CN101125844A - 原花青素b2的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种原花青素B2的提取方法，步骤为：(1)以松科、蔷薇科等植物的根、茎或叶为原料，加乙醇水溶液，浸提，过滤，上清液减压浓缩至糖度2－40的提取物；(2)将提取物分散至水中，经大孔树脂吸附，用乙醇水溶液梯度洗脱，通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含原花青素B2的组分，减压浓缩，得糖度为10～40的浓缩物；(3)将浓缩物进行聚酰胺树脂分离，用乙醇水溶液梯度洗脱，通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含原花青素B2的组分，将洗脱液减压浓缩，得糖度为10－20的原花青素B2重量百分含量为20％－50％的提取物。用本发明的方法可以获得高含量的原花青素B2提取物。
Description
技术领域
本发明涉及一种原花青素B2的提取方法。
背景技术
原花青素(proanthocyanidins或procyanidins，简称PC)是植物界中广泛存在的一大类多酚化合物的总称。起初统称为缩合鞣质或黄烷醇类。随着分离鉴定技术的不断发展以及对此类物质研究的不断深入，现已成为独立的一大类物质，统称之为原花青素。原花青素是由多羟基黄烷-3-醇单元构成的低聚体和多聚体，由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成[1]。原花青素具有抗氧化、保护心血管、抗肿瘤、抗糖尿病、抗衰老、抗辐射、减肥美容等多种保健功效[2-3]。原花青素B2是原花青素中主要的活性成分，是由两个表儿茶素结构以4-8位连接而成。目前市场上销售的含有原花青素的植物提取物中原花青素B2的含量较低为1-15％。本发明将提供一种制备高含量原花青素B2的方法。
参考文献：
[1]Fuleki T，Ricardo da silva J M.Catech in and procyanidin composition of seeds from grape cultivate grownin ontario[J].J Ag ric Food Chem，1997，45：1156-1160.
[2]Chang H.Research Progress in Pharmacological activity of Oligomeric Proanthocyanidins in Grape SeedsExtracts[J].Foreign Medical Sciences(Section of Hygiene)(国外医学卫生学分册)，2005，32：72-76.
[3]Zhang B R，Lao Y X，Su W W.Research and Development Status Quo of Oligomeric Proanthocyanidins[J].Jorunal of Chinese Medicinal Materials(中药材)，2003，26：905-908.
发明内容
本发明的目的是提供一种原花青素B2的提取方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种原花青素B2的提取方法，包括如下步骤：
(1)以松科松属植物的根、树皮、叶；或蔷薇科植物的根、茎、叶、果实、种子；或葡萄科葡萄属植物的根、茎、果实、种子；或豆科植物的茎或种皮为原料；向所述原料中加入4-10重量倍的水或4-10重量倍的体积百分比浓度为10％～95％的乙醇水溶液或4-10重量倍的10％～95％的甲醇水溶液，常压，70-95℃浸提取1～5小时，过滤，提取次数为1～5次，提取液合并静置至温度低于50度，弃沉淀，得上清液，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩至糖度2-40，得到提取物；
(2)将所述提取物以重量比为1∶1～10的比例分散至水中，经大孔树脂吸附，用水及体积百分比浓度为10％～95％的乙醇水溶液或水及体积百分比浓度为10％～95％的甲醇水溶液梯度洗脱，通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含原花青素B2的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，得糖度为10～40的浓缩物；
(3)将步骤(2)的产物进行聚酰胺树脂分离，用水及体积百分比浓度为20-95％的乙醇水溶液或水及体积百分比浓度为20-95％的甲醇水溶液梯度洗脱，通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含原花青素B2的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，得糖度为10-20的原花青素B2。
所述步骤还可以包括：(4)将所述步骤(3)制备的原花青素B2进行ODS中低压柱层析，用水及体积百分比为10％-50％的甲醇水溶液梯度洗脱，通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，以原花青素B2纯品作为对照品，收集富含原花青素B2的组分，并将其在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，得糖度为10-20的原花青素B2。
所述步骤还可以包括：(5)将所述步骤(4)制备的原花青素B2进行Sephadex LH-20柱层析纯化，用体积百分比10-30％的甲醇进行等浓度洗脱，通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，以原花青素B2纯品作为对照品，收集富含原花青素B2的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06-0.08MPa减压浓缩，得到糖度为10-20的组分，冷冻干燥得到原花青素B2。
所述步骤(1)中过滤所用滤网的目数为80～120。
所述步骤(2)中所述大孔树脂为AB-8型、HP20型、HPD100型、HPD100A型、HPD300型、X-5型、NKA-II型、D101型或DA201型。
