CN101043875B

CN101043875B - 糖皮质激素和糖皮质激素衍生物的脂质体组合物

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Publication number: CN101043875B
Application number: CN200580035942.2A
Authority: CN
Inventors: 叶切科尔·巴伦霍茨; 阿尔伯托·A·加比宗; 尤瓦尔·阿夫尼埃尔
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 2004-09-09
Filing date: 2005-09-11
Publication date: 2014-05-07
Anticipated expiration: 2025-09-11
Also published as: CA2579786A1; JP5355890B2; US7744920B2; CN101043875A; WO2006027786A2; AU2005281352B2; US20080058294A1; WO2006027786A8; WO2006027786A3; US20150093434A1; JP2008512445A; JP2008512446A; AU2005281351B2; US8932627B2; CN101048138A; US20080003276A1; EP1793804A2; CN101048138B; AU2005281351A1; EP1791525A1

Abstract

本发明提供了糖皮质激素和糖皮质激素衍生物的脂质体组合物，具体是，含有稳定包封在脂质体中的糖皮质激素或糖皮质激素衍生物的药物组合物。所述糖皮质激素或糖皮质激素衍生物选自：具有pKa等于或小于11且在pH7时logD为-2.5～1.5的两亲弱碱性糖皮质激素或糖皮质激素衍生物；或者具有pKa大于3.5且在pH7时logD为-2.5～1.5的两亲弱酸性糖皮质激素或糖皮质激素衍生物。使用多发性硬化和癌症的合适模型，本发明的药物组合物在体内表现出治疗效果。

Description

糖皮质激素和糖皮质激素衍生物的脂质体组合物

技术领域

本发明通常涉及脂质体技术，具体地说，涉及该技术用于体内输送糖皮质激素的用途。

背景技术

糖皮质激素(糖皮质类固醇)是一类特征在于能与在几乎所有脊椎动物组织细胞内发现的皮质醇受体结合并引发相似效果的类固醇激素。糖皮质激素通过特定受体、靶细胞和效果等与诸如性类固醇等其他类固醇区分开。皮质醇(或氢化可的松)是天然的最重要的人糖皮质激素。

糖皮质激素具有潜在的抗炎和免疫抑制性质。这在以药理剂量施用糖皮质激素时是非常明显的，而且在生理学免疫应答中也是重要的。结果，糖皮质激素广泛用作用于治疗诸如关节炎或皮炎等炎性症状的药物，以及用作诸如自体免疫疾病等症状的附加疗法。另一方面，由作为药物施用导致的过量糖皮质激素水平或肾上腺皮质功能亢进对许多系统都有副作用，一些实例包括抑制骨骼形成、抑制钙吸收以及延缓伤口愈合等。

已开发多种合成的糖皮质激素用于治疗用途，其中一些比皮质醇有效得多。它们具有不同的药物代谢动力学(吸收因素、半衰期、分布体积、清除率)和药物效应动力学(例如盐皮质激素活性的能力：钠(Na⁺)和水的保持)。因为可很好地通过小肠吸收，它们主要通过口服(经口)施用，但也可通过诸如在皮肤上局部施用等其他途径施用。

甲泼尼龙(孕甾-1，4-二烯-3，20-二酮，11，17，21-三羟基-6-甲基-，(6α，11β)。C₂₂H₃₀O₅，MW374.48)是治疗上有效的合成糖皮质激素药物的一个实例，由于其具有疏水特性，因此通常口服服用。类似于大多数肾上腺皮质类固醇，甲泼尼龙通常用于抗炎目的。然而，糖皮质激素具有广泛的作用，包括对代谢和免疫应答的改变。类似于其他皮质类固醇，甲泼尼龙对之有效的疾病或病理症状的列表是相当长的。常见用途包括关节炎治疗，以及由于各种呼吸道疾病导致的支气管炎症的短期治疗。虽然非常有效，但由于频发尤其是与长期治疗有关的严重不良作用，它们的全身应用受到限制。

