CN111742215A - 金属-酶夹层 - Google Patents

Abstract

对靶分析物的测量用基于酶的传感器进行。酶水凝胶受金属材料多孔层保护。孔的尺寸小到足以阻止由生物体的免疫系统引起的酶层降解，但又大到足以允许参与电化学反应的分子转移，从而允许酶检测靶分析物。

Description

金属-酶夹层

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年4月9日提交的美国临时专利申请第62/654,701号和于2018年11月14日提交的美国专利申请第16/191,357号的优先权，其公开内容都通过引用以其整体并入本文。

利益声明

本发明是在政府的支持下根据由DARPA授予的批准号HR0011-15-2-0050进行的。政府在本发明中拥有某些权利。

技术领域

本公开内容涉及生物传感。更特别地，本公开内容涉及金属酶夹层(metal-enzymesandwich layers)。

附图简述

被并入本说明书的并构成本说明书的一部分的附图图示了本公开内容的一个或更多个实施方案，并与对示例实施方案的描述一起用于解释本公开内容的原理和实施。

图1-2图示了传感器制造过程中的步骤。

图3图示了电极配置。

图4图示了不规则峰的图像。

图5图示了示例性周期性(periodic)纳米柱。

图6图示了具有保护性金属顶层的示例性传感器。

图7图示了示例性数据。

图8图示了在平坦基底上建立电化学传感器的示意性方法。

图9-10图示了传感装置的不同实施方案。

图11图示了传感装置的示例性阵列。

概述

在本公开内容的第一方面，描述了一种传感装置，该传感装置包括：在基底上的工作电极；其中：所述工作电极包括：接触基底的金属层；在金属层上的酶层；和在酶层上的金属多孔层，并且所述工作电极、所述金属多孔层和所述酶层被配置为通过电化学反应检测靶分析物。

详述

含有酶分子的层对于葡萄糖、乳酸和身体中许多其他具有医学重要性的代谢物的电化学测量很重要。如本领域普通技术人员所知，在涉及分析物分子的化学反应期间，酶促反应可用来选择性地将感兴趣的分析物转化为副产物，释放电活性化合物。然后，对电活性化合物产生速率的电化学测量可以提供分析物分子的浓度数据。这些测量通常不是无误差的，因为酶反应对感兴趣的材料可能不是完全选择性的。换言之，酶反应的发生可能伴随假阳性。另一个因素是发生反应所需的试剂应该以足够的量存在，否则电化学测量将受到试剂量的限制，而不完全准确。此外，酶的转化率应该高到足以产生与分析物分子成比例的电活性化合物，否则信号可能在噪声中损失。

在一些实施方案中，电活性化合物可以是离子。然而，在一些实施方案中，电活性化合物可以是除了离子之外的分子。例如，典型的葡萄糖氧化酶反应中感兴趣的产物(过氧化氢)不是离子。在本公开内容中，一些实施方案可以将离子称为电活性化合物，然而这些实施方案更通常地还可在没有离子但具有不带电荷的电活性化合物的情况下实施。在本公开内容中，“电活性化合物”是指能够通过电极表面上的化学反应产生通过电极的电流的离子和不带电荷的化合物。

如果能够从电活性产物中收集到明显的电流，就可能对代谢生物标志物进行准确测量，只要酶分子保持是有活性的。因此，必须考虑酶降解，并阻止或至少降低酶降解以延长传感器的寿命。分析物反应转化为测量的电流的效率由转化效率表征，如果电活性产物被有效地收集到测量电极上并且不会通过扩散而损失到周围环境中，则转化效率能够被优化。反应速率还应该受到感兴趣的分析物的存在以及由适当的周转率维持的试剂对酶分子的浓度梯度的限制。

自20世纪60年代以来，酶反应已被用于测量葡萄糖和其他分析物。第一电化学葡萄糖检测器测量工作电极上的电流，相对于反电极偏差负0.6V，以便从葡萄糖氧化酶(GOx)催化的葡萄糖与氧之间的酶促反应产生的过氧化氢中收集电荷。在该催化反应中，葡萄糖被氧化为过氧化氢和D-葡萄糖酸内酯(D-glucono-lactone)。用恒电位仪(potentiostat)测量金属工作电极处过氧化氢转化为水和氧的电流。在宽的浓度范围内，电流与葡萄糖浓度成比例。自20世纪60年代初以来，已经鉴定了许多其他的酶(氧化酶和脱氢酶二者)来测量感兴趣的其他分析物。这样的酶可以选择性地与葡萄糖、乳酸、醇、尿素、胆固醇、黄嘌呤和几十种感兴趣的其他分析物反应。