所述步骤(3)中所述的薄层层析检测方法采用聚酰胺薄膜，展开溶剂为体积比为4∶1∶3的正丁醇-醋酸-水，显色剂为重量百分浓度为5％三氯化铁乙醇溶液，与原花青素B2标准品对照。
本发明的优点：市场上销售的含有原花青素B2的提取物含量相对较低，一般只有1-15％，本发明提供的方法可以制备20-98％不同含量的原花青素B2的提取物，使20-98％不同含量的原花青素B2的提取物能够达到产业化生产，为20-98％不同含量的原花青素B2提取物的进一步开发利用奠定基础。
附图说明
图1为本发明的原花青素B2的聚酰胺薄膜TLC检测图。
图2为本发明的原花青素B2的液相分析图谱。
图3为本发明的原花青素B2的ESI-MS图谱。
图4为本发明的原花青素B2的1H-NMR图谱。
图5为本发明的原花青素B2的13C-NMR图谱。
具体实施方式
原花青素B2的分子结构如下：
本发明的植物来源广泛，松科植物：如松科松属植物马尾松、野山松及其同属植物的根、树皮、松针等。
蔷薇科山楂属山楂及其同属植物的果实及其叶，蔷薇科苹果属植物苹果及其同属植物的果实及其根、茎枝、树叶，蔷薇科蔷薇属植物含两个亚属：单叶蔷薇亚属(Huhhemia)和蔷薇亚属(Rosa)。其中蔷薇亚属包括9个组：芹叶组(Pimpinellifollae)、蔷薇组(Rosa)、桂味组(Cinnamomeae)、月季组(Chinenses)、合柱组(Synstylae)、木香组(Banksianae)、金樱子组(Laevigatae)、硕苞蔷薇组(Bractcatae)、小叶组(Microphyllae)，约有200种，本属植物广泛分布于亚、欧、北非、北美各洲寒温带至亚热带地区，我国产82种。到目前为止，国内外学者已对该属植物的30个品种进行过研究，本属植物所含的主要化学成分为原花青素类成分，是提供原花青素成分很好的植物原料。
葡萄科葡萄属植物葡萄的根、茎枝、果实和种子。
豆科植物落花生的种皮、茎，豆科植物黑大豆的种皮等。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
90％以下的原花青素B2含量HPLC检测方法：
色谱柱：C-18250×4.6mm
检测波长：280nm
流速：1.0ml/min
流动相：A：1％磷酸
B：乙腈∶水＝80∶20
| 时间(min) | 0 | 3 | 6 | 15 | 30 | 50 | 60 | 66 | 80 | 83 | 85 | 105 |
| B比例(％) | 0 | 0 | 4 | 10 | 15 | 23 | 25 | 30 | 50 | 80 | 0 | Stop |
样品用50％乙醇溶解
实施例2
98％原花青素B2的HPLC检测方法：
色谱柱：C-18250×4.6mm
检测波长：280nm
流速：1.0ml/min
流动相：乙腈∶0.5％磷酸＝20∶80
实施例3
(1)提取：500g葡萄籽中加入2000g的水常压95℃温浸提取5次，提取时间分别为5、4、3、2、1小时，过滤，滤网的目数为120，提取液合并静置至温度低于50度，弃沉淀，得上清液；
(2)大孔树脂吸附分离：将(1)中提取液经HP20型大孔树脂吸附，用水、体积百分比浓度为10％、30％、50％、70％、95％的乙醇水溶液梯度洗脱，每250ml作为一个接收体积，通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含原花青素B2的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为40，得原花青素B2的富集物；(3)聚酰胺树脂分离：大孔树脂吸附分离后得到的原花青素B2的富集物分散至水中(1∶4)进行聚酰胺树脂分离，用水、体积百分比浓度为20％、50％、70％、95％的乙醇水溶液，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，收集富含原花青素B2的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为10，得原花青素B2的富集物。原花青素B2的含量为37.4％。
步骤(3)中所述的薄层层析检测方法采用聚酰胺薄膜，展开溶剂为体积比为4∶1∶3的正丁醇-醋酸-水，显色剂为重量百分浓度为5％三氯化铁乙醇溶液，与原花青素B2标准品对照。
实施例4
步骤(1)-(3)同实施例3；
(4)ODS中低压柱层析分离：将通过聚酰胺分离后富含原花青素B2的组分进行ODS中低压柱层析，用水、体积百分比为10％、20％、30％、40％、50％的甲醇水溶液梯度洗脱，每50ml作为一个接收体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，以原花青素B2纯品作为对照品，收集富含原花青素B2的组分，并将其在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为10，用实施例1的方法测定：原花青素B2的含量为75.3％。
实施例5
步骤(1)-(4)同实施例4；
(5)Sephadex LH-20进行纯化：将(4)中得到的含有原花青素B2的组分进行SephadexLH-20柱层析纯化，用体积百分比30％的甲醇进行洗脱，每10ml作为一个接收体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，以原花青素B2纯品作为对照品，收集富含原花青素B2的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06-0.08MPa减压浓缩，得到糖度为20的组分，冷冻干燥得到原花青素B2(260mg)。
利用ESI-MS、1H-NMR和13C-NMR等光谱手段并于文献数据进行对照，鉴定了根据上述方法分离得到的原花青素B的结构。在此基础上利用标准品(美国CHROMDEX公司购买)进行标定，测定原花青素素B2含量为98％。原花青素B2淡黄色粉末，聚酰胺薄膜以正丁醇-醋酸-水(4∶1∶3)展开，Rf为0.3，5％三氯化铁乙醇溶液显单一蓝色斑点。阴离子ESI-MS中给出了准分子离子峰[M-H]-577和[M-H+Cl]-612，其1H-NMR(300MHz，in DMSO)中信号交叠较严重，其13C-NMR(75MHz，in DMSO)中信号清晰，与文献相对照进行了全归属，鉴定为原花青素B2，结果见下表。
