CN101072625A - 涂布膜的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及往微孔膜上涂布含有固体的反应性薄膜的方法，其中该膜首先进行润湿，然后将含有固体的反应性薄膜涂布到依然潮湿的膜上。以这种方式生产的膜可以含有反应性薄膜，它含有高比例的薄膜致孔剂，可以有利地用于检测体液成分，尤其大疏水分析物的诊断单元中。

Description

涂布膜的方法
本发明涉及往微孔膜(Membranen)涂布含有固体的反应性薄膜(film)的方法，因此涉及生产的膜和含有它们的诊断单元。
定性或定量分析测定流体成分，特别是诸如血液之类的体液成分时常常采用所谓的缚载体试验。在这些试验中，试剂，特别是专门的检测试剂和辅助试剂在适当的固体载体层中被包埋或固定。这些层称之检测元件。让该液体样品与这些检测元件接触，测定相应的分析物。一般而言，有目标分析物，特别有颜色变化，这种颜色变化可以采用目视方法或使用仪器，通常采用反射光度法进行分析时，该液体样品与最初以干燥形式存在并被该样品再溶解的这些试剂进行反应产生一种信号，其信号可以采用光学方法或电化学方法进行监测。其它的检测方法例如是以电化学方法和检测电荷、电位或电流变化为基础的方法。
与通常的实验室试验相反，由于这些检测试剂最初是以干燥形式存在的，缚载体试验通常也称之“干化学试验”。
干化学试验的试验元素或试验载体通常呈测试条形式，它们基本上由塑料材料制成的伸长载体层组成，检测元素固定在它们的上面作为试验区域。然而，人们还知道设计成正方形或长方形干胶片的试验载体。
一般而言，采用干化学测试条进行血液中低分子分析物的光度检测包括分离干涉光度测量的红血球。
分析物检测需要的酶通常位于耐水的不溶薄膜中，在该薄膜中由成膜剂构成的疏水基质含有全部或至少一些检测试剂(即基本上酶和指示剂系统)，样品穿过这些试剂并且在这些试剂中进行生色反应。采用各种各样的确定涂布法(例如刮刀涂布)在非吸收的机械稳定的载体材料(例如像由双酚A聚碳酸酯制成的Pokalon箔)上涂敷这些薄膜。
术语成膜剂表示能涂布成机械稳定的耐水试剂层的聚合物(例如Propiofan，丙酸乙烯酯塑料分散体)。
此外，这些反应性薄膜通常含有溶胀剂。溶胀剂是水溶性聚合物，它们充分地影响涂料软膏的粘性，这会造成这些试剂在耐水层的疏水部分区域中细分散，并且促使样品渗透到该层中(实例是海藻酸盐、Keltrol、Gantrez、Eudragit等)。
添加填料(还称之薄膜致孔剂)可能对“致孔度”，从而对分析物渗透到反应性薄膜的能力有正影响(参见例如US 4 312 834)。填料是水不溶性的、非膨胀的、易润湿的细无机或有机颗粒，它们不能使光光学散射或只是轻微光学散射，并且甚至能使相对大的分子(例如呈脂蛋白形式的脂类)，甚至细胞(例如红血球)渗透到耐水薄膜中。填料实例是白垩、纤维素、硅藻土(Diatomeenerde)、Celatom、硅藻土(Kieselgur)、硅酸等。
在第一代的血糖测试条中(例如Boehringer Mannheim的“Hmoglukotest”20-800，还参见US 3 630 957)，除了检测化学之外，反应性薄膜仅含有成膜剂(Propiofan)和溶胀剂(海藻酸盐)。在这些非常密实，即没有致孔的耐擦薄膜的情况下，红血球不能渗透到反应性薄膜中，尽管特别诸如葡萄糖之类的血液低分子量成分实际上能穿透。因此，分开的血液分离是不必要的。打算测量血糖的血滴简单地直接涂敷在测试条反应性薄膜上。该血滴在反应性薄膜上培育一分钟后，擦去血液，再反应一分钟后，可以从前面已涂敷血液的这条同侧读出显色时间作为分析物浓度的度量。
