CN102608176B - 用二价锰离子溶液稳定或再活化肌酸酐传感器的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于稳定肌酸酐传感器的方法，所述肌酸酐传感器包含作为生物活性分子的肌酸酐酶。通过将肌酸酐酶暴露于足量的，浓度范围在0.01至150μM的二价锰离子以稳定肌酸酐酶。通过将传感器暴露于含有二价锰离子的溶液，或通过在传感器中引入提供持续释放的二价锰离子的组合物，从而可获得稳定肌酸酐传感器的效果。

Description

用二价锰离子溶液稳定或再活化肌酸酐传感器的方法
本申请是申请日为2006年5月16日、申请号为200680017184.6、发明名称为“用二价锰离子溶液稳定或再活化肌酸酐传感器的方法”的申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及稳定或再活化肌酸酐传感器的方法，所述肌酸酐传感器包含作为生物活性分子的肌酸酐酶，以及稳定的传感器和包含作为生物活性分子的肌酸酐酶的传感器膜。本发明还涉及实行此方法的仪器。
发明背景
用于测定生理样品参数的传感器广泛应用在化学、生物学和生理学各个领域。可利用含有合适的一种或多种酶的传感器测定可被生物活性分子，如酶，降解的物质的存在和其浓度。这些传感器常指生物传感器。已知生物传感器应用电化学和光度测定原理。
在生理液体样品，例如全血、血清或尿中，肌酸酐的测定对于评价肾功能是重要的。磷酸肌酸储存于脊椎动物的肌肉中，并且提供能量储备。其不可逆地转化为肌酸酐(一种降解产物)和高能磷酸基(phosphate group)。在正常肌肉功能范围内，大约每天有磷酸肌酸的总量1-2％转化为肌酸酐。肌酸酐释放入血液，并且由肾清除。因此，在健康个体中，肌酸酐的水平在约35至约75μM相对恒定。如果血液中肌酸酐的水平增加，其可能为某种肾机能障碍的标志。在这种情况下，肌酸酐的水平可增加至高达2,000μM。
肌酸酐可通过包含各种酶的生物传感器测量，所述酶例如肌酸酐亚胺水解酶(通过NH3测量)或肌酸酐酰胺水解酶。肌酸酐酰胺水解酶也指“肌酸酐酶”。
在肌酸酐酶存在下，在生理液体中的肌酸酐水平通过导致H2O2形成的酶反应级联测定，其可依次通过电流计的或光度计的方法检测。在一些系统中，还可使用酶(如过氧物酶)或指示剂(如发光团)。
酶的反应级联包含肌酸酐酶(EC 3.5.2.10)，肌酸酰胺水解酶(EC3.5.3.3-“肌酸酶”)，和肌氨酸氧化酶(EC 1.5.3.1)，见下列反应：
中间产物肌酸也存在于例如血液、血清或尿样品中。因此，如果通过上述酶反应级联测定肌酸酐，优选的是应用一种双重传感器系统。使用双重传感器系统，可通过两种物质总量和单独中间产物之差，测定肌酸酐酶。因此，用于测定样品中肌酸酐和肌酸总浓度的第一个传感器中，肌酸酐酶、肌酸酶和肌氨酸氧化酶都存在以用于将肌酸酐和肌酸转化为H2O2。用于测定样品中肌酸浓度的第二个传感器中，存在肌酸酶和肌氨酸氧化酶以用于将肌酸转化为H2O2。因此，样品中的肌酸酐浓度是通过样品中肌酸酐和肌酸的总浓度和样品中肌酸浓度的差而测定的。
这种传感器系统公开于美国公开申请2004/0072277，其衍生于WO02/14533(Roche Diagnostics)，2002年2月21日公开，其中产生的H2O2由电流计的方法检测。讨论了可能出现的酶抑制剂，特别是肌酸酶的抑制。当测量含有约90μM的肌酸酐的牛血清样品时，获得双重传感器系统的稳定响应至少一周。
肌酸酐酶特性在Kaoru Rikitake等人的“Creatinine Amidohydrolase(Creatininase)from Psedomonas Putida”J.Biochem.1979，86(4)，pp.1109-1117中描述。肌酸酐酶为一种在每一个亚单位上携带两个锌原子的金属酶。纯化的酶非常稳定，特别是在热处理后，所述热处理为纯化处理的一部分。Mn、Co、Mg、Zn、Ni、Ca和Fe的二价金属离子表现出轻微抑制纯化的、热处理的酶的活性。此外，肌酸酐酶仅表现出轻微的被乙二胺四乙酸(EDTA)所抑制，说明酶牢固保持锌原子。锌离子仅可在酶的加热处理前去除，而不能在热处理后的酶制剂中去除，这一实事也可证实这一现象。通过特定细胞消化处理去除肌酸酐酶的锌离子后，导致酶蛋白的失活，其可通过加入0.5mM的Mn、Co、Mg、Zn、Ni或Fe的二价金属离子再活化。相似的，Inouye等人，“Purification and Characterization of Creatine Amidohydroplase ofAlcaligenes Origin”Chem.Pharm.Bull.34(1)269-274(1986)，公开了耗尽金属离子的肌酸酐酶能够通过加入1.0mM的MnCl2溶液而再活化。
