CN101081245A - 治疗心脑血管疾病的药物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种可有效用于治疗或缓解心脑血管疾病的药物组合物,其含有按药材干重计(0.01~100)∶(0.01~100)∶(0.01~100)的淫羊藿、黄芪和当归。更具体而言,本发明涉及可用于治疗或缓解缺血性脑血管病、脑血管病后遗症、冠心病或周围血管病的中药组合物、以及该中药组合物的提取物。
Description
技术领域
本发明提供一种可有效用于治疗或缓解心脑血管疾病的药物组合物。更具体而言,本发明涉及可用于治疗或缓解缺血性脑血管病、脑血管病后遗症、冠心病或周围血管病的中药组合物、以及该中药组合物的提取物。
背景技术
中风病是当今社会严重危害人类生命和健康的常见病,也是中老年人致死的主要原因之一。因此,提高中风病的诊断与治疗水平已成为临床工作者的主要任务之一。
近年来,各地运用中药复方治疗缺血性中风的越来越多。陈可冀(活血II号注射液治疗急性闭塞性脑血管病147例临床疗效观察,中西医结合杂志,1985,5(2):100~1018)等探讨了以活血II号注射液(由丹参、赤芍、红花、降香、川芎组成)进行治疗的效果。全国中风病急症科研协作组对以清开灵注射液治疗进行了临床观察(清开灵注射液治疗中风急症的临床研究,北京中医学院学报,1988,11(3):21~24)。
陈达仁等(陈达仁等,川芎和低分子右旋糖苷治疗急性脑缺血卒中的疗效观察,全国第3届活血化瘀研究学术会议资料,北京:学苑出版社,1990:43~45)观察治疗了134例患者。北京制药工业研究所等(北京制药工业研究所,川芎嗪治疗缺血性脑血管病218例报告,中华医学杂志,1977,57(8):467-469)机构以川芎嗪对700例患者进行了治疗。
由于缺血性中风在中风发病中占绝大多数,且对其的治疗尚无令人满意的切实可行的方法,因此,需要一种能够有效治疗缺血性中风,并可用于治疗或缓解各种心脑血管疾病症状的药物。
发明内容
本发明提供一种由淫羊藿、黄芪、当归组成的药物组合物,其中按药材干重计,淫羊藿、黄芪和当归之间的比例为(0.01~100)∶(0.01~100)∶(0.01~100),优选为(2~4)∶(2~4)∶(1~3),更优选为3∶3∶2。
本发明还提供一种制备淫羊藿、黄芪、当归提取物的方法,其包括:
1)用水煎煮上述药物组合物,其中按药材干重计淫羊藿、黄芪和当归的比例优选为(2~4)∶(2~4)∶(1~3)、更优选为3∶3∶2;
2)过滤并浓缩滤液,使其中淫羊藿苷含量≥0.002ng/ml、黄芪甲苷含量≥0.001ng/ml、阿魏酸含量≥0.001ng/ml、氯原酸含量≥0.003ng/ml。
此外,在上述制备淫羊藿、黄芪、当归提取物的方法中,还任选地包括以下步骤:
用醇沉淀所得浓缩的滤液,并取上清液;和/或
调节pH值;和/或
除去杂质和热原。
本发明还提供由如上所述方法制得的淫羊藿、黄芪和当归的提取物。
本发明还提供包含如上所述的提取物的药物组合物。该药物组合物可依据任何常规的工艺与适宜的载体、赋形剂及稀释剂一同配制为适宜的剂型。剂型可以为片剂、丸剂、散剂、小药囊、酊剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气雾剂、软或硬胶囊剂或无菌注射液的形式。
适宜的载体、赋形剂及稀释剂的实例为淀粉、蔗糖、乳糖、葡萄糖、明胶、山梨醇、甘露醇、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油;所述剂型中还可另外包括填充剂、抗凝集剂、崩解剂、助流剂、润湿剂、矫味剂、乳化剂、防腐剂等。本发明的药物组合物可通过应用任何本领域周知的工艺配制成用于在给药于哺乳动物后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。
在优选的具体实施方案中,包含所述提取物的药物组合物制备为用于非胃肠道给药的剂型。在更为优选的具体实施方案中,所述非胃肠道剂型为注射液。
附图说明
图1-2:光镜观察假手术组大鼠脑部病理组织学改变。
图3-5:光镜观察模型组大鼠脑部病理组织学改变。
图6-9:光镜观察受试注射液组大鼠脑部病理组织学改变。
图10-11:光镜观察川芎嗪组大鼠脑部病理组织学改变。
图12-15:电镜观察受试注射液组大鼠脑部超微结构改变。
图16-19:电镜观察川芎嗪组大鼠脑部超微结构改变。
图20-21:电镜观察模型组大鼠脑部超微结构改变。
图22-23:电镜观察假手术组大鼠脑部超微结构改变。
具体实施方式
本发明药物组合物中所用药材如下所示:
(1)淫羊藿:
本品为小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicormum Maxim.箭叶;淫羊藿Epimedium sagittatum(sieb.et Zucc.)的地上干燥部分。夏、秋茎叶茂盛时采割,除去粗梗及杂质,切成丝状(厚5-7cm)晒干或阴干。主产于湖北、四川、浙江等地。
(2)黄芪:
本品为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membrannaceus(Fisch.)Bge.Yar.mongholicus(Bge)或膜荚黄芪Astragalus membrannaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。春、秋二季采挖,除去根须及根头,晒干。主产于内蒙古、陕西、甘肃等地。
(3)当归:
本品为伞形科植物当归Angelica sinensis(Olivi.)Diels的干燥根。秋末采挖,除去根须及泥沙,待水分稍蒸发后,捆成小把,上棚,用烟火慢慢熏干,切片(厚1-2cm)。主产于四川、陕西、湖北等地。
在一个具体实施方案中,本发明提供按药材干重计淫羊藿、黄芪和当归的重量比优选为(2~4)∶(2~4)∶(1~3),更优选为3∶3∶2的药物组合物。
在另一具体实施方案中,本发明提供一种制备淫羊藿、黄芪、当归提取物的方法,其包括:
1)用水煎煮按药材干重计(0.01~100)∶(0.01~100)∶(0.01~100)、优选为(2~4)∶(2~4)∶(1~3)、更优选为3∶3∶2的淫羊藿、黄芪和当归;
2)过滤并浓缩滤液,使其中淫羊藿苷含量≥0.002ng/ml、黄芪甲苷含量≥0.001ng/ml、阿魏酸含量≥0.001ng/ml、氯原酸含量≥0.003ng/ml。
此外,在上述制备淫羊藿、黄芪、当归提取物的方法中,还任选地包括以下步骤:
用醇沉淀所得浓缩的滤液,并取上清液;和/或
调节pH值;和/或
除去杂质和热原。
在优选的具体实施方案中,制备本发明淫羊藿、黄芪和当归提取物的方法包括分三次煎煮所述重量比的淫羊藿、黄芪和当归;过滤并合并、浓缩滤液。
在另一优选的具体实施方案中,所述制备淫羊藿、黄芪和当归提取物的方法包括用醇沉淀所得浓缩滤液。在进一步优选的具体实施方案中,所述醇为乙醇。
在另一优选的具体实施方案中,所述制备淫羊藿、黄芪和当归提取物的方法包括将pH调节为约3~10。
在另一优选的具体实施方案中,所述制备淫羊藿、黄芪和当归提取物的方法包括用超滤法滤除杂质及热原。
在另一优选的具体实施方案中,所述制备淫羊藿、黄芪和当归提取物的方法包括以微孔滤膜除去杂质及热原。
在另一优选的具体实施方案中,所述制备淫羊藿、黄芪和当归提取物的方法在调节pH值之前进一步包括脱色步骤。在所述脱色步骤中,优选以活性炭进行脱色。
在另一优选的具体实施方案中,所述制备淫羊藿、黄芪和当归提取物的方法进一步包括回收用于沉淀滤液的醇的步骤。
在另一具体实施方案中,本发明提供由如上所述方法制得的淫羊藿、黄芪和当归的提取物。
在另一优选的具体实施方案中,本发明提供如上所述的各种药物组合物、或提取物在制备用于治疗或缓解心脑血管疾病的药物中的应用。
