CN101182474A - 转鲑鱼降钙素基因酵母及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种转鲑鱼降钙素基因酵母及其制备方法和应用，将鲑鱼降钙素在酿酒酵母这种真核系统中表达。酿酒酵母发酵技术成熟，表达量较高，而且酿酒酵母可以直接食用，得到的转化降钙素的酿酒酵母不需要纯化可以直接口服，从而降低了生产成本，实现了降钙素的口服给药。

Description

转鲑鱼降钙素基因酵母及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术和生物工程技术领域，具体地说，是一种转鲑鱼降钙素基因酵母及其制备方法和应用。

背景技术

降钙素(calcitonin，简称CT)是由32个氨基酸残基组成的一种多肽类激素，由脊椎动物的后腮体和哺乳动物的甲状腺C细胞分泌。自从Copp等人1961年首次发现降钙素以来，人们对其分子结构和作用机理进行了广泛的研究。发现降钙素在人体内协同甲状腺素(PTH)调控着钙磷的代谢，可以抑制骨的原发性骨吸收和继发性骨吸收。不同来源的降钙素氨基酸序列不同，不同生物的降钙素对人都有活性，后鳃体来源的降钙素活性高于甲状腺来源的降钙素，而以鲑鱼降钙素(salmon calcitonin，简称sCT)活性最高，是人降钙素活性的20-40倍。鲑鱼降钙素通过抑制破骨细胞的活性，防止骨中的钙质流失到血液当中，从而降低了血钙含量。鲑鱼降钙素的这种作用被称之为抑制再吸收效应(anti-resorptive effect)。鲑鱼降钙素已经在临床上应用多年，主要用于预防和治疗老年性骨质疏松、Paget氏)综合症、高钙血症等，并作为糖尿病、胃溃疡、急性胰肠炎等疾病的辅助治疗药物。由于这些疾病常常伴有强烈的骨痛，而鲑鱼降钙素能作用于神经中枢，产生镇痛的特殊效果，并且其安全性高于双磷酸盐等破骨细胞抑制剂，因此在欧美国家普遍运用。

目前已经上市的鲑鱼降钙素只有注射和鼻喷两种，由于降钙素需要长期使用，一方面，给病人带来额外的痛苦，病人的依从性差，另一方面，由于生物当中的降钙素含量极微，而合成降钙素造价昂贵，极大的限制了鲑鱼降钙素的广泛使用。

随着基因工程技术的兴起和发展，利用高效的生物表达系统表达制备廉价的鲑鱼降钙素成为可能。国外利用生物工程技术，已经获得降钙素的多种表达方式，近十年，国内也出现许多基因表达方面的报道。

表达系统表达宿主主要有原核表达系统(主要为大肠杆菌)和真核表达系统(包括酵母、动物细胞、植物等)。

原核表达系统外源蛋白产量高，生产周期短，目前通过基因工程工业化生产鲑鱼降钙素主要是通过从转基因原核生物中提取，再进一步纯化，再酰胺化得到成品。但是由于原核表达系统无法对外源蛋白进行转录后修饰，酰胺化工艺水平将直接影响重组表达的鲑鱼降钙素的活性；而且在实际生产当中，由于细菌本身产生的热源、内毒素不易除去，所以必须进行纯化，纯化过程复杂，而且成本很高。

真核表达系统作为制备鲑鱼降钙素的表达载体，虽然免去了酰胺化的步骤，已经极大的节约了成本，但是真核表达系统的表达量普遍较低，且表达系统本身成本较高，限制了其在生产中的应用。如利用昆虫细胞、鼠垂体细胞或者转基因兔的方法成本昂贵；在植物当中表达鲑鱼降钙素虽然很可能降低成本，但是表达出的鲑鱼降钙素蛋白如何提纯还没有得到很好的解决。

因此，目前存在的问题迫切地要求发展更廉价更高效的表达系统。

2001年，Blanquet在“Trends Biotechnol”上提出了“biodrug”的概念，指出干燥后的重组酿酒酵母可在消化液存在的条件下作为载体运输口服多肽。酿酒酵母被认为是食品安全级的微生物，酿酒酵母生产容易，发酵技术已相当成熟。冷冻干燥后的酵母对胃肠道的抗降解能力强，对表达的产物能起到良好的保护作用。而且，目前研究较多的口服型肠溶微粒模式证明，鲑鱼降钙素能够以多肽的形式直接穿过动物胃肠道的表皮细胞进入血液。以上报道为转鲑鱼降钙素基因酵母的研制和应用提供了理论依据。

发明内容

本发明提供了一种转鲑鱼降钙素基因酵母及其制备方法和应用，可以解决目前鲑鱼降钙素在表达系统中的表达量低、需纯化、造价高及不能口服给药的问题。

通过对鲑鱼降钙素的基因进行改造，并通过表面展示技术，获得能表达重组鲑鱼降钙素的酿酒酵母。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种转鲑鱼降钙素基因酵母，其特征在于：所述转基因酵母是将人工合成的鲑鱼降钙素基因转入到酿酒酵母中获得的。