肌酸酐酶的特性在Tadashi Yoshimoto等人，“Crystal Structures ofCreatininase Reveal the Substrate Binding Site and Provide an Insight into theCatalytic Mechanism”J.MoI.Biol.2004，337，pp.399-416中证实。
因此，已知肌酸酐酶为一种稳定的酶，对EDTA和其它抑制剂仅有轻微的响应。
此外，EP 0 872 728Al公开了有反应层的生物传感器，其包含酶和电子受体，并且其附近有二价水溶性盐。该盐优选为钙盐、镉盐、锰盐、镁盐或锶盐；优选为氯化物、硝酸盐或硫酸盐。引起金属与酶结合的金属的最低基本浓度描述为0.01mg/mL，相应于锰的最低基本的摩尔浓度约180μM。
已发现当上述类型的双重传感器系统用于生理样品中肌酸酐的多重测量时，肌酸酐传感器的响应在一定时间段或一定数量的测量后开始降低。其结果为双重传感器系统的敏感性逐渐降低。敏感性的降低为一个不利因素，因为其导致传感器系统的使用寿命较短。这种传感器包含经热处理的肌酸酐酶，并且期望其对金属离子活化不敏感。
再活化耗尽金属的酶显然要求的(Rikitake等人和Inouye等人)或并入生物传感器的(EP 0 872 728Al)锰离子相对高的浓度常认为其存在问题，特别是当在多重传感器仪器中使用时。在清洁或冲洗溶液中的高浓度可导致锰盐的沉淀，特别是如果该溶液与其它具有不同盐浓度或pH值的溶液或与次氯酸盐溶液混和时。此外，二价锰离子是电活性物质，其可导致电化学传感器中不稳定的零点电流。并且，锰可能导致对镁传感器的干扰。
发明简述
本发明提供了通过新方法和新的肌酸酐传感器，新的肌酸酐传感器用膜，和新的用于测定生理液体中肌酸酐的仪器，巧妙解决上述提及问题的方案。
因此，本发明一方面涉及稳定或再活化包含作为生物活性分子的肌酸酐酶的肌酸酐传感器的方法，所述方法包括将肌酸酐酶暴露于足以增加稳定性或增加传感器活性的量的二价锰离子溶液，其中溶液包含二价锰离子，浓度在0.01-150μM范围内。
本发明的另一方面涉及稳定的肌酸酐传感器，其包含作为生物活性分子的肌酸酐酶，和持续一段时间释放足以稳定或再活化传感器的量的二价锰离子的组合物。
本发明的第三个方面涉及肌酸酐传感器的膜，其包含作为生物活性分子的肌酸酐酶和持续一段时间释放足以稳定或再活化传感器的量的二价锰离子的组合物。
本发明还有一些方面涉及(i)用于测定在生理液体中肌酸酐的仪器，其包含含有作为生物活性分子的肌酸酐酶的肌酸酐传感器，浓度范围为0.01-150μM的二价锰离子的溶液，和用于将肌酸酐酶暴露于二价锰离子溶液的装置；(ii)测定在生理液体中肌酸酐的仪器，包含肌酸酐传感器、滤器、使合适的液体流经该滤器以获得浓度范围为0.01-150μM的二价锰离子溶液的装置，以及将肌酸酐酶暴露于二价锰离子溶液的装置，所述肌酸酐传感器含有作为生物活性分子的肌酸酐酶，所述滤器包含润湿后持续一段时间释放二价锰离子的组合物；和(iii)测定在生理液体中肌酸酐的仪器，包含肌酸酐传感器，所述肌酸酐传感器含有作为生物活性分子的肌酸酐酶，其中肌酸酐传感器为本文定义的传感器或包含本文定义的膜的传感器。
附图简述
图1说明包含电极和膜的酶传感器。
图2详细说明图1中传感器的膜。
图3对于几乎无起始肌酸酐酶过量的传感器，比较了肌酸酐传感器对肌酸酐的响应和相同传感器对肌酸的响应。
图4对于有显著肌酸酐酶过量的传感器，比较了肌酸酐传感器对肌酸酐的响应和相同传感器对肌酸的响应。
图5说明厚膜传感器。
发明详述
因此，本发明的目的为提供稳定或再活化包含作为生物活性分子的肌酸酐酶的传感器的方法。
令人惊奇的是，已发现该目的可通过提供根据本发明的方法而获得，所述方法包含将肌酸酐酶暴露于低的，但仍足量的二价锰离子中。
