)为酶抑制剂并且对于血液为内源性的，并且不同的人在其血液中具有不同浓度的这些调节剂。因此，这些调节剂的存在可能影响测量。

此外，一些调节剂诸如Ca²⁺向传感器中扩散地非常慢。因此，在对新样品执行测量时，来自早先样品的残留Ca²⁺的效应也可能影响结果。鉴于扩散速率慢，需要长时间冲洗以去除来自先前样品的任何残留调节剂，这将增加样品之间的循环时间。

因此，针对校准Cr传感器和/或Crn传感器的有效方法的尚未满足的需求考虑传感器中的不同酶调节水平同时使循环时间尽可能短。

发明内容

在本发明的第一方面中，申请人提供一种校准用于测量包含一种或多种酶调节剂的样品中的Cr和/或Crn的浓度的设备的方法，该设备包括酶层，该方法包括：确定设备对于一种或多种校准溶液中的每种校准溶液的灵敏度；确定待测量的样品的调节度，确定每种校准溶液的调节度；其中所述确定调节度中的每个调节度包括估计设备的酶层中的酶调节剂的浓度；以及计算设备对于样品的灵敏度，其中所述计算包括将设备对于每种校准溶液的灵敏度调节某个因数，该因数包括样品和校准溶液的所确定的调节度。

通过确定样品和校准溶液中的调节度，可能能够校准测量以校正调节剂可能对读数造成的任何影响，从而得到更准确的结果。某些调节剂可能残留在校准设备的酶层中，并且可能由此影响结果，因此所述调节度可考虑到调节剂的在酶层中将被估计到的浓度或量。

在一些示例性实施方案中，在确定样品的调节度之前，该方法还包括：抽吸设备中的早先样品；在另一个实施方案中，对在设备中先前抽吸的样品执行该方法。所提议的解决方案在早先样品已被抽吸的情况下尤其有利，因为对这些样品的抽吸在测量之间可能导致在酶层中残留的酶调节剂的水平增加。由于所提议的解决方案考虑到酶层中的酶调节剂的量，因此所提议的解决方案特别适合在已测量早先样品之后进行测量。

在一些示例性实施方案中，从抽吸早先样品到测量样品中的Crn的浓度的时间段小于2分钟，并且优选地为1分钟。可能有利的是使两个样品之间的时间较短(诸如小于2分钟或1分钟)，因为这将增加可在给定时间中测量的样品的数量。然而，当冲洗所提议的较短(例如，小于2分钟)时，残留的酶调节剂可能足以影响结果的准确度。所提议的解决方案考虑到在短时间冲洗之后的酶层中残留的酶调节剂的量。所提议的解决方案能够进行准确的测量，而不管在酶层中残留的酶调节剂如何。

在一些示例性实施方案中，所述估计酶调节剂的浓度包括确定自抽吸早先样品以来所经过的时间段。由于测量不一定在稳态期间执行，因此酶调节剂的量可能取决于时间。这样，通过测量自对样品的先前测量(并且因此对酶调节剂的先前测量)以来所经过的时间，可能估计在给定时间段之后残留的酶调节剂的量。