在基于酶的电化学传感器中，当酶分子被攻击、溶解或损失其辅因子时，分析物分子向可测量电流的转化效率通常随时间改变。这些过程导致传感器的灵敏度和准确度随时间推移劣化(deterioration)。依赖于酶促反应的电化学传感器存在几种故障模式。例如，酶可能因由于其周围环境中的分子化合物或由于传感器自身产生的反应性化合物被氧化而劣化。酶也可能损失能够与分析物有效反应的辅因子。用于酶促反应的其他必要试剂，诸如对于氧化酶而言的氧，可能被耗尽，或者反应性酶膜可能简单地通过降解而使其对基底的粘附产生分层。当传感器位于活生物体内时，这些故障模式通常会加速，因为生物体的免疫系统会通过其对外来物质的身体反应(foreign body reponse)而攻击传感器，并通过氧化导致酶劣化。体内植入物可能被包封，通过这一过程，免疫应答在植入的装置周围建立疤痕组织扩散屏障，阻止试剂和分析物渗透到传感器电极，并将植入物与生物体的其余部分隔离。所有这些影响最终限制传感器的寿命，或者限制电化学传感器能够提供有用且准确信息的时间长度。大多数传感器局限于在活生物体中遇到的挑战性环境中工作几周。

本公开内容描述了用于避免常规降解机制并延长基于酶的电化学传感器和依赖于监测电化学活性触点(contact)上或附近的选择性(结合)反应的其他传感器的寿命的新方法。通常，电极用于通过使用针或线的几何形状或者通过在平坦表面上界定电极来形成电化学传感器。理想地，电极材料应该对周围环境呈惰性，并且不会遭受快速腐蚀。因此，铂、金、钨、铱和钛是优选的材料，因为它们是生物相容性材料，不会在体内快速变质，并且不会产生有害的免疫系统反应。

这些电极的阻抗最终决定在给定电压可以流过电极的电流，为了使传感器灵敏度和信噪比最大化，期望电极使该电路电阻最小化。这种阻抗可以通过改变电极的表面面积来改变。增加的表面面积可以通过增加传感器的横向尺寸来实现，或者通过制造对于相同的横向尺寸具有增加的表面面积的三维电极表面来实现。例如，可以通过波纹成形(corrugation)、通过扩展海绵状几何形状、或者通过制造规则或不规则的纳米柱或锯齿状结构来增加表面面积。通常，表面积与体积比大的电极可以为电化学反应提供低阻抗触点。

在依赖监测酶反应产生的离子的传统电化学传感器中，金属触点表面涂覆有含有酶的薄粘合层。该层通常被称为“水凝胶”，因为其由相对多孔的材料组成，该多孔材料能够使较小的分子分析物(葡萄糖、乳酸等)扩散穿过该层以与固定在该层的分子结构内的酶分子反应。葡萄糖监测器中使用的传统化学是戊二醛体系，这是一种交联形成化学稳定支架的聚合物，酶分子可以固定在该支架中。该聚合物多孔到足以使酶分子保持有活性，并且使试剂进入且使产物离开该聚合物。在商业传感器中，含有酶的基于戊二醛的层通常是数微米厚的。酶分子产生离子，该离子需要穿过该数微米的厚度，以便在电极表面处被读取。不幸的是，任何残留的戊二醛都是免疫原性的，并且可以加速天然免疫应答。因此，基于戊二醛的层通常覆盖有由聚氨酯组成的保护层或被聚乙二醇聚PEG化，以降低免疫应答。这些另外的层通常降低酶传感器的灵敏度，并且当它们受到自然氧化性物质(oxidizingspecies)的攻击时会慢慢被侵蚀，继而导致相对短的传感器寿命。

本公开内容描述了一种用于延长基于酶的电化学传感器的寿命的方法。该方法使用沉积在含有活性酶的薄层的顶部表面上的薄金属层。例如，铂可以以非常多孔几何形状沉积，通常称为“铂黑”。诸如钛、金或钨的其他材料也可以用于制造金属多孔层，该金属多孔层允许靶分析物、试剂和副产物在两个方向上移动通过多孔电极，从而允许接近下面的酶水凝胶。铂(或其他金属)层可以通过真空沉积工艺沉积，其中铂从铂靶溅射并沉积到样品上。溅射沉积工艺能够通过调整沉积参数来控制铂层的厚度和微结构二者，沉积参数包括沉积期间的电压、功率和真空压力。因此，铂黑层可以用作电化学电极的低阻抗接触表面。溅射沉积不是沉积金属的唯一方法，并且替代方法包括从加热源蒸发。该源可以通过电阻方法加热或用电子束加热。在其他实施方案中，可以使用其他沉积方法，诸如脉冲激光沉积。沉积技术的关键要求是酶层的局部加热和沉积所要求的时间应该被最小化。事实上，局部加热可能使酶层降解。尽管材料沉积可能需要腐蚀性溶液，但通过电镀或无电镀(electroless plating)从电镀槽沉积金属层也是可能的。