在上述技术方案中，还具有以下技术特征：所述的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，所述鲑鱼降钙素基因含有124bp的DNA片段，与序列表第1号序列所示核苷酸序列具有100％的同源性。

在上述技术方案中，还具有以下技术特征：通过将人工合成的鲑鱼降钙素基因构建大肠杆菌工程菌p-sCT-Sf，以p-sCT-Sf的质粒在URA3位点转化酿酒酵母获得转基因酵母工程菌yAGA2-sCT。

在上述技术方案中，还具有以下技术特征：所述的大肠杆菌工程菌p-sCT-Sf质粒，其在人工鲑鱼降钙素之前为AGA2基因，AGA2亚基可与酵母表面的AGA1亚基通过二硫键连接于酵母表面的葡聚糖上，从而实现外源蛋白在酵母表面的表达，AGA2基因与序列表第5号序列所示的核苷酸序列具有100％的同源性。

在上述技术方案中，还具有以下技术特征：所述的URA3基因分别位于质粒p-sCT-Sf表达框的两侧，质粒p-sCT-Sf通过URA3位点与酿酒酵母发生同源重组，该URA3基因长807bp，与序列表第6号序列所示的核苷酸序列具有100％的同源性。

在上述技术方案中，还具有以下技术特征：所述的鲑鱼降钙素基因，其密码子根据酿酒酵母偏爱密码子进行了优化，其由两条寡核苷酸长链SCT1和SCT2通过互补配对得到，寡核苷酸长链序列SCT1与序列表第2号序列所示的核苷酸序列具有100％的同源性，寡核苷酸长链序列SCT2与序列表第3号序列所示的核苷酸序列具有100％的同源性。

在上述技术方案中，还具有以下技术特征：所述鲑鱼降钙素基因是编码34个氨基酸残基的多肽，其第34位氨基酸为甘氨酸，其后三个氨基酸为连续的终止密码子，其氨基酸序列与序列表第4号序列所示的氨基酸序列具有100％的同源性。

所述转鲑鱼降钙素基因酵母的制备方法，具有如下步骤：

[1]鲑鱼降钙素基因的制备：

根据酵母偏爱密码子，利用化学合成与酶相结合方法，获得鲑鱼降钙素基因，经内切酶BamH I切割后，连入经同样内切酶切割的克隆载体pUC18，构建重组质粒pUC18-sCT，经测序，与预期序列一致；

[2]含鲑鱼降钙素基因穿梭质粒的制备：

以通用的pUC18引物从重组质粒pUC18-sCT上通过PCR反应扩增含有sCT的片段，该片段经过BamH I切割之后，连入经同样内切酶切割的穿梭载体p-Sf，构建重组穿梭质粒p-sCT-Sf，重组的穿梭质粒通过引物对pyd1和pyd2进行筛选，pyd1引物序列与序列表第7号序列所示的核苷酸序列具有100％的同源性，pyd2引物对的序列与序列表第8号序列所示的核苷酸序列具有100％的同源性；

[3]鲑鱼降钙素基因向酿酒酵母的转化：

穿梭质粒p-sCT-Sf经过Nco I酶切之后通过乙醇沉淀的方法获得含鲑鱼降钙素的线性片段，该线性片段通过LiAc介导的方法转化酿酒酵母感受态细胞，转化子在色氨酸缺陷型平板上筛选重组子；

[4]转鲑鱼降钙素基因酵母的培养步骤如下：

转基因酵母yAGA2-sCT在28-30℃条件下预先在SD-CAA培养基中培养到对数期，吸取1/10的菌液到SG-CAA培养基当中继续培养细胞到5×10⁷cells/ml；摇床设置为28-30℃，180-200rpm；SD-CAA培养基和SG-CAA培养基的配方如下：

SD-CAA培养基：2％(w/v)葡萄糖；0.67％(w/v)酵母氮源；1％(w/v)酪蛋白氨基酸；

SG-CAA培养基：2％(w/v)半乳糖；0.67％(w/v)酵母氮源；1％(w/v)酪蛋白氨基酸；

[5]转鲑鱼降钙素基因酵母的检测步骤如下：

(1)挑取一个酵母单克隆到10ml SD-CAA培养基(含2％葡萄糖)当中，于28-30℃恒温摇床中培养过夜；

(2)在600nm下读取培养物吸光值，OD₆₀₀应该在2到5之间；当OD₆₀₀低于2或者超过5时，继续培养到该浓度范围或者稀释到该浓度；

(3)以3000-5000g在室温的条件下离心5-10min；

(4)重悬浮细胞于SG-CAA培养基(含2％半乳糖)当中直到OD₆₀₀值达到0.5-1之间；

(5)迅速转移相当于2OD₆₀₀单位的酵母到冰上，该时间作为诱导的零点时刻；

(6)在20-25℃的摇床上培养酵母细胞；

(7)分析0，6，12小时三个时间段的细胞培养物，在每时间段吸取相当于2OD₆₀₀的细胞培养物置于冰上准备进行分析；

[6]转鲑鱼降钙素基因酵母的冷冻干燥：

细胞在冷冻离心机当中以4℃，5000g，10min的条件收获然后重悬于生理盐水当中，重悬液以1℃/min的速率冷冻到-40℃；样品在冷冻干燥仪上冷冻干燥，压力6Pa，在冷冻干燥的最后两小时内，加热样品到23℃以减少残留水蒸气。