在另一优选的具体实施方案中,所述心脑血管疾病为缺血性脑血管病、脑血管病后遗症、冠心病或周围血管病。
在另一具体实施方案中,本发明淫羊藿、黄芪和当归提取物与淀粉、蔗糖、乳糖、葡萄糖、明胶、山梨醇、甘露醇、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油等赋形剂一同被配制为片剂、丸剂、散剂、小药囊、酊剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气雾剂、软或硬胶囊剂或无菌注射液的形式。
在更优选的具体实施方案中,本发明制剂为注射液的形式,并且更优选地为用于静脉滴注的注射液、静脉注射的注射液、肌肉注射的注射液、皮下注射的注射液、或长效储库型注射液的形式。
在进一步优选的具体实施方案中,所述注射剂的包装规格为每支0.05毫升至每支20000毫升。
在更优选的具体实施方案中,本发明制剂中还可另外包括填充剂、抗凝集剂、崩解剂、助流剂、润湿剂、矫味剂、乳化剂、防腐剂、pH调节剂、等渗调节剂等。
在另一优选的具体实施方案中,本发明的组合物可通过应用任何本领域周知的工艺配制成用于在给药于哺乳动物后提供活性成分的快速、持续或延迟释放的剂型。
在更为优选的具体实施方案中,包含所述提取物的药物组合物与本领域常用的赋形剂经本领域技术人员公知的技术制备为非胃肠道给药的剂型,优选为注射剂。
在更为优选的具体实施方案中,本发明组合物被制备为用于静脉输注的注射剂。
以下将通过具体实施例对本发明进行进一步的阐述。本领域技术人员应理解,尽管通过特定的实施方式对本发明进行具体阐述,但这些特定的实施方式决不应被理解为对本发明范围的限制。
实施例
实施例1-5制备组成如下的药物组合物:
淫羊藿(g) | 黄芪(g) | 当归(g) | |
实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5 | 2040253530 | 4020352530 | 3010251520 |
实施例6-9制备组成如实施例1-4中所述的药物组合物的提取物
将3种药材在30℃时加热烘干。称取处方所示的各药材,洗净。
将药材用适量水在不锈钢容器中煎煮3h,过滤并浓缩滤液。
实施例10制备组成如实施例5中所述的药物组合物的提取物
将3种药材在30℃时加热烘干。称取处方所示的各药材,洗净。
将药材用10倍量药材的水在不锈钢容器中煎煮三次,第一次2h,第二次、第三次为1.5h,过滤,合并三次滤液,浓缩。
实施例11淫羊藿、黄芪和当归提取物注射液的制备
如下所述分别制备三个批次的淫羊藿、黄芪和当归提取物注射液。
1)将3种药材在30℃时加热烘干,称取处方所示的各药材,洗净;
2)将药材用10倍量药材的水在不锈钢容器中煎煮三次,第一次2h,第二次、第三次为1.5h,过滤,合并三次滤液;
3)用浓缩装置将上述滤液浓缩至80ml;
4)在浓缩液中加入乙醇,使其浓度为75%,在约4-8℃下静置48小时,取上清液,加乙醇,使其浓度为60%,在4-8℃下静置48小时,取上清液;
5)任选将上述液体用蒸馏装置回收乙醇,(乙醇可以再用于提取药材),剩下的药液备用;
6)任选将药液脱色,将活性炭加入到药液中,煮沸15~30分钟,减少不必要的色素,用减压抽滤法滤去活性炭,药液备用;
7)加入10%的碳酸钠溶液使药液的pH为3~10,以适应注射液酸碱度的要求;
8)在无菌条件下将药液用超滤器进行超滤,除去杂质和热源;
9)在无菌条件下将超滤出来的药液灌入10ml的安剖中,封口。
试验例1实施例11中所制备注射液的安全性试验
一、溶血试验
1、2%红血球混悬液的制备
取兔血数毫升,放入盛有玻璃珠的三角瓶中振摇10分钟,除去纤维、蛋白质,使成脱纤血液,加10倍量的生理盐水,摇匀,离心,除去上清液,沉淀的红血球再用生理盐水如法洗涤三次,至上清液不显红色为止。将所得红血球用生理盐水配成2%的混悬液,供试验用。
2、试验方法
取试管6只,按下表配比量依次加入2%红细胞混悬液和生理盐水,混匀后,于37℃恒温箱放置半小时,然后分别加入不同量的药液(第6管为对照管)。摇匀后,置37℃恒温箱中。开始每隔15分钟观察一次,1小时后,每隔一小时观察一次,观察两小时。
3、结果判断:
从下表可知,在4小时内,各管中均不产生溶血作用。
表1
试管编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
2%红血球混悬液(ml)生理盐水(ml)实施例11注射液(ml)结果 | 2.52.00.5- | 2.52.10.4- | 2.52.20.3- | 2.52.30.2- | 2.52.40.1- | 2.52.5-- |
二、急性毒性试验
取小鼠20只(雌雄各半),以一日一次给小鼠静脉注射最大浓度(4.0克/毫升)的生药,最大体积(4.0毫升/20克体重)的药液后,连续观察7天,无死亡现象。
三、热原检查
按《中国药典》2000版)方法检查,符合规定。
试验例2注射液形式的含有淫羊藿、黄芪和当归提取物的药物组合物的药效试验
一、实施例11中所制备注射液对脑缺血大鼠血栓素A2、前列环素、内皮素、降钙素基因相关肽含量的影响
1、动物分组及给药方法
Wistar大鼠随机分为5组:假手术组、模型组、川芎嗪组(53.3mg/kg体重)、大剂量受试注射液组(10ml/kg体重)、小剂量受试注射液组(5ml/kg体重),每组各10只。前两组分别腹腔注射生理盐水(10ml/kg体重),后三组用相应药物腹腔注射,每日1次,14天后分别作假手术和脑缺血模型。
2、造模
模型组、川芎嗪组、两受试注射液组大鼠用盐酸氯胺酮(1ml/100g)麻醉后,仰卧固定,切开颈前皮肤,沿气管两侧分离出左右颈总动脉,并在动脉下穿线,准备结扎,翻转大鼠,以脑立体定位仪俯卧固定大鼠头颈部,在枕骨后第1、2颈椎的位置做一约1cm长切口,从中央向两侧分离背阔肌和斜方肌,然后分离暴露第1颈椎的横突翼,并找到左横突孔(椎动脉在入脑前从此处通过)。用一直径约8.5mm的电凝针插入横突孔,将左椎动脉电凝后立即翻转大鼠,迅速结扎两侧颈总动脉,即造成急性不完全性脑缺血动物模型。选模后将两受试注射液组立即再腹腔注射实施例11中所制备注射液10ml/kg体重、5ml/kg体重,川芎嗪组腹腔注射川穹嗪注射液53.3mg/kg体重。假手术组仅分离颈总动脉和椎动脉,不作结扎及电凝。造模后1小时各组动物腹主静脉取血,然后立即断头取脑。
3、观察指标与方法
1)血浆TXB2、6-keto-PGF1α测定方法
快速腹主静脉取血3ml,注入含消炎痛-EDTA·Na2 0.2ml的塑料试管内,混匀,4℃离心3500rpm 15分钟,分离血浆,放上-20℃以下保存待测。
2)脑组织TXB2、6-keto-PGF1α测定
快速取右大脑皮质约20mg置微型匀浆器中,加无水乙醇0.1ml研磨,再加主理盐水0.9ml充分研磨制成匀浆,倒入试管,-20℃以下存放待测。
3)血浆ET、CGRP测定
腹主静脉取血2ml,注入含10%EDTA二钠30μl和抑肽酶40μl的试管中混匀。4℃3000rpm离心10分钟,分离血浆,取上清,-20℃以下存放待测。
4)脑组织ET、CGRP测定
取右大脑皮质约100mg,尽快放入含0.1mol/l HAC 1ml的微型匀浆器中略作碾磨,然后在100℃水浴中煮沸10分钟,再次碾磨制成匀浆,在4℃下3000rpm离心15min,取上清-20℃以下存放待测。
5)统计方法:整理所得数据,采用t检验分析
4、实验结果
1)对血浆TXB2和6-keto-PGF1α水平的影响(平均值±标准差)
表2
组别 | 例数 | TXB2 | 6-keto-PGF1α | TXB2/6-keto-PGF1α |