糖皮质激素的全身施用的有效性和安全性研究揭示了除所述药物在不同组织中的深奥活性外，这些药物被从血浆中快速清除，因此需要大而频繁的剂量以获得靶位点处的有效量。

因此，研究了作为另外一种选择的用于肠胃外施用的方法。例如，开发糖皮质激素的局部区域内施用(例如通过在哮喘中使用吸入器和在关节炎中使用关节内注射)使得能使用较低剂量的类固醇而在损伤处获得足够药物水平，同时具有最小的副作用。

另外的方法包括通过使用诸如脂质体等合适的载体将药物靶向靶组织。

Fildes FJ等，[J Pharm.Pharmacol.30(6)：337-42(1978)]首次尝试将皮质类固醇包封在脂质体中，其中包括在脂质体的脂双层中包封胆固醇。该方法基于皮质类固醇实际上是疏水性的理解。然而，这样的脂质体制剂变得不适合临床应用。

同样也努力开发“可溶性”糖皮质激素。实例包括琥珀酸(succinate)衍生的类固醇，例如氢化可的松半琥珀酸钠盐和甲泼尼龙半琥珀酸钠盐。另一类可溶性糖皮质激素包括类固醇的磷酸衍生物。当赋予类固醇水溶性使得能使用注射用酸性类固醇时，显示出这些“药物前体”在注射后少于6小时内从血浆中完全清除。[Mishina EV等，Pharm Res 13(1)：141-5(1996)]。

还研究了酸性类固醇与脂质体的组合。Schmidt等，[Schmidt J等，Brain 126(8)：1895-1904(2003)]描述了聚乙二醇(PEG)包覆的长期循环空间稳定的脂质体包封有磷酸泼尼松龙(水溶性类固醇药物前体中的一种)的制剂以及其在治疗多发性硬化中与游离形式的类固醇相比的有利效果。然而，类似包封半琥珀酸甲泼尼龙(一种弱酸)的尝试失败了，原因在于其导致产生不稳定的制剂。

另外，[Gonzalez-Rothi，Ricardo J等，Pharmaceutical Research13(11)：1699-1703(1996)]描述了将磷酸曲安奈德(曲安西龙的水溶性强酸衍生物(pKa小于2))包封在脂质体中。所述脂质体制剂通过将酸性皮质类固醇被动装载入脂质体中进行制备并用作用于治疗肺部症状的可注射剂型(静脉内的或气管内的)。另外，离体(ex vivo)稳定性研究中显示出在24小时后所述脂质体保留有超过75％的酸性皮质类固醇。

发明内容

本发明基于以下发现：采用化学修饰的糖皮质激素(GC)(以其两亲弱酸形式)使得能在脂质体中有效装载酸性GC。令人惊奇地是，因此形成的脂质体弱酸性GC是稳定的，即在4℃保存甚至14个月以后大部分所述物质以完整的酸性GC的形式保留在脂质体内。一旦从脂质体中释放至水或体液中，所述酸性GC水解得到活性非酸性GC。

因此，根据本发明的第一方面，本发明提供了含有包封在脂质体中的GC或GC衍生物的药物组合物，其中所述GC或GC衍生物基本上保留在所述脂质体中6个月，优选为10个月和更优选为14个月，所述GC/GC衍生物选自：

i)具有pKa等于或低于11且在pH7时logD为约-2.5～约1.5，优选为约-1.5～约1.0的两亲弱碱性GC或GC衍生物；

ii)具有pKa大于3.5且在pH 7时logD为约-2.5～约1.5，优选为约-1.5～约1.0的两亲弱酸性GC或GC衍生物。

所述GC衍生物优选为酸性GC，即在从脂质体释放至体液后转化为非酸性形式的两亲弱酸性GC衍生物。更具体地说，所述酸性GC是甲泼尼龙半琥珀酸钠(MPS)。

优选的本发明的MPS制剂含有由氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、(甲基)聚乙二醇包覆的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)和胆固醇以55∶40∶5的摩尔比组合形成的空间稳定的脂质体。

所述药物组合物优选用于任何其可接受的治疗形式包括施用糖皮质激素的疾病的治疗或预防。

本发明的药物组合物通常至少在以下一个方面优于非包封的GC：更好地输送至靶位点、更长的循环时间、更慢的清除率、更少的副作用、更高的效率或更高的治疗指数。

所述药物组合物优选用于多发性硬化的治疗或防治。

所述药物组合物也优选用于已知对类固醇敏感的癌症的治疗或防治，所述癌症例如造血起源的癌症，包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、乳癌和前列腺癌。