因此，第一次可能直接检测全血中的葡萄糖。由于这些反应性薄膜不含有任何填料，它们仅允许低分子量的易溶于水的分析物，例如葡萄糖缓慢渗透，并不能检测大而疏水的分子(例如像胆固醇(CHOL)、HDL(高密度脂蛋白，即更高密度的脂蛋白)、三酸甘油酯(TG)、肌酸激酶(CK)等)。
在检测全血分析物的干化学试验的发展过程中，使用玻璃纤维毛分离红血球(其中参见US 4 816 224)，特别是与含有填料的开孔反应性薄膜一起使用(例如Roche Diagnostics的Reflotron生产线的测试条，以及后来Roche Diagnostics的Accutrend生产线的所谓“非擦拭试验”)是一个里程碑。除了快得多的动力学之外，特别在该分析物渗透到检测薄膜中、酶反应以及颜色反应方面，这些试验上层结构还能检测相对大的疏水分子(例如CHOL、HDL、TG等)。
然而，玻璃纤维毛技术缺陷是可用血浆体积与使用血液体积的比(在下文中也称之血液/血浆产率)相对不利。此外，在氧化性分析物检测(即在指示剂存在下使用分析物氧化酶的分析物检测和使用过氧化物酶生成过氧化氢的反应中，该指示剂在这个过程中由(一般无色)还原形式变成(一般有色)氧化形式)的情况下，把氧供给反应性薄膜被证明是有限的，特别是在所谓的堆叠结构(分离红血球的玻璃纤维毛和反应性薄膜构成堆叠复合材料；把该血样涂敷到玻璃纤维毛上，它渗透玻璃纤维毛，同时红血细胞与以这种方式生成的血清或血浆渗透到下面的反应性薄膜层中，在那里进行实际检测和指示剂反应，然后由与涂敷血液位置相反的堆叠复合材料一侧可以观察到这个反应)，因此只是可能在顶端获得有限的测量范围。
因此，为了减少血液体积，最近一代测试条使用血液分离膜(例如参见EP-A 0 654 659)或非常薄的单层或双层薄膜(参见US 5 536 470和US 6 036 919)。这样膜基系统的血液/血浆产率比在使用玻璃纤维技术的情况下有利得多。下面将阐明两个膜基系统。
US 5 536 470公开了由薄膜层组成的试验场。把全血样品涂敷到该薄膜层的一面上。由没有红血球的相反面可以检测出显色反应，而红血球能从样品涂敷面渗透到检测面。可以在透明载体(例如箔)上或在膜上涂布这种薄膜层。因此，在US 5 536 470中公开的薄膜起到将血液(有色物)分离与检测层结合起来的作用。高比例的颜料对于实现前一功能(血液(有色物质)分离)是必不可少的，即颜料含量是在这种情况下以该成膜糊剂的固体含量计至少30重量％。高成膜剂含量对于保证含有高比例颜料的这样薄膜层的机械稳定性也是必需的。颜料与成膜剂的重量比应大致相同。如果可能，在这些薄膜层中应该没有惰性填料(即所谓的薄膜致孔剂)，或者如果有这些惰性填料，那么它们应该仅仅非常少量(总固体含量的10％以下)地存在于该成膜糊剂中，因为否则不再保证该薄膜层的血液-分离性能。然而，由于成膜糊剂至多10％的低填料含量，US 5 536 470公开的薄膜致孔不足以能使大的疏水分析物(例如脂类)渗透。
在使用于透明箔上薄的双层薄膜进行葡萄糖检测的情况下，第一层(即直接处在该箔上的层)是反应性薄膜，除了酶-指示剂系统外，它含有成膜剂、溶胀剂和光学透明填料(例如Transpafill，Degussa的硅酸铝钠)。与湿化学光度计试验类似，透明的第一层类似地构成在其中进行光度分析检测的比色皿。贴在第一层上的第二层含有高比例的高折射颜料(例如二氧化钛)，同时分配薄膜致孔剂或填料。把血液直接涂敷到第二层上，从试验条的相对面通过在第一层中的透明载体箔进行光度检测。
光学不透明的、致孔少的第二层在这种情况下完成双重功能。一方面，作为血液-分离薄膜，它阻止红血球渗透到反应第一层里，而另一方面，它光反射不让通过第一层，防止红血球的红色从发光直到检测面。