本公开内容描述了铂/酶/铂夹层或多层的沉积，而不是在铂电极层的顶部沉积单个含酶活性层。该结构包括顶部铂层(其是相对多孔的以使分析物能够到达中间层中的酶分子)和底部铂层(其充当电极)。该方法带来数个重要的优点。铂层使下面的酶层免受氧化性物质影响，该氧化性物质将通过免疫应答过程攻击聚合物。顶部金属层中的孔是纳米级的，因此多孔铂层阻止免疫系统探测和识别潜在的化学物质(chemistry)，去除免疫原性行为。事实上，免疫系统的活性组分通常比纳米级孔大。顶部铂层任选地充当另一个接触表面，该接触表面捕获原本会损失的逃逸离子，并使其能够对电测量做出贡献。这是可能的，如果顶部铂层通过穿过酶层的通孔(vias)或通过酶层周围的电通路电连接到底部铂层的话。铂层还能保留氧，氧是在过氧化物离子在金属表面处反应转化为水和溶解氧时产生的。氧是后续反应所需要的，该后续反应要求氧作为试剂，以使酶辅助的转化成功进行。可减少底部铂层与顶部铂层之间的距离，以通过扩散到传感器周围的溶液来控制辅因子的损失。所有这些效应已表明改善传感器对葡萄糖响应的线性度。

在一些情况下，可能优选的是将顶部多孔金属层电附接到底部电极。该过程可以有效地使可用电极面积加倍，这在灵敏度是重要的情况下可能是期望的。可以以数种方式进行附接。如图9的横截面示出的，基于酶的传感层(905)可以被制造为稍小于底部电极层(910)。换言之，酶层的横向尺寸稍小，在侧面留下一些空间。然后顶部导电多孔层(900)可以被制造为比基于酶的传感层大。以这种方式，顶层通过酶层边缘(periphery)周围的导电通路电连接到底部电极层。可选地，基于酶的传感层(920)可以被制造为具有多个洞(hole)或通孔(902)，顶部多孔层(915)通过这些洞或通孔电连接到底部电极层(925)。这些洞可以通过光刻图案化技术形成，并且在一些情况下，这些洞可以通过调整基于酶的传感层的沉积参数使得其天然地包含孔来形成。该制造技术的一个优点是大量的导电附接点提高了电连接的可靠性及其机械可靠性二者。形成这些导电附接点的另一种方式是制造底部电极层(945)，使得其具有柱(904)。然后可以将基于酶的传感层(935)沉积在底部电极层(945)上，留下暴露的柱的顶部表面。当多孔层(930)沉积在该结构上时，其接触柱的顶部表面，在顶部电极与底部电极之间形成多个导电通路。

这些导电附接点本身可以增加有效电极面积，因为每个导电附接点都增加了一些表面面积。因此，在增加的电极面积是有益的情况下，每个导电附接点的宽度可以小至5-40纳米，这是这种类型结构的大多数实际制造技术的限制。附接点之间的间距(spacing)可以小至100纳米。然而，这样的附接点可能是易碎的，并且通常生产起来复杂。如果由于较高的背景电流，如此高的有效表面面积是不必要的或可能不是有益的，则更大的附接点诸如1至25微米，以及更大的间距诸如1至25微米，是优选的。这些附接点的形状通常由制造技术决定，并且可以具有例如圆形或矩形横截面。这些附接点的高度通常基于酶传感层的期望厚度来选择。

在一些实施方案中确保顶部导电多孔层与底部电极层电断开可能是优选的。事实上，顶部导电多孔层本身可以从传感器外部产生的干扰化合物产生干扰电流。另外地，增加的表面面积可能增加背景电流。在一些情况下，这些干扰电流和背景电流可能大到足以抵消从酶传感层收集分子的表面面积增加的益处。存在维持顶部多孔层与底部电极层之间的电断开的多种方式。在图10中，示出了维持电隔离的一种方式。酶传感层(1005)被制造为具有比底部电极层(1000)大的横向尺寸。顶部多孔层(1010)被制造为具有与酶传感层相比更大的横向尺寸，完全包封酶层，同时避免顶层与底层之间的任何电连接。

在一些实施方案中，基于酶的传感层在沉积时天然地包含孔，导致顶层与底层电连接。在这些情况下，可能需要沉积另外的绝缘层。例如，如果含有孔的有缺点的(imperfect)酶传感层(1020)被沉积在底部电极(1025)上，则薄的多孔电绝缘体(insulator)(1015)可以被沉积在酶传感层(1020)的顶部，以将底部电极(1025)与顶部多孔导电电极(1030)分开。可以使用多种多孔绝缘材料，包括例如聚氨酯和Nafion^TM，它们通常被出于该目的用于电化学传感器中。在一些情况下，可以制造具有孔的无机绝缘体，诸如氮化硅或二氧化硅，以完成相同的任务。通常，用于层(1015)的材料必须是电绝缘体，并且含有足够大的孔，以容易地允许感兴趣的分析物到达酶传感层。该层的厚度由多种因素决定，包括维持足够电绝缘所需要的厚度、层的孔隙率、顶部多孔层的沉积方法的性质以及下面的酶传感层的粗糙度和厚度。通常，该层被制成尽可能薄，以便其不妨碍分析物或其他分子进出传感层的转运。例如，无机绝缘体通常具有优异的绝缘性能。如果使用无机绝缘体，在10nm至500nm之间的层可能足以进行该功能。如果使用有机绝缘体，可以使用100nm至5微米的层厚度。