本发明还提供了GC或GC衍生物用于制备本发明的药物组合物的应用，所述GC或GC衍生物包封在脂质体中，其中所述GC或GC衍生物基本上保留在所述脂质体中6个月，优选为10个月和更优选为14个月，所述GC或GC衍生物选自：

ii)具有pKa大于3.5且在pH7时logD为约-2.5～约1.5，优选为约-1.5～约1.0的两亲弱酸性GC或GC衍生物。

此外，本发明提供一种将糖皮质激素(GC)，优选为不与水混溶的GC，输送至体内靶位点的方法，所述方法包括将所述GC化学修饰为如权利要求1～14中任一项所述的两亲弱酸衍生物或两亲弱碱衍生物，以及将所述两亲弱酸衍生物或两亲弱碱衍生物装载在脂质体中。具体地说，所述脂质体是空间稳定的脂质体和所述GC衍生物通过形成跨脂质体膜离子或pH梯度(即通过主动装载技术)而装载入所述脂质体中。

此外，本发明提供一种用于治疗或防治疾病或病理症状的方法，所述方法包括向有需要的受试对象施用一定量的包封在脂质体中的GC或GC衍生物，所述量足以实现治疗效果。

优选为所述方法包括注射所述包封有GC或GC衍生物的脂质体。

附图说明

为理解本发明并领会如何实际实施本发明，现将仅通过非限制性实施例的方式，参考如下附图描述优选实施方案，在所述附图中：

图1A-1C是显示甲泼尼龙半琥珀酸钠(MPS)化学特性的曲线图，所述化学特性包括作为pH函数的MPS的浊度(图1A)；MPS在不同pH点的分配系数(图1B)；以及作为GC浓度函数的半琥珀酸甲泼尼龙和磷酸地塞米松的表面张力(图1C)。

图2A-2B是在主动装载MPS前(图2A)和后(图2B)脂质体的Cryo-TEM(透射电子显微术)图像。

图3A-3B是在4℃保存14个月后SSL-MPS的尺寸排阻色谱图，而图3B是描述图3A的级分8～17的这部分的放大图，显示存在极少量的游离MPS和甲泼尼龙(MP)。

图4是在血浆中温育时，MPS和Ca⁺²从SSL-MPS中的释放曲线。

图5是显示SSL-MPS治疗在实验性自体免疫脑脊髓炎(EAE)中的效果的示图。

图6A和6B是显示SSL-MPS治疗在EAE诱导的动物中对存活率(％)(图6A)和平均临床评分(图6B)的效果的曲线图。

图7是显示与两种常规药物倍泰龙(Betaferon)和克帕松(Copaxone)相比，SSL-MPS治疗对EAE的效果的曲线图。

图8是显示SSL-MPS治疗在慢性EAE动物模型中的效果的曲线图。

图9是显示SSL-MPS治疗对BCL-1淋巴瘤的存活率的效果的曲线图。

具体实施方式

糖皮质激素(GC)是主要影响碳水化合物(和在更小范围里的脂肪和蛋白)的代谢(并具有其他作用)的一类激素。糖皮质激素是在肾上腺的外侧部分(皮质)中产生并在化学上分类为类固醇。皮质醇是主要的天然糖皮质激素。虽然如此，术语“糖皮质激素”也用于指实验室中合成的等价激素。

在互联网站点http://www.steraloids.com/可以找到糖皮质激素的非限制性列表，在此以参考的方式全文引入。实例包括半琥珀酸泼尼松龙、半琥珀酸甲泼尼龙、半琥珀酸地塞米松、半琥珀酸别孕烷醇酮、倍氯米松21-半琥珀酸、倍他米松21-半琥珀酸、半琥珀酸勃地酮、半琥珀酸泼尼松龙钠盐、泼尼松龙21-半琥珀酸、半琥珀酸诺龙、19-去甲睾酮半琥珀酸酯、脱氧皮质酮21-半琥珀酸、半琥珀酸地塞米松、半琥珀酸地塞米松:精胺、半琥珀酸皮质酮、11-脱氧皮甾醇半琥珀酸酯(cortexolonehemisuccinate)。