“足量”的二价锰离子可定义为足以影响肌酸酐酶，从而增加传感器稳定性或活性的量。二价锰离子对于传感器有利作用的量有一个上限，例如，由于在较高浓度有抑制作用或其它有害作用。因此，优选的最高上限为约150μM。其中实施本发明方法的环境可轻微影响二价锰离子的工作范围和最佳水平。一般而言，二价锰离子的浓度越高，观察到的稳定或再活化程度越高，直到到达最佳水平，之后可能为抑制性浓度。
对于增加传感器的稳定性或活性必须的“足量”的二价锰离子至少约0.01μM；或者，至少约0.1μM；或者，至少约1μM；或者，至少约2μM。
二价锰离子的最大水平为至多150μM，一般至多130μM，或者至多100μM，更特殊的至多50μM。
二价锰离子浓度的优选范围为，如在0.01-150μM范围内；在0.01-130μM范围内；或者，在0.1-100μM范围内；或者，在0.1-50μM范围内；或者，在1-50μM或2-50μM范围内，或者在2-25μM范围内。
此处定义的“暴露”指足够近的接近，以使所述的二价锰离子在肌酸酐酶上进行所需的相互作用或影响，并且可包括相互作用物质或其它之间的实际性接触。
使用已知的肌酸酐传感器的实验表明，在使用肌酸酐传感器期间，对于肌酸酐的响应会下降，然而肌酸酐传感器对于肌酸的响应为稳定的(相对传感器响应，R)。此现象表明了在反应级联中的第一个酶，肌酸酐酶的不稳定性，尽管其具有稳定的性质。相对传感器响应下降开始之前的时间阶段依赖于肌酸酐酶相对于反应级联中其它酶的水平的起始过量。过量程度越高，下降开始之前的时间越长。然而，当酶的浓度增加时，密度和因此的扩散阻力增加，导致更长的响应时间和较小的信号。因此，酶的低密度对于减少响应时间是理想的。相对传感器响应下降开始之前的时间阶段与传感器总的寿命密切相关。根据本发明，可获得寿命的延长，而不增加响应时间。
实际上，我们已发现二价锰离子在酶检测中表现出对于热处理的肌酸酐酶有有利的作用。此现象与Rikitake等人的发现相反。
已证明浓度范围0.01-150μM的二价锰离子可激活肌酸酐酶，而对其它用于检测肌酸酐的双重传感器系统的酶没有不良作用或不干扰测量技术。因此，二价锰离子适于在稳定或再活化包含作为生物活性分子的肌酸酐酶的传感器中使用。
已发现锰不会使一般的传感器酶，例如乳酸氧化酶，葡萄糖氧化酶和脲酶失活，因此，二价锰离子对于多重分析物的血液分析仪为优选的。
并且重要的是，二价锰离子与流动系统中传导的各种液体是相容的，例如生理样品其它的参数或成分，并且二价锰离子在流动系统中不会沉淀。已发现在浓度范围为0.01-150μM时，二价锰离子能发挥有益作用，同时可避免沉淀的危险。
已发现当肌酸酐传感器暴露于二价锰离子时，可观察到传感器的再活化或稳定化。
此处定义的术语“稳定化(stabilisation)”和“使稳定(stabilize)”指避免在其它方面预期的传感器响应的减少并且传感器响应保持在将肌酸酐酶暴露于二价锰离子之前即刻存在的传感器响应水平。稳定，如，见实施例1和图3，其中通过用浓度为2μM的二价锰离子持续处理，传感器的响应水平大体上维持了约0.8，并且在此水平保持至少5天，然而根据最初23/4天外推，传感器响应水平预期降低到低于0.5。
此处定义的术语“再活化(reactivation)”，“使再活化(reactivate)”和“使活化(activate)”指避免在其它方面预期的传感器响应的减少，并且与在肌酸酐酶暴露于二价锰离子之前即刻存在的传感器响应水平比较，传感器响应增加到更高水平，并且可能高达起始传感器反应水平。再活化，如，见实施例1和图4，其中通过用浓度为10μM的二价锰离子持续处理，传感器的响应水平从约0.9(18天)增加到约1.3(相当于起始水平)，并且在此水平保持至少5天，然而根据最初18天外推，传感器响应水平预期降低到低于0.8。是否达到相对传感器响应(R)的起始水平，依赖于相对于其它酶存在的肌酸酐酶的起始过量。因此，如果少于100％的肌酸酐酶再活化，若使用无明显过量的肌酸酐酶，再活化后的传感器响应可能有些低于起始水平。
本发明可关于常规类型或平面类型的传感器，如，厚膜传感器或薄膜传感器。这些传感器的酶膜通常为分层结构，称为分层膜。关于此点的具体实施例描述于实施例部分。
常规类型的酶传感器中，膜，如多层膜，包含例如支持层，酶层，和覆盖膜，其通常装配为单个物体，之后将其与电极连接(即，通常安装在电极头上)。见，如图1和2。构建这种多层膜的方法在本领域众所周知。见，即WO 98/21356。常规类型的酶传感器可包括径迹蚀刻膜，还包括溶剂铸造膜。