如本领域普通技术人员已知的，获得线性传感器性能的替代方法要求使用有机控制层例如聚氨酯来控制扩散。这些层的精确厚度及其粘附化学非常依赖其被沉积的环境湿度和温度。可变性难以控制，可能对测量引入不确定性。本公开内容中描述的多孔金属扩散控制层提供了具有提高的离子收集效率和氧再循环的解决方案，因为没有过氧化物分子损失到周围组织中，导致测量的传感器灵敏度几乎没有降低。因此，使用多孔金属层减少了不同传感器之间的可变性，继而提高每个传感器的准确度和可靠性。

除了提供更好的线性度和氧不敏感性(oxygen insensitivity)之外，通过对免疫系统隐藏传感性化学物质，金属表面保护性层还能保护酶分子免受攻击，从而产生赋予长寿命的具有非常薄的酶层的高效电化学传感器。酶层的厚度决定传感器对感兴趣的分析物分子的反应与观察到来自在接触表面释放的离子的电信号之间的延迟。在本公开内容的结构中，这种延迟可以被缩短，由受周转率(turn-over)确定的酶反应速度所限制，而不是受聚合物基质中离子的扩散速率所限制。

当要涂覆薄且易碎的有机材料时，通过真空处理的金属沉积会给其带来许多潜在的缺陷。然而，通过酶层与戊二醛的适当聚合以及随后使用铂溅射沉积工艺来金属化，在酶上沉积金属层而不会使酶的化学性能劣化太多是可能的。金属/酶/金属夹层甚至可以被沉积在光致抗蚀剂剥离掩模(photoresist lift-off mask)上，并通过使用光刻方法图案化。这种制造方法仅在感兴趣的电极顶部留下活性夹层，并且从而能够以微米准确度实现选择区域的功能化。剥离化学(其由使用丙酮选择性溶解光致抗蚀剂模板层，以界定金属/酶/金属功能化区域的图案构成)未显著降低葡萄糖氧化酶的酶活性，并且允许将夹层结构界定在电化学恒电位仪检测器的顶部。这也可能适用于其他酶，诸如乳酸氧化酶或脲酶，并且导致通过将不同的酶层沉积到电化学工作电极上的一系列光刻工艺而在同一基底上限定数个不同的化学传感器的机会。因此，在一些实施方案中，传感器可以包括多于一个区域，每个区域具有不同的酶层，以便用相同的传感器检测多于一个靶分析物。与现有技术中已知的过氧化物或氨分子可逃逸的传感器系统不同，本公开内容中描述的基于金属的多层阻止这些分子逃逸，避免串扰，并且能够精确测量数个非常接近的分析物。

在这样的基于酶的传统传感器系统中，由于串扰，在紧凑型传感器中测量多于一种分析物通常非常困难。具体地，用于不同分析物的许多酶产生相同的报告分子(报告分子是产生传感的分子)，并且由于一种分析物产生的报告分子可以被用于另一种分析物的电极传感。例如，被设计为测量乳酸和葡萄糖二者的可植入传感器可以具有两个电极，一个涂覆有乳酸氧化酶，且一个涂覆有葡萄糖氧化酶。当葡萄糖水平高时，由葡萄糖氧化酶产生的过氧化氢可能扩散到乳酸氧化酶电极，错误地使乳酸读数升高。这些电极通常可能需要分开1mm或更大的距离，以将串扰降低到可接受的水平，这取决于传感器被植入的环境并且取决于所要求的准确度。无线可植入传感器可以小于1mm，电极小至200×200微米，因此，当必须对多于一种分析物传感时，所要求的这种分隔可能限制最小装置尺寸。因为本公开内容中描述的金属/酶/金属传感器具有多孔顶层，该顶层被设计为与任何逃逸的过氧化氢或其他报告分子反应或捕获任何逃逸的过氧化氢或其他报告分子反应，所以发生的串扰少得多，并且多分析物传感器可以在工作电极之间具有小至10-250微米的分隔，这取决于顶部金属层所要求的孔隙率和每个传感器所要求的准确度。该优点允许制造具有小于1mm²的区域的无线可植入传感器，其可以在一个装置中检测多种分析物。