类似许多其他药物，施用游离形式的GC可具有一些缺点，例如使受治疗个体受到已知与GC治疗伴生的副作用影响的风险，类固醇从血浆中被迅速清除等。

在寻求克服这些缺点时，本发明人已设想，尽管难以将相当疏水的GC有效地和稳定地装载入载体中，但通过对糖皮质激素进行相当简单的化学修饰(涉及将所述类固醇转化为水溶性衍生物)可以将所述衍生物装载入脂质体中。

因此，本发明提供了含有包封在脂质体中的糖皮质激素(GC)或GC衍生物的稳定药物组合物，其中所述GC或GC衍生物基本上保留在所述脂质体中6个月，优选为10个月，更优选为14个月，所述GC或GC衍生物选自：

此处使用的术语“GC衍生物”指或者通过插入化学基团或者通过从GC分子上移除化学基团进行化学修饰过的GC分子，所述修饰导致所述分子根据所用修饰的类型转化为两亲弱碱或两亲弱酸。正如精通类固醇化学的技术人员能很好地理解的那样，这些天然亲水分子具有至少一个可与弱酸或弱碱结合而形成相应的两亲弱酸或两亲弱碱分子的化学反应性基团。正如精通化学的技术人员公知的那样，通常包含在类固醇基本结构中的化学反应性基团的非限制性实例有羟基、羧基等。应当注意的是在本发明的上下文中，GC衍生物也包括活性的、非修饰的、两亲的和弱酸性的GC。

一方面，GC衍生物是药物前体，即当其为存在于脂质体中的形式时不具有药物活性。随着从脂质体中释放，所述GC药物前体通过例如酯酶等酶转化为其具有药物活性的疏水形式。

根据另一方面，包封在脂质体中的GC已经是其药物活性形式，和不需要进行任何酶促过程使之变得有活性。根据第二方面，GC本身是弱两亲酸或碱。

此处使用的术语“两亲弱酸”指既具有疏水基团又具有亲水基团的分子，GC的类固醇骨架基本构成所述疏水基团，而由于上述修饰而连接在GC上的弱酸部分基本构成所述亲水基团。所述GC两亲弱酸或GC衍生物的特征在于下列物理特性：

-pKa：其具有大于3.0，优选为大于3.5，更优选为约3.5～约6.5的pKa；

-分配系数：在pH为7.0的正辛醇/缓冲液(水相)体系中，其具有约-2.5～约1.5，更优选为约-1.5～约1.0的logD。

可通过本领域技术人员已知的技术将GC与二羧酸或三羧酸反应，或者将GC连接到氨基酸的氨基上而得到上述GC的两亲弱酸性衍生物。

GC衍生物的具体实例包括，但不限制于，倍他米松21-半琥珀酸泼尼松龙半琥珀酸钠盐、泼尼松龙21-半琥珀酸、半琥珀酸地塞米松、半琥珀酸地塞米松:精胺、半琥珀酸皮质酮半琥珀酸泼尼松龙、半琥珀酸甲泼尼龙、半琥珀酸地塞米松。

此处使用的术语“两亲弱碱”指既具有疏水基团又具有亲水基团的分子，GC的类固醇骨架基本构成所述疏水基团，而由于上述修饰而连接在GC上的弱碱部分基本构成所述亲水基团。所述GC两亲弱碱性衍生物的特征在于下列物理特性：

-pKa：其具有小于11.0，更优选为约11.0～约7.5的pKa；

-分配系数：在正辛醇/缓冲液(水相)体系中，其具有约-2.5～约1.5，优选为-1.5～约1.0的logD。

可通过以下方法得到上述GC的两亲弱碱性衍生物：将GC与诸如精氨酸或赖氨酸等碱性氨基酸反应，或使GC通过其羧基与任何氨基酸反应而使氨基自由，或将GC与诸如亚精胺或精胺等多胺反应。