在上述技术方案中，还具有以下技术特征：所述转鲑鱼降钙素基因酵母是用于预防和治疗骨质疏松症、Paget氏综合症即变形性骨病、高钙血症的口服药物，或用于上述病症的保健品。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明提供了鲑鱼降钙素的口服给药的新途径，拓宽了鲑鱼降钙素在骨质疏松症治疗上的应用，为鲑鱼降钙素在医疗事业上更广泛的使用提供了依据。

重组鲑鱼降钙素能够在体外抑制破骨细胞的活性。外源表达的蛋白通过细胞实验对其体外的活性进行了检测。检测中采用的是破骨细胞。破骨细胞作为一种终分化细胞，能够在骨组织上进行骨的吸收，形成骨陷窝。首先通过骨片切割机制作了小牛皮质骨骨片。骨片与破骨细胞进行培养的过程中加入了yAGA2-sCT中释放的重组鲑鱼降钙素。密钙息(医用鲑鱼降钙素注射液)作为培养实验的阳性对照。骨片培养一周之后，骨片在数码显微镜下拍照并计算出骨陷窝面积。结果发现重组鲑鱼降钙素能够显著减少骨陷窝的生成。

转基因酵母yAGA2-sCT灌胃正常Wistar大鼠具有持续的降血钙能力。根据英国药典的方法进行了动物降血钙实验。动物采用了正常的Wistar雌性大鼠。实验分为阴性对照组，阳性对照组和实验组。阴性对照组灌胃5g/kg含空白载体的转基因酵母yAGA2-V5，阳性对照组则注射200mIU/kg密钙息(医用鲑鱼降钙素注射液)。实验组中，灌胃了低、中、高三个剂量(0.1g/kg，0.5g/kg，5g/kg)冷冻干燥的yAGA2-sCT。实验动物在不同的时间段(1，2，4，6，8，10小时)从眼球丛静脉毛细血管吸取全血制备血清，血清送往青岛市解放军401医院测定血钙值。实验结果表明，灌胃5g/kg冷冻干燥的酵母yAGA2-sCT显著降低了大鼠血钙值(p＜0.01)。其最大药效时间Tmax为2小时，Wistar大鼠血钙值降低到2.355±0.012mM。实验发现灌胃yAGA2-sCT能持续降低血钙值，且呈现出剂量效应。

转基因酵母对高钙血症具有抑制作用。高钙血症是最常见的伴癌内分泌综合征，晚期癌肿病人约10％有高钙血症。当此症状转化为高钙血危象时，将严重威胁患者的生命。目前治疗高钙血症的首选药物是帕米磷酸盐(pamidronate)等双磷酸盐药物。这些双磷酸盐药物毒副作用较大，长期使用可能导致体内解毒器官病变。鲑鱼降钙素安全性强且见能迅速降低血钙值，但注射鲑鱼降钙素2小时之后药效逐渐消失，故临床上鲑鱼降钙素在治疗高钙血症时作为辅助药物。为了研究转基因酵母yAGA2-sCT对高钙血症的作用，首先制作了高钙血症大鼠模型。根据文献方法，连续一周灌胃正常的Wistar雌性大鼠活性维他命D3(1，25-dihydroxy-cholecalciferol)。大鼠血钙值由2.638±0.017mM上升到2.838±0.022mM，显著高于普通大鼠，标志着造模的成功。高钙血大鼠实验分为阴性对照组，阳性对照组和试剂组。阴性对照组灌胃含空白载体的转基因酵母5g/kg yAGA2-V5，阳性对照组则注射1.25mg/kg双磷酸盐药物pamidronate。实验组中，灌胃了低、中、高三个剂量(0.1g/kg，0.5g/kg，5g/kg)冷冻干燥的yAGA2-sCT。处理12小时之后从眼球丛静脉毛细血管吸取全血制备血清，血清送往青岛市解放军401医院测定血钙值。实验发现，灌胃5g/kg冷冻干燥的酵母yAGA2-sCT显著降低了模型大鼠的血钙值，血钙值从2.81±0.018mM降低到了2.69±0.025mM，P＜0.01，差异显著。灌胃0.5g/kg yAGA2-sCT时，血钙值降低到2.75±0.016mM，P＜0.05。

在急性毒性实验中，动物耐受量大于10g/kg。在亚急性毒性实验当中，检测了大鼠的体重变化，血液生理指标，生化指标，脏体系数。各项指标均无显著变化，初步证明转鲑鱼降钙素基因酵母用药安全。

本发明通过将鲑鱼降钙素在酿酒酵母这种真核系统中来表达，基于酿酒酵母生产容易，发酵技术已相当成熟的优势，而且表达量较高，其次酿酒酵母可以直接食用，得到的转化降钙素的酿酒酵母不需要纯化可以直接口服，从而降低了生产成本，实现了降钙素的口服给药。