这样一种体系与采用玻璃纤维毛分离红血球相比的优点是，检测低分子分析物时需要的样品体积少，而动力学快。
这种双层结构的缺陷是疏水大分子(例如脂蛋白、胆固醇、三酸甘油酯、HDL等)不能通过分离血液第二层扩散，因此不能在第一层进行检测。
因此，一个可选方案是使用血液分离膜。血液分离膜(即由全血得到血浆或血清的膜)是很不对称的膜(通常聚醚或聚醚砜，例如Pall Co.的BTS-SP-300、Spectral Diagnostics的PrimeCareX或者SG)，即膜孔径不均匀，而是有致孔和窄孔面。一般而言，把血液涂敷到膜的更多致孔面。该样品物质穿过其膜时，这些红血球被阻止在锥形孔中(参见EP 0 654 659)。
干化学试验条基本上使用两种形式的血液分离膜。在所谓的单层结构中，除了血液分离外，血液分离膜还实现检测化学的载体功能。为了这一目的，使用含有含水指示剂和检测系统的系统浸渍该膜(例如采用浴浸渍或缝式喷嘴计量)。
为了确保浸渍的干燥酶迅速溶解与该膜被样品物质迅速润湿，通常把润湿剂加到漫渍溶液中。
一层膜结构的缺陷是这种膜在干燥状态下为光学不透明的(空气的折射率是约1.00；该膜的折射率是约1.35-1.38，即这些折射率之差是约0.35-0.38，因此该膜好像是不透明的)，但是，这种膜在湿的状态下变得光学透明得多(水的折射率是约1.33，因此这些折射率之差仅仅约0.02-0.05)，从而在较低膜区中分离红血球的固有颜色透过，影响光度测定结果。
往该浸渍溶液中添加白色颜料(例如二氧化钛，折射率约2.55)可以减少或防止这种现象。由于光学不透明的白色颜料的粒度范围是被反射光波长的一半(0.2-0.4μm)，所以它们在浸渍过程中可以进入膜的孔(它的直径典型地是0.2-10μm)中，从而使孔变得狭窄而使其堵塞，因此疏水大分子不可能或更难以进入并通过膜。
因此，专门使用有血液分离膜的单层结构检测易于溶于水的小分析物(例如葡萄糖)。
双层膜结构可以避开单层结构的许多问题。在这种情况下，另一种更窄孔的检测膜吸收血液分离膜中的血浆(例如Pall公司的BiodyneA或Loprodyne＝0.2/0.45μm尼龙膜)，所述的膜与血液分离膜邻近。在这种情况下，光学不透明的白色颜料不是必要的。而且，第二个膜中的检测系统并不与血分离系统直接接触，该系统特别在脂质试验方面能使用易溶解脂质，还具有溶血作用的润湿剂。
但是，双层结构的缺陷是复杂、昂贵的试验配置。生产过程对机械测试条联合装置要求高，因为如果可能应该保证无间隙地紧密接触，以使血清或血浆可以由血液分离膜进入检测膜中。该系统的内在缺陷是由于检测膜孔较窄，试验结构润湿缓慢，与单层结构相比血液/血浆产率不利以及更慢的动力学。
因此，总之，现有技术方法的缺陷是含有高比例填料的开放检测膜尤其对于检测疏水大分子是必不可少的，但是仅仅这样的开放检测膜不能保证光学分析测试条将干扰血液组分分离(首先是红血球、血红蛋白)。相反地，合适的血液分离系统(薄膜、膜)能使疏水大分子渗透，即使完全，那么仅仅达到不充分的程度。基本上适合检测疏水大分子的系统(例如玻璃纤维毛与开放检测薄或两层膜结构的结合)只是不充分地解决这个问题，因为它们生产复杂，易于干扰，其试验性能不是最令人满意的(需要大量的血、有限的测量上限或缓慢的反应动力学)。
本发明的目的是消除这些缺陷。特别地，本发明的目的是提供干化学试验装置(及其相应的生产方法)，该装置能从尽可能少量的全血中检测生物样品中作为脂蛋白配合物存在的疏水大分子，特别地脂类，其中将红血球分离整合到该装置中，达到检测反应的快速动力学。
通过本发明的主题达到该目的。