在一些示例性实施方案中，估计酶调节剂的浓度还包括在所确定的时间段期间估计设备的酶层中的酶调节剂的浓度的变化。

在一些示例性实施方案中，所述估计浓度的变化包括评估指数衰减项，其中该指数衰减项的时间常数与酶调节剂转入或转出酶层的速率相关。

在一些示例性实施方案中，在确定样品的调节度之前，该方法还包括：在抽吸早先样品之后，估计酶层中的酶调节剂的早先浓度，其中对调节度的确定利用早先浓度。

在一些示例性实施方案中，该方法还包括测量样品中的酶调节剂的浓度，其中对样品的调节度的确定利用样品的酶调节剂的浓度。

在一些示例性实施方案中，该方法还包括接收每种校准溶液中的酶调节剂的浓度，其中对校准溶液的调节度的确定利用每种校准溶液中的酶调节剂的浓度中的一种或多种浓度。

在一些示例性实施方案中，在确定样品的调节度之前，该方法还包括在设备中执行冲洗。

在一些示例性实施方案中，该方法还包括接收在冲洗中所使用的冲洗溶液的酶调节剂的浓度，其中对调节度的确定利用冲洗溶液的酶调节剂的浓度。

在一些示例性实施方案中，一种或多种酶调节剂包括Ca²⁺、Mg²⁺、以及它们的盐。

在一些示例性实施方案中，一种或多种酶调节剂抑制酶活性。

在一些示例实施方案中，所述确定设备对于每种校准溶液的灵敏度包括计算校准溶液中的设备的输出与校准溶液中的Cr和/或Crn的浓度之间的比率。

在一些示例性实施方案中，所述因数还包括校准溶液的所确定的灵敏度中的两个所确定的灵敏度之间的比率，其中每种校准溶液具有不同量的酶调节剂。

在一些示例性实施方案中，设备为Cr和/或Crn传感器。

根据本发明的另一个方面，提供包含指令的计算机可读介质，其中该指令当由电子设备的一个或多个处理器执行时使得电子设备根据前述方法中的任一方法进行操作。

根据本发明的另一个方面，提供一种电子设备，该电子设备包括：一个或多个处理器；以及包含指令的存储器，其中该指令当由处理器中的一个或多个处理器执行时使得电子设备根据前述方法中的任一方法进行操作。

附图说明

现在将参照附图来详细描述本发明所提议的装置的示例，其中：

图1为安培测量系统的示例的示意图；

图2为示出将Crn转化为过氧化氢的酶级联反应的一系列示意图；

图3为概述所提议的方法的步骤的流程图；以及

图4为示出在使用所提议的方法时结果改善的图示。

具体实施方式

现在将参照图1，其为三电极安培测量系统101的示意图。安培测量系统可具有至少两个电极：工作电极(WE)110、以及组合的反电极和参比电极(CE/RE)。对于三电极安培测量系统101而言，CE/RE电极的功能被分成两个单独的电极：参比电极(RE)111和反电极(CE)112。示例性安培测量系统101还包括安培计120、伏特计121、电压源122、和电解质溶液140。

WE 110为带正电的电极，在此处发生氧化反应。另选地，WE 110可为带负电的电极，在此处发生还原反应。RE 111通常由Ag/AgCl制成并且能够保持稳定的电势(尤其是在没有电流流过其中的情况下)，因此对于CE 112而言需要使来自WE 110的电流往回流到电解质溶液140。电解质溶液140和样品150提供这三个电极之间的离子接触。膜130将分析物选择性地转化为选择性地允许从样品150穿过的物质。电压源122施加必要的电势，以用于保持所需的由伏特计121控制的还原或氧化反应。安培计120测量流经电路的所得的电流，该安培计为自由流动电子的量度。

在图1中所示的安培测量系统为示例性示例，并且可设想若干个其他具体实施。例如，安培测量系统可为如上所述的双电极系统。

流过电极链的电流与在WE 110处被氧化(或还原)的物质的浓度成比例。在理想情况下，当获知将电流与浓度关联起来的比例常数时，任何给定样品中的浓度军可通过测量由该特定样品所生成的电流来获得。

为了示出安培测量系统中的测量过程，我们假定：样品150包含在膜130中选择性转化为种类A的种类B，其可在WE 110(阳极)处被氧化成A⁺；并且电解质140包含在CE 112(阴极)处被还原成X^-的种类X。我们还假定膜130仅允许种类A从样品穿过并进入电解质溶液140中。

当在电极两端施加适当的电势时，A根据以下反应在WE 110处被氧化：

A→A⁺+e^-

A的氧化反应产生电子流。为了完成该电路，需要消耗电子的还原反应。因此，种类X根据以下反应在CE 112处被还原：

X+e^-→X^-

流过电路的电流与被氧化的分析物的浓度成比例。如果种类X过量，则分析仪因此可自动计算样品中的分析物的浓度。

术语“传感器”是指完整的安培测量系统，如在不包括样品150的图1中所示的。

Crn在水溶液(例如，血液)中不稳定，其中其可逆地被转化为Cr(参见方案1)。为了测量cCr，使用Cr传感器(Crea A)。为了测量cCrn，可使用双传感器系统，其中一个传感器(Crea A)仅检测Cr，并且另一个传感器(Crea B)检测Cr和Crn两者。借助于差值测量，可获得cCrn值。

传感器由多层膜130保护，该多层膜由至少三个功能层组成，即可透过Crn和Cr的外膜层；中间酶层；以及可透过H₂O₂的内膜层。多层膜层130在下文中也被称为酶层。

在另一个实施方案中，利用基本上仅对Crn具有灵敏度的传感器来直接确定cCrn。这可通过施加不可透过Cr但可透过Crn的外膜来进行。

测量系统还可包含用于在样品测量之间清洗系统的冲洗机构。例如，可将冲洗溶液送入样品室中，以冲洗在样品室或膜中残留的任何残留物质。冲洗所用的时间量通常取决于去除残留物质所需的时间量。某些残留物可能需要非常长的时间才能去除，诸如从酶层中扩散出来的速度比其他物质慢得多的Ca²⁺。在所提议的解决方案的实施方案中，冲洗循环不必运行去除所有残留物的足够长的时间，因为该校准方法被调整为考虑到尚未被冲洗液去除的任何残留物质。