在一些实施方案中，传感器还可以包括无线电子器件，以将其测量值从人体内传输到外部设备。例如，传感器可以具有1.2mm乘1.2mm的尺寸，0.1s的快速响应时间，使用5微瓦的低功率，并且仅花费10美分。毫米规模尺寸的传感器不会相对于周围的细胞移动，维持恒定的阻抗。由于其尺寸小，传感器也可以植入到许多位置，其可被注射并且产生小的组织刺激。可能的应用包括监测慢性疾病，诸如糖尿病、肾衰竭、心血管问题和癌症。传感器还可以用于皮肤贴片中以监测皮质醇、醇、葡萄糖，以及诸如运动医学和术后监测等应用。功率可以通过无线传输，例如使用线圈天线传输到传感器。可以使用典型的电极配置，例如同心(concentric)正方形的工作电极、参比电极和反电极。例如，图3示出了具有反电极(305)、参比电极(310)和工作电极(305)的配置。

在一些实施方案中，使用铂制造所有三个电极。与已知的Ag/AgCl电极相比，铂允许使用更低的电压和更稳定的运行。图4示出了用于高电流(例如500nA)传感器的具有较高不规则峰的示例性电极结构的原子力显微镜图像(405,410)。图4还示出了用于低电流(例如5nA)传感器的较低峰(415,420)。图5示出了可以被制造在电极表面上以增加其表面面积和灵敏度的示例性纳米柱。纳米柱可以是相同的金属材料，以形成均匀的电极。在一些实施方案中，传感器通过旋涂酶而不是滴涂来制造。旋涂允许更薄的电极层。由于过氧化氢必须扩散到要测量的金属电极表面，较薄的酶层增加传感器的收集效率。在一些实施方案中，酶水凝胶层不厚于1微米，并且通常在2nm与1微米之间。酶分子通常大于1-2纳米，因此最小酶层通常是酶分子的尺寸。顶部电极控制靶分析物通过金属中的孔向酶层扩散的转移速率以及过氧化物的转移速率。顶部金属层可以具有在1nm与1微米之间的孔(或针孔)。金属层形成电化学电容器，因此其多孔结构影响传感器的电性能。底部金属层可以是所需的厚度，因为其为其他层提供结构支撑。

在一些实施方案中，铂为多孔层提供最佳选择，因为其与工作电极和参比电极材料匹配，其是惰性的，并且持续时间长。在一些实施方案中，可以使用金，因为其反应性不很大，并且通常可以被认为是生物相容性的。金可能使电子电池内的测量复杂化，因为金与参比电极之间可能存在伽伐尼电压(galvanic voltage)和电流。也可以使用钨，因为其是惰性的并且通常是生物相容性的，但是也可以通过伽伐尼相互作用使测量复杂化。钛是一种生物相容性材料，因此也可以使用钛，尽管其往往被氧化，但是氧化物是导电的，因此氧化通常不是问题，但电化学相互作用可能是问题。钯是一种许多植入物中使用的材料，并且可以被合理地认为是生物相容性的。铱是生物相容性的，但非常昂贵。硅具有一定的导电性，并且其是合理地生物相容的，然而，其可能产生伽伐尼相互作用。在一些实施方案中，可以使用上述金属或其他金属，以及其合金。也可以使用半导体以及导电金属氧化物，诸如，例如，TiO₂、WO₃、SnO₂、InO₂等。所使用的沉积技术可以是真空技术，诸如溅射沉积和气相沉积，以及电镀或无电镀。

金属保护性结构中的孔大到足以让葡萄糖、氧和水通过，但又小到足以避免细胞和大分子攻击酶。因此，在一些实施方案中，孔尺寸或直径的范围可以从2纳米至2微米。在一些实施方案中，孔尺寸低于200纳米，或低于20nm。控制该层的孔隙率能够控制可以从酶层逃逸的氧的量以及可以进入酶层的葡萄糖的量。通过将孔的面积视为允许化学物质通过的传感器的开口面积，并将其与孔周围金属的封闭面积进行比较，限定传感器的孔隙率是可能的。在一些实施方案中，孔隙率可以在0.001％与50％之间。在一些实施方案中，孔隙率在0.1％与10％之间，并且可以通过控制沉积参数来控制。换言之，孔的开口面积在多孔层总面积的0.001％与50％之间，或在多孔层总面积的0.1％与10％之间。

在一些实施方案中，夹层结构的三个单独层的层厚度如下。底部(接触)层的厚度可以在1nm与1mm之间，因为其需要提供导电基底。可以使用针，或者金属层可以被沉积在硅芯片或聚合物支持物上。顶部(保护性)层的厚度可以在1nm与10微米之间。在一些实施方案中，顶部金属层比1微米薄，或比100nm薄。在一些实施方案中，酶层可以在10nm与50微米之间。在一些实施方案中，酶层具有低于10微米，或小于1微米，或小于400nm的厚度。