本发明涉及根据权利要求1所述的方法，涉及根据权利要求10所述的可以采用本发明方法生产的微孔膜，根据权利要求11所述的使用在反应性薄膜中含有相对高比例填料(以成膜剂计)的所述薄膜涂布的微孔膜，和根据权利要求16所述的含有本发明膜的诊断单元(Mittel)。本发明的优选具体实施方案是从属权利要求的主题。
往微孔膜涂布含有固体的反应性薄膜的本发明方法，其特征在于该膜首先进行润湿，然后把含有固体的反应性薄膜涂敷在它仍是潮湿的膜上。
含有固体的反应性薄膜是耐水的、不溶于水的薄膜，它们在成膜剂的疏水基体中含有所有或至少一些检测试剂。除了实际的检测化学，它通常含有酶、辅酶、介质、指示剂或指示剂系统等，反应性薄膜可以含有耐水成膜剂、膜致孔剂和任选地光阻挡颜料(后者用于降低光透明度)和本技术领域的技术人员已知的其它组分(润湿剂、溶胀剂等)。
根据本发明，考虑无机或有机材料，特别地微粒材料作为薄膜致孔剂(也称作填料)。本技术领域的技术人员本身知道这样一些薄膜致孔剂。例如，如本文前面已经提到的，不溶于水的、非膨胀的、易润湿的细无机或有机颗粒是合适的，这些颗粒不散射光或只是轻微散射光，甚至能使较大的分子(例如呈脂蛋白形式的脂类)，甚至细胞(例如红血球)迅速渗透到耐水薄膜中。填料的实例是白垩、纤维素、硅藻土(Diatorneenerde)、Celatom(硅藻土)、Kieselgur(硅藻土)、硅酸等。已证明Celatom和kieselgur特别适用于本发明的目的。
特别地，根据本发明，考虑能形成机械稳定的、耐水的试剂层的有机聚合物作为成膜剂。本技术领域的技术人员本身知道这样一些成膜剂。例如，如本文前面已经提到的，丙酸乙烯酯-塑料-分散体，例如Propiofan、Eudragit(丙烯酸树脂分散体)、Mowiol(一种聚乙烯醇)等是合适的。
根据本发明，把该反应性薄膜涂布在微孔载体层上，这个微孔载体层也可以称之微孔膜。特别地，全血用作样品材料时，当该膜具有血液分离性能时，即能将全血样品中的有色成分(首先是红血球、血红蛋白)保留下来，因此得到全血的血浆和血清时是有利的。本技术领域的技术人员本身知道这样一些膜。实例是聚醚或酸醚砜膜，它们优选地是不对称的。这些膜的实例是BTS SP 300(Pall)、Prime Care X或SG(Spectral Diagnostics)。
根据本发明，已证明有利的是在使用这种涂料膏涂布微孔膜形成反应性薄膜之前使该微孔膜润湿，并且在它还处于潮湿状态时进行这种涂布。特别有利的是在反应性薄膜润湿后，即如果可能在同一个处理步骤中直接涂布反应性薄膜涂料。
如果把反应性薄膜涂布到还没有预润湿的膜上，即涂布到干膜上，得到了涂布反应性薄膜的血液分离膜，如所预期的，这些膜阻止了红血球。涂到该膜上的反应性薄膜充满了血浆。原则上，可以观察到取决于分析物量的彩色显影。但是，分析血液样品时，特别地如果该分析物是大分子或疏水分子(CHOL、TG、HDL等)时，涂有反应性薄膜的干膜只是具有次最优的结果。在这种情况下，这种反应性薄膜中彩色显影程度比预期的小得多。
但是，含有脂类的血浆直接涂布到这个反应性薄膜上，即没有利用该膜预先将血液从全血中分离出来，得到期望的彩色显影。如果首先让同样的样品通过干的涂布血液分离膜，尽管确保反应性薄膜被血浆润湿，但还是几乎没有色彩显影。这个实验发现得出，涂布含有填料的相对开放的薄膜会大大降低疏水大分子在该膜中的渗透性这个推测。
利用甘油三酸酯(TG-)试验作为实例，可明确地表明即使膜是干涂的，也确保小的、易溶解的临时生成的分析物中间体(例如甘油、H2O2)通过膜-反应性薄膜复合材料的渗透性(即从上(直接在反应性薄膜上)和从下(接触反应性薄膜前，把样品涂敷到膜上并渗透这种膜)样品涂布之间在颜色上没有差别)。