测量系统还可包含用于测量调节剂如Ca²⁺、HCO₃ ^-的浓度、以及pH的装置。例如，这些装置适于测量样品以及用于在使用之间冲洗测量系统的溶液中的调节剂的浓度。冲洗溶液中的调节剂的浓度可与冲洗溶液一起被提供，因此可能无需测量冲洗溶液。

图2示出了将Cr和Crn转化为过氧化氢的示例性酶级联反应。在该示例中，肌酸酶(肌酸脒基水解酶)220、肌氨酸氧化酶230、和肌酸酐酶(肌酸酐酰胺水解酶)210用于酶级联反应。这些酶固定在内膜层与外膜层之间，而Crn和Cr分子可扩散穿过外膜层。

该Crea A传感器根据反应202和203通过将Cr转化为过氧化氢来检测Cr。为了实现该转化，该Crea A传感器使用肌酸脒基水解酶220和肌氨酸氧化酶230。在Crea A传感器中，酶级联反应按如下方式来改变Cr：

Cr+H₂O→肌氨酸+尿素 (肌酸脒基水解酶)

肌氨酸+H₂O+O₂→甘氨酸+甲醛+H₂O₂ (肌氨酸氧化酶)

该Crea B传感器包含肌酸酐酰胺水解酶210、肌酸脒基水解酶220、和肌氨酸氧化酶230所有三种酶，并且因此检测Crn和Cr两者。在酶级联反应中，Crn/Cr参与反应201,202和203：

(肌酸酐酰胺水解酶)

Cr+H₂O→肌氨酸+尿素 (肌酸脒基水解酶)

肌氨酸+H₂O+O₂→甘氨酸+甲醛+H₂O₂ (肌氨酸氧化酶)

对于Crea A和Crea B传感器两者，酶反应产生相同的终产物，其中的一者为可穿过内膜层扩散到WE 110(优选地，铂)的H₂O₂。通过将足够高的电势施加到Crea A和Crea B传感器的电极链，H₂O₂可在Pt阳极240处被氧化：

H₂O₂→2H⁺+O₂+2e^-

为了完成该电路，在CE 112处在还原反应中消耗电子，从而保持WE110与CE 112之间的电荷平衡。

对H₂O₂的氧化产生与H₂O₂的量成比例的电流(I)，该电流(I)继而根据以下传感器响应模型而与Crea A传感器的Cr的量、以及Crea B传感器的Cr和Crn的量直接关联：

I_A＝灵敏度_A，Cr·[Cr]＝灵敏度_A·[Cr] 公式1

其中I_A和I_B分别为在Crea A传感器和Crea B传感器处产生的电流；灵敏度_A,Cr和灵敏度_B,Cr为分别将电流(I)与Crea A传感器和Crea B传感器中的Cr浓度关联的灵敏度常数，并且灵敏度_B，Crn为将电流(I)与Crea B传感器中的Crn浓度关联的灵敏度常数。下文将灵敏度_A和灵敏度_B分别用作灵敏度_A，Cr和灵敏度_B，Cr的缩略术语。

将电流与浓度关联的比例常数Sens通常被称为灵敏度。通过校准传感器来确定这些常数。通过分析仪中的安培计120来测量每个传感器的电流(信号)。如果传感器灵敏度为已知的，则易于从以上公式确定给定样品中的未知Crn浓度。

可通过酶调节剂来调节在图2中所示的反应。此类酶调节剂对于样品诸如Ca²⁺和HCO₃ ^-可为内源性的，并且这些酶调节剂可抑制所使用的任何酶的作用。术语“酶调节剂”包括降低酶的性能(抑制剂)或提高酶性能的物质。

酶调节剂不限于特定分子，并且可包括其他因数诸如溶液或样品的pH或温度。众所周知，如溶液的pH的因数可影响酶的性能，因此因数诸如pH在本文中可被称为酶调节剂。

在本文所公开的示例性实施方案中，提供了一种用于校准传感器以考虑作为调节剂的pH、HCO₃ ^-和Ca²⁺的效应的方法。然而，所提议的解决方案不限于这些特定调节剂，并且技术人员应当理解，该方法可被调整为忽略特定调节剂或包括其他调节剂的效应。