附图说明

图1为穿梭载体p-sCT-Sf的构建流程图；

图2为重组鲑鱼降钙素在穿梭载体p-sCT-Sf的表达框；

图3为重组鲑鱼降钙素在转基因酵母的表达模式；

图4为破骨细胞在骨片上的重吸收图；

图5为免疫荧光测定图；

图6为流式细胞仪测定图；

图7为转基因酵母在Wistar大鼠体内的降血钙活性图；

图8为转基因酵母对高钙血模型Wistar大鼠的抑制效果图。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae yAGA2-sCT)的保藏日期：

2007年10月17日；

保藏单位的名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院研究所；

简称：CGMCC；

保藏编号：2199。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1：转鲑鱼降钙素基因酵母的制备：

1.鲑鱼降钙素基因的制备：

选用酿酒酵母偏爱密码子设计出它的基因DNA序列，利用DNA合成仪合成鲑鱼降钙素基因的两条部分单链sCT1和sCT2。取上述单链DNA片段sCT1和sCT2各80pmol，在终体积80μl的退火缓冲液中混匀，置90℃水浴5min，缓慢冷却至室温。加入5mol/L的NaCl至终浓度为300mmol/L和3倍体积的乙醇，-20℃放置过夜；离心去上清，抽干除净残留的乙醇。沉淀的DNA溶于Klenow酶反应液的1×缓冲液中，内含由dNTPs(终浓度各0.5mmol/L)和5U Klenow酶，37℃水浴1小时左右，乙醇沉淀后获双链DNA。经内切酶BamH I切割后，连入经同样内切酶切割的克隆载体pUC18，构建重组质粒pUC18-sCT，经测序，与预期序列一致(如序列表第1号序列所示)。

2.含鲑鱼降钙素基因穿梭质粒p-sCT-Sf的构建：

以通用的pUC18引物从重组质粒pUC18-sCT上通过PCR反应扩增含有sCT的片段。该片段经过BamH I切割之后，连入经同样内切酶切割的穿梭载体p-Sf，构建重组穿梭质粒p-sCT-Sf(重组质粒构建如图1所示)。其中穿梭载体p-Sf是将酿酒酵母的URA3基因分别插入到酵母表达载体pYD1的表达框两侧构建而成(穿梭载体p-Sf结构示意图如图1所示)。重组的穿梭质粒通过引物对pyd1和pyd2进行筛选。pyd1为22bp的DNA单链(如序列表第7号序列所示)，pyd2为22bp的DNA单链(如序列表第8号序列所示)。

3.鲑鱼降钙素基因向酿酒酵母的转化：

穿梭质粒p-sCT-Sf经过NcoI酶切之后通过乙醇沉淀的方法获得含鲑鱼降钙素的线性片段，该线性片段通过LiAc介导的方法转化酿酒酵母感受态细胞。转化子在色氨酸缺陷型平板上筛选重组子。

4.转鲑鱼降钙素基因酵母的培养：

转基因酵母yAGA2-sCT在30℃条件下预先在SD-CAA培养基培养到对数期。吸取1/10的菌液到SG-CAA培养基当中继续培养细胞到5×10⁷cells/ml。摇床设置为30℃，200rpm。SD-CAA培养基和SG-CAA培养基的配方如下：

SD-CAA培养基：

2％(w/v)葡萄糖；0.67％(w/v)酵母氮源；1％(w/v)酪蛋白氨基酸

SG-CAA培养基：

2％(w/v)半乳糖；0.67％酵母氮源；1％(w/v)酪蛋白氨基酸

5.重组鲑鱼降钙素在酵母表面的表达：

转基因酵母在半乳糖诱导下表达配体蛋白AGA2亚基。AGA2亚基与酵母表面的AGA1亚基通过二硫键连接于酵母表面的葡聚糖上，从而实现了外源蛋白在酵母表面的表达。同时，外源蛋白之前具有肠激酶位点，有利于鲑鱼降钙素在动物自身体内肠激酶的作用下释放(如图2、图3所示)。

(1)挑取一个酵母单克隆到10ml SD-CAA(含2％葡萄糖)培养基当中，于30℃恒温摇床中培养过夜。

(2)在600nm下读取培养物吸光值，OD₆₀₀应该在2到5之间。当OD₆₀₀低于2或者超过5时，继续培养到该浓度范围或者稀释到该浓度。

(3)以3000-5000g在室温的条件下离心5-10min。

(4)重悬浮细胞于SG-CAA培养基(含2％半乳糖)中，调节OD₆₀₀值达到0.5-1之间。

(5)在20-25℃的摇床上培养酵母细胞，在0，6，12小时分别吸取相当于2OD₆₀₀的细胞培养物置于冰上。

(6)分析0，6，12小时三个时间段的细胞培养物。

6.转鲑鱼降钙素基因酵母的冷冻干燥：

细胞在冷冻离心机中以4℃，5000g，10min的条件收获，然后重悬于生理盐水中。重悬液以1℃/min的速率冷冻到-40℃。样品在冷冻干燥仪上冷冻干燥，压力6Pa，在冷冻干燥的最后两小时内，加热样品到23℃以减少残留水蒸气。