假手术组模型组川芎嗪组大剂量组小剂量组 | 1010101010 | 1625.39±109.752380.79±113.75△△2189.21±252.11*1995.68±175.34**2003.21±163.76** | 1359.72±299.60578.33±161.57△△808.98±258.94*977.06±251.44**841.57±231.84** | 1.25±0.274.44±1.34△△2.90±0.75*2.23±0.83**2.54±0.70** |
△△表明与假手术组P<0.01。
*表明与模拟组相比,P<0.05。
**表明与模拟组相比,P<0.01。
其中,各受试注射液组与川芎嗪组相比较,虽然TXB2和TXB2/6-keto-PGF1α水平有下降趋势而6-keto-PGF1α水平有上升趋势,但其差异无统计学意义(P>0.05)。
以上结果表明,川芎嗪组及各受试注射液组均有明显改善TXA2-PGI2平衡失调的作用,从而抑制血小板聚集,且各受试注射液组与川芎嗪组作用无明显差异。
2)对脑组织TXB2和6-keto-PGF1α水平的影响(平均值±标准差,pg/ml)
表3
组别 | 例数 | TXB2 | 6-keto-PGF1α | TXB2/6-keto-PGF1α |
假手术组模型组川芎嗪组大剂量组小剂量组 | 1010101010 | 664.51±168.651126.29±203.05△△924.55±200.30*826.78±182.08**901.30±190.60* | 318.85±56.29143.64±42.34△△204.73±64.68*237.63±57.15**190.29±55.45* | 2.13±0.718.50±3.00△△5.23±1.82*3.72±1.38**5.17±1.43* |
△△表明与假手术组P<0.01。
*表明与模拟组相比,P<0.05。
**表明与模拟组相比,P<0.01。
其中,各受试注射液组与川芎嗪组相比较,TXB2和TXB2/6-keto-PGF1α含量差异无统计学意义(P>0.05)。
以上结果表明,川芎嗪组及各受试注射液组均可降低缺血脑组织TXA2水平,提高PGI2水平,调节TXA2-PGI2平衡,其疗效与川芎嗪组相当。
3)各组血浆中ET、CGRP含量的变化(平均值±标准差,pg/ml)
表4
组别 | 例数 | ET | CGRP |
假手术组模型组川芎嗪组大剂量组小剂量组 | 1010101010 | 130.10±30.16254.36±50.39△△207.20±46.45*157.23±24.31**##165.46±37.44**# | 452.86±42.36318.68±45.83△△328.89±59.13399.03±52.78**#385.17±50.22**# |
△△表明与假手术组P<0.01。
*表明与模拟组相比,P<0.05。
**表明与模拟组相比,P<0.01。
#表明与川芎嗪组相比,P<0.05。
##表明与川芎嗪组相比,P<0.01。
各受试注射液组之间差异无显著意义。
以上表明,各受试注射液组均可明显改善ET、CGRP代谢,川芎嗪组虽可降低脑缺血后ET水平,但改善CGRP作用不明显,可见,各受试注射液组均优于川芎嗪组。
4)各组脑组织中ET、CGRP含量的变化(平均值±标准差,pg/ml)
表5
组别 | 例数 | ET | CGRP |
假手术组模型组川芎嗪组大剂量组小剂量组 | 1010101010 | 17.65±3.9934.94±4.70△△30.12±5.42*22.72±4.63**##26.26±4.41**# | 2196.99±433.161157.41±199.56△△1435.93±195.27**1832.87±317.04**##1731.87±209.26**# |
△△表明与假手术组P<0.01。
*表明与模拟组相比,P<0.05。
**表明与模拟组相比,P<0.01。
#表明与川芎嗪组相比,P<0.05。
##表明与川芎嗪组相比,P<0.01。
各受试注射液组之间差异无显著意义。
以上表明,各受试注射液组均可明显改善ET、CGRP代谢,且作用均优于川芎嗪组。
二、实施例11中所制备注射液对脑缺血性大鼠模型脑系数和脑组织含水量的影响
1、动物分组及给药方法
Wister种大鼠随机分为四组:假手术组10只,不给药,仅进行假手术,模型组10只,不给药,仅造脑缺血模型。受试注射液组10只,腹腔注射实施例11中所制备注射液10毫升/公斤体重,每日1次。川芎嗪组10只,腹腔注射川芎嗪注射液53.3毫克/公斤体重,每日1次,共给药14天,14天后造脑缺血模型。
2、造模
受试注射液组、模型组、川芎嗪大鼠组大鼠用盐酸氯胺酮腹腔麻醉(1毫升/100克)后,仰卧固定。切开颈前皮肤,沿气管两侧分离出左右颈总动脉,并在动脉下穿线,准备结扎。翻转大鼠,以自制脑立体定位仪俯卧固定大鼠头颈部,在枕骨后第1、2颈椎的位置作一约1厘米长切口,从中央向两侧分离背阔肌和斜方肌,然后分离暴露第一颈椎的横突翼,并找到左横突孔(椎动脉在此入脑前从此孔通过),用一个直径约0.5毫米的电凝针插人横突孔,将左椎动脉电凝后立即翻转大鼠迅速结扎两侧颈总动脉,即造成急性不完全性脑缺血动物模型。造模后,受试注射液组立即再腹腔注射实施例11中所制备注射液10毫升/公斤体重,川芎嗪组腹腔注射川芎嗪注射液53.3毫克/公斤体重。假手术组仅分离颈总动脉和椎动脉,不作结扎及电凝。
3小时后断头处死动物,迅速取出脑组织,沿大脑半球后极横切,去除切面以下部分,立即在万分之一分析天平上称出湿重,按公式(湿重-干重)/干重×100%计算出脑组织含水量,脑系数=脑重/体重×100%,计算出脑系数,再用滤纸吸去脑表面液体,将脑置于干燥箱中于110℃干燥到恒重。
3实验结果
1)瞳孔与眼征的改变
根据处理前与处理后15分钟、30分钟,1、2、3小时的定时观察记录,有如下发现:
假手术组:所有大鼠双侧瞳孔均没有出现不等大情况,对光反应灵敏,无迟顿或减弱现象。
模型组:4只大鼠双侧瞳孔出现不等大,其中有二只大鼠瞳孔对光反应消失,5只大鼠对光反应迟钝(含4只大鼠)。
川芎嗪组:2只大鼠双侧瞳孔出现不等大,3只大鼠对光反应减弱。
受试注射液组:所有大鼠均没有出现瞳孔不等大,其中2只大鼠对光反应稍减弱,另一只大鼠出现双侧瞳孔对光反应一过性消失(约20秒)随后恢复正常。
表6
分组 | 例数 | 脑系数% | 脑组织含水量(%) |
假手术组模型组川芎嗪组受试组 | 10101010 | 0.67±0.070.69±0.050.67±0.040.65±0.06 | 78.4±0.7*80.1±0.878.8±0.9*78.6±0.6* |
*表示经t检验与模型组相比P<0.05。
各组与假手术组比较,脑缺血动物脑系数的变化无明显差异,模型组与假手术组比较,脑组织含水量明显增加,且有显著性差异(P<0.05)提示脑缺血缺氧时有脑水肿出现,受试注射液组、川芎嗪组与模型组比较,有显著性差异(P<0.05),提示二组均有明显降低缺血脑组织含水量,改善脑水肿作用。川芎嗪组与受试注射液组降低缺血脑组织含水量作用相似,二者比较无统计学意义。
三、实施例11中所制备注射液对脑缺血大鼠模型血液流变学的影响
1.主要实验仪器
NZ-6型锥板式粘度计,天津分析仪器厂生产
XSN-R型体外血栓形成血小板粘附两用仪,江苏无锡电子仪器二厂生产。
DXC-200型核孔滤膜红钿胞变形能力测定仪,日本光电公司生产。
Olympus双目光学显微镜,Olympus公司生产。
2.实验观察指标
A、全血粘度:测定全血在切变率为1S、5S、50S、100S的粘度
B、红细胞聚集指数(A.I):用Ditanfass公式计算A.I=μ1/μ2本试验A.I=μ1/μ100。
C、红细胞变形能力测定:用红细胞滤过率体现,用核孔滤漠法测定红细胞滤过率。
D、红细胞压积(HCT)测定:毛细管压积法。
E、血浆纤维蛋白原含量:双缩服法
F、血小板聚集率[A(I)%,A(max)%]测定:Bom氏比浊法。
G、光镜观察血小板的形态