此处使用的术语“脂质体”指基于脂质的双层泡囊。脂质体广泛用作药物、肽、蛋白质、原生质DNA(plasmic DNA)、反义寡核苷酸或核酶的生物相容性载体，而用于药物、化妆和生化目的。所述脂质在颗粒尺寸和物理参数上极其丰富的多样性提供了有吸引力的潜力，以用于为广泛的应用而构建特制载体。对于不同的应用(例如胃肠外、经皮、肺部、鼻内和口服施用)的各种脂质制剂(脂质体、脂复合物、立方相、乳剂、微胶粒和固体脂质纳米颗粒)的不同性质(尺寸、胶体行为、相转移、电荷和多形性)对于本领域技术人员是可用的和已知的。这些性质影响所述脂质体的相关性质，例如脂质体在保存时和在血清中的稳定性，生物分布和货物的被动或主动(特异性)靶向，以及如何触发药物释放和膜解体和/或融合。

本发明可用于大量脂质体组合物而本领域技术人员知道如何根据不同的考虑来选择所述脂质体的组成，所述考虑包括GC或GC衍生物的选择、最终脂质体制剂的施用模式等。

所述脂质体是主要由形成脂质体的脂质所组成的脂质体，所述脂质是两亲分子，该两亲分子的基本特征在于包装参数为0.74～1.0或者在于加和包装参数(脂质体每种成分的包装参数乘以每种成分的摩尔分数的总和)为0.74～1的脂质混合物。

形成脂质体的脂质，此处可举出磷脂，其在水中形成双层泡囊。所述脂质体也可以包括加入到所述脂质双层中的其他脂质，例如磷脂酰乙醇胺(PE)和甾醇，这些其他的脂质的疏水部分与双层膜的内侧疏水区域相接触，而其头部基团部分朝向双层膜的外侧极性表面。这些附加的非形成脂质体的脂质成分的类型和水平取决于所述脂质双层的所有组分的加和包装参数保持为0.74～1.0。

所述形成脂质体的脂质优选为具有丙三醇骨架的脂质，在丙三醇骨架中头部基团的至少一个优选两个羟基优选被酰基链取代(以形成酰基或二酰基衍生物)，然而也可以被烷基链或烯基链、磷酸基团或它们的组合或衍生物取代，并且在所述头部基团中可含有化学反应性基团(例如胺、酸、酯、醛或醇)，因此提供了极性头部基团。诸如鞘磷脂等鞘脂是甘油磷酸酯的优秀替代物。

通常，所述取代链，例如酰基链、烷基链或烯基链的长度为14～约24个碳原子，并具有为完全氢化、部分氢化或非氢化脂质等不同的饱和度。此外，所述脂质可以是天然来源的、半合成的或者全合成的脂质，并且可以是中性的、带负电的或带正电的。存在大量形成泡囊的合成脂质和形成泡囊的天然脂质，包括诸如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、蛋黄磷脂酰胆碱(EPC)、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱(POPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)等磷脂；磷脂酸(PA)、磷脂酰丝氨酸(PS)1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱(POPC)，以及诸如具有12～24个碳原子酰基链或烷基链的鞘磷脂(SM)等鞘磷脂。上述具有不同饱和度的烃链(酰基/烷基/烯基链)的脂质和磷脂可以商购或根据公开的方法制备。其他合适的包含在脂质体中的脂质有甘油糖脂和鞘糖脂和甾醇(例如胆固醇或植物甾醇)。

优选为所述磷脂是蛋磷脂酰胆碱(EPC)、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱(POPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)或氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)。

阳离子脂质(单阳离子和多阳离子)也适合用于本发明的脂质体中，其中所述阳离子脂质可作为所述脂质组合物的次要成分或作为主要或单独组分被包含于其中。所述阳离子脂质通常具有亲脂部分，诸如甾醇、酰基链或二酰基链，并且其中所述脂质具有整体上的净正电荷。优选为所述脂质载体的头部基团带正电。单正电荷脂质可包括例如，1，2-二肉豆蔻酰-3-三甲基铵丙烷(DMTAP)、1，2-二油酰氧-3-(三甲基氨基)丙烷(DOTAP)、N-[1-(2，3-二(十四烷氧基))丙基]-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N-二甲基-N-羟乙基-溴化铵(DORIE)、N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、3β[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)和二甲基-二(十八烷基)铵(DDAB)。