所述酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，如酿酒酵母Saccharomycescerevisiae EBY100。

实施例2：鲑鱼降钙素在酿酒酵母表面表达的免疫荧光测定：

1.对转基因酵母进行荧光标记前的培养步骤如实施例1中步骤5所述。

2.对转基因酵母进行荧光标记的步骤如下：

(1)根据以上时间点得到的培养物在冷冻离心机下以4℃，3000-5000g离心5-10分钟。

(2)在1×PBS的当中洗涤培养物一次。

(3)沉淀重悬于250μl 1×PBS(含1mg/ml BSA和1μg抗体)。

(4)在冰上静置30分钟，可以轻轻的摇晃混匀。

(5)在冷冻离心机下以4℃，3000-5000g离心5-10分钟。

(6)用1×PBS再次洗涤沉淀。

(7)重悬细胞yAGA2-sCT于1×PBS(含1mg/ml BSA和1μg异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG)当中。

(8)在冰上静置30分钟，可以轻轻的摇晃混匀。

(9)用不含BSA的1×PBS洗涤2次。

(10)重悬沉淀于于40μl 1×PBS当中，吸取5-10μl在荧光显微镜下分别对结合了抗体的yAGA2-sCT细胞进行观察。

3.鲑鱼降钙素在酵母表面表达的免疫荧光测定：

荧光显微镜下被FITC标记后的酵母发出明亮的黄绿色。图5表示转基因酵母yAGA2-sCT经诱导表达0，6，12个小时后的荧光/普通光图。图中的左列为荧光图，右列为普通光下的照片。从图5中可以看出，随着时间的增加，转基因酵母中细胞中表达外源蛋白的数目逐渐增多。

实施例3：鲑鱼降钙素在酿酒酵母表面表达的流式细胞仪测定：

1.对转基因酵母进行荧光标记前的培养步骤如实施例1中步骤5。

2.对转基因酵母进行荧光标记的步骤如实施例2中步骤2。

3.荧光标记后的细胞在流式细胞仪当中读取参数。图6中横坐标代表荧光读数，纵坐标代表细胞数目。图中的每个数值代表该荧光读数下的细胞数。下图的双峰中，第一个峰表示酵母的本底，第二个峰表示荧光标记后的细胞群。流式细胞仪通过自动计算曲线下的面积即可推断表达的细胞的数目。观察中发现，随着诱导时间的增加，转基因酵母中表达外源蛋白的细胞数目就越多。通过流式细胞仪检测，在0时刻几乎没有发现转基因酵母的表达迹象，在6小时时刻，发现转基因酵母开始了表达，但荧光标记的峰值显示表达的细胞不多。转基因酵母yAGA2-V5中表达外源蛋白的细胞数目为8％而酵母yAGA2-SCT中为12％。在12小时时刻，转基因酵母yAGA2-V5中表达外源蛋白的细胞数目达到了52％，而yAGA2-sCT菌株中表达外源蛋白的细胞数目达到了65％。

实施例4：破骨细胞在骨片上的重吸收：

在肠激酶的作用下，转基因酵母中的外源蛋白释放到酶切液的上清当中。该上清简称为EKS。实验首先通过骨片切割机制作了小牛皮质骨骨片。从大鼠四肢骨机械分离破骨细胞，接种到骨片上，贴壁培养(5％的CO2，95％空气，37℃湿热)30～60min，用预温的MEM培养液洗去未贴壁细胞(2～3次)，更换培养液继续培养。

在96孔板上每6孔放置1个骨片，每6个含骨片的孔为一组。实验共分为4组。第一组每组不加入其它试剂，作为对照组。第二组中每孔加入10□1yAGA2-v5 EKS，作为阴性对照组。第三组中每组加入10μl密钙息，作为阳性对照组。第四组每组加入10μl yAGA2-sCT EKS，作为药物组。实验重复4次。外源表达的蛋白通过细胞实验对其体外的活性进行了检测。破骨细胞作为一种终分化细胞，能够在骨组织上进行骨的吸收，形成骨陷窝。骨片与破骨细胞进行培养的过程中加入了yAGA2-V5 EKS和yAGA2-sCT EKS。密钙息(医用鲑鱼降钙素注射液)作为培养实验的阳性对照。

实验结果如图4所示，破骨细胞处理7天之后，骨片上变得粗糙不平，产生了大量得骨陷窝。骨陷窝平均面积为1505.90±40.10μm²。在阴性对照组当中，培养液中加入了10μl yAGA2-V5 EKS以后，骨片没有明显的变化。骨陷窝面积平均为1381.52±44.97μm²，(P＝0.081)。这说明培养液中不含有抑制破骨细胞活性的成分。而在加入10μl密钙息(10-8M sCT)之后，破骨细胞的活性受到了明显的抑制，骨片上的骨陷窝减少为688.60±34.79μm²(P＜0.01，vs.control)。这种抑制效应在加入10μl yAGA2-sCT EKS之后同样观察到了(696.25±29.04μm²P＜0.01，vs.control)。以上结果显示重组鲑鱼降钙素能明显的抑制破骨细胞活性。