为了模拟调节剂的行为，在该示例性实施方案中，传感器被视为一维隔室模型，其中外膜仅具有扩散阻力但无体积，并且酶层仅具有体积，并且浓度在所有酶层中均相同。对该模型的以下推导得出一种在考虑pH、HCO₃ ^-和Ca²⁺的贡献时校准测量系统的方法。然而，本领域技术人员清楚地知道，下面的推导可适于得到一种适用于不同类型调节剂和传感器的方法。

可假定传感器相对于Cr转化处于稳态中。当传感器处于稳态中时，进入传感器的通量必须等于Cr的转化率，并且该转化率必须与所测量的电流(I_A)成比例。

通量_Cr＝转化率_Cr∞I_A 公式3

该通量也等于渗透率乘以样品与酶层之间的浓度差：

通量_Cr＝A_senP_OM([Cr]_sam-[Cr]_enz) 公式4

术语A_sen为酶层的面积，而P_OM表示外膜的渗透率。[Cr]_sam为样品中的Cr的浓度，而[Cr]_enz表示酶层内的Cr的浓度。

可假定Cr的转化率遵循其中浓度远低于Michaelis常数K_M(对于肌酸酶为27mM)的Michaelis-Menten动力学。酶层的体积为酶层的厚度(l酶)乘以传感器的面积。

公式4和公式5中的通量和转化率的表达式可插入到公式3中以得到公式6：其中假定K_M>>[Cr]_enz

理想的传感器具有无穷大的酶活性，并且因此能够将酶层中的Cr的浓度降至0。因此，进入理想传感器的通量可被表达为：

通量_Cr，理想＝A_senP_OM([Cr]_sam) 公式7

根据公式1，安培传感器的灵敏度被定义为电流除以样品浓度。

灵敏度与理想灵敏度之间的比率尤其适用于校准传感器。因此，公式3中的电流的表达式可插入到公式8中的传感器公式中，以提供灵敏度的比率的表达式：

公式4和公式7中的通量和理想通量的表达式可代入公式9中并且简化为公式10：

公式6可重写为酶层中的Cr浓度的表达式([Cr]_enz)：

公式11的酶层中的Cr浓度可代入公式10中，以提供传感器灵敏度与理想灵敏度的比率的表达式：

V最大值除以K_M可被表示为单位形式：

其中U为被分配在传感器上的单位的量(单位摩尔/秒)。U可除以酶层的体积，即(A_senl_enz)。α(t)项表示时间t处的残留活性，并且可处于0至1的范围内。调节度‘mod’提供在给定pH以及HCO₃ ^-和Ca²⁺浓度下对酶的调节程度的估计。调节度的值范围可在0和1之间。该函数可仅凭经验预测。

将公式13中的

的表达式插入公式12中，从而得到灵敏度的比率的最终表达式：

公式14仅适用于其中不考虑Crn的双酶传感器(Crea A)。如果传感器包含过量的肌酸酐酶酶活性，一些Cr在酶层中将被立即转化为Crn。考虑到这种可能性，可修改公式14以同时考虑Cr和Crn的总通量。假定样品仅包含Cr(与许多校准溶液相同)导致对公式14的下列修改：