表1本发明中化合物的13C-NMR数据
| 位置 | 13C-NMR | |||
| 化合物 | PB2(文献) | |||
| Aunit | Bunit | Aunit | Bunit | |
| 2 | 78.6 | 76.1 | 79.9 | 76.9 |
| 3 | 65.2 | 72.1 | 67.0 | 73.5 |
| 4 | 28.3 | 36.3 | 29.9 | 36.7 |
| 4a | 99.4 | 102.6 | 99.6 | 103.9 |
| 5 | 154.5 | 156.4 | 156.5 | 157.6 |
| 6 | 96.4 | 95.1 | 96.8 | 95.6 |
| 7 | 154.9 | 157.2 | 156.6 | 157.8 |
| 8 | 107.7 | 94.4 | 107.2 | 95.5 |
| 8a | 153.6 | 157.2 | 154.5 | 157.7 |
| 1′ | 130.9 | 131.9 | 132.1 | 132.5 |
| 2′ | 115.0 | 115.1 | 114.9 | 114.9 |
| 3′ | 145.2 | 144.9 | 145.8 | 145.7 |
| 4′ | 144.8 | 144.6 | 145.5 | 145.4 |
| 5′ | 115.4 | 115.5 | 115.6 | 115.7 |
| 6′ | 118.2 | 118.4 | 118.7 | 119.0 |
用葡萄的根、茎或果替代实施例3、4、5中的原料，可以获得原花青素B2。
实施例6
(1)提取：500g山楂中加入5000g的水常压70℃温浸提取2次，每次4小时，过滤，滤网的目数为80，提取液合并静置至温度低于50度，弃沉淀，得上清液；
(2)大孔树脂吸附分离：将(1)中提取液经大孔树脂D101吸附，用水、体积百分比浓度为10％、30％、50％、70％的乙醇水溶液梯度洗脱，每250ml作为一个接收体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，收集富含原花青素B2的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为40，得原花青素B2的富集物；
(3)聚酰胺树脂分离：大孔树脂吸附分离后得到的原花青素B2的富集物分散至水中(1∶4)进行聚酰胺树脂分离，用水、体积百分比浓度为20％、50％、70％、95％的乙醇水溶液，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，收集富含原花青素B2的组分，根据原花青素B2的含量高低不同将洗脱液分成三个组分合并，分别在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为10，得原花青素B2的富集物。原花青素B2的含量为65.9％；
用山楂的根、茎和叶取代本实施例的原料，可以获得原花青素B2的含量为33.1％、36.8％。
实施例7
步骤(1)-步骤(3)同实施例6；
(4)ODS中低压柱层析分离：将经步骤(1)-步骤(3)分离后富含原花青素B2的组分进行ODS中低压柱层析，用水、体积百分比为10％、20％、30％、40％、50％的甲醇水溶液梯度洗脱，每50ml作为一个接收体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，以原花青素B2纯品作为对照品，收集富含原花青素B2的组分，并将其在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为20，得到的原花青素B2提取物含量分别78.1％。
用山楂的根、茎和叶取代本实施例的原料，可以获得原花青素B2的含量为51.4％、71.2％。
实施例8
步骤(1)-步骤(4)同实施例7；
(5)Sephadex LH-20进行纯化：将(4)中得到的含有原花青素B2的组分进行SephadexLH-20柱层析纯化，用体积百分比30％的甲醇进行洗脱，每10ml作为一个接收体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，以原花青素B2纯品作为对照品，收集富含原花青素B2的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06-0.08MPa减压浓缩，得到糖度为10的组分，冷冻干燥得到原花青素B2的纯品(185mg)。
用山楂的根、茎和叶取代本实施例的原料，可以获得较纯的原花青素B2。
实施例9
(1)提取：500g苹果的果树枝加入5000g的体积百分比浓度为10％的乙醇水溶液常压70℃温浸提取1次，浸提5小时，过滤，滤网的目数为100，提取液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为10，得原花青素B2的富集物；
(2)大孔树脂吸附分离：将(1)中B2提取物用水分散(重量比为1∶3)，静置2小时，弃去沉淀，上清液经大孔树脂AB-8吸附，用水、体积百分比浓度为10％、30％、50％、70％、95％的乙醇水溶液梯度洗脱，每250ml作为一个接收体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，收集富含原花青素B2的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为40，得原花青素B2的富集物；
(3)聚酰胺树脂分离：大孔树脂吸附分离后得到的原花青素B2的富集物分散至水中(重量比为1∶4)进行聚酰胺树脂分离，用水、体积百分比浓度为20％、50％、70％、95％的乙醇水溶液，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，收集富含原花青素B2的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为10，得原花青素B2的富集物，原花青素B2含量为19.4％。
实施例10
步骤(1)-步骤(3)同实施例9；