实施例5：转基因酵母在Wistar大鼠体内的降血钙活性测量

在检测转基因酵母yAGA2-sct的体内活性实验当中，动物实验分为阴性对照组，阳性药物组以及高中低三个试剂组。阴性对照组灌胃5g/kg冷冻干燥的yAGA2-V5，阳性药物组皮下注射200mIU密钙息。高中低三个剂量组分别为5g/kg，0.5g/kg，0.1g/kg yAGA2-sct。

通过图7可以看出，灌胃5g/kg转基因酵母yAGA2-sCT具有明显的降血钙活性。在第2小时降血钙效应达到最大，血钙值降低到2.355mM，相比正常的大鼠降低了0.33mM，其效果持续到10个小时。相比之下，阳性药物密钙息在1小时其药效达到最大，此时大鼠血钙值降低到2.29mM，相比正常大鼠降低了0.38mM，然后迅速减弱，在2小时内其药效几乎消失，大鼠血钙恢复正常。

实验结果表明，5g/kg浓度的转基因酵母yAGA2-sCT能明显降低血钙值，其最大降血钙能力较200mIU/kg的阳性药物密钙息略低，但其持续时间明显长于注射的密钙息。

实施例6：转基因酵母对高钙血模型Wistar大鼠的抑制效果测量

高钙血模型采用Shuichi Tsuruoka(et al.，2000)的方法。大鼠在造模之前给予标准的鼠粮和(CE-2，含1.18％Ca和2.5IU/g维他命D3)和去离子水。禁食1小时之后，灌胃Wistar大鼠维他命D3(1，25-dihydroxy-cholecalciferol)(2μg/Kg)。连续灌胃1周后检测血钙值。动物实验分为载体组，阳性药物组和试剂组。载体组给模型大鼠灌胃5g/kgyAGA2-V5。阳性药物组给模型鼠注射1.25mg/kg帕米磷酸盐(pamidronate)。试剂组分别给模型大鼠灌胃低、中、高三个剂量(0.1，0.5，5g/kg)的yAGA2-sCT。灌胃12小时之后，眼球取血测定血钙值。大鼠眼球取血后，血液放于EP管，在室温下放置0.5～1h。然后直接放于冰上1h。然后以4000～6000rpm在室温下离心3～5min，每300ul全血取100～150ul血清，取血清的关键是不能溶血：轻拿轻放，用枪吸血清时，争取一次完成。取得的血清分装到已经灭菌的EP管中，送青岛市解放军401医院进行血钙测定。

如图8所示，和载体组对比，注射1.25mg/kg帕米磷酸盐(pamidronate)之后，大鼠血钙从2.81±0.018mM降低到了2.71±0.032mM，差异显著，P＜0.01。这意味着阳性药物帕米磷酸盐(pamidronate)具有降低高血钙的活性。灌胃鲑鱼降钙素转基因酵母yAGA2-sCT 5g/kg时，可以发现其明显的降低了血钙值。此时血钙为2.69±0.025mM，P＜0.01。这里可以看到yAGA2-sCT对高钙血症大鼠的剂量效应。随着剂量的增加，其针对模型大鼠的降血钙活性越强，在灌胃0.5g/kg yAGA2-sCT时，血钙值降低到2.75±0.016mM，P＜0.05；灌胃0.1g.kg yAGA2-sCT时，血钙值降低到2.71±0.032mM，P＞0.05，结果不显著。

由以上分析结果可以看出，酵母本身对高钙血大鼠模型无明显的影响，而转基因酵母灌胃大鼠后，随着剂量的增加，大鼠的血钙值明显降低。在以5g/kg的冷冻干燥的yAGA2-sCT的浓度下灌胃大鼠，其降低血钙的效果相当与静脉注射阳性药物帕米磷酸盐(pamidronate)1.25mg/kg。证明其在大鼠中有效的抑制了高钙血症。

当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

                             序列表

<110>中国海洋大学

<120>转鲑鱼降钙素基因酵母及其制备方法和应用

<160>8

<170>

<210>1

<211>124

<212>DNA

<213>重组鲑鱼降钙素(recombinant salmon calcitonin)

<220>

<221>CDS

<222>(8)...(107)

<223>

<400>1

1    CGGGATCCTG TTCTAACTTG TCTACCTGTG TTTTGGGTAA GTTGTCTCAA GAATTGCACA

61   AGTTGCAAAC CTACCCAAGA ACCAACACCG GTTCTGGTAC CCCAGGTTAA TAGTAAGGAT

121  CCCG

<210>2

<211>72

<212>DNA

<213>重组鲑鱼降钙素(recombinant salmon calcitonin)