3.统计学处理:所有数据均用均数±标准差(x±s)表示,多个样本均数的两两比较用q检验。
4.实验结果
造模三小时后,大鼠仰卧固定,从腹正中线皮肤切开腹腔,使腹主动脉暴露用注射器吸出5毫升血液,采用肝素抗凝,立即送交化验。
1)对大鼠血液流变学指标的影响
a:对不同切变率下全血粘度的影响
表7各组不同切变率下全血粘度
组别 | 例数 | 全血粘度 | |||
1s-1 | 2s-1 | 50s-1 | 100s-1 | ||
假手术组模型组川芎嗪组受试组 | 15151515 | 47.97±4.6851.92±5.74*31.67±5.08**△△31.43±4.90**△△ | 20.08±1.9421.63±2.19*17.84±1.77**△△18.23±1.71**△△ | 8.69±0.049.16±0.76*8.26±0.4**△△8.55±0.42△ | 7.23±0.377.63±0.64*6.88±0.46*△△7.25±0.51# |
与假手术组比较:*P<0.05 **P<0.01
与模型组比较:△p<0.05 △△p<0.01
与川芎嗪组比较:#P<0.05
由上表可见:模型组全血粘度在各切变率下均明显高于假手术组,二者间有显著性差异(P<0.05)。表明脑缺血后,血液成分改变,全血粘度增高,有凝固倾向。川芎嗪组与模型组比较,各切变率下全血粘度均明显降低,且有极显著性差异(P<0.01),受试注射液组在切变率IS、5S、50S时均低于模型组。并具有显著性差异(P<0.01,P<0.05),但在100S时,二者无显著性差异,受试注射液组在100S全血粘度高于川芎嗪组,并有显著性差异(P<0.05),由上可知,受试注射液组与川芎嗪组均有显著改善全血粘度的作用。
b:对大鼠血浆纤维蛋白原,血小板聚集率的影响
表8各组血浆纤维蛋白原,血小板聚集率
组别 | 例数 | 纤维蛋白原(mg%) | 血小板聚集率 | |
A(1)(%) | A(max)(%) | |||
假手术组模型组川芎嗪组受试组 | 15151515 | 672.87±17.92689.74±24.01*561.48±19.60**△△553.16±15.12**△△ | 67.42±1.2068.54±1.73*67.03±1.77△△68.29±1.45# | 69.80±1.5771.19±1.85*70.04±1.4870.62±1.60 |
与假手术组比较:*P<0.05 **P<0.01
与模型组比较:△△P<0.01
与川芎嗪比较:#P<0.05
表8显示:模型组血浆蛋白原含量及血小板聚集率均高于假手术组,二者有显著性差异(P<0.05),提示脑缺血后血浆粘度增高,血小板聚集性增强,受试注射液组和川芎嗪组的血浆纤维蛋白原量均低于模型组,且有极显著性差异(P<0。01),川芎嗪组血小板一分钟聚集率显著低于模型组,二者有极显著差异(P<0.01),受试注射液组血小板聚集率与模型组无显著差异,由上可知:受试注射液组和川芎嗪组均有显著降低血浆粘度作用,川芎嗪组还可降低血小板聚集率。
2)血小板形态观察
假手术组:多数血小板为盘形,圆形或椭圆形,表面光滑,有的细胞表面可见到短小的突起,细胞大小较均匀一致。
模型组:血小板形态多样,发生粘性变形呈球形,细胞表面不规则,皱折较多,体积增大的血小板比例增多,许多血小板伸出长伪足,或相邻细胞以伪足互相联系,血小板粘附,聚集性增强,聚集体中参与的细胞数量多,有的血小板崩解融合,细胞间无明显界线,形成较大的实体性团块,伪足肿胀增粗,相互缠绕。
受试注射液组:血小板形态基本正常,形成明显伪足的细胞减少。
川芎嗪组:血小板形态基本正常,有部分细胞出现明显伪足现象,偶尔可见到较小的聚集体,细胞间较疏松,可辨认出细胞间界线及细胞膜的形态。
四、实施例11中所制备注射液对脑缺血大鼠模型病理组织学和超微结构的影响
1.仪器
H-600型透射电子显微镜(日本日立公司)
2.光镜观察
造模三小时后,将各组试验动物断颈处死,立即剥离并取出大脑固定于10%福尔马林溶液中、72小时后,切取大脑组织块2毫米左右厚度,制作病理组织切片备用,按常规脱水、透明、包埋、切片其厚度为4微米,HE染色法,于光学显微镜下观察,其结果分述如下:
假手术组:大鼠脑组织结构正常,无水肿,神经细胞的胞浆丰富,核膜清楚,核仁明显,神经胶质细胞核仁清晰,胞浆透亮或染,细胞膜及核膜清楚,毛细血管和小血管腔较窄,或是一道缝隙。见图1-2。
模型组:大鼠脑组织主要于大脑皮质,海马等区域病理改变比较明显,该区域可见组织明显灶性水肿,神经细胞的胞浆和胞核界线不清,核固缩成三角形,核仁消失,着色过深,整个胞体变小。于水肿区:少数血管扩张、充血、神经细胞、胶质细胞、毛细血管及小血管周围的间隙明显增宽,小血管闭塞,周围有少许薄薄红染液体渗出,间质疏松,神经胶质细胞肿胀,胞浆亮度加大,室管膜周围的神经细胶质细胞较明显。见图3-5。
受试注射液组:大鼠脑组织神经细胞固缩及深染较模型组有较大的减轻,神经胶质细胞肿胀及间质疏松程度也轻于模型组。见图6-9。
川芎嗪组:大鼠脑神经细胞、胶质细胞的病理改变,与受试注射液组比较效果略差。见图10-11。
3.脑组织损伤程序主要观察大脑皮质,海马、海马回的神经细胞,现根据神经细胞损伤的不同表现分4级:
一级:无病变,神经细胞核仁清晰可见、细胞清楚,细胞核染色适中。
+级:轻度病变,胞核及胞浆有些不清,核仁模糊,胞体轻度固缩,胞体变小不明显。
++级:中度病变,大部分细胞核仁消失,核膜不清,核轻度固缩,少数成三角形,核染色较深,胞体变小。
+++级:重度病变,病理改变更广泛、更重。胞浆、胞核界线明显不清,核固缩成三角形,核着色深染,个别神经细胞坏死,或个别神经细胞,纤维轴索肿胀、断裂,呈串珠状,多数神经细胞小血管周围增宽明显。
白质的损伤主要表现为轴索肿胀,髓鞘脱失、软化及出血水肿等,按损伤程度及范围依次分为轴索肿胀+级、髓鞘脱失++级、软化及出血水肿+++级,无损伤者均标记一。
表9顶叶灰质(小椎体细胞)
受损程度分级 | 假手术组 | 模型组 | 川芎嗪组 | 受试组 | 合计 |
-++++++ | 2530 | 0144 | 0531 | 0531 | 216136 |
合计 | 10 | 9 | 9 | 9 | 37 |
表10海马及海马回
受损程度分级 | 假手术组 | 模型组 | 川芎嗪组 | 受试组 | 合计 |
-++++++ | 2530 | 0027 | 0252 | 0441 | 2111410 |
合计 | 10 | 9 | 9 | 9 | 37 |
表11大脑白质
受扣程度分级 | 假手术组 | 模型组 | 川芎嗪组 | 受试组 | 合计 |
-++++++ | 5410 | 0342 | 1422 | 0541 | 216114 |
合计 | 10 | 9 | 9 | 9 | 37 |
注:秩和检验:
受试注射液组、川芎嗪组神经细胞损伤程度相似,但二者无统计学意义,P>0.05,受试注射液组与假手术组相比,有统计学意义P<0.05,受试注射液组与模型组相比差异明显P<0.05,提示:受试注射液对实验大鼠脑缺血神经细损伤有一定的保护作用。
4.电镜超微结构改变
取大脑皮层顶叶脑组织一小块,置2.5%戌二醛溶液中,PBS洗涤,再用1.5%锇酸固定,PBS洗涤,乙醚逐渐脱水,甲环氧树脂包埋,超薄切片,在日立H-600型电子显微镜下观察拍片。其结果分述如下:
受试注射液组:部分线粒体排列不规则,少见絮状致密物,双层体膜基本完好,部分嵴缺失、鞘板松解。见图12-15。
川芎嗪组:少部分线粒体水肿、嵴断裂、紊乱,少数内嵴紊乱,有致密物质沉积。见图16-19。
模型组:线粒体大部分空泡状,嵴排列紊乱,体膜部分溶解,消失,部分神经元细胞器结构崩解,神经轴突内微管系统紊乱,鞘板松解。见图20-21。
假手术组:细胞核膜完整,核膜孔清晰可见,线粒体内嵴排列规则,可见神经胶质细胞,溶酶体,核糖体,高尔基复合体,内质网,线粒体双层膜清晰,内嵴与纵轴垂直,标准排列。见图22-23。