平面类型的酶传感器中，如厚膜传感器和薄膜传感器，电极和含酶层和覆盖膜的酶膜通过相应于电极的沉积物质(通常为连续地和独立地)，任何间隔层和中间层，酶层，和任何覆盖膜层，排布在固体的，电介质基底上，如陶瓷或晶片物质。平面传感器构造的实例见图5。构建平面类型传感器，如厚膜传感器和薄膜传感器的方法，在本领域众所周知。见，如WO 01/90733，WO 01/65247和WO 90/05910。对应于平面传感器的这些传感器膜的层的物质最通常通过溶剂铸造沉积。
本发明的方法一般对于多重用途传感器有最大影响，因为这种传感器使用时间更长。因此，失活的问题在这种传感器中就更加重要。
将多重用途传感器理解为应用于多于一个测量的传感器，因此其暴露于多于一体积的样品和/或校正溶液中。
在生理液体样品中肌酸酐的测量可以在各种自动化的和半自动化的分析仪上进行，它们中许多应用了多重传感器，以测量多种参数。一个实例是临床分析仪，特别是血液分析仪。手动或自动方式将样品引入分析仪的流动系统中，或进入暗盒的流动系统中，以引入分析仪。于是可将用于生理样品的一种或多种参数的传感器暴露于引入流动系统的样品中。
另一种类型的分析仪为流动注射分析仪，其中将生理液体的样品引入流动的流体中，其将样品传送到反应区，随后至检测区。在这种情况下，将传感器理解为这些包含检测器的区域。为了能够检测生理样品中的肌酸酐酶，反应区可包含肌酸酐酶，肌酸酶和肌氨酸氧化酶，并且在检测区可在存在指示剂，例如发光体或酶，例如过氧化物酶的情况下，用光度计法检测H2O2。
在两种类型的分析仪中，传感器正常情况下暴露于样品和其它通至并且来自传感器的液体。
肌酸酐酶周围的溶液优选提供足够量的二价锰离子，由于要求二价锰离子以溶解形式存在，以便充分地影响肌酸酐酶。可通过三种方法之一实现此结果，即(i)通过提供预先制备的二价锰离子溶液，(ii)通过在传感器内原位制备二价锰离子溶液，或(iii)通过在接触传感器前即时制备二价锰离子溶液。下面将详细解释。
在一个具体的实施方案中，包含二价锰离子的溶液从容器导入传感器，由此将肌酸酐酶暴露于二价锰离子。
这种溶液可以通过在水溶液中溶解二价锰离子盐制备。优选的二价锰离子盐包括醋酸盐，硝酸盐，硫酸盐和/或氯化物盐。不期望这些盐的平衡离子在相关浓度引起任何对传感器的有害作用。
本发明的另一个目的是提供稳定的肌酸酐传感器或用于包含作为生物活性分子的肌酸酐酶的肌酸酐传感器的稳定膜。该传感器或膜还包含持续一段时间释放足量的二价锰离子的组合物。
在此具体实施方案中，传感器包含当暴露于样品或其它合适的液体时，持续一段时间释放二价锰离子的组合物。持续一段时间理解为足以稳定肌酸酐酶活性，直至传感器期望的使用寿命结束的一段时期。当传感器暴露于样品或其它合适的液体时，锰离子释放，并且带入传感器中的溶液，因此导致肌酸酐酶附近存在锰离子。由此在传感器润湿后，肌酸酐酶或多或少的连续性的暴露于二价锰离子。所述组合物优选存在于传感器膜内。此外，当二价锰离子在肌酸酐传感器中释放时，在多重传感器仪器中污染和其它传感器干扰的危险可几乎完全避免。
当暴露于样品或其它合适液体时，持续一段时间释放二价锰离子的组合物优选包含作为微溶性盐的二价锰离子。锰离子合适的微溶性盐的实例包括碳酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、正磷酸盐、硒化物、硫化物、氢氧化物、草酸盐、正磷酸盐或亚硒酸盐中至少一种。认为碳酸盐、柠檬酸盐和酒石酸盐特别有用。认为最合适的盐可根据有关盐产物溶解度的知识，考虑可溶解盐的溶液中平衡离子(阴离子)浓度(如pH，如果平衡离子为-OH)而进行选择。当溶液还提供其它用途时，如，如果溶液同时用作清洗液或清洁溶液时，这特别相关。例如，碳酸锰(MnCO3)产物的溶解度为2.2·10-11M2。如果在合适的清洗液中碳酸根(CO3 2-)离子的浓度为1.0·10-6M(1μM)，那么在用碳酸锰饱和的清洗溶液中，二价锰离子的浓度将为2.2·10-5M(22μM)。
或者，并且二价锰离子可结合于提供持续释放的离子交换树脂。