<400>2

     CGGGATCCTGTTCTAACTTGTCTACCTGTGTTTTGGGTAAGTTGTCTCAAGAATTGCACA

     AGTTGCAAACCT

<210>3

<211>73

<212>DNA

<213>重组鲑鱼降钙素(recombinant salmon calcitonin)

<400>3

     CGGGATCCTTATCATTAACCTGGAGTACCAGAACCAGTGTTAGTTCTTGGGAAGTTTGCA

     ACTTGTGAGCGTC

<210>4

<211>34

<212>PRT

<213>重组鲑鱼降钙素(recombinant salmon calcitonin)

<400>4

Ser Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu

Leu His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly Thr

Pro Gly

<210>5

<211>261

<212>DNA

<213>酵母AGA2蛋白(AGA2 of Saccharomyces cerevisiae)

<400>5

1    ATGCAGTTAC TTCGCTGTTT TTCAATATTT TCTGTTATTG CTTCAGTTTT AGCACAGGAA

61   CTGACAACTA TATGCGAGCA AATCCCCTCA CCAACTTTAG AATCGACGCC GTACTCTTTG

121  TCAACGACTA CTATTTTGGC CAACGGGAAG GCAATGCAAG GAGTTTTTGA ATATTACAAA

181  TCAGTAACGT TTGTCAGTAA TTGCGGTTCT CACCCCTCAA CAACTAGCAA AGGCAGCCCC

241  ATAAACACAC AGTATGTTTT T

<210>6

<211>804

<212>DNA

<213>酵母URA3蛋白(URA3 of Saccharomyces cerevisiae)

<400>6

1    ATGTCGAAAG CTACATATAA GGAACGTGCT GCTACTCATC CTAGTCCTGT TGCTGCCAAG

61   CTATTTAATA TCATGCACGA AAAGCAAACA AACTTGTGTG CTTCATTGGA TGTTCGTACC

121  ACCAAGGAAT TACTGGAGTT AGTTGAAGCA TTAGGTCCCA AAATTTGTTT ACTAAAAACA

181  CATGTGGATA TCTTGACTGA TTTTTCCATG GAGGGCACAG TTAAGCCGCT AAAGGCATTA

241  TCCGCCAAGT  ACAATTTTTT  ACTCTTCGAA  GACAGAAAAT  TTGCTGACAT  TGGTAATACA

301  GTCAAATTGC  AGTACTCTGC  GGGTGTATAC  AGAATAGCAG  AATGGGCAGA  CATTACGAAT

361  GCACACGGTG  TGGTGGGCCC  AGGTATTGTT  AGCGGTTTGA  AGCAGGCGGC  GGAAGAAGTA

421  ACAAAGGAAC  CTAGAGGCCT  TTTGATGTTA  GCAGAATTGT  CATGCAAGGG  CTCCCTAGCT

481  ACTGGAGAAT  ATACTAAGGG  TACTGTTGAC  ATTGCGAAGA  GCGACAAAGA  TTTTGTTATC

541  GGCTTTATTG  CTCAAAGAGA  CATGGGTGGA  AGAGATGAAG  GTTACGATTG  GTTGATTATG

601  ACACCCGGTG  TGGGTTTAGA  TGACAAGGGA  GACGCATTGG  GTCAACAGTA  TAGAACCGTG

661  GATGATGTGG  TCTCTACAGG  ATCTGACATT  ATTATTGTTG  GAAGAGGACT  ATTTGCAAAG

721  GGAAGGGATG  CTAAGGTAGA  GGGTGAACGT  TACAGAAAAG  CAGGCTGGGA  AGCATATTTG

781  AGAAGATGCG  GCCAGCAAAA  CTAA

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>质粒p-sCT-Sf(plasmid p-sCT-Sf)

<400>7

    AGTAACGTTTGTCAGTAATTGC

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>质粒p-sCT-Sf(plasmid p-sCT-Sf)

<400>8

    GTCGATTTTGTTACATCTACAC

Claims (9)

1.一种转鲑鱼降钙素基因酵母，其特征在于：所述转基因酵母是将人工合成的鲑鱼降钙素基因转入到酿酒酵母中获得的。

2.根据权利要求1所述的转鲑鱼降钙素基因酵母，其特征在于：所述的酿酒酵母为Saccharomyces cerevisiae，所述鲑鱼降钙素基因含有124bp的DNA片段，与序列表中的第1号序列所示核苷酸序列具有100％的同源性。

3.根据权利要求2所述的转鲑鱼降钙素基因酵母，其特征在于：通过将人工合成的鲑鱼降钙素基因构建大肠杆菌工程菌p-sCT-Sf，以p-sCT-Sf的质粒在URA3位点转化酿酒酵母获得转基因酵母工程菌yAGA2-sCT。

4.根据权利要求3所述转鲑鱼降钙素基因酵母，其特征在于：所述的大肠杆菌工程菌p-sCT-Sf质粒，其在人工鲑鱼降钙素之前为AGA2基因，AGA2亚基可与酵母表面的AGA1亚基通过二硫键连接于酵母表面的葡聚糖上，从而实现外源蛋白在酵母表面的表达，AGA2基因与序列表第5号序列所示的核苷酸序列具有100％的同源性。