五、实施例11中所制备注射液对鼠脑缺血再灌注NO、ET、Ca2+及水含量的影响
1.动物分组及给药方法
Wistar大鼠随机分为6组:假手术组、模型组、川芎嗪组(1.33ml/kg体重)、受试注射液小剂量组(3.34ml/kg体重)、中剂量组(5.02ml/kg体重)、大剂量组(6.67ml/kg体重),每组各10只,后四组分别用相应药物尾静脉注射,每日1次,3天后分别作假手术和脑缺血再灌注损伤模型。
2.造模方法
模型组、川芎嗪组、受试注射液小、中、大剂量组大鼠用25%乌拉坦(100ml/kg体重)腹腔注射麻酸,仰卧固定,切开颈前皮肤,分离暴露两侧颈总动脉,并分别置线备用,翻转大鼠,以脑立体定位仪俯卧固定大鼠头颈部,在枕骨后第1、2颈椎的位置做一约1cm长切口,从中央向两侧分离背阔肌和斜方肌,借助于手术显微镜充分暴路第一颈椎横突孔,用一直径为0.5mm的电凝针插入横突孔将两侧椎A电凝,永久性阻断椎动脉血流,立即翻转大鼠,用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉30分钟,此时脑供血全部中断造成全脑缺血模型;移去双侧动脉夹60分钟,造成再灌注60分钟动物模型[7]。造模后受试注射液小、中、大剂量组立即分别再舌下静脉注射受试注射液3.34ml/kg体重、5.02ml/kg体重、6.67ml/kg体重;川芎嗪组舌下静脉注射川芎嗪注射液1.33ml/kg体重。假手术组仅分离颈总动脉,不作结扎和电凝。实验动物于缺血30分钟、再灌注60分钟后分别腹主动脉取血,然后立即断头取脑。
3.观察指标与方法
1)血清NO测定方法
缺血30min及再灌注60min后,分别腹主动脉取血2ml注入塑料试管中。4℃2000rpm离心10分钟,分离血清,-20℃以下冰箱中保存待测。
2)血浆ET测定方法
缺血30min及再灌注60min后,分别腹主动脉取血1ml注入含10%EDTA·Na21ul和抑肽酶10ul的塑料试管内,混匀,4℃3000rpm离心15分钟,分离血浆,-20℃以下冰箱中保存待测。
3)脑组织Ca2+含量及水含量测定
快速取出全脑,弃去嗅球,沿大脑半球后极横切,去除切面以下部分,用滤纸吸干表面水分,在万分之一分析天平上称湿重,然后置105℃烘箱烤干,称取干重,按公式(湿重-千重)÷湿重×100%计算出脑组织水含量。然后取一定量干燥脑组织,加混合酸溶化,放置24小时后,于电热板上加热至无色透明且冒白烟,冷却定容,将样品蒸干至无色透明状,于GBC-90AA型原子吸收分光光度计测定Ca2+含量。
4)统计学处理
数据采用Office2000专业版Microsoft Excel统计软件进行处理。各组测定值均以均数±标准差(平均值±标准差)表示,两组均数之间比较采用t检验法。
4.结果
1)各组大鼠CIRI时血清NO含量的变化
表12各组对CIRI的大鼠血清NO含量的影响(平均值±标准差,μmol/l)
组别 | 例数 | 缺血30min | 再灌注60min |
假手术组模型组川芎嗪组受试注射液小剂量组受试注射液中剂量组受试注射液大剂量组 | 101010101010 | 11.66±3.8420.83±5.94△11.76±4.16**14.16±5.17*12.66±5.04**12.16±4.16** | 11.96±4.2426.49±4.97△15.20±4.19**18.33±4.12*17.50±4.53**15.50±4.84** |
注:与假手术组比较,△P<O.01
与模型组比较,*P<0.05**P<0.01
表12显示:缺血30min及再灌注60min后,模型组大鼠血清NO含量明显高于假手术组,差异有显著性(P<0.01),用药后,川芎嗪组及受试注射液小、中、大剂量组NO含量均明显低于模型组,差异有显著性(P<0.05-0.01),受试注射液各剂量组NO含量与川芎嗪组比较,无统计学意义(P>0.05)。
2)各组大鼠CIRI时血浆ET含量的变化
表13各组对CIRI的大鼠血浆ET含量的影响(平均值±标准差,pg/ml)
组别 | 例数 | 缺血30min | 再灌注60min |
假手术组模型组川芎嗪组受试注射液小剂量组受试注射液中剂量组受试注射液大剂量组 | 101010101010 | 30.55±3.649.79±7.84△36.61±6.24**41.69±8.80*39.80±6.44*34.32±5.44** | 30.65±4.2758.85±7.10△40.75±7.12**46.53±9.09*44.69±8.79*38.15±5.18** |
注:与假手术组比较,△P<0.01
与模型组比较,*P<0.05 **P<0.01
表13显示:模型组大鼠血浆ET含量明显高于假手术组,差异有显著性(P<0.01),而用药后各组ET含量均显著下降,与模型组比较,差异有显著性(P<0.05~0.01),受试注射液各剂量组ET含量与川芎嗪组比较,无统计学意义(P>0.05)。
3)各组大鼠CIRI时脑组织钙及水含量的变化
表14各组对CIRI时大鼠脑组织钙及水含量的影响(平均值±标准差)
组别 | 例数 | Ca2+(ug/g) | 水含量(%) |
假手术组模型组川芎嗪组受试注射液小剂量组受试注射液中剂量组受试注射液大剂量组 | 101010101010 | 104.49±14.83221.55±88.26△109.44±28.46**143.94±69.18*131.63±48.40**124.52±26.02** | 65.44±6.2181.43±7.38△69.29±7.13**72.79±8.84*70.68±7.51*67.80±6.98** |
注:与假手术比较,△P<0.01
与模型组比较,*P<0.05 **P<0.01
表14显示:模型组脑组织钙含量及水含量明显高于假手术组,差异有显著性(P<0.01):用药后各组脑组织钙含量及水含量均显著降低,差异有显著性(P<0.05~0.01),受试注射液各剂量组钙含量及水含量与川芎嗪组比较,无统计学意义(P>0.05)。
六、实施例11中所制备注射液对全脑缺血再灌注大鼠脑组织含水量、血清TNF-α、IL-1、IL-6含量的影响
1.实验方法
1)动物分组及给药方法
Wistar大鼠随机分为6组:假手术组(J)、模型组(M)、川芎嗪组(26.6mg/kg体重)、受试注射液低剂量组(XL)(3.38ml/kg体重)、受试注射液中剂量组(XM)(5.02ml/kg体重)、受试注射液高剂量组(XH)(6.70ml/kg体重),每组各10只。前两组分别尾静脉永注射生理盐水(6.70ml/kg体重)。后四组用相应药物尾静脉注射,日1次,连用5天后造模。
2)造模方法
参照Pulsinelli四血管闭塞法制作全脑缺血/再灌注模型,将人鼠用25%乌拉坦注射液按0.4ml/100g剂量腹腔注射麻醉后,仰卧固定,切开颈前皮肤,沿气管两侧分离出左右颈总动脉(CCA),并在动脉下穿线备用。然后翻转大鼠,以脑立体定位仪俯卧固定大鼠头颈部,在枕骨后第1、2颈椎的位置做一长约1cm切口,从中央向两侧分离颈阔肌和斜方肌,分离暴露第一颈椎的横突翼,并找到双侧横突孔(椎动脉在入脑前从此通过)。将电凝针依次插入双侧横突孔,立即翻转大鼠,迅速用套有硅胶的动脉夹夹闭双侧颈总动脉,造成急性全脑缺血。立即采用脑电图机监测脑电活动,以在60秒内脑电活动基本停止,波型接近一直线,翻正反射消失,双侧瞳孔放大,呼吸加深但能自主呼吸为模型成功标志。30分钟后腹主动脉取血2ml,然后开放CCA再灌注60分钟后腹主动脉取血2ml,立即断头取出脑组织。
2指标测定与方法
1)脑组织含水量的测定
取出脑组织后,立即在万分之一分析天平上称取湿重,然后放入电热恒温干燥箱内烘干48小时称干重,脑含水量测定采用以下公式计算:脑含水量=(湿重-干重)÷湿重×100%。