图1示出了基底(105)和工作电极的金属层(110)，例如由Pt通过溅射沉积制成的金属层。金属层被图案化以产生更高的表面面积(115)。该图案可以是诸如图1中的不规则柱，或如图5中的规则周期性柱。如图2中示出的，酶层(205)被旋涂在图案化的金属层上。例如，可以使用酶水凝胶。例如，可以使用酶和BSA涂层。可以例如通过真空蒸发沉积戊二醛层(210)以使酶水凝胶交联。例如，开口容器内的水溶液中的戊二醛被插入真空室，导致蒸发在室内的样品上。在一些实施方案中，该过程仅应用于工作电极，而在其他实施方案中，其也可以应用于图3的一个或两个其他电极。在一些实施方案中，图2中的层(210)可以包括戊二醛底层和戊二醛上方的多孔金属层。在一些实施方案中，层(210)不包含戊二醛，而仅包括多孔金属层。

图6示出了具有保护性金属顶层的示例性传感器。传感器包括基底(625)、第一金属图案化层(620)、酶水凝胶层(615)和保护酶水凝胶的第二金属图案化层。第二层包括多孔层(610)，该多孔层(610)具有允许选择的化学物质通过同时阻挡其他化学物质的开口。第二层也可以在上方具有图案化区域(605)。例如，顶部多孔Pt层可以是50nm厚，酶层可以是300nm厚，并且Pt底层可以是100nm厚。

图7示出了将具有未涂覆的酶层的传感器(710)与具有如本公开内容中描述的保护性多孔层的传感器(705)的优异性能进行比较的示例性数据。在一些实施方案中，传感器可以包含酶，诸如葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶、胆固醇氧化酶、肌氨酸氧化酶、皮质醇氧化酶、尿酸氧化酶、醇氧化酶、谷胱甘肽氧化酶和尼古丁氧化酶。在一些实施方案中，传感器可以用粘合贴片附接到皮肤上，例如以监测汗液或用离子透入法提取的物质。外部传感器可以是具有外部电池和通信模块的健身追踪器的一部分。

图8示出了示例性光刻工艺：传感器包括三个电极(805)；光致抗蚀剂被旋涂在传感器上(810)；曝光后，部分光致抗蚀剂被剥离(815)，允许沉积多层，诸如酶和交联剂，以及多孔金属保护性层；剩余的光致抗蚀剂被完全剥离(820)，并且三个传感器现在在顶部具有酶水凝胶和多孔金属层。例如，如图8中可见的(825)，包括第一金属层、酶层和顶部的多孔金属层的三个层可以被沉积在抗蚀剂上。在一些实施方案中，在通过光刻工艺制造传感装置的情况下，使用沉积在酶层顶部的金属在光刻处理期间保护下面的酶分子(即，暴露于丙酮等)是可能的。

本公开内容描述了一种结构，其由基底上的反应性材料层组成，反应性材料层被多孔无机层覆盖，多孔无机层能够控制试剂和/或产物流入或流出反应性材料以控制反应速率。在一些实施方案中，无机多孔层是铂、金、钨、铱、钛、碳(包括石墨烯或碳纳米管)或具有非常低免疫原性的其他生物相容性材料，并且反应性层是酶促性的。在一些实施方案中，无机层是铂或另一种能够在活性氧或氧化性物质可以到达敏感反应性层之前将活性氧或氧化性物质还原的催化性金属。在一些实施方案中，传感器能够对特定分析物定量，反应性层是氧化酶家族中的酶，并且无机层的孔隙率被控制，使得氧可以自由进入反应层，分析物被限制，并且其他干扰或破坏性物质(包括免疫细胞)被拒绝，提高系统的整体灵敏度、氧独立性和高分析物浓度性能。

在一些实施方案中，传感器是发电单元的一部分，反应性层是酶，并且干扰或破坏性物质(包括免疫细胞)被拒绝在区室之外。在一些实施方案中，传感器包括基底上的反应性材料层，反应性材料层被多孔导电层覆盖，该多孔导电层能够控制反应物和/或产物流入或流出反应性材料，并且对反应室内的化学物质进行电化学转换而进出外部电路，从而提高该化学物质的转换效率。在一些实施方案中，基底本身是导电的，并且在多孔导电层与基底之间形成周期性或偶然的导电附接点，从而极大地提高感兴趣的化学物质的转换效率。在一些实施方案中，基底和多孔导电层单独地由铂、PEDOT:PSS或其他能够进行电化学转换的生物相容性导电材料构成，导电附接点由生物相容性导电材料构成，并且反应性层是酶促性的。

在一些实施方案中，传感器能够对特定分析物定量，并且无机层的孔隙率被控制为使得分析物和反应物可以自由进入反应层，并且其他干扰或破坏性物质(包括免疫细胞)被拒绝，从而允许电化学活性产物由于反应性层几乎完全被包封而以非常低的损失被转换。在一些实施方案中，传感器是发电单元的一部分，并且无机层的孔隙率被控制为使得反应物可以自由进入反应性层，并且其他干扰或破坏性物质(包括免疫细胞)被拒绝，从而允许电化学活性产物由于反应性层几乎完全被包封而以非常低的损失产生能量。在一些实施方案中，生物传感器包括基于氧化酶的反应性层。在一些实施方案中，对孔设定尺寸以促进氧向反应性层的流动，拒绝干扰和破坏性物质(包括免疫细胞)进入反应性层，降低过氧化氢从反应性层的损失，并且任选地相对于氧降低分析物向反应性层的流动，以提高生物传感器在高分析物浓度的线性度。