此外，已观察到在往吸收的非预湿润的膜涂布含有填料和颜料的开放薄膜期间，亚稳定的涂料膏开始分离。在涂布过程中，涂料膏的颜料和填料部分在刮刀间隙处富集。这样造成涂层非常不均匀。
尽管已有可能通过减少涂料膏中颜料/填料的比例，往吸收的非预湿润的膜上涂布更稳定的涂料膏，从而得到更均匀的薄膜，但采用这种方法不利于分析物的渗透性，因为具有较低比例填料的薄膜致孔反而不高，因而分析物更不易渗透，大分析物或疏水分析物尤其不易渗透。
现在出乎意料地已发现，如果这些膜在潮湿状态下进行涂布，则可以往吸收的膜涂布含有固体的亚稳定反应性薄膜，而不会降低分析物的渗透性。
例如在一个处理步骤中首先让这种膜通过水浴，接着使用刮刀或缝模，在该膜仍是潮湿的时把含有固体的膏涂布其上，这在技术上实施很有利。
除了增加反应物的渗透性，一个积极的附加作用是薄膜涂布均匀得多，因为在涂布过程中，使用潮湿的膜时，含有固体的亚稳定膏分离趋势大大降低。更均匀的薄膜最终意味着改进光度测定的精确度，从而浓度测定中变化系数也更低。
此外，在涂料膏中采用高比例的填料，这种方法可以用于涂布在一些膜上的致孔薄膜。
由于这种方法明显减少了在涂布过程中反应性薄膜组分渗透到一些膜中，这种方法因为血液分离(在膜中)和反应性薄膜(在膜上)在空间上分开得更好，而在单层结构中能使整体上促进测试反应的组分添加到反应膜上(例如特殊的润湿剂，它容易溶解脂蛋白与激活脂肪酶和酯酶)，同时不会由于血液分离膜中的润湿剂而引起溶血作用。
优选地，采用浴浸渍、开缝喷嘴浸渍或喷射方法润湿这种膜。水或水溶液可以用于润湿这种膜，它例如可以含有缓冲剂、润湿剂(一般而言也称之表面活性剂或洗涤剂)，改进这种膜等的润湿。
本发明的方法特别适合于涂布反应性薄膜，其中薄膜致孔剂与成膜剂的质量比是10∶1-1∶1。特别地，已证明薄膜致孔剂与成膜剂的质量比5∶1-2∶1的薄膜是特别合适的。具有这样一种质量比的反应性薄膜的特征在于相对大的开孔隙度，它有利于或允许疏水大分子再渗透到反应性薄膜中。以前不可能生产这样一些涂布均匀而致孔薄膜的膜。因此相应地涂布微孔膜也是本发明的主题。
采用本身已知的方法，例如刮刀涂布、辊涂或缝模涂布，涂布这种反应性薄膜。
除了本发明的涂布膜外，本发明的另一个主题是检测体液成分的诊断单元，该单元包括涂有反应性薄膜的膜。在这种背景中体液具体地是血液、血清、血浆、尿、唾液、汗等，其中血液是优选的。待检测成分典型地是体液中被检测的分析物，特别是如CHOL、TG、HDL等之类的大分子和/或疏水分子，它们在血液中以脂蛋白配合物的形式存在，而且它们还包括果糖胺、肌酸激酶(CK)、谷氨酸草酸盐转移酶(GOT)、谷氨酸丙酮酸盐转氨酶(GPT)、淀粉酶、血红蛋白、白蛋白。
本发明目的的优点是本发明的方法首先能使有高含量填料(以成膜剂量计)的反应性薄膜涂布在膜上，从而得到稳定而均匀的开放薄膜。这些薄膜对于检测全血中的大疏水分析物是特别有利的。这种膜实现了血液分离功能，即它阻止红血球以及任选地血红蛋白，因此血液颜色不会干扰采用光学方法进行的后续分析物检测。保证这种膜与检测薄膜之间紧密接触，因此达到血清/血浆迅速而基本上完全转移到反应性薄膜中。使用几μl全血可以检测其分析物。该涂布方法极其适合于自动过程，尤其适合于大面积生产涂布在一些膜上的反应性薄膜，采用辊或带方法同样如此。
通过下述实施例和附图进一步说明本发明。
图1表示在含有不同甘油三酸酯含量(65、207、294、494和728mg/dl)的血液样品存在下，包括“湿涂”膜的试验条的动力学测定过程，该图是以相对反射率(R以％计)与时间(t以s计)进行绘制的。
图2表示干涂(2)膜和湿涂(1)膜的在血液样品中不同甘油三酸酯浓度(c，mg/dl)的相对反射率(R)，。
图中的数字和缩写具有下述含义：
1  湿涂布膜的测定曲线