因此，该组合物还可以包含聚合物基体，其提供二价锰离子的持续释放。在这种情况下，二价锰离子可以上述任何盐形式存在或结合于离子交换树脂。因此，盐的溶解度和盐与离子交换树脂的结合和聚合物基体均控制释放速度。合适的聚合物例子包括乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟乙基纤维素(HEC)、丙烯酸酯、醋酸邻苯二甲酸纤维素、邻苯二甲酸羟乙基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素或其它纤维聚合物，聚氨基甲酸酯(PUR)或它们的混合物。
本发明的另一个实施例中，在分析仪中提供了滤器，其中滤器包含当暴露于样品或其它合适液体时，持续一段时间释放二价锰离子的组合物。滤器必须在传感器前放置，例如在盛有仪器参比溶液的暗盒中。当合适的液体通过滤器时，在包含二价锰离子的流动系统中提供溶液。该溶液随后导至传感器，以在传感器中将肌酸酐酶暴露于该溶液中。滤器使用的锰盐的选择将在上文中加以描述。
在第一个实施方案中使用的溶液或在第二和第三个实施方案中使用的合适的液体可包含合适的缓冲液，以便提供范围为约6至约9的pH值，优选为约7至约7.5。合适的缓冲液的例子包括咪唑缓冲液，TRIS缓冲液或磷酸缓冲液。
优选将肌酸酐酶反复地或连续地(continuously)暴露于二价锰离子，以获得延长时间的稳定化或再活化效果。
此处定义的术语“连续的”指将传感器暴露于二价锰离子的溶液，至少为其工作寿命的80％。其可通过在适用于传感器的清洗液和/或清洁溶液中包括二价锰离子而最方便的实现。如实施例2中，在清洗液中包含二价锰离子将有效地使传感器暴露于二价锰离子，长达多于其工作寿命的90％。或者，包含微溶性锰(II)盐的组合物(或滤器)也可用于获得这种连续性的暴露。
此处定义的术语“反复地”指传感器在其工作寿命期间暴露于二价锰离子溶液一次，或优选的，多次。优选的，传感器在其工作寿命期间至少暴露于二价锰离子溶液3次，例如至少5次，或至少10次。因此，传感器可连续地，或在测量生理液体样品期间暴露于包含二价锰离子的溶液。溶液或合适的液体优选为含水的，并可包含，例如，清洗剂或清洁剂的其它成分和/或待测定的参数的参比量。示例性的清洗剂和/或清洁剂包括，但是不局限为，蛋白裂解酶，例如蛋白酶，有机溶剂和碱性溶剂。示例性参数包括pH；电解质(如Li+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、HCO3 -、NH3和NH4 +)浓度；其它溶解气体(如氧气和二氧化碳)浓度，其通常以分压形式报导(如pO2、pCO2)；血细胞比容(Hct)；血红蛋白和血红蛋白衍生物(如，氧合血红蛋白，去氧血红蛋白，高铁血红蛋白，碳氧血红蛋白，硫血红蛋白和胎儿血红蛋白)浓度；和代谢因子(如，葡萄糖，肌酸酐，肌酸，尿素(BUN)，尿酸，乳酸，丙酮酸，抗坏血酸，磷酸盐，蛋白质，胆红素，胆固醇，甘油三酯，苯丙氨酸和酪氨酸)浓度。这些溶液包含二价锰离子，其可同时达到几种目的，因为可清洁流动系统和传感器表面，和/或校正传感器，同时稳定或再活化肌酸酐传感器。
为了将肌酸酐酶暴露于足量的二价锰离子，包围肌酸酐酶的溶液应当优选包含浓度范围为0.01-130μM的二价锰离子；或者，浓度范围为0.1-100μM；或者，浓度范围为0.1-50μM。
二价锰离子最优选的浓度范围依赖于暴露的频率和持续时间。例如，如果肌酸酐酶暴露于溶液至少50％的所述时间，那么最优选的浓度则为约5至约10μM。通常，如果暴露时间下降，二价锰离子浓度应相应增加，但仍保持在上限为150μM的浓度范围内。
已发现除了与二价锰离子接触，如果肌酸酐酶暴露于阳离子络合剂，优选为在导致约一半的二价锰离子结合的浓度，则为保持一定水平的稳定或再活化作用所必须的二价锰离子的有效量降低。换言之，若加入阳离子络合剂，则一定水平的二价锰离子的作用在正常情况下增加。优选的阳离子络合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)。EDTA强烈结合二价锰离子，且优选应以浓度约为二价锰离子浓度的一半加入。通过加入阳离子络合剂而获得的益处在于阳离子络合剂有效结合任何有害阳离子(如，铜和汞离子(Cu2+，Hg2+，等))的能力，所述有害阳离子可存在于传感器附近，如，由前样品引起的污染物。由于这些有害阳离子仅以非常微小的量存在(如纳摩尔的或甚至皮摩尔量)，加入微摩尔量的阳离子络合试剂将实质性结合所有这些有害阳离子，并且将结合一部分二价锰离子，剩余另一部分的二价锰离子可用于与肌酸酐酶相互作用。如果加入一定浓度的阳离子络合试剂，导致几乎所有的二价锰离子的结合，将会有不足量的未结合的锰离子暴露于肌酸酐酶。另一方面，二价锰离子的存在允许加入阳离子络合剂，而无去除肌酸酐酶或其它酶中的固有的(native)二价阳离子的风险。