多阳离子脂质的实例包括与单阳离子脂质相似的亲脂性部分，多阳离子部分与所述亲脂性部分相连。示例性多阳离子部分包括精胺或亚精胺(可举出DOSPA和DOSPER)，或者诸如聚赖氨酸等肽或其他多胺脂质。例如，中性脂质(DOPE)能与聚赖氨酸衍生形成阳离子脂质。多阳离子脂质包括但不局限于N-[2-[[2，5-双(3-氨丙基)氨基]-1-氧戊基]氨基]乙基]-N，N-二甲基-2，3-双[(1-氧-9-十八碳烯基)氧基]-1-丙铵(DOSPA)和神经酰胺氨基甲酰基精胺(CCS)。

所述形成脂质体的脂质混合物可经选择后实现特定程度的流动性或刚性，以控制所述脂质体在血清中的稳定性以及控制被包封在脂质体中的试剂的释放速率。

此外，所述脂质体也可以包括脂质与亲水聚合物衍生形成的称为脂聚合物的新的实体。脂聚合物优选包括在其头部基团处使用分子量等于或大于750Da的聚合物进行修饰的脂质。所述头部基团可以是极性的或非极性的，然而，优选连接有较大(＞750Da)高度水化(每个头部基团水化至少60个分子水)的柔性聚合物的极性头部基团。所述亲水聚合物头部基团与脂质区域的连接可以是共价的或者非共价的连接，然而，优选通过共价键的形成(可选地通过接头)。亲水聚合物链的最外层有效地使得脂质体在体内具有较长的血液循环寿命。所述脂聚合物可以通过两种不同方式导入脂质体：(a)或者通过将所述脂聚合物加入到形成脂质体的脂质混合物中。所述脂聚合物将被合并以及暴露在脂质体双层的内小叶和外小叶[Uster P.S.等，FEBBS Letters 386：243(1996)]；(b)或者通过首先制备脂质体然后或者通过在高于脂质体和形成脂质体的脂质的Tm的温度温育，或者通过短时间微波照射将脂聚合物并入预先形成的脂质体的外小叶。

以下文献中已经描述了包含形成脂质体的脂质的泡囊的制备和亲水聚合物对所述脂质的衍生(因此形成脂聚合物)，例如Tirosh等，[Tirosh等，Biopys.J.，74(3)：1371-1379，(1998)]和在美国专利第5,013,556号、第5,395,619号、第5,817,856号、第6,043,094号、第6,165,501号中，在此通过参考的方式整体引入，以及在WO 98/07409中。所述脂聚合物可以是非离子脂聚合物(有时也称为中性脂聚合物或不带电荷的脂聚合物)或具有净负电荷或净正电荷的脂聚合物。

存在可以连接到脂质上的大量聚合物。通常用作脂质修饰物的聚合物包括但不局限于：聚乙二醇(PEG)、聚唾液酸、聚乳酸(也称为聚丙交酯)、聚羟基乙酸(也称为聚乙交酯)、聚乳酸-聚羟基乙酸(apolylactic-polyglycolic acid)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟乙基噁唑啉、聚羟丙基噁唑啉、聚天冬酰胺(polyaspartmide)、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚乙烯基甲基醚、聚丙烯酸羟乙基酯、诸如羟甲基纤维素或羟乙基纤维素等衍生纤维素。这些聚合物可以以均聚物或嵌段共聚物或无规共聚物的形式使用。

尽管衍生为脂聚合物的脂质可以是中性、带负电荷以及带正电荷的，但是对带特定电荷(或者不带电荷)没有限制，最常使用并可市售购得的衍生为脂聚合物的脂质是基于磷脂酰乙醇胺(PE)，通常为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)的那些脂质。