2  干涂布膜的测定曲线
R  相对反射率
t  时间
c  浓度
实施例1
往血液分离膜涂布反应性薄膜的方法和检测全血中甘油三酸酯的相应试验装置
1.涂料膏的生产
a.)Gantrez溶液：
往58.5g 85毫摩尔浓度的磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中添加35.5g水。添加1.7g MgSO4后，分小份添加5.2g Gantrez S 97(甲基乙烯醚和马来酸酐的共聚物，GAF Coproration化学部)，搅拌3小时直到Gantrez完全膨胀。之后添加4.5g 32％NaOH溶液，再搅拌30分钟后，喷入0.6g PVP(聚乙烯吡咯烷酮25,000)，再搅拌20分钟，直到它完全溶解。接着，用32％NaOH将膏制剂的pH调整到6.7-7.0。
b.)Symperonic溶液：
将1.3g Symperonic F68(聚氧化乙烯-共(co)-氧化丙烯，ICI)溶于5.3g水中，同时搅拌20分钟。
c.)往a.)描述的Gantrez溶液中添加17.0g Propiofan 70 D(50％在水中丙酸乙烯酯聚合物分散体，去单体化，BASF，Ludwigshafen源)，搅拌30分钟后在10分钟内添加26.5g Celatom MW 25(硅藻土Kieselgur，CHEMAG)，再搅拌20分钟。之后往该制剂中添加6.6g b.)描述的Symperonic溶液，再搅拌10分钟。
d.)Refloblau溶液
在避光下将1.7g Refloblau(4-(4-二甲基氨基苯基)-5-甲基-2-(3，5-二甲氧基-4-羟基苯基)-咪唑二盐酸化物，RocheDiagnostics)溶于23.3g 35℃温水中，使用磁搅拌器搅拌15分钟。
e.)二氧化钛/Refloblau部分制剂
在避光的时候首先添加22.5g 85毫摩尔浓度的磷酸盐缓冲液(pH7.5)，使用450rpm的溶解搅拌器在5分钟内喷入4.3g TiO2(RN 56，Kronos Titan)，之后再搅拌5分钟。最后在5分钟内把在d.)制备的25gRefloblau溶液加到TiO2悬浮液中，再搅拌30分钟。然后把该TiO2/Refloblau部分制剂储存在电冰箱中直到使用，同时避光。
f.)ATP溶液
将1.7g ATP(三磷酸腺苷；二钠盐)溶于3.3g水中。
g.)DONS溶液
将1.3g DONS(磺基琥珀酸二辛基钠)溶于5.3g丙酮中。
h.)MPSC溶液
将0.03g MPSC(甲苯基氨基脲)溶于0.6g 1-甲氧基-2-丙醇中，同时避光。
i.)酶溶液
将下述酶(以冻干物存在)相继地溶于15.9g 85毫摩尔浓度磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中，其中分别称量的酶量取决于使用该批酶的比活性：
40千(Kilo)单位(约1.8g)甘油激酶(嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的EC 2.7.1.30；Roche Diagnostics，Cat.No.0 717398)
34千单位(约2.4g)胆甾醇酯酶(柱状假丝酵母的EC 3.1.1.13；RocheDiagnostics，Cat.No.0 129 046)
28.9千单位(约0.12g)过氧化物酶(辣根的EC 1.11.1.7；RocheDiagnostics，Cat.No.0 121 606)
27.8千单位(约0.44g)L-α-甘油磷酸酯氧化酶(EC 1.1.3.21；重组体，Roche Diagnostics，Cat.No.1 582 003).