通量_Cr+Crn＝A_senP_OM,Cr([Cr]_sam-[Cr]_enz)+A_senP_OM,Crn(-[Crn]_enz) 公式14A

公式14A可通过引入Crn与Cr之间的平衡比β以及渗透率之间的比率(假定为等于扩散系数之间的比率)而得以简化：

其中β＝[Crn]_enz/[Cr]_enz

使用公式14B而非公式4中定义的通量将得到针对三酶传感器(Crea B)的公式14的修改版本：

其中Crea B传感器的灵敏度灵敏度B根据公式2而被定义为电流除以样品的Cr和Crn的浓度，其中将后一种浓度与Cr和Crn的传感器灵敏度之间的比率α_B相乘。

针对三酶传感器(Crea B)的表达式(公式14C)类似于针对双酶传感器(Crea A)的表达式(公式14)，但三酶传感器公式包括因数

当β＝0.7并且

为约1.25时，相比于双酶传感器，将三酶传感器中的酶活性除以约2的因数。

为了对经调节的传感器进行校正，需要确定调节度函数的函数形式。为此，将调节度从公式14C中分离：

如果在较短时间帧内在同一传感器上抽吸变化的pH、HCO₃ ^-和Ca²⁺的一系列样品，则可认为右侧的项是恒定的并且可被常数C₁替代：

根据该项，可将调节度作为样品中的pH和HCO₃ ^-的函数来测量。如果假定调节由三个独立的函数组成，则得到以下项：

假设HCO₃ ^-为竞争抑制剂，从而将Michaelis-Menten动力学公式中的K_M项改变如公式18所示的某个因数，：

其中

公式18中的K_i为解离常数。公式17中的调节度([HCO₃ ^-]_enz)项的形式可通过将公式18插入到公式13中进行估计：

由于Ca²⁺也有助于抑制酶，因此也应被考虑到HCO₃ ^-的调节因数中，即

求解Ca²⁺、HCO₃ ^-(碳酸氢根)和酶之间的反应的体系(Enz-Bi表示受到一个HCO₃ ^-抑制的酶；Enz-Bi-Ca表示受到一个HCO₃ ^-和一个Ca²⁺抑制的酶)：

酶的总量的质量平衡(cEnz总量)由下式给出：

[Enz-Bi-Ca]_enz+[Enz-Bi]enz+[Enz]_enz＝cEnz总量

在上述公式中插入并分离[Enz]，从而得到：

从该公式中，可看到公式19的更准确的形式为：

接下来，可估计pH的效应(调节度(pH))，但由于pH并非简单的抑制，因此无法使用相同的方法。组氨酸(His232)在肌酸酶的活性位点中具有重要作用，并且pH依赖性可由该组氨酸基团的电荷来确定。由于酶活性随pH增大而提高，可假定不带电的组氨酸基团为具有酶活性的基团。因此，假定组氨酸遵循普通缓冲热力学，则可估计pH的以下表达式：

如果将带电的组氨酸替代为以下表达式：

[Enz-HisH⁺]＝cEnz总量-[Enz-His]

然后如果分离不带电的组氨酸，则所得的表达式将为：

假定其为具有活性的不带电His232的唯一酶，则最终调节项可由下式给出：

通过相对于总浓度cEnz总对公式22进行归一化，由于该项在公式16中作为C₁的一部分存在，因此调节值的范围可被限定在0和1之间的范围内；

可通过多种方式来确定K_a的值。例如，通过将公式23拟合到真实数据的示例性集合，确定针对该示例性集合的具有10^-7.9的值的K_a。

上述模型假设系统处于稳态中。然而，当正在测量系统时，其不一定处于稳态中，在测量已开始较短时间段之后尤其如此。在所提供的示例中，该短时间段将为17秒，但可设想更短或更长的时间。

HCO₃ ^-和pH通常具有快速时间常数，因此传感器通常在抽吸下一个样品之前的短时间冲洗之后达到平衡。因此，在确定酶层内的HCO₃ ^-的非稳态含量和pH水平时，一种合理的近似是仅检验来自当前样品的效应，而不是先前测量的任何残留量的效应。

然而，Ca²⁺具有远远更大的时间常数，并且传感器可能“记忆”具有高浓度Ca²⁺的先前样品。例如，残留Ca²⁺在冲洗较短时间之后仍可能存在于酶层中，因为短时间冲洗未提供足够长的时间供Ca²⁺扩散到冲洗溶液中。虽然设置较长的冲洗循环可有助于减少Ca²⁺的残留量，但这样将延长样品之间的时间，从而降低采样速率。执行完整的循环可能导致测量之间需要3分钟或更长时间，而有利的是将这一时间缩短至1分钟或更短。因此，与执行完整冲洗循环相反，所提议的解决方案执行部分冲洗，并且然后考虑来自先前样品的残留于系统中的Ca²⁺(或任何其他调节剂)的量。

估计酶层中的HCO₃ ^-的浓度

可通过两个主要贡献因素(HCO₃ ^-本身和CO₂)的质量平衡来估计17秒之后的酶层中的HCO₃ ^-浓度的样品引起的变化：

进入传感器的通量可由简单的线性模型近似得出，其中引入两个常数C₁和C₂(也包含t＝17秒、A_sen、P_OM和l_enz)：

由于在Crn传感器中测得的H₂O₂将在测量传感器的整个17秒内生成，因此在17秒内生成的平均HCO₃ ^-的近似值将用于进行测定。在确定样品的调节度(mod)时，公式25中的17秒处的浓度表达式应足够准确以用于代入公式23中。

可通过各种手段来确定两个常数值C1_HCO3和C2_CO2。例如，通过标准性能测试的优化可能表明这两个常数的最优值可为：

C1_HCO3＝0.5

估计酶层中的pH

由于pH由对数函数来定义，因此非稳态建模需要多个另外的步骤。影响pH的因素可包括流动缓冲液和固定缓冲液两者。假设一种流动缓冲液mBuf为具有共轭酸mBuf_A和碱mBuf_B种类的主缓冲剂，则17秒之后的酶层中的样品引起的pH的变化可被表示为：