(4)ODS中低压柱层析分离：将通过聚酰胺分离后富含原花青素B2的组分进行ODS中低压柱层析，用水、体积百分比为10％-50％的甲醇水溶液梯度洗脱，每50ml作为一个接收体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，以原花青素B2纯品作为对照品，收集富含原花青素B2的组分，并将其在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为10，原花青素B2含量为51.2％。
实施例11
步骤(1)-步骤(4)同实施例10；
(5)Sephadex LH-20进行纯化：将(4)中得到的含有原花青素B2的组分进行SephadexLH-20柱层析纯化，用体积百分比10％的甲醇进行洗脱，每10ml作为一个接收体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，以原花青素B2纯品作为对照品，收集富含原花青素B2的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06-0.08MPa减压浓缩，得到糖度为20的组分，冷冻干燥得到原花青素B2的纯品(68mg)。
实施例12
(1)提取：500g青苹果加入5000g的体积百分比浓度为10％的乙醇水溶液常压70℃温浸提取1次，浸提5小时，过滤，提取液合并在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为10，得原花青素B2的富集物。
(2)大孔树脂吸附分离：将(1)中B2提取物用水分散(重量比为1∶3)，静置2小时，弃去沉淀，上清液经大孔树脂AB-8吸附，用水、体积百分比浓度为10％、30％、50％、70％、95％的乙醇水溶液梯度洗脱，每250ml作为一个接收体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，收集富含原花青素B2的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为40，得原花青素B2的富集物。
(3)聚酰胺树脂分离：大孔树脂吸附分离后得到的原花青素B2的富集物分散至水中(重量比为1∶4)进行聚酰胺树脂分离，用水、体积百分比浓度为20％、50％、70％、95％的乙醇水溶液，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，收集富含原花青素B2的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为10，得原花青素B2的富集物，原花青素B2含量为41.2％；
(4)ODS中低压柱层析分离：将通过聚酰胺分离后富含原花青素B2的组分进行ODS中低压柱层析，用水、体积百分比为10％-50％的甲醇水溶液梯度洗脱，每50ml作为一个接收体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，以原花青素B2纯品作为对照品，收集富含原花青素B2的组分，并将其在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为10，原花青素B2含量为89.2％；
(5)Sephadex LH-20进行纯化：将(4)中得到的含有原花青素B2的组分进行SephadexLH-20柱层析纯化，用体积百分比10％的甲醇进行洗脱，每10ml作为一个接收体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，以原花青素B2纯品作为对照品，收集富含原花青素B2的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06-0.08MPa减压浓缩，得到糖度为20的组分，冷冻干燥得到原花青素B2的纯品(132mg)。
实施例13
(1)提取：500g月季的根加入5000g的体积百分比浓度为95％的乙醇水溶液常压70℃温浸提取3次，浸提5小时，过滤，提取液合并静置至温度低于50度，弃沉淀，得上清液；在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩至无醇，糖度为40，得原花青素B2的富集物；
(2)大孔树脂吸附分离：将(1)中B2提取物分散至水中(重量比为1∶10)，静置2小时，弃去沉淀，上清液经大孔树脂X-5吸附，用水、体积百分比浓度为10％、30％、50％、70％、95％的乙醇水溶液梯度洗脱，每250ml作为一个接收体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，收集富含原花青素B2的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为20，得原花青素B2的富集物；
(3)聚酰胺树脂分离：大孔树脂吸附分离后得到的原花青素B2的富集物分散至水中(1∶4)进行聚酰胺树脂分离，用水、体积百分比浓度为20％、50％、70％、95％的乙醇水溶液，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，收集富含原花青素B2的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为20，得原花青素B2的富集物，原花青素B2含量为38.9％；
(4)ODS中低压柱层析分离：将通过聚酰胺分离后富含原花青素B2的组分进行ODS中低压柱层析，用水、体积百分比为10％-50％的甲醇水溶液梯度洗脱，每50ml作为一个接收体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，以原花青素B2纯品作为对照品，收集富含原花青素B2的组分，并将其在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为10，原花青素B2含量为76.3％；
(5)Sephadex LH-20进行纯化：将(4)中得到的含有原花青素B2的组分进行SephadexLH-20柱层析纯化，用体积百分比20％的甲醇进行洗脱，每10ml作为一个接收体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，以原花青素B2纯品作为对照品，收集富含原花青素B2的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06-0.08MPa减压浓缩，得到糖度为20的组分，冷冻干燥得到原花青素B2的纯品(275mg)。