5.根据权利要求3所述的转鲑鱼降钙素基因酵母，其特征在于：所述的URA3基因分别位于质粒p-sCT-Sf表达框的两侧，质粒p-sCT-Sf通过URA3位点与酿酒酵母发生同源重组，该URA3基因长807bp，与序列表第6号序列所示的核苷酸序列具有100％的同源性。

6.根据权利要求1所述的转鲑鱼降钙素基因酵母，其特征在于：所述的鲑鱼降钙素基因，其密码子根据酿酒酵母偏爱密码子进行了优化，其由两条寡核苷酸长链SCT1和SCT2通过互补配对得到，寡核苷酸长链序列SCT1与序列表第2号序列所示的核苷酸序列具有100％的同源性，寡核苷酸长链序列SCT2与序列表第3号序列所示的核苷酸序列具有100％的同源性。

7.根据权利要求6所述的转鲑鱼降钙素基因酵母，其特征在于：所述鲑鱼降钙素基因是编码34个氨基酸残基的多肽，其第34位氨基酸为甘氨酸，其后三个氨基酸为连续的终止密码子，其氨基酸序列与序列表第4号序列所示的氨基酸序列具有100％的同源性。

8.根据权利要求1所述转鲑鱼降钙素基因酵母的制备方法，其特征在于有如下步骤：

[1]鲑鱼降钙素基因的制备：

根据酵母偏爱密码子，利用化学合成与酶相结合方法，获得鲑鱼降钙素基因，经内切酶BamH I切割后，连入经同样内切酶切割的克隆载体pUC18，构建重组质粒pUC18-sCT，经测序，与预期序列一致；

[2]含鲑鱼降钙素基因穿梭质粒的制备：

以通用的pUC18引物从重组质粒pUC18-sCT上通过PCR反应扩增含有sCT的片段，该片段经过BamH I切割之后，连入经同样内切酶切割的穿梭载体p-Sf，构建重组穿梭质粒p-sCT-Sf，重组的穿梭质粒通过引物对pyd1和pyd2进行筛选，pyd1引物序列与序列表第7号序列所示的核苷酸序列具有100％的同源性，pyd2引物序列与序列表第8号序列所示的核苷酸序列具有100％的同源性；

[3]鲑鱼降钙素基因向酿酒酵母的转化：

穿梭质粒p-sCT-Sf经过NcoI酶切之后通过乙醇沉淀的方法获得含鲑鱼降钙素的线性片段，该线性片段通过LiAc介导的方法转化酿酒酵母感受态细胞，转化子在色氨酸缺陷型平板上筛选重组子；

[4]转鲑鱼降钙素基因酵母的培养步骤如下：

转基因酵母yAGA2-sCT在28-30℃条件下预先在SD-CAA培养基中培养到对数期，吸取1/10的菌液到SG-CAA培养基当中继续培养细胞到5×10⁷cells/ml；摇床设置为28-30℃，180-200rpm；SD-CAA培养基和SG-CAA培养基的配方如下：

SD-CAA培养基：2％(w/v)葡萄糖；0.67％(w/v)酵母氮源；1％(w/v)酪蛋白氨基酸；

SG-CAA培养基：2％(w/v)半乳糖；0.67％(w/v)酵母氮源；1％(w/v)酪蛋白氨基酸；

[5]转鲑鱼降钙素基因酵母的检测步骤如下：

(1)挑取一个酵母单克隆到10ml SD-CAA培养基(含2％葡萄糖)当中，于28-30℃恒温摇床中培养过夜；

(2)在600nm下读取培养物吸光值，OD₆₀₀应该在2到5之间；当OD₆₀₀低于2或者超过5时，继续培养到该浓度范围或者稀释到该浓度；

(3)以3000-5000g在室温的条件下离心5-10min；

(4)重悬浮细胞于SG-CAA培养基(含2％半乳糖)当中直到OD₆₀₀值达到0.5-1之间；

(5)迅速转移相当于2OD₆₀₀单位的酵母到冰上，该时间作为诱导的零点时刻；

(6)在20-25℃的摇床上培养酵母细胞；

(7)分析0，6，12小时三个时间段的细胞培养物，在每时间段吸取相当于2 OD₆₀₀的细胞培养物置于冰上准备进行分析；

[6]转鲑鱼降钙素基因酵母的冷冻干燥：

细胞在冷冻离心机当中以4℃，5000g，10min的条件收获然后重悬于生理盐水当中，重悬液以1℃/min的速率冷冻到-40℃；样品在冷冻干燥仪上冷冻干燥，压力6Pa，在冷冻干燥的最后两小时内，加热样品到23℃以减少残留水蒸气。

9.根据上述任意一项权利要求所述的转鲑鱼降钙素基因酵母，其特征在于：所述转鲑鱼降钙素基因酵母是用于预防和治疗骨质疏松症、Paget氏综合症、高钙血症的口服药物，或用于上述病症的保健品。

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