2)血清TNF-α的测定
将两次取血样品立即4℃离心3500rpm,20分钟,分离血清,放-20℃以下保存待测。
3)血清IL-1的测定
将两次取血样品立即4℃离心3500rpm,20分钟,分离血清,放-20℃以下保存待测。
4)血清IL-6的测定
将两次取血样品立即4℃离心3500rpm,20分钟,分离血清,放-20℃以下保存待测。
以上三种细胞因子的测定,采用放射免疫分析法,取聚本乙烯试管编号,按各自RIA加液程序配液、混匀,室温放置20min后,4℃离心3500rpm,25min,吸弃上清液,在γ计数器上测定放射性。由自动γ计数器预先编制程序,根据有关参数及标准曲线,得出样品浓度。
3.统计方法
所有数据以均数±标准差(X±S)表示,采用t检验分析。
4.结果
1)受试注射液对全脑缺血再灌注大鼠脑含水量的影响。
表15全脑缺血再灌注大鼠及含水量的变化(平均值±标准差,%)
组别 | n | 脑含水量 |
JMYXLXMXH | 101010101010 | 65.44±6.2181.43±7.38**69.29±7.13△△72.79±8.84△70.68±7.51△67.80±6.98△△ |
与J比较**P<0.01
与M比较△P<0.05 △△P<0.01
表15示:M组脑含水量明显高于J组,两组比较具有非常著性差异(P<0.01),提示脑缺血再灌注后脑组织水肿明显。XH、XM、XL及Y组脑含水量均明显低于模型组(P<0.05),而XH、XM、XL组之间以及与Y组比较均无明显差异(P<0.05),说明XH、XM、XL组与Y组均能明显降低脑含水量,XH、XM、XL组与Y组作用大致相当。
2)实施例11中所制备的注射液对全脑缺血再灌注大鼠血清TNF-α的影响
表16全脑缺血再灌注大鼠血清TNF-α含量的变化(平均值±标准差,ng/ml)
组别 | N | 缺血30min | 再灌60min |
JMYXLXMXH | 101010101010 | 1.620±0.2392.682±0.309*2.310±0.300△2.321±0.309△2.063±0.239△△#2.094±0.340△△# | 1.822±0.4144.098±0.205**☆☆☆3.774±0.341△3.746±0.357△2.987±0.277△△##2.979±0.445△△## |
与J比较术*P<0.01 **P<0.001
与缺血30min比较☆☆☆P<0.001
与同一时间M比较△P<0.05 △△P<0.01
与Y比较#P<0.05 ##P<0.01
表16显示:全脑缺血30min和再灌60minM组TNF-α含量明显高于J组(P<0.001),再灌注60minM组与缺血30minM组比较有极其显著性差异(P<0.001),提示全脑缺血后丁TNF-α即开始分泌表达,再灌注后表达更加明显。缺血30minY、XL组与M细比较具有显著性差异(P<0.05),XM、XH与M组比较具有极显著性差异(P<0.01),XM、XH与Y组比较具有显著性差异(P<0.05),而XL与Y组比较则无显著性差异(P>0.05);再灌注60minY、XL与M组比较有显著性差异(P<0.05),XM、XH与M组比较具有极显著性差异(P<0.01),XM、XH与Y组比较有极显著差异(P<0.01)。而XL与Y组比较则无明显差异(P>0.05)。这说明Y、XL、XM、XH均能明显降低全脑缺血和再灌注大鼠血清中TNF-α的含量,XL与Y作用大致相当,而XM、XH则明显优于Y。
3)受试注射液对全脑缺血再灌注大鼠血清IL-1的影响
表17全脑缺血再灌注大鼠血清IL-1含量的变化(平均值±标准差,ng/ml)
组别 | N | 缺血30min | 再灌60min |
JMYXLXMXH | 101010101010 | 0.497±0.1121.010±0.112**0.864±0.112△0.860±0.116△0.699±0.123△△#0.588±0.131△△## | 0.589±0.1091.593±0.417**☆☆1.153±0.211△1.126±0.172△0.896±0.128△△#0.837±0.134△△## |
与J比较**P<0.01
与缺血30min比较☆☆P<0.01
与同一时间M比较△P<0.05△△P<0.01
与Y比较#P<0.05##P<0.01
表17显示:全脑缺血30min和再灌60minM组IL-1含量明显高于J组(P<0.01),再灌注60minM组与缺血30minM组比较有极显著性差异(P<0.01),提示全脑缺血后IL-1即开始分泌表达,再灌注后表达更加明显。缺血30min XL、Y组与M组比较具有显著性差异(P<0.05),XM、XH组与M组比较则差异极其显著(P<0.01),且XM组与Y组比较具有显著性差异(P<0.05),XH与Y组比较差异极其显著(P<0.01),而XL与Y组比较则无显著性差异(P>0.05);再灌注60min XL、Y与M组比较有显著性差异(P<0.05),XM、XH与M组比较具有极显著性差异(P<0.01),XM与Y组比较具有显著性差异(P<0.05),XH与Y组比较具有极显著性差异(P<0.01),而XL与Y组比较则无显著性差异(P>0.05),说明Y、XL、XM、XH均能明显降低全脑缺血和再灌注大鼠血清中IL-l的含量,XL与Y作用大致相当,而XM、XH则明显优于Y。
4)实施例11中所制备的注射液对全脑缺血再灌注大鼠血清IL-6的影响
表18全脑缺血再灌注大鼠血清IL-6含量的变化(平均值±标准差,pg/ml)
组别 | N | 缺血30min | 再灌60min |
JMYXLXMXH | 101010101010 | 57.93±15.58108.12±23.60**68.23±19.68△△80.18±18.22△71.49±13.09△△67.69±11.89△△ | 70.92±13.251149.20±317.49***☆☆☆503.32±131.05△△787.08±223.03△#504.62±119.13△△515.71±112.21△△ |
与J比较**P<0.01 ***P<0.001
与缺血30min比较☆☆☆P<0.001
与同一时间M比较△P<0.05 △△P<0.01
与Y比较#P<0.05
表18显示:全脑缺血30min和再灌注60minM组IL-6的含量明显高于J组(P<0.01,P<0.001),再灌注60minM组与缺血30minM组比较有极显著性差异(P<0.01),提示全脑缺血后IL-6即开始分泌表达,再灌注后表达更加明显。缺血30min,XL与M比较具有显著性差异(P<005),XM、XH、Y与M组比较具有极显著性差异(P<0.01),XL、XM、XH与Y组比较无显著性差异(P>0.05);再灌注60min XL。与M组比较具有显著性差异(P<0.05),XM、XH、Y与M组比较差异极其显著(P<0.01),XM、XH与Y组比较无显著性差异,而XL与Y组比较具有显著性差异(P<0.05)。以上说明Y、XL、XM、XH均能明显降低全脑缺血和再灌注大鼠血清中IL-6的含量,XM、XH与Y的作用大致相当,而XL的作用不及Y、XM和XH。
七、实施例11中所制备注射液对脑缺血大鼠神经行为症状、脑梗塞面积、被动性条件反射、超氧化物歧化酶活性(SOD)、丙二醛水平(MDA)的影响
1.实验方法
1)动物分组及给药方法
Wistar大鼠随机分为6组:假手术组、模型组、川芎嗪组(1.33ml/kg体重)、受试注射液低剂量组(3.34ml/kg体重)、受试注射液中剂量组(5.00ml/kg体重)、受试注射液高剂量组(6.67ml/kg体重),每组各10只。
2)造模方法