实施例14
(1)提取：500g葡萄藤加入2000g的体积百分比浓度为60％的乙醇水溶液常压70℃温浸提取1次，浸提5小时，过滤，提取液合并在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为20，得原花青素B2的富集物；
(2)大孔树脂吸附分离：将(1)中B2提取物用水分散(重量比为1∶4)，静置2小时，弃去沉淀，上清液经大孔树脂HPD-100吸附，用水、体积百分比浓度为10％、30％、50％、95％的乙醇水溶液梯度洗脱，每250ml作为一个接受体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，收集富含原花青素B2的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为40，得原花青素B2的富集物；
(3)聚酰胺树脂分离：大孔树脂吸附分离后得到的原花青素B2的富集物分散至水中(1∶4)进行聚酰胺树脂分离，用水、体积百分比浓度为20％、50％、70％、95％的乙醇水溶液，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，收集富含原花青素B2的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为10，得原花青素B2的富集物；原花青素B2含量为19.2％；
(4)ODS中低压柱层析分离：将通过聚酰胺分离后富含原花青素B2的组分进行ODS中低压柱层析，用水、体积百分比为10％-50％的甲醇水溶液梯度洗脱，每50ml作为一个接受体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，以原花青素B2纯品作为对照品，收集富含原花青素B2的组分，并将其在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为20，原花青素B2含量为55.6％
(5)Sephadex LH-20进行纯化：将(4)中得到的含有原花青素B2的组分进行SephadexLH-20柱层析纯化，用体积百分比10％的甲醇进行洗脱，每10ml作为一个接受体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，以原花青素B2纯品作为对照品，收集富含原花青素B2的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06-0.08MPa减压浓缩，得到糖度为10的组分，冷冻干燥得到原花青素B2的纯品(78mg)。
实施例15
(1)提取：500g玫瑰花干品加入2.5L的体积百分比浓度为60％的乙醇水溶液常压70℃温浸提取1次，浸提5小时，过滤，提取液合并在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为20，得原花青素B2的富集物。
(2)大孔树脂吸附分离：将(1)中B2提取物用水分散(重量比为1∶4)，静置2小时，弃去沉淀，上清液经大孔树脂HPD-100A吸附，用水、体积百分比浓度为10％、30％、50％、95％的乙醇水溶液梯度洗脱，每250ml作为一个接受体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，收集富含原花青素B2的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为40，得原花青素B2的富集物。
(3)聚酰胺树脂分离：大孔树脂吸附分离后得到的原花青素B2的富集物分散至水中(1∶4)进行聚酰胺树脂分离，用水、体积百分比浓度为20％、50％、70％、95％的乙醇水溶液，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，收集富含原花青素B2的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为10，得原花青素B2的富集物，含量为21.8％
(4)ODS中低压柱层析分离：将通过聚酰胺分离后富含原花青素B2的组分进行ODS中低压柱层析，用水、体积百分比为10％-50％的甲醇水溶液梯度洗脱，每50ml作为一个接受体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，以原花青素B2纯品作为对照品，收集富含原花青素B2的组分，并将其在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为20，含量为53.4％
(5)Sephadex LH-20进行纯化：将(4)中得到的含有原花青素B2的组分进行SephadexLH-20柱层析纯化，用体积百分比10％的甲醇进行洗脱，每10ml作为一个接受体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，以原花青素B2纯品作为对照品，收集富含原花青素B2的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06-0.08MPa减压浓缩，得到糖度为10的组分，冷冻干燥得到原花青素B2的纯品(214mg)。
实施例16
(1)提取：500g松树皮加入4L的体积百分比浓度为10％的甲醇水溶液常压70℃温浸提取1次，浸提5小时，过滤，提取液合并在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为10，得原花青素B2的富集物；
(2)大孔树脂吸附分离：将(1)中B2提取物用水分散(重量比为1∶1)，静置2小时，弃去沉淀，上清液经大孔树脂NKA-II吸附，用水、体积百分比浓度为10％、30％、50％、70％、95％的甲醇水溶液梯度洗脱，每250ml作为一个接受体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，收集富含原花青素B2的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为15，得原花青素B2的富集物；