缓冲液的pK_a可取多个值，但这里使用的pK_a值为7.0。假设固定量的固定缓冲容量来自与流动缓冲液具有相同pK_a的酶，则pH的公式变为：

由于冲洗液和样品中的大多数种类的pK_a显著大于或小于7，因此改变传感器中的pH的唯一相关机制为CO₂被转化为H⁺和HCO₃ ^-。该机制可通过如下方式反映在pH公式中：

个CO₂产生的H⁺的量可通过如下公式近似得出，其中重复使用来自公式25的CO₂常数(C2_CO2)：

针对pH变化的另一种间接方法为确定测量期间的流动缓冲液的损失(以及校准期间的可能的增益)：

[mBuf_A]_enz≈[mBuf_A]_冲洗+C₃([mBuf_A]_sam-[mBuf_A]_冲洗)

[mBuf_B]_enz≈[mBuf_B]_冲洗+C₃([mBuf_B]_sam-[mBuf_B]_冲洗)

这些项可插入上述pH公式中，以得到：

流动缓冲液扩散的贡献通常微不足道，并且可忽略来自酶层的缓冲液量，因此公式可被简化为公式27：

在确定样品的调节度(mod)时，该pH的表达式可用于公式23中。

估计酶层中的Ca²⁺的浓度

Ca²⁺相比于pH和HCO₃ ^-具有远远更小的时间常数，并且因此在短时间冲洗之后，可能仍有Ca²⁺残留。为允许较短冲洗时间，所提议的解决方案追踪测量系统中的Ca²⁺浓度的历史记录。

扩散进入和离开隔室(诸如酶层)可通过指数衰减函数来建模。因此，紧在抽吸新样品之前，酶层中的浓度可被表示为：

其中Δt为从K_a上一个样品到抽吸新样品所经过的时间：[Ca²⁺]_{enz，上一个样品之后}为上一个样品结束时的酶层中的Ca²⁺浓度；τ为特定于传感器构造的时间常数。

在暴露于样品时，酶层中的浓度符合相同的函数。在该示例中，暴露时间为20秒。

公式28中的c[Ca²⁺]_{enz，上一个样品之前}表达式可代入公式29中，以形成显示自上一个样品以来经过的时间、在上一个样品之后的酶层中的浓度与当前样品浓度之间的关系的单个公式：

公式30可用于追踪作为时间和样品的函数的Ca²⁺浓度。还可修改该公式以用于估计在调节函数中所使用的Ca²⁺浓度，从而考虑到测量仅执行17秒而上述估计仅执行20秒的事实。因此，可通过定义17秒测量中间(8.5秒)的Ca²⁺浓度来优化该公式：

公式30用于追踪随时间的变化的Ca²⁺浓度，而公式31可能更适于代入公式23中的调节函数中。

既然已建立用于确定调节度([pH]_enz、[HCO₃ ^-]_enz、[Ca²⁺]_enz)的表达式，则应对公式14C的剩余项进行评估。可将不依赖于样品的项隔离到可通过校准而确定的单个变量

中：

为无量纲常数，其为酶活性与传感器的渗透率之间的比率的表达式。在每次执行校准时，可通过评估公式32的右侧来确定该变量。

需要利用下列项来校正样品的灵敏度：

关于调节度的指标指示针对样品或校准溶液的抽吸来对调节函数进行评估。如果需要实施Crn/Cr校正项，则可通过找到P_OM的分析表达式来校正

在所提供的示例性实施方案中，可确定两种校准溶液(灵敏度_B,Cal2和灵敏度_B,Cal3)的灵敏度，但缺失灵敏度_B,理想的值。缺失灵敏度_B,理想数据但可能够获得Cal2和Cal3数据的

的表达式如下所示：

针对稳态数据(公式33和34)与非稳态调节函数(公式33、35、37和41)组合导出的上述校准模型适用于校正传感器，即使不一定在稳态中进行测量时也是如此。

对该校准模型的推导可由本领域技术人员进行调整，以适应不同的配置，诸如酶、调节剂、定时和校准溶液的数量的差异。使用推导出的校准模型，技术人员可执行考虑到调节剂的准确校准，同时保持样品测量之间的时间相对较短。