利用结扎一侧大脑中动脉(MCAO)的方法造成大鼠局灶性脑缺血模型。①假手术组中将大鼠用氯胺酮腹腔注射麻醉(100mg/kg体重)。在大脑下静脉和嗅束间用外科无创伤缝合线穿过大脑中动脉,不结扎血管,缝合并局部消毒。②模型组中在大脑下静脉和嗅束间用外科无创伤缝合线结扎大脑中动脉,并于结扎远侧切断。④川芎嗪组(阳性对照组),行大脑中动脉结扎术,术后于鼠尾静脉注射川芎嗪注射液,每日1次。连续5日。④受试注射液大、中、小剂量,作大脑中动脉结扎术,术后于鼠尾静脉注射受试注射液,剂量依次为6.67ml/kg、5.00ml/kg、3.34ml/kg,每日1次,连续5日。
2.神经学分级、体重的测定
动物于治疗前后称重,计算体重减轻百分率,进行神经学分级(0级:正常;I级:对侧前肢屈曲;II级:提尾时,对侧前肢抓力减弱;III级;自主运动无方向性,提尾时向对侧旋转;IV级:自主运动时向对侧旋转)。从术后第2日观察神经学症状,每日1次,共4日。
3.脑梗塞面积的测量
动物断头取脑,将大脑平均冠状切为5片,放于1%TTC染液中,37℃恒温温育10min~15min,梗塞区不着色(白色),正常脑组织染成红色,生理盐水冲洗后,用照相机照象,在照片上用透明坐标纸测量每片梗塞区和全脑截面积,计算梗塞面积百分比。
4.被动性条件反射测定
采用避暗法,用WJ-1型条件反射箱,造模前将动物置于明室,当动物四肢均进入暗室时,通过36V的交流电,记录潜伏期,将潜伏期大于30s的大鼠剔除。末次给药后1h,重复测试,记录动物进入暗室的潜伏期和5min的错误次数。
5.SOD与MDA的测定
SOD检测采用黄嘌呤氧化酶法,MDA检测采用硫代巴比妥酸法。严格按SOD、MDA测试盒(南京建成生物工程研究所提供)说明书要求,用722光栅分光光度计测定血浆SOD、MDA含量。SOD单位以亚硝酸盐Nu/ml(血浆)、MDA单位以nmol/ml(血浆)表示。
统计学方法:
表19.各组对MCAO大鼠神经学分级、体重及脑梗塞面积的影响
组别 | 鼠数(n) | 神经学分级 | 脑梗塞面积 | ||||
0 | I | II | III | IV | |||
假手术组模型组川芎嗪组受试注射液大剂量受试注射液中剂量受试注射液小剂量 | 101010101010 | 1000444 | 015455 | 054110 | 031101 | 01△△△0*0**0***#0**# | 03.51±1.89△△△1.60±1.11*0.92±1.04**1.17±0.83**1.25±1.11** |
注:与假手术组比较:△P<0.05,△△P<0.01,△△△P<0.001;与模型组比较:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001与川芎嗪组比较:#P<0.05(下同)。
组别 | 例数 | 潜伏期 | 错误次数 |
假手术组模型组川芎嗪组受试注射液大剂量组受试注射液中剂量组受试注射液小剂量组 | 101010101010 | 157.20±150.6933.00±34.28△130.30±146.54145.90±136.73*143.30±137.33*154.70±125.73* | 0.5±0.531.6±1.17△1.0±1.050.6±0.52*0.6±0.16*0.5±0.53* |
表21各组对MCAO大鼠血浆SOD、MDA的影响(
)
组别 | 例数 | SOD | MDA |
假手术组模型组川芎嗪组受试注射液大剂量组受试注射液中剂量组受试注射液小剂量组 | 101010101010 | 57.90±7.7047.02±9.56△58.30±10.81*61.81±7.19**66.20±6.96***62.27±4.09*** | 2.00±0.893.33±1.07△△2.37±1.052.11±1.00*2.26±0.82*1.98±1.5* |
结论:
如表19所示,川芎嗪组、受试注射液大、中、小剂量组均能明显改善MCAO大鼠神经行为症状,与模型组比较,均有显著性差异,P值分别为0.05、0.01、0.001、0.01。且以受试注射液中剂量组差异最为明显。受试注射液中、小剂量组改善MCAO大鼠神经行为症状与川芎嗪组比较,均有显著差异,P<0.05;而受试注射液大剂量组与川芎嗪组相比,无显著性差异。
如表19所示,MCAO模型组大鼠大脑冠状切面绝大多数可见较大的苍白梗死区,与正常脑组织(红色)界线较明显。假手术组大鼠大脑冠状切面脑组织未见梗死灶。川芎嗪组大鼠脑梗塞面积与模型组比较显著缩小(P<0.05)。受试注射液大、中、小剂量组大鼠脑梗塞面积与模型组比较均显著缩小(P均<0.01)。同时,还观察到MCAO模型大鼠脑梗塞面积越大,其神经学症状也相应加重。
如表20所示,MCAO大鼠记忆力明显低于假手术组大鼠,潜伏期显著缩短,错误次数明显增加;受试注射液大、中、小剂量组均能明显提高大鼠记忆力,显著延长MCAO大鼠潜伏期,明显减少错误次数,与模型组比较均有统计学意义(P均<0.05)。受试注射液大、中、小剂量组与川芎嗪组比较,无显著性差异。与川芎嗪组与模型组比较,其潜伏期和错误次数无显著差异(P>0.05)。
如表21所示,MCAO大鼠模型组与假手术组比较,血浆SOD明显下降(P<0.05),MDA明显升高(P<0.01)。川芎嗪组与模型组比较,血浆SOD升高(P<0.05),MDA有下降趋势,但无统计学意义(P>0.05)。受试注射液大、中、小剂量组与模型组比较,血浆SOD活性均显著升高,且具有统计学意义(P值分别为0.01、0.001、0.001);血浆MDA显著降低(P<0.05)。
八、实施例11中所制备注射液对大鼠缺血脑组织5-羟色胺、5-羟吲哚乙酸以及β-内啡肽含量的影响
1.实验方法
1)动物分组及给药方法
Wistar大鼠随机分为4组:假手术组(10ml/kg生理盐水)、模型组(10ml/kg生理盐水)、川芎嗪组(53.3mg/kg)、受试注射液组(10ml/kg)。腹腔注射给药,每天1次,连续7天。
2)造模方法
用盐酸氯胺酮(1ml/100g)腹腔麻醉后,仰卧固定。切开颈前皮肤,沿气管两侧分离出左右颈总动脉,并在动脉下穿线,准备结扎。翻转大鼠,以自制脑立体定位仪俯卧固定大鼠头颈部,在枕骨后第1、2颈椎的位置作一约1cm长切口,从中央向两侧分离背阔肌和斜方肌。然后分离第一颈椎的横突翼,并找到左横突孔(椎动脉在入脑前从此孔通过)用一直径约0.5mm的电凝针插入横突孔,将左椎动脉电凝后立即翻转大鼠,迅速结扎两侧颈动脉,即造成急性不完全性脑缺血动物模型。假手术组除不电凝椎动脉和夹闭颈总动脉外,余操作同实验组。
2指标测定与方法
大鼠断头取脑,在沸生理盐水中煮5min。
1)5-HT和5-HIAA的测定
取右侧大脑半球,加酸化正丁醇匀浆,离心取上清液,经提取后用日本日立MPF-4型荧光分光光度仪测定5-HT和5-HIAA的荧光强度。
2)β-EP的含量测定
取左侧大脑半球,加入1mol/L HCl 4ml匀浆,倒人塑料管中,室温放置10min使生物活性肽充分溶解在酸中后,加入1mol/L NaOH 4ml中和酸,离心(4000r/min)10分钟,取上清液,装入塑料管中,低温(-20℃以下)保存待测。β-EP测定采用放射免疫测定法,严格按照RIA药盒规定程序操作。
对缺血性脑组织5-HT与5-HIAA的影响见表22。
组别 | 例数 | 5-HT | 5-HIAA |
假手术组模型组川芎嗪组受试注射液组 | 10101011 | 360.59±99.73158.97±57.15##384.36±159.65**300.02±92.92** | 374.22±85.50469.53±69.14#399.57±40.68*380.16±16.33* |
与假手术组比较:#P<0.05 ##P<0.01
与模型组比较:*P<0.01 **P<0.05