因此，如果肌酸酐酶暴露于溶液至少50％的所述时间，最优选的阳离子络合试剂的浓度为在1-4μM的范围。
通过使用本发明的方法，以稳定或再活化包含作为生物活性分子的肌酸酐酶的传感器，这种传感器的寿命可由约一周延长至至少约一个月，或可能长达2或3个月。实事上，根据本发明所述方法，肌酸酐酶的寿命可能延长至肌酸酐传感器寿命被除肌酸酐酶寿命外的其它因素所限制的程度。
根据本发明所述方法的益处还包括获得可以提供与现有技术所述相比更精确和更准确的测量的传感器。因此，仅需更少的校正和更少的校正点。
在一个检测肌酸酐酶的电流分析双重传感器系统中，两个示例性的传感器优选地包含：作为生物活性分子的肌酸酐酶、肌酸酶和肌氨酸氧化酶，以检测样品中肌酸酐和肌酸的总浓度；和作为生物活性分子的肌酸酶和肌氨酸氧化酶，用以检测样品中肌酸的浓度。
两个传感器均以电流测定终产物H2O2。
尽管本说明书、实施例和权利要求主要集中于二价锰离子的使用，以稳定或再活化包含作为生物活性分子的肌酸酐酶的传感器，可以想象其它的二价金属离子可以以相应方法使用，即，如使用二价锰离子时的所述方法。这种其它的二价金属离子的例子选自钒、铬、铁、钴、镍、锌、以及它们的混合物。
实施例
下列实施例目的为说明本发明，而不是限制本发明。在所有实施例中，使用来自于恶臭假单胞菌(Pseudomonas Putida)的肌酸酐酶，获得自RocheDiagnostics，Mannheim，德国。
示例性的传感器构造(常规传感器)。
双重传感器系统的肌酸和肌酸酐传感器的每一个建立为传统的电流型传感器。图1表明这种传感器1，其适用于安置于测量生物样品中分析物浓度的仪器(如，ABLTM 735血气分析仪(Radiometer Medical ApS，Copenhagen，丹麦))。
基本上，传感器1包含电极2，其上附加膜环3。电极2包含铂阳极4，其与铂线5连接，铂线5通过微塞6，与银质阳极接触体7连接。铂阳电极4和铂线5的下部密封在玻璃体8中。在玻璃体8和微塞6之间，铂线5被热收缩管保护。管状的银质参比电极10环绕玻璃体8的上部，且延伸电极2的长度至阳极接触体7，阳极接触体7通过固定体11和环氧树脂12固定在参比电极中。玻璃体8的下部围绕有电极基底13，此处附加膜环3。
参比电极10的上部围绕有塞部14，从而在分析仪器(未显示)相应的的塞中安置电极2，并固定套膜15。垫圈16和17置于电极2和套膜15之间，以便确保任何位于电极2测量表面的电解质不会蒸发。膜环3，其安置于套膜15的一端，包含环20。膜21延伸出环20的下端开口。此膜21详见图2。
图2详细表明膜21，其包含5层：减噪间隔层22，其面对电极2的铂阳极4，干扰限制膜层23，环绕酶层25的垫圈24，以及扩散限制多孔膜层26，其上涂一层含水量约80％的聚氨基甲酸酯亲水保护层。涂膜层26面对进行分析的样品。
减噪间隔层22可为约21±2μm厚的聚对苯二甲酸乙酯(PETP)镶边膜。干扰限制膜层23可为约6±2μm厚的醋酸纤维素(CA)多孔膜。
垫圈24可为30±5μm的双面粘着盘，其有一个直径为1500μm的中心孔。垫圈24的粘着剂附着于干扰限制膜层23和扩散限制膜层26，从而阻止酶从层之间漏出。
肌酸传感器的酶层25通常为约20μm的肌酸酐酶和肌氨酸氧化酶层，其与同合适的添加剂，如缓冲液混和的戊二醛交联。肌酸酐传感器的酶层25通常为约20μm的肌酸酐酶、肌酸酶和肌氨酸氧化酶层，其与同合适的添加剂，如缓冲剂混和的戊二醛交联。
扩散限制多孔膜层26可为约12μm的聚对苯二甲酸乙酯(PETP)层(孔直径约0.1μm；孔密度约3·107孔/cm2)，其上涂含水量约80％的聚氨基甲酸酯。
在肌酸酐传感器中，肌酸和肌酸酐均转化为过氧化氢。在肌酸传感器中，只有肌酸转化为过氧化氢。
在电流电极中，过氧化氢在对于Ag/AgCl电极，+675mV下，在阳极氧化。所得电流与样品中肌酸酐/肌酸浓度成比例。
肌酸酐的浓度通过肌酸酐传感器信号(代表肌酸+肌酸酐)和肌酸传感器信号(代表肌酸)之间的差异而测定。
示例性传感器构造(厚膜传感器)