(1)聚酰胺树脂分离：大孔树脂吸附分离后得到的原花青素B2的富集物分散至水中(重量比为1∶4)进行聚酰胺树脂分离，用水、体积百分比浓度为20％、50％、70％、95％的乙醇水溶液，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，收集富含原花青素B2的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为10，得原花青素B2的富集物，原花青素B2含量为17.3％；
(2)ODS中低压柱层析分离：将通过聚酰胺分离后富含原花青素B2的组分进行ODS中低压柱层析，用水、体积百分比为10％-50％的甲醇水溶液梯度洗脱，每50ml作为一个接受体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，以原花青素B2纯品作为对照品，收集富含原花青素B2的组分，并将其在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为20，原花青素B2含量为59.1％；
(3)Sephadex LH-20进行纯化：将(4)中得到的含有原花青素B2的组分进行SephadexLH-20柱层析纯化，用体积百分比10％的甲醇进行洗脱，每10ml作为一个接受体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，以原花青素B2纯品作为对照品，收集富含原花青素B2的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06-0.08MPa减压浓缩，得到糖度为15的组分，冷冻干燥得到原花青素B2的纯品(65mg)。
实施例17
(1)提取：500g豆科植物黑大豆的种皮加入3L的体积百分比浓度为95％的甲醇水溶液常压70℃温浸提取3次，浸提3小时，过滤，提取液合并在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为40，得原花青素B2的富集物；
(2)大孔树脂吸附分离：将(1)中B2提取物用水分散(重量比为1∶10)，静置2小时，弃去沉淀，上清液经大孔树脂HPD-300吸附，用水、体积百分比浓度为10％、30％、50％、70％、95％的乙醇水溶液梯度洗脱，每250ml作为一个接受体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，收集富含原花青素B2的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为30，得原花青素B2的富集物；
(3)聚酰胺树脂分离：大孔树脂吸附分离后得到的原花青素B2的富集物分散至水中(重量比为1∶4)进行聚酰胺树脂分离，用水、体积百分比浓度为20％、50％、70％、95％的乙醇水溶液，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，收集富含原花青素B2的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为10，得原花青素B2的富集物，原花青素B2含量为52.7％；
(4)ODS中低压柱层析分离：将通过聚酰胺分离后富含原花青素B2的组分进行ODS中低压柱层析，用水、体积百分比为10％-50％的甲醇水溶液梯度洗脱，每50ml作为一个接受体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，以原花青素B2纯品作为对照品，收集富含原花青素B2的组分，并将其在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为10，原花青素B2含量为88.9％；
(5)Sephadex LH-20进行纯化：将(4)中得到的含有原花青素B2的组分进行SephadexLH-20柱层析纯化，用体积百分比10％的甲醇进行洗脱，每10ml作为一个接受体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，以原花青素B2纯品作为对照品，收集富含原花青素B2的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06-0.08MPa减压浓缩，得到糖度为20的组分，冷冻干燥得到原花青素B2的纯品(95mg)。
实施例18
(1)提取：500g豆科植物落花生的种皮加入3L的体积百分比浓度为95％的甲醇水溶液常压70℃温浸提取3次，浸提3小时，过滤，提取液合并在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为40，得原花青素B2的富集物；
(2)大孔树脂吸附分离：将(1)中B2提取物用水分散(重量比为1∶10)，静置2小时，弃去沉淀，上清液经大孔树脂HPD-300吸附，用水、体积百分比浓度为10％、30％、50％、70％、95％的乙醇水溶液梯度洗脱，每250ml作为一个接受体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，收集富含原花青素B2的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为30，得原花青素B2的富集物；
(3)聚酰胺树脂分离：大孔树脂吸附分离后得到的原花青素B2的富集物分散至水中(重量比1∶4)进行聚酰胺树脂分离，用水、体积百分比浓度为20％、50％、70％、95％的乙醇水溶液，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，收集富含原花青素B2的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为10，得原花青素B2的富集物，原花青素B2含量为56.4％；