图3概述了用于执行所提出的方法的示例性实施方案的步骤。所提出的方法不限于图3所示的步骤顺序，可设想所述方法也不仅限于所提供的该示例性实施方案。

在步骤310处，确定设备对于一种或多种校准溶液中的每种校准溶液的灵敏度。所述确定该灵敏度可涉及计算安培计输出(电流，I)与校准溶液中的Cr或Crn的已知浓度之间的比率、以及Crea B传感器的灵敏度之间的比率α_B。在一些实施方案中，校准溶液的Cr或Crn的浓度需要根据初始浓度而被确定或调节，而在其他实施方案中，这些浓度作为伴随校准溶液的数据而被提供。

例如，一种校准溶液Cal2的灵敏度可由下式给出：

类似地，另一种校准溶液Cal3的灵敏度可由下式给出：

可能有利的是使用两种校准溶液，其中在校准溶液中提供不同量的酶调节剂，从而有效地提供两个数据点以用于确定酶调节剂与灵敏度之间的关系。提供具有不同酶调节剂量的多于两种校准溶液可得出更准确的结果。可选择一种校准溶液以具有非常少酶调节剂或没有酶调节剂，而选择另一种校准溶液以具有与样品中的预期量的酶调节剂大约相同数量级的酶调节剂。这样，第二校准溶液提供接近预期样品的灵敏度，而第一校准溶液提供偏离第二校准溶液足够远的灵敏度，从而提供对酶调节与灵敏度之间的关系的良地度量。

在步骤320处，确定待测量的样品的酶调节度。该酶调节度为给定样品中的对酶活性的调节程度的量度。例如，在存在HCO₃ ^-浓度([HCO₃ ^-])、Ca²⁺浓度([Ca²⁺])和高于最佳碱度(pH)的情况下，这可将酶活性抑制由调节度给出的特定百分比。

可通过下列方法来确定所测量的样品的调节函数：

为确定该调节函数，需要对pH_enz、[HCO₃ ^-]_enz和[Ca²⁺]_meas的值进行估计。pH_enz的值可使用公式27来确定，即

HCO₃ ^-浓度的值可使用公式25来确定，即

Ca²⁺浓度的值可使用公式31来确定，其中考虑到先前样品中的Ca²⁺的浓度以及时间，以便考虑酶层(321)中的酶调节剂的量：

借助估计出的pH_enz、[HCO₃ ^-]_enz和[Ca²⁺]_enz的值，可确定样品的调节度函数。针对每个所测量的样品可重复该过程。

在步骤330处，使用与用于样品的相同的方法来确定用于校准溶液Cal2和Cal3的调节函数调节度_Cal2和调节度_Cal3。

首先，需要估计每种校准溶液的pH_enz、[HCO₃ ^-]_enz和[Ca²⁺]_enz的值，然后可计算调节函数。可使用公式27来确定Cal2和Cal3校准溶液的pH_enz的值：

可使用公式25来确定Cal2和Cal3校准溶液的HCO^3-浓度的值：

可使用公式31来确定Cal2和Cal3校准溶液的Ca²⁺浓度的值。可考虑先前测量的Ca² ⁺浓度以及时间，以便在校准溶液的测量期间考虑酶层(331)中的酶调节剂的量：

在步骤340处，计算测量设备对于每种校准溶液和样品的灵敏度。该步骤可能涉及接收校准溶液的所测量的灵敏度并将其调整某个因数，该因数为调节函数和

的函数。该

可由已计算得出的校准溶液灵敏度和调节函数给出，并且可为公式34的形式：

一旦确定

的值并在步骤320和步骤330中确定调节函数，则可使用公式33来确定灵敏度：

一旦已确定灵敏度，测量系统便被校准。在此处通过测量安培计的原始输出并将其除以所计算的灵敏度，可使用对于样品的灵敏度来确定样品的Cr或Crn的准确浓度，如公式1和公式2所示。

图4为将根据所提议的解决方案测量血液中的Crn浓度的结果与不利用所提议的解决方案测量血液中的Crn浓度的结果进行比较的图示。抽吸血液样品五次，在冲洗之间利用2分钟的相当短的循环时间。

点410显示对Crn的测量，而不考虑系统中的时间依赖性酶调节剂(Ca²⁺)的量。如趋势线411所示的，在不进行时间依赖性校正时，Crn的测量随每个后续测量减小。这是由于在每次测量之后酶层中的酶调节剂(Ca²⁺)含量增加引起的，其中在测量之间未进行足够的冲洗来清除Ca²⁺。数据表明，Crn的读数仅在五次测量之后就降低5.7％(从78.8μM降至74.3μM)。