双重传感器系统的肌酸和肌酸酐传感器的每一个建立为如图5所示。
参照图5，提供了200μm厚度的氧化铝基底110，其一面上有直径为1000μm且厚度为10μm的环状铂工作电极120，外径为3000μm、内径为2000μm且厚度为10μm的环状铂对应电极130，其覆盖工作电极外周的角范围为30-330°，以及直径为50μm，且位于工作电极外周在0°的环状银/氯化银参比电极140。这三种电极结构均与传感器电子设备(未显示)相连接，其横过氧化铝基底110，通过铂，穿过孔(未显示)通过基底。操作中，工作电极120相对于参比电极140极化至+675mV。
此外，氧化铝基底110为两层的玻璃和聚合物密封剂结构。该两层的结构包括，外径为1800μm，内径为1200μm和厚度为50μm包围工作电极120的环状结构的160、161和厚度为50μm的包围完整电极系统的结构150，151。这些两层结构均由内层150、160(其面对厚度为20μm的来自英国的ESLEurope的ESL玻璃4904的氧化铝基底110)和外层151、161(其为国际专利申请WO97/43634公开的，来自美国加州的SenDx Medical Inc.的聚合物密封剂，该聚合物密封剂包含28.1重量％的聚甲基丙烯酸乙酯(Elvacite，部分号2041，来自DuPont)、36.4重量％的乙酸卡必醇、34.3重量％的硅烷化高岭土(部分号HF900，来自Englherd)、0.2重量％的火成二氧化硅和重量为1.0％的三甲氧基甲硅烷)组成。
醋酸纤维素和醋酸丁酸纤维素的环状内膜170，直径为1200μm，且厚度为10μm，其覆盖工作电极120。
对于肌酸酐传感器，经直径为1200μm，厚度为2μm的戊二醛交联的肌酸酐酶、肌酸酶和肌氨酸氧化酶的环状酶层180覆盖内膜170。
对于肌酸传感器，经直径为1200μm，厚度为2μm的戊二醛交联的肌酸酶和肌氨酸氧化酶的环状酶层180覆盖内膜170。
酶层180通过在醋酸纤维素膜170上分配经戊二醛的交联的0.4μl的酶缓冲液制备。酶层在37℃，干燥30分钟。
直径为4000μm且厚度为10μm的PVC/三甲基壬基-三甘醇/二甘醇的环状外膜层190覆盖完整电极系统，集中于工作电极120。
外层膜用1.35克的聚氯乙烯(Aldrich 34，676-4)，0.0149克的三甲基壬基-三甘醇(Tergitol TMN3，来自Th.Goldschmidt)和0.134克的二甘醇，加入到21.3克的四氢呋喃和7.58克的环己酮中制备。搅拌混合物至PVC溶解，并且获得均匀溶液。加入28.5克的四氢呋喃，以获得2％的90/1/9的PVC/表面活性剂/亲水化合物组合物的溶液。将该溶液分配于传感器区域，以覆盖所有三种电极，并与聚合物密封剂151形成约0.5mm的重叠。外膜在23±2℃干燥30分钟，并在40℃，干燥11/2小时。
所有三层170、180、190置于一个x，y，z台(table)，台上装有自动分发元件(IVEK泵)。
在肌酸酐传感器中，肌酸和肌酸酐均转化为过氧化氢。在肌酸传感器中，只有肌酸转化为过氧化氢。
肌酸酐的浓度通过肌酸酐传感器信号(代表肌酸+肌酸酐)和肌酸传感器信号(代表肌酸)之间的差而测定。
实施例1：锰离子对于肌酸酐传感器测量的影响。
改良来自Radiometer Medical ApS，丹麦的ABLTM735型血液分析仪，从而适应上述的双重传感器系统。(“示例性的传感器构造(常规传感器)”)。
各种浓度的锰加入至放射计清洗溶液S4970样品中。加入的锰为醋酸锰(II)形式，以获得分别约2μM和10μM的浓度。
肌酸酐传感器的稳定性通过观察传感器对包含肌酸酐和肌酸每种底物的校正溶液的响应检测。
校正溶液通过在放射计校正溶液1 S1720中溶解约200μM的肌酸酐和在放射计校正溶液2 S1730中溶解约200μM的肌酸制备而成。这些溶液反复地顺序引入仪器，并获得传感器响应。
当引入的溶液无锰时，观察到肌酸酐传感器对于肌酸酐的响应下降，然而肌酸酐传感器对于肌酸的响应稳定。此现象表示在反应级联中的第一个酶，肌酸酐酶的不稳定性。传感器响应下降是否立即开始或在一定时间阶段后开始，其依赖于肌酸酐酶相对于肌酸酶和/或肌氨酸氧化酶的起始过量。过量程度越高，下降开始之前的时间越长。然而，如果酶的密度太高，将导致不理想的增加扩散阻力的结果，从而导致较长的响应时间和较小的信号。