(4)ODS中低压柱层析分离：将通过聚酰胺分离后富含原花青素B2的组分进行ODS中低压柱层析，用水、体积百分比为10％-50％的甲醇水溶液梯度洗脱，每50ml作为一个接受体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，以原花青素B2纯品作为对照品，收集富含原花青素B2的组分，并将其在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为10，原花青素B2含量为85.1％；
(5)Sephadex LH-20进行纯化：将(4)中得到的含有原花青素B2的组分进行Sephadex LH-20柱层析纯化，用体积百分比10％的甲醇进行洗脱，每10ml作为一个接受体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，以原花青素B2纯品作为对照品，收集富含原花青素B2的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06-0.08MPa减压浓缩，得到糖度为20的组分，冷冻干燥得到原花青素B2的纯品(219mg)。
Claims (6)
1.一种原花青素B2的提取方法，其特征是包括如下步骤：
(1)以松科松属植物的根、树皮、叶；或蔷薇科植物的根、茎、叶、果实、种子；或葡萄科葡萄属植物的根、茎、果实、种子；或豆科植物的茎或种皮为原料；向所述原料中加入4-10重量倍的水或4-10重量倍的体积百分比浓度为10％～95％的乙醇水溶液或4-10重量倍的10％～95％的甲醇水溶液，常压，70-95℃浸提取1～5小时，过滤，提取次数为1～5次，提取液合并静置至温度低于50度，弃沉淀，得上清液，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩至糖度2-40，得到提取物；
(2)将所述提取物以重量比为1∶1～10的比例分散至水中，经大孔树脂吸附，用水及体积百分比浓度为10％～95％的乙醇水溶液或水及体积百分比浓度为10％～95％的甲醇水溶液梯度洗脱，通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含原花青素B2的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，得糖度为10～40的浓缩物；
(3)将步骤(2)的产物进行聚酰胺树脂分离，用水及体积百分比浓度为20-95％的乙醇水溶液或水及体积百分比浓度为20-95％的甲醇水溶液梯度洗脱，通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含原花青素B2的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，得糖度为10-20的原花青素B2。
2.根据权利要求1所述的一种原花青素B2的提取方法，其特征是所述步骤包括：(4)将所述步骤(3)制备的原花青素B2进行ODS中低压柱层析，用水及体积百分比为10％-50％的甲醇水溶液梯度洗脱，通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，以原花青素B2纯品作为对照品，收集富含原花青素B2的组分，并将其在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，得糖度为10-20的原花青素B2。
3.根据权利要求2所述的一种原花青素B2的提取方法，其特征是所述步骤包括：(5)将所述步骤(4)制备的原花青素B2进行Sephadex LH-20柱层析纯化，用体积百分比10-30％的甲醇进行等浓度洗脱，通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，以原花青素B2纯品作为对照品，收集富含原花青素B2的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06-0.08MPa减压浓缩，得到糖度为10-20的组分，冷冻干燥得到原花青素B2。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种原花青素B2的提取方法，其特征是所述步骤(1)中过滤所用滤网的目数为80～120。
5.根据权利要求1或2或3所述的一种原花青素B2的提取方法，其特征是所述步骤(2)中所述大孔树脂为AB-8型、HP20型、HPD100型、HPD100A型、HPD300型、X-5型、NKA-II型、D101型或DA201型。
6.根据权利要求1或2或3所述的一种原花青素B2的提取方法，其特征是所述步骤(3)中所述的薄层层析检测方法采用聚酰胺薄膜，展开溶剂为体积比为4∶1∶3的正丁醇-醋酸-水，显色剂为重量百分浓度为5％三氯化铁乙醇溶液，与原花青素B2标准品对照。
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Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102093328A (zh) * | 2010-12-20 | 2011-06-15 | 大兴安岭林格贝有机食品有限责任公司 | 一种富集纯化松树皮中原花青素的方法 |
| CN102229631A (zh) * | 2011-05-03 | 2011-11-02 | 西安瑞联近代电子材料有限责任公司 | 一种从葡萄皮红中分离纯化锦葵花素葡萄糖苷的方法 |
| CN101633873B (zh) * | 2009-08-25 | 2012-07-18 | 天津市尖峰天然产物研究开发有限公司 | 添加原花青素b2的葡萄酒及制备方法 |
| CN103145680A (zh) * | 2013-03-05 | 2013-06-12 | 重庆海巨农业发展有限公司 | 一种萝卜原花青素二聚体的制备方法 |
| CN103333142A (zh) * | 2013-06-24 | 2013-10-02 | 天津市尖峰天然产物研究开发有限公司 | 一种维尼酚宁的提取方法 |
| WO2014054174A1 (ja) * | 2012-10-05 | 2014-04-10 | フジッコ株式会社 | 低重合度プロアントシアニジンの製法およびそれにより得られる低重合度プロアントシアニジン |