本发明采用的一类具体的脂聚合物包括连接至DSPE的单甲基化PEG(具有不同长度的PEG链，所述甲基化PEG在本文简称为PEG)，其中所述PEG聚合物通过氨基甲酸酯连接与脂质相连而形成带负电荷的脂聚合物。其他脂聚合物是中性甲基聚乙二醇二硬脂酰甘油(mPEG-DSG)和中性甲基聚乙二醇羟羰基-3-氨基-1，2-丙二醇二硬脂酰酯(mPEG-DS)[Garbuzenko O.等，Langmuir.21：2560-2568(2005)]。所述PEG部分优选具有分子量为约750Da～约20,000Da的头部基团。更优选为所述分子量为约750Da～约12,000Da以及最优选为约1,000Da～约5,000Da。本文采用的一种具体的PEG-DSPE是其中PEG具有2000Da分子量的PEG-DSPE，在本文称为²⁰⁰⁰PEG-DSPE或者^2kPEG-DSPE。

已描述包括所述衍生脂质的脂质体的制备，其中通常为1摩尔％～20摩尔％的所述衍生脂质包括在所述脂质体制剂中。

已很好地确定：脂质体制剂的制备涉及除水相成分成分以外选择合适的脂质组合物，所述水相成分例如缓冲剂、抗氧化剂、金属螯合剂和低温保护剂等。诸如磷脂酰甘油等电荷诱导脂质可加入到脂质体双层中以降低泡囊-泡囊融合并增强与细胞的相互作用，同时胆固醇和鞘磷脂可包含在制剂中以降低包封药物的可透过性和泄漏。在中性pH的缓冲剂能减低水解。加入诸如抗坏血酸钠等抗氧化剂能降低氧化等。

这些脂质体成分间比例的变化控制所述脂质体的药物性质，包括脂质体的稳定性，这是多种类型的泡囊应用的主要考虑因素。显然，脂质体的稳定性应当满足与常规药物相同的标准。化学稳定性涉及防止磷脂双层中的酯键水解和脂质链中不饱和位点的氧化。化学不稳定性可导致物理不稳定性或者包封药物从双层中的泄漏以及泡囊的融合和聚集。化学不稳定性也可导致脂质体的血液循环时间短，这将影响有效接近靶目标和与靶目标的相互作用。

本发明的优选制剂是含有诸如蛋PC(EPC)或氢化大豆PC(HSPC)等磷脂酰胆碱(PC)(作为形成脂质体的脂质)、PEG化(2000Da)的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)和胆固醇的制剂。明显地是，也可以以相同、相近或者不同摩尔比采用其他脂质混合物，条件是脂质体的不同成分的最终加和包装参数为约0.74～1.0。

已证明本发明的药物制剂是高度稳定的。在本发明的一个示意性实施方案中，GC衍生物、琥珀酸甲泼尼龙(用琥珀酸修饰的甲泼尼龙)被包封在含有上述三种成分的脂质体中，该实施方案显示在4℃保存14个月后GC衍生物仅有少量的减少(从起始浓度算少于20％)(图3A-3B)。

因此，在本发明的上下文中，术语“稳定性”指制剂在常规保存条件(4℃)在脂质体中保留大部分(超过80％，优选超过90％)GC/GC衍生物长达6个月、优选为10个月并更优选为14个月。因此，此处使用的术语“基本上保留”指80％，优选90％的GC/GC衍生物在保存条件下保留在脂质体中长达约6个月，优选为10个月并更优选为14个月。根据一个优选实施方案，通过使用立体稳定脂质体(SSL)，即包覆有亲水成分的脂质体来保持脂质体的稳定性。根据一个优选实施方案，所述SSL包含摩尔比为55∶40∶5的氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、²⁰⁰⁰PEG-DSPE和胆固醇的组合。

通常，可获得多种药物装载方法以制备含有俘获药物的脂质体，包括被动俘获和主动远程装载。所述被动俘获法最适合将亲脂性药物俘获入脂质体膜中以及最适合俘获高水溶解性的药物。在可离子化亲水性或两亲药物的情况下，通过将药物逆膜离子梯度装载入脂质体甚至能实现更高的药物装载效率[Nichols，J.W，等，Biochim.Biophys.Acta455：269-271(1976)；Cramer，J.，等，Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 75(2)：295-301(1977)]。通常称为远程装载的这种装载方法通常涉及天然为两亲并具有可离子化基团的药物，通过将所述药物加入到具有内侧较高/外侧较低的H⁺和/或离子梯度的脂质体悬浮液中进行装载。