j.)最终在搅拌下往来自c.)的Gantrez/Propiofan/Celatom的制剂里添加下述部分制剂：
来自g.)的6.6g DONS溶液
来自f.)的5.0g ATP溶液
来自e.)的51.8g TiO2/Refloblau悬浮液
7.0g洗出TiO2的水/Refloblau溶液
11.8g Celatom MW 25
来自h.)的0.63g MPSC溶液
来自i.)的20.66g酶溶液
2.2g 85毫摩尔浓度磷酸盐缓冲液洗出酶溶液。
添加各个部分溶液(Celatom例外)后，制剂搅拌5分钟。在15分钟内以小部分地喷入Celatom，然后该制剂再搅拌20分钟。
最后，全部制剂(约250g)在300g下离心20分钟以脱气，接着使用橡胶刷手动缓慢地使已离心沉淀的任何固体再悬浮。
然后，让涂料膏通过140μm试验筛，再次均化10分钟，同时轻轻搅拌。
涂料膏具有表1列出的组成。
表1：涂料膏的组成   绝对值   固体含量
Gantrez S97(作为薄膜增稠剂/溶胀剂)   5.2g   5.2g
PVP(聚乙烯吡咯烷酮)   0.6g   0.6g
Propiofan分散体(50％在水中，作为成膜剂)   17g   8.5g
Celatom(作为薄膜致孔剂)   38.3g   38.3g
TiO2 RN56(作为白色颜料)   4.3g   4.3g
MgSO4   1.7g   1.7g
Refloblau   1.7g   1.7g
甲苯基氨基脲   0.03g   0.03g
ATP(二钠盐)   1.7g   1.7g
Symperonic F68   1.3g   1.3g
DONS(磺基琥珀酸二辛基钠)   1.3g   1.3g
甘油激酶   40KU   1.8g
胆固醇氧化酶   34KU   2.4g
过氧化物酶   28.9 KU   0.12g
L-α-甘油磷酸酯氧化酶   27.8KU   0.44g
丙酮   5.3g   -
1-甲氧基-2-丙醇   0.6g   -
NaOH(32％)   4.5g   1.4g
蒸馏水   152.9g
合计   241.2g   70.8g
涂料膏的固体含量是29％。以全部固体含量计，成膜剂(Propiofan)的固体百分含量是12％。以全部固体含量计，薄膜致孔剂(Celatom)的固体百分含量是54％。薄膜致孔剂与成膜剂的比是4.5∶1。
2.往血液分离膜上涂布反应性薄膜
采用以下描述的方法，血液分离膜(BTS-SP-300型；物品编号No.955 00 12 0953，从Pall GmbH/63303 Dreieich获得)涂布如在节1.)描述得到的涂料膏，生产反应性薄膜。
a)首先把约1米长的一片膜(BTS-SP-300)拉过装满水的不锈钢槽，然后用橡胶刷除去留在膜表面上过量的水。以进料速度1.5m/min、刀距150μm将1.)的涂料膏刮涂到仍然潮的膜上。
接着以这种方式涂布的膜(下文中称之“湿涂布膜”)在50℃干燥5分钟。
最后，使用铣刀轴将这种膜切成4.0mm宽的细切辊。这些细切辊干燥保存直到再使用。
b)作为对比，第二片BTS-SP-300涂布相同的涂料膏，但没有预先将膜拉过装满水的不锈钢槽(下文中称作“干涂布膜”)。
3.生产试验条功能模型，测试全血中的TG
在5mm宽、78mm长的载体箔(Melinex)上粘附使用双面胶带在两面上涂布约200μm厚的聚酯箔(所谓的间隔层)，由此，预先借助于刻图机(Schneidplotters)(ARISTO Graphic System；公司的Aristomat 1310型；22525 Hamburg)，以距离5.0mm将1.5mm宽、沿纵向通到后续试验条的毛细管(毛细管长度35mm)切割，采用“轻触裁断(Kiss cut-Schnitt)”。将筛孔宽度250μm的5mm×25mm聚酯网(Sefar公司/CH-9410 Heiden的Petex 07-98/34型)粘到这个间隔片/毛细管层上，一方面形成毛细管的上边界，另一方面保证样品/血液从毛细管进入叠加的分析物检测区中。
Scrynell网以这样一种方式排列在间隔层上，使得该网不会覆盖第一根5mm毛细管，从而可以用作样品涂敷区。
根据节2所述方法涂布反应性薄膜并且利用两个热熔性粘合珠粘合在侧面的血液分离膜，位于Scrynell网上(未涂布血液分离膜侧朝下；反应性薄膜朝上)。
试验条功能模型的构型可与EP申请No.04 023 734(申请日2004年10月5日)的实施例1和图1所述的试验条相比。
4.评定使用含有甘油三酸酯的血液样品的功能模型
把25μl血液涂布在试验条功能模型上的样品涂布区(Scrynell网前面的毛细区)。使用反射光度计，采用带LED的光学测量系统，在主波长660nm，以10秒间隔在3分钟内从上方(这种膜的反应性薄膜侧)测定这种模型。
测定程序描述如下：