表22显示:(1)模型组的5-HT含量明显低于假手术组(P<0.01),而5-HIAA含量显著高于假手术组(P<0.05),说明脑缺血1h后脑组织内5-HT含量明显偏低,而其代谢产物5-HIAA却明显增高。(2)川芎嗪组和受试注射液组5-HT含量较模型组有极显著升高(P<0.01),而5-HIAA有显著降低(P<0.05),说明受试注射液和川芎嗪都能明显改善脑缺血后5-HT的过度释放,减少其代谢,保持脑缺血后5-HT的相对稳定,二者无显著性差异(P>0.05)。
2.对大鼠缺血脑组织β-EP含量的影响见表23。
表23各组β-EP含量分析(pg/g脑组织,
)
组别 | 例数 | β-EP含量 |
假手术组模型组川芎嗪组受试注射液组 | 10101011 | 9.56±0.6913.80±0.82*12.72±1.36*#9.78±1.17##△ |
与假手术组比较:*P<0.01;
与模型组比较#P<0.05,##P<0.01
与川芎嗪组比较:△P<0.01
表23结果表明:(1)模型组的β-EP含量明显高于假手术组(P<0.01),说明脑缺血缺氧时有β-EP的异常增高;(2)川芎嗪与假手术组比较有显著性差异(P<0.01),与模型组比较有显著性差异(P<0.05),提示川芎嗪有一定程度的降低脑缺血缺氧后β-EP的作用;(3)受试注射液组与模型组、川芎嗪组比较均有显著性差异(P<0.01),与假手术组比较无统计学意义(P>0.05),提示受试注射液可显著降低脑缺血缺氧后β-EP的异常升高,作用优于川芎嗪组。
尽管参照具体的实施方案对本发明进行说明,但应理解,对于本领域技术人员而言,可在不脱离如所附权利要求书所要求的范围内对本发明进行各种改变及修饰。这些改变及修饰同样属于本发明范围之中。
Claims (16)
1、一种用于治疗或缓解心脑血管疾病的药物组合物,其含有按药材干重计(0.01~100)∶(0.01~100)∶(0.01~100)的淫羊藿、黄芪和当归。
2、如权利要求1所述的药物组合物,其中按药材干重计淫羊藿、黄芪和当归的比例为(2~4)∶(2~4)∶(1~3),优选为3∶3∶2。
3、制备如权利要求1或2所述的药物组合物的提取物的方法,其包括以下步骤:
1)用水煎煮所述药物组合物;
2)过滤并浓缩滤液,使其中淫羊藿苷含量≥0.002ng/ml、黄芪甲苷含量≥0.001ng/ml、阿魏酸含量≥0.001ng/ml、氯原酸含量≥0.003ng/ml。。
4、如权利要求3所述的方法,其中煎煮步骤分3次进行,并合并每次过滤所得的滤液。
5、如权利要求3或4所述的方法,其还包括用醇沉淀滤液的步骤,以及任选的回收用于沉淀滤液的所述醇的步骤,所述醇优选为乙醇。
6、如权利要求3或4所述的方法,其在经过任选的进一步的脱色步骤后还包括将pH调节为3~10的步骤,其中优选地以活性炭实施所述脱色步骤。
7、如权利要求3或4所述的方法,其还包括优选地以超滤法或微孔滤膜除杂质和热原的步骤。
8、通过如权利要求2-7之一所述的方法得到的提取物。
9、一种用于治疗或缓解心脑血管疾病的药物组合物,其含有如权利要求8所述的提取物。
10、如权利要求9所述的药物组合物,其为片剂、胶囊剂、软胶囊剂、包衣片剂、注射剂、混悬剂、乳剂、酊剂、散剂、颗粒剂、丸剂,优选为注射剂,进一步优选为用于静脉滴注的注射液、静脉注射的注射液、肌肉注射的注射液、皮下注射的注射液、长效储库型注射液。
11、如权利要求10所述的药物组合物,其中所述注射剂的包装规格为每支0.05毫升至每支20000毫升。
12、如权利要求8所述的提取物在制备用于治疗或缓解心脑血管疾病的药物中的应用。
13、如权利要求12所述的应用,其中所述心脑血管疾病为缺血性脑血管病、脑血管病后遗症、冠心病或周围血管病。
14、如权利要求1或2所述的药物组合物、如权利要求8所述的提取物或如权利要求9所述的药物组合物在制备用于以下治疗用途的药物中的应用:
(1)、降低动物脑缺血后血浆的血栓素A2(Thromboxane,TXA2)水平,及提高动物脑缺血后血浆的前列环素(Prostacyclin,PGI2)水平;及/或
(2)、改善动物脑缺血后血浆的血栓素A2-前列环素(TXA2-PGI2)的平衡;及/或
(3)、降低动物脑缺血后血浆的血栓烷素B2(Thromboxane,TXB2)水平,及提高动物脑缺血后血浆的6-酮-前列腺素(6-KETO-PGF1α)水平;及/或
(4)、降低动物脑缺血后血浆、脑组织的TXB2/6-KETO-PGF1α比值,改善动物脑缺血后血浆的血栓烷素B2与6-酮-前列腺素(TXB2-6-KETO-PGF1α)的平衡;及/或
(5)、降低动物脑缺血后血浆、脑组织的内皮素(Endothelin,ET)水平;及/或
(6)、提高动物脑缺血后血浆、脑组织的降钙素基因相关肽(CalcitoninGene-Related Peptide,CGRP)水平;及/或
(7)、纠正动物动物脑缺血后血浆、脑组织的内皮素-降钙素基因相关肽(Endothelin-Calcitonin Gene-Related Peptide)的失衡;及/或
(8)、降低动物脑缺血后血浆、血清的一氧化氮(Nitric oxide,NO)含量;及/或
(9)、降低动物脑缺血后脑组织的钙离子(Ca2+)含量;及/或
(10)、提高动物脑缺血后脑组织的镁离子(Mg2+)含量;及/或
(11)、降低动物脑缺血后血清的TNF-α含量;及/或
(12)、降低动物脑缺血再灌注后血清的TNF-α含量;及/或
(13)、降低动物脑缺血后血清的IL-1含量;及/或
(14)、降低动物脑缺血再灌注后血清的IL-1含量;及/或
(15)、降低动物脑缺血后血清的IL-6含量;及/或
(16)、降低动物脑缺血再灌注后血清的IL-6含量;及/或
(17)、增强动物脑缺血后血浆的超氧化物歧化酶活性(Activity ofSuperoxide dismutase SOD);及/或
(18)、降低动物脑缺血后血浆的丙二醛(Malondialdehyde MDA)水平;及/或
(19)、提高动物脑缺血后脑组织的5-羟色胺(5-HT)水平,及降低动物脑缺血后脑组织的5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)水平,改善缺血脑组织单胺神经递质(5-羟色胺-5-羟吲哚乙酸)的代谢失衡;及/或
(20)、降低动物脑缺血缺氧后脑组织的β-内啡肽(β-EP)含量,改善缺血脑组织神经肽的代谢失衡;及/或
(21)、改善动物脑缺血后脑血管舒缩功能;及/或
(22)、降低动物脑缺血后缺血脑组织含水量,改善脑水肿症状;及/或
(23)、降低动物脑缺血后全血粘度;及/或
(24)、降低动物脑缺血后血浆粘度;及/或
(25)、促进动物脑缺血后血小板回复正常形态,减少血小板细胞形成伪足;及/或
(26)、减轻动物脑缺血后脑组织神经细胞固缩及深染;及/或
(27)、减轻动物脑缺血后脑组织神经胶质细胞肿胀;及/或
(28)、减轻动物脑缺血后脑组织间质疏松;及/或
(29)、减轻动物脑缺血后脑组织(脑组织包括顶叶灰质、海马及海马回、大脑白质)的神经细胞损伤(神经细胞损伤包括神经细胞胞核、胞浆、胞膜的破损;神经细胞纤维轴索肿胀、断裂、呈串珠状;髓鞘脱失、软化、出血、水肿;神经细胞小血管周围增宽);及/或
(30)、降低动物脑缺血再灌注后脑组织含水量,改善脑水肿症状;及/或
(31)、缩小动物脑缺血后脑梗死面积;及/或
(32)、减轻动物脑缺血后神经行为症状(包括运动障碍、活动减少);及/或
(33)、减轻动物脑缺血后对被动性条件反射的降低。
15、如权利要求12~14之一所述的应用,其中所述药物为片剂、胶囊剂、软胶囊剂、包衣片剂、注射剂、混悬剂、乳剂、酊剂、散剂、颗粒剂、丸剂,且优选为注射剂,更优选为用于静脉滴注的注射液、静脉注射的注射液、肌肉注射的注射液、皮下注射的注射液、长效储库型注射液。
16、如权利要求15所述的应用,其中所述注射剂的包装规格为每支0.05毫升至每支20000毫升。
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