| CN104262314A (zh) * | 2014-09-12 | 2015-01-07 | 长春海涛天然色素有限公司 | 高纯度黑米花青素制备工艺 |
| CN104496957A (zh) * | 2014-12-01 | 2015-04-08 | 成都红柿子科技有限公司 | 一种从葡萄皮中提取原花青素的方法 |
| CN105153095A (zh) * | 2015-10-14 | 2015-12-16 | 新疆大学 | 一种从葡萄枝蔓中提取原花青素的方法 |
| CN105232803A (zh) * | 2015-11-10 | 2016-01-13 | 天津市尖峰天然产物研究开发有限公司 | 一种生产低农残高(-)-表儿茶素3-o-没食子酸酯含量的葡萄籽提取物的方法 |
| CN107057906A (zh) * | 2017-05-08 | 2017-08-18 | 乌鲁木齐上善元生物科技有限公司 | 一种富含原花青素的葡萄酒及其生产方法 |
| CN109796431A (zh) * | 2019-01-31 | 2019-05-24 | 河北三狮生物科技有限公司 | 一种提取花青素的方法 |
| CN110879269A (zh) * | 2019-12-10 | 2020-03-13 | 浙江尖峰健康科技有限公司 | 一种蔓越莓提取物的组合鉴别方法 |
| CN114605369A (zh) * | 2022-04-07 | 2022-06-10 | 西安天美生物科技股份有限公司 | 一种原花青素b2及其提纯方法和应用 |
| CN118026981A (zh) * | 2024-01-29 | 2024-05-14 | 宁波天鼎生物科技有限公司 | 一种低灭菌丹残留的葡萄籽提取物的制备方法 |
Families Citing this family (2)
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|---|---|---|---|---|
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| CN106543128A (zh) * | 2016-09-24 | 2017-03-29 | 合肥信达膜科技有限公司 | 一种花青素提取技术 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
2007
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Cited By (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101633873B (zh) * | 2009-08-25 | 2012-07-18 | 天津市尖峰天然产物研究开发有限公司 | 添加原花青素b2的葡萄酒及制备方法 |
| CN102093328A (zh) * | 2010-12-20 | 2011-06-15 | 大兴安岭林格贝有机食品有限责任公司 | 一种富集纯化松树皮中原花青素的方法 |
| CN102229631A (zh) * | 2011-05-03 | 2011-11-02 | 西安瑞联近代电子材料有限责任公司 | 一种从葡萄皮红中分离纯化锦葵花素葡萄糖苷的方法 |
| CN102229631B (zh) * | 2011-05-03 | 2014-06-18 | 西安瑞联近代电子材料有限责任公司 | 一种从葡萄皮红中分离纯化锦葵花素葡萄糖苷的方法 |
| WO2014054174A1 (ja) * | 2012-10-05 | 2014-04-10 | フジッコ株式会社 | 低重合度プロアントシアニジンの製法およびそれにより得られる低重合度プロアントシアニジン |
| CN103145680A (zh) * | 2013-03-05 | 2013-06-12 | 重庆海巨农业发展有限公司 | 一种萝卜原花青素二聚体的制备方法 |
| CN103333142A (zh) * | 2013-06-24 | 2013-10-02 | 天津市尖峰天然产物研究开发有限公司 | 一种维尼酚宁的提取方法 |
| CN104262314B (zh) * | 2014-09-12 | 2016-08-17 | 长春海涛天然色素有限公司 | 黑米花青素制备工艺 |
| CN104262314A (zh) * | 2014-09-12 | 2015-01-07 | 长春海涛天然色素有限公司 | 高纯度黑米花青素制备工艺 |
| CN104496957A (zh) * | 2014-12-01 | 2015-04-08 | 成都红柿子科技有限公司 | 一种从葡萄皮中提取原花青素的方法 |
| CN105153095A (zh) * | 2015-10-14 | 2015-12-16 | 新疆大学 | 一种从葡萄枝蔓中提取原花青素的方法 |
| CN105232803A (zh) * | 2015-11-10 | 2016-01-13 | 天津市尖峰天然产物研究开发有限公司 | 一种生产低农残高(-)-表儿茶素3-o-没食子酸酯含量的葡萄籽提取物的方法 |
| CN107057906A (zh) * | 2017-05-08 | 2017-08-18 | 乌鲁木齐上善元生物科技有限公司 | 一种富含原花青素的葡萄酒及其生产方法 |
| CN109796431A (zh) * | 2019-01-31 | 2019-05-24 | 河北三狮生物科技有限公司 | 一种提取花青素的方法 |
| CN110879269A (zh) * | 2019-12-10 | 2020-03-13 | 浙江尖峰健康科技有限公司 | 一种蔓越莓提取物的组合鉴别方法 |
| CN110879269B (zh) * | 2019-12-10 | 2022-04-08 | 浙江尖峰健康科技有限公司 | 一种蔓越莓提取物的组合鉴别方法 |
| CN114605369A (zh) * | 2022-04-07 | 2022-06-10 | 西安天美生物科技股份有限公司 | 一种原花青素b2及其提纯方法和应用 |
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| GR01 | Patent grant |