肌酸酐传感器对肌酸酐的响应，相对于肌酸酐传感器对肌酸的响应之间的关系可用下列比例方便的描述：
R＝对肌酸酐的响应/对肌酸的响应。
如果R为恒定，那么肌酸酐酶的活性为稳定的。R值的下降表示肌酸酐酶活性的总的丧失。
进行两组实验。
在第一个实验中，将几乎没有肌酸酐酶的起始过量的两个传感器暴露于清洗溶液(0μM醋酸锰(II))中23/4天。如图3所示，R在实验开始后短期内开始下降。随后，传感器暴露于改良的清洗溶液(2μM醋酸锰(II))中51/2天。结果(R值)见图3。图3表明在传感器暴露于浓度为2μM的二价锰离子后，R值可得到稳定。
使用有显著起始过量的肌酸酐酶的5个肌酸酐传感器，进行如上所述的相同的实验。图4中，对该实验描述了R值。在不含锰的清洗溶液中检测传感器18天，之后传感器通过改用包含10μM锰(10μM醋酸锰(II))的清洗溶液而再活化。如图4所示，R在检测后一周开始下降。18天后，R从1.3下降至0.9。当改用包含10μM锰的清洗溶液18天后，传感器再活化，从而获得R＝1.3的起始水平。
实施例2：肌酸酐传感器的操作。
改良来自Radiometer Medical ApS，丹麦的ABLTM837型血液分析仪，从而适应上述的双重传感器系统。清洁溶液包含浓度为10μM的二价锰离子。传感器清洁溶液还用于在测量和校正间储存传感器。
仪器的标准操作规程包括每4小时一次的单点校正(一种校正液)和每8小时一次的双点校正(两种校正液)。通常，每天(24小时)进行约40次测量。
当进行校正或样品测量时，将清洁溶液从传感器去除，且将校正液或样品分别泵入传感器。允许样品/液体静置30秒。之后，校正液或样品通过清洁溶液的冲洗而去除，随后清洁溶液可以在传感器中静置直到引入下一个校正液或样品。因此，校正液/样品接触传感器总共为约40秒。
“标准”工作日包括40次测量，和3+2*3(即9)次校正。测量持续约总共1960秒，即约每个工作日33分钟。这意味着传感器与清洁溶液接触至少97％的所述时间。
上述详细给出的说明书仅为了理解清楚且不应该理解为不必要的限制，因此改变对于本领域技术人员是明显的。同时连同具体实施方案描述本发明，应理解为本发明能够进一步修改，并且本申请覆盖一般根据本发明的原理以及包括来自本发明有关技术在内的公知或习用实施所进行的这种本发明的偏离的任何变化、使用或修改，且可用于在此前述和在下述附带权利要求书的范围的基本特征。
本文引用的各种公开和每个专利，专利申请和文献在此全部引入作为参考。

Claims (11)

1.稳定或再活化肌酸酐传感器的方法，所述肌酸酐传感器包含作为生物活性分子的肌酸酐酶，所述方法包括将肌酸酐酶暴露于足以增加传感器的稳定性或活性的量的二价锰离子清洗溶液中，其中所述清洗溶液包含浓度范围在2-10μM的二价锰离子，且
其中将肌酸酐酶暴露于二价锰离子清洗溶液长达传感器工作寿命的至少97％。
2.如权利要求1的方法，其中所述清洗溶液包含浓度范围在5-10μM的二价锰离子。
3.如权利要求1-2任一项的方法，其中通过将包含二价锰离子的清洗溶液传送至肌酸酐酶，使肌酸酐酶暴露于所述量的二价锰离子。
4.如权利要求1的方法，其中所述清洗溶液通过以下制备：在肌酸酐酶暴露于清洗溶液之前，使合适的液体通过滤器，所述滤器包含持续一段时间释放二价锰离子的组合物。
5.如权利要求1的方法，其中所述量的二价锰离子通过以下制备为清洗溶液：将合适的液体与存在于传感器的组合物接触，所述存在于传感器的组合物在持续的一段时间内释放二价锰离子，然后将肌酸酐酶暴露于清洗溶液中。
6.如权利要求4和5中任意一项的方法，其中所述组合物包含二价锰离子的微溶性盐。
7.如权利要求6的方法，其中二价锰离子的微溶性盐选自碳酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、正磷酸盐、硒化物、硫化物、氢氧化物、草酸盐、正磷酸盐或亚硒酸盐。
8.如权利要求7的方法，其中微溶性盐选自碳酸盐，柠檬酸盐，酒石酸盐。
9.如权利要求1的方法，其中肌酸酐酶还暴露于包含阳离子络合试剂的清洗溶液中。
10.如权利要求9的方法，其中阳离子络合物试剂为乙二胺四乙酸(EDTA)。
11.如权利要求9和10中任意一项的方法，其中阳离子络合试剂的浓度在1-4μM的范围内。
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