在一些实施方案中，多孔层和基底由铂构成，铂几乎没有免疫原性，并且能够催化还原破坏性活性氧物质。在一些实施方案中，反应性层的几乎完全包封允许反应性层产生的几乎所有过氧化氢被捕获，并且由过氧化氢氧化产生的大部分氧被反应性层重新使用，提高了生物传感器的灵敏度和线性度。

在一些实施方案中，多孔导电电极被部分覆盖并填充有反应性材料，使得期望的反应产物的转换最大化，并且使导电电极再生的用于反应性材料的反应物最大化。在一些实施方案中，导电电极是传感器的一部分并且由铂构成，反应性材料含有氧化酶，期望的反应产物是感兴趣的分析物，再生的反应物是氧，从而提高传感器的线性度，传感器在高分析物浓度的线性度提高，并且总体灵敏度提高。在一些实施方案中，电极是能量收获系统的一部分。

在一些实施方案中，酶层通过浸渍、喷墨印刷、旋涂来沉积，并且顶部保护金属通过真空沉积技术来沉积，以有意地包含针孔或其他微制造导管用于使产物和试剂穿过金属膜。在一些实施方案中，电极的金属层包括不规则的锯齿状峰或纳米柱阵列。在一些实施方案中，装置可以被植入到内部。在一些实施方案中，三个电极具有如图3中的同心正方形形状。

在一些实施方案中，传感装置可以仅包括两个电极，而不是三个电极。在这些实施方案中，两个电极各自包括如本公开内容中描述的包括保护性多孔金属层的多层。在其他实施方案中，传感装置可以包括单个电极，而不是三个或两个电极。例如，一电极系统使用被测量的生物体的身体作为地电位(ground)并使用单个工作电极进行测量。

在一些实施方案中，顶部多孔层不一定是金属的，但是可以是导电的，以便提高任何电活性物质的收集，并且可能对任何破坏性化学物质(诸如由免疫系统产生的活性氧物质)具有催化活性。例如，该顶部多孔导电层可以由PEDOT:PSS或聚吡咯构成。如参考图10所解释的，在一些实施方案中，金属多孔层与金属层电断开。

在一些实施方案中，顶层的孔隙率是沉积方法固有的。例如，在电子束蒸发或溅射金属膜期间调整沉积参数可以用于控制孔隙率。在一些实施方案中，顶层的多孔性可以被更有意地图案化。例如，可以使用电子束微影(lithography)或光刻来选择孔的精确位置和尺寸。例如，含有洞图案的掩模可以被沉积在非多孔顶层的顶部，并且随后用于将受控制的洞蚀刻到顶层中。以这种方式，顶层的孔隙率可以更好地控制，与当膜被天然沉积为带有孔时可能的控制相比更好。

在一些实施方案中，底部传感层不一必是金属，而是导电电极材料。例如，碳、聚吡咯和PEDOT通常被用作非金属电极材料。在一些实施方案中，传感装置可以以阵列排列。因此，生物传感器可以包括如本公开内容中描述的传感装置的阵列，其中传感装置的阵列的传感装置之间的间隔被配置为避免由于传感过程期间产生的中间报告分子的泄漏而导致的串扰。图11图示了传感装置的示例性阵列，其中每个装置(1105)如本公开内容在上文所描述的。

以上提出的实例作为如何进行和使用本公开内容的实施方案的完整公开和描述被提供给本领域普通技术人员，并且不旨在限制一个或更多个发明人所认定的其公开内容的范围。

对本领域技术人员明显的、用于进行本文公开的方法和系统的以上描述模式的修改旨在落入以下权利要求书的范围内。在说明书中提到的所有专利和出版物是本公开内容所属的领域的技术人员的技术水平的指示。在本公开内容中引用的所有参考文献通过引用并入，其程度如同每个参考文献已经单独地通过引用以其整体并入。

应当理解的是，本公开内容不限于特定方法或系统，其当然可以改变。还应当理解本文使用的术语仅为了描述特定实施方案的目的而不意图是限制性的。除非内容清楚地另外指示，否则如在本说明书和所附的权利要求中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指示物。除非内容清楚地另外指示，否则术语“多于一个”包括两个或更多个指示物。除非另外限定，否则本文使用的所有技术术语和科学术语都具有与本公开内容所属的技术领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。

Claims (34)