点420示出了在根据所提议的解决方案考虑时间依赖性酶调节剂(Ca²⁺)的量时的相同血液样品的Crn的测量。借助时间依赖性校正，趋势线421表明测量在整个测量过程中更一致，并且该图证实所提议的解决方案充分考虑到测量与短时间冲洗之间的Ca²⁺水平增加。数据表明Crn读数的最大变动仅为1.1％(从79.7μM降至78.8μM)。这证实确定时间依赖性酶调节量的所提议的解决方案可得到更准确和更一致的结果，特别是在测量之间的冲洗时间较短的情况下。

应当理解，本公开包括在上述实施方案中陈述的任选特征的组合的排列。具体地，应当理解，在所附从属权利要求中陈述的特征与可提供的任何其他相关独立权利要求联合公开，并且该公开内容不限于仅是这些从属权利要求的特征与它们初始从属的独立权利要求的特征的组合。

Claims

1.一种校准用于测量包含一种或多种酶调节剂的样品中的肌酸和/或肌酸酐的浓度的设备的方法，所述设备包括酶层，所述方法包括：

确定所述设备对于一种或多种校准溶液中的每种校准溶液的灵敏度；

确定待测量的所述样品的调节度，

确定每种校准溶液的调节度；

其中确定所述调节度中的每个调节度包括估计所述设备的所述酶层中的酶调节剂的浓度；以及

计算所述设备对于所述样品的所述灵敏度，其中所述计算包括将所述设备对于每种校准溶液的所述灵敏度调节某个因数，所述因数包括所述样品和所述校准溶液的所确定的调节度，

其中在确定所述样品的调节度之前，所述方法还包括：

抽吸所述设备中的早先样品。

2.根据权利要求1所述的方法，其中从抽吸所述早先样品到测量所述样品中的肌酸酐的所述浓度的时间段小于2分钟。

3.根据权利要求2所述的方法，其中从抽吸所述早先样品到测量所述样品中的肌酸酐的所述浓度的时间段小于1分钟。

4.根据权利要求1所述的方法，其中估计酶调节剂的所述浓度包括确定自抽吸所述早先样品以来所经过的时间段。

5.根据权利要求2所述的方法，其中估计酶调节剂的所述浓度包括确定自抽吸所述早先样品以来所经过的时间段。

6.根据权利要求3所述的方法，其中估计酶调节剂的所述浓度包括确定自抽吸所述早先样品以来所经过的时间段。

7.根据权利要求4所述的方法，其中估计酶调节剂的所述浓度还包括在所确定的时间段期间估计所述设备的所述酶层中的酶调节剂的浓度的变化。

8.根据权利要求7所述的方法，其中估计浓度的变化包括评估指数衰减项，其中所述指数衰减项的时间常数与酶调节剂转入或转出所述酶层的速率相关。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中在确定所述样品的所述调节度之前，所述方法还包括：

在抽吸所述早先样品之后，估计所述酶层中的酶调节剂的早先浓度，

其中对所述调节度的所述确定利用所述早先浓度。

10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，所述方法还包括测量所述样品中的酶调节剂的浓度，

其中对所述样品的所述调节度的所述确定利用所述样品的所述酶调节剂的所述浓度。

11.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，所述方法还包括接收每种校准溶液中的酶调节剂的浓度，

其中对所述校准溶液的所述调节度的所述确定利用每种校准溶液中的所述酶调节剂的所述浓度中的一种或多种浓度。

12.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中在确定所述样品的调节度之前，所述方法还包括在所述设备中执行冲洗。

13.根据权利要求12所述的方法，所述方法还包括接收在所述冲洗中所使用的冲洗溶液的酶调节剂的浓度，

其中对所述调节度的所述确定利用所述冲洗溶液的所述酶调节剂的所述浓度。

14.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述一种或多种酶调节剂包括Ca²⁺、Mg²⁺、以及它们的盐。

15.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述一种或多种酶调节剂抑制酶活性。

16.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中确定所述设备对于每种校准溶液的所述灵敏度包括计算所述校准溶液中的所述设备的输出与所述校准溶液中的肌酸酐和/或肌酸的浓度之间的比率。

17.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述因数还包括校准溶液的所确定的灵敏度中的两个所确定的灵敏度之间的比率，其中每种校准溶液具有不同量的酶调节剂。

18.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述设备为肌酸和/或肌酸酐传感器。

19.一种包含指令的计算机可读介质，所述指令当由电子设备的一个或多个处理器执行时使得所述电子设备根据如权利要求1至18中任一项所述的方法进行操作。

20.一种电子设备，包括：

一个或多个处理器；和

包含指令的存储器，所述指令当由所述处理器中的一个或多个处理器执行时使得所述电子设备根据如权利要求1至18中任一项所述的方法进行操作。