涂布样品前，测量一次试验条，同时隔绝环境光线，以得到各种未反应的反应性薄膜的反射率。为了接着在样品物质存在下的动力学测定，将以这种方式得到试验条的“空白值”设定为100％相对反射率(R)。
涂布25μl血液后立刻开始动力学测定。以这种动力学方式得到的反射率除以各自的试验条空白值，并以相对反射率(R，以％计)对测定时间绘图。
图1表示在不同甘油三酸酯含量(65、207、294、494和728mg/dl)的血液样品存在下，以这种方式得到试验条(含有“湿涂布”膜)的动力学测量过程，
当动力学测量的曲线时间过程表明反应性薄膜的颜色形成在选择的测定时间内依赖于浓度达到反射率最小值(最大的色彩深度)时，在下面选择该反射率最小值作为样品中分析物浓度的度量。
下表2列出“湿涂布”和“干涂布”BTS-SP-300膜的相对反射率最小值(以％表示)，这些膜含有相同的反应性薄膜，含有不同甘油三酸酯含量的血液样品按照升序排列。
表2
    ％相对反射率(最小值)
  血液样品中甘油三酸酯含量    “湿涂布”膜   “干涂布”膜
  65mg/dl     74.7％    81.6％
  76mg/dl     71.7％    81.5％
  100mg/dl     69.4％    81.3％
  105mg/dl     68.7％    77.7％
  142mg/dl     63.5％    77.3％
  154mg/dl     63.1％    77.8％
  207mg/dl     59.0％    75.7％
  217mg/dl     56.9％    72.6％
  265mg/dl     52.6％    72.3％
  294mg/dl     49.7％    70.3％
  326mg/dl     48.8％    71.5％
  384mg/dl     47.3％    68.6％
  494mg/dl     44.2％    64.3％
  728mg/dl     36.1％    57.5％
  合计反射率范围     38.6％    24.1％
如表2所示，含有“湿涂布”膜的功能模型比含有相同反应性薄膜的“干涂布”膜，在全部测定范围内产生多得多的色彩(更低的反射率值)。
此外，这些测定值表明，在全部测定范围内达到的反射率范围(即甘油三酸酯浓度65mg/dl和728mg/dl的相对反射率之差)，在38.6％REM的“湿涂布”膜比在24.1％REM的“干涂布”膜的大得多(还可参见图2所示的曲线图，其中1是湿涂布膜的测定曲线，2是干涂布膜的测定曲线)。
由于“湿涂布”膜的反射率范围大得多，反射率测量与测量间的变化导致浓度变化低得多，从而功能模型的精度更高。

Claims (16)

1、往微孔膜上涂布含有固体的反应性薄膜的方法，其特征在于首先润湿该膜，且把含有固体的反应性薄膜涂布到仍然潮湿的膜上。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于该膜分离血液。
3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于该反应性薄膜含有成膜剂、薄膜致孔剂和任选地光学阻挡颜料。
4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于薄膜致孔剂与成膜剂的质量比是10∶1-1∶1。
5、根据上述权利要求中任一项权利要求所述的方法，其特征在于该反应性薄膜在润湿后直接涂布到膜上。
6、根据上述权利要求中任一项权利要求所述的方法，其特征在于采用浴浸渍润湿该膜。
7、根据上述权利要求中任一项权利要求所述的方法，其特征在于使用水或水溶液润湿该膜。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于水或水溶液含有润湿剂。
9、根据上述权利要求中任一项权利要求所述的方法，其特征在于采用刮涂法或缝模涂布法涂布反应性薄膜。
10、采用权利要求1-9中任一项权利要求所述方法可得到的涂布反应性薄膜的微孔膜。
11、涂布反应性薄膜并含有成膜剂和薄膜致孔剂的微孔膜，其特征在于薄膜致孔剂与成膜剂的质量比是10∶1-1∶1。
12、根据权利要求11所述的膜，其特征在于成膜剂是耐水的。
13、根据权利要求11或12所述的膜，其特征在于薄膜致孔剂是有机或无机颗粒材料。
14、根据权利要求11、12或13所述的膜，其特征在于该膜分离血液。
15、根据上述权利要求中任一项权利要求所述的膜，其特征在于薄膜致孔剂与成膜剂的质量比是5∶1-2∶1。
16、检测体液成分的诊断单元，它包括涂布根据权利要求10-15中任一项权利要求所述的反应性薄膜的膜。
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