1.一种传感装置，所述传感装置包括：

在基底上的工作电极；

其中：

所述工作电极包括：

接触所述基底的金属层；

在所述金属层上的酶层；和

在所述酶层上的金属多孔层，并且

所述工作电极、所述金属多孔层和所述酶层被配置为通过电化学反应检测靶分析物。

2.根据权利要求1所述的传感装置，其中所述金属层包括纳米柱的阵列。

3.根据权利要求1所述的传感装置，其中所述金属层包括不规则的锯齿状峰。

4.根据权利要求1-2中任一项所述的传感装置，其中所述金属多孔层包括纳米柱的阵列。

5.根据权利要求3所述的传感装置，其中所述金属多孔层包括不规则的锯齿状峰。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的传感装置，其中所述金属多孔层包括孔的阵列，所述孔的直径大于参与所述电化学反应的分子的直径。

7.根据权利要求1-5中任一项所述的传感装置，其中所述金属多孔层包括具有2nm与2微米之间的直径的孔的阵列。

8.根据权利要求1-5中任一项所述的传感装置，其中所述金属多孔层包括具有小于200nm的直径的孔的阵列。

9.根据权利要求1-5中任一项所述的传感装置，其中所述金属多孔层包括具有小于20nm的直径的孔的阵列。

10.根据权利要求6-9中任一项所述的传感装置，其中所述孔的阵列具有的总面积在所述金属多孔层的总面积的0.001％与50％之间。

11.根据权利要求6-9中任一项所述的传感装置，其中所述孔的阵列具有的总面积在所述金属多孔层的总面积的0.1％与10％之间。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的传感装置，其中所述金属多孔层由选自以下组成的组的材料制成：Pt、Au、W、Ti、Pd、Ir、Si、TiO₂、WO₃、SnO₂、石墨烯和InO₂。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的传感装置，其中所述金属层具有1nm与1mm之间的厚度。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的传感装置，其中所述金属多孔层具有1nm与10微米之间的厚度。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的传感装置，其中所述酶层具有小于10微米的厚度。

16.根据权利要求1-14中任一项所述的传感装置，其中所述酶层具有小于1微米的厚度。

17.根据权利要求1-14中任一项所述的传感装置，其中所述酶层具有小于400nm的厚度。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的传感装置，其中所述酶层包含氧化酶和水凝胶。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的传感装置，其中所述酶层包含选自由以下组成的组的氧化酶：葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶、胆固醇氧化酶、肌氨酸氧化酶、皮质醇氧化酶、尿酸氧化酶、醇氧化酶、谷胱甘肽氧化酶和尼古丁氧化酶。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的传感装置，其中所述传感装置被配置为植入到生物体内部，或者附接到所述生物体皮肤的外部。

21.根据权利要求1-20中任一项所述的传感装置，所述传感装置还包括：

在所述基底上的反电极；和

在所述基底上的参比电极，

其中：

所述反电极包括：

接触所述基底的金属层；

在所述金属层上的酶层；和

在所述酶层上的金属多孔层，并且

所述参比电极包括：

接触所述基底的金属层；

在所述金属层上的酶层；和

在所述酶层上的金属多孔层。

22.根据权利要求21所述的传感装置，其中所述工作电极、所述反电极和所述参比电极具有同心正方形形状。

23.根据权利要求1-22中任一项所述的传感装置，其中所述靶分析物是葡萄糖，并且所述酶层包含葡萄糖氧化酶。

24.根据权利要求1-23中任一项所述的传感装置，其中所述金属多孔层电连接到所述金属层。

25.根据权利要求24所述的传感装置，其中：

所述酶层包括多于一个洞，并且

所述洞被所述金属多孔层填充，从而在所述金属多孔层与所述金属层之间形成电连接。

26.根据权利要求24所述的传感装置，其中：

所述酶层在横向上小于所述金属层，并且

所述酶层的侧面被所述金属多孔层填充，从而在所述金属多孔层与所述金属层之间形成电连接。

27.根据权利要求24所述的传感装置，其中：

所述金属层包括柱，并且

所述柱之间的空间被所述酶层填充，从而在所述金属多孔层与所述金属层的所述柱的顶部表面之间形成电连接。

28.根据权利要求1-23中任一项所述的传感装置，其中所述金属多孔层与所述金属层电断开。

29.根据权利要求28所述的传感装置，其中所述酶层在横向上比所述金属层长，并且所述酶层覆盖了所述金属层的侧面，从而阻止所述金属层与所述金属多孔层之间的电接触。

30.根据权利要求28所述的传感装置，所述传感装置还包括在所述金属层与所述酶层之间的多孔绝缘层。

31.根据权利要求30所述的传感装置，其中所述多孔绝缘层是聚氨酯。

32.根据权利要求1-19中任一项所述的传感装置，其中所述酶层还包含戊二醛。

33.一种传感装置的阵列，所述阵列的每个传感装置如权利要求1-32中任一项中所描述的，其中所述传感装置的阵列的传感装置之间的间距被配置为避免由于中间报告分子的泄漏而引起的串扰。

34.根据权利要求33所述的阵列，其中所述间距在10nm与250nm之间。

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