在本发明的上下文中采用的脂质体优选通过远程装载原理进行装载。所得制剂表现出显著高的GC衍生物：脂质比例。优选为GC衍生物与脂质的摩尔比为0.01～2.0，更优选为0.04～0.25。对于GC衍生物的高装载，有时候优选其在脂质体中的浓度为使其在预先俘获的反离子存在下沉淀。

可以通过多种技术制备用于远程装载中具有跨脂质体双层的H⁺和/或离子梯度的脂质体。典型的方法包括将具有形成稳定脂质体的比例的脂质混合物溶解在合适的有机溶剂中并在容器中蒸发形成脂质薄膜。随后使用将在脂质体内部空间中形成水相的含有溶质物质的水性介质覆盖在薄膜上。在脂质体形成后，根据已知方法可以调节泡囊的尺寸以实现在所选范围内的脂质体尺寸分布。在本发明中使用的脂质体优选为均匀调整至选定的尺寸范围70nm～100nm，优选为约80nm。

在调整尺寸后，脂质体的外部介质经处理形成跨脂质体膜的离子梯度(通常使用与形成脂质体相同的缓冲液)，其通常为内侧较高/外侧较低的离子浓度梯度。这可以通过多种方式完成，例如通过(i)稀释外部介质，(ii)对所需的最终介质透析，(iii)凝胶排阻色谱，例如使用Sephadex G-50，在用于洗脱的所需介质中平衡，或者(iv)重复进行高速离心和将沉淀脂质体在所需最终介质中重悬浮。外部介质的选择取决于梯度的类型、梯度形成的机制、外部溶质和所需的pH，现将进行描述。

在产生离子和/或H⁺梯度的最简单的方法中，脂质在具有选定的内部介质pH的介质中进行水合和调整大小。脂质体的悬浮液经过滴定直到外部脂质体混合物达到所需最终pH，或者经过如上处理使外部相缓冲液与具有所需外部pH的缓冲液交换。例如，在选定的缓冲液，例如谷氨酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐缓冲液中的起始水合介质可具有5.5的pH，而最终外部介质可具有在相同或不同缓冲液中的8.5的pH。这些缓冲液的共同特性是它们形成自脂质体基本不能穿过的酸。优选选择内部和外部介质使之含有相同的重量克分子渗透浓度，例如通过合适地调节缓冲液、盐或诸如葡萄糖或蔗糖等低分子非电解质溶质的浓度。

在另外一种通用方法中，通过在脂质体中包括选定的离子载体来生成梯度。为了进行示例，在钾缓冲液中制备用于制备在脂质体双层中包含缬氨霉素的脂质体，调整尺寸，然后外部介质与钠缓冲液交换，而产生内侧钾/外侧钠的梯度。钾离子由内向外方向的移动接着产生内侧较低/外侧较高的pH梯度，大概是由于质子响应跨脂质体膜的净电负性从而进入脂质体的移动[Deamer，D.W.，等，Biochim.et Biophys.Acta 274：323(1972)]。

相似的方法是水合所述脂质和在高浓度硫酸镁中调整所形成的多层脂质体的尺寸。通过对蔗糖中的20mM HEPPES，pH 7.4的缓冲液透析产生所述硫酸镁梯度。然后，加入A23187离子载体，而引起镁离子的向外转运以每个镁离子交换两个质子，还建立脂质体内侧高/脂质体外侧低的质子梯度[Senske DB等(Biochim.Biophys.Acta 1414：188-204(1998)]。

在另一个更优选的方法中，用于药物装载的质子梯度是通过建立跨脂质体膜的铵离子梯度产生的，如同在例如美国专利第5,192,549号和第5,316,771号中所描述，在此以参考的方式引入。所述脂质体在含有诸如硫酸铵、磷酸铵和柠檬酸铵等铵盐的水性缓冲液中制备，所述铵盐通常为在诸如5.5～7.5的合适pH的0.1M～0.3M铵盐。所述梯度也可以通过在水合介质中包括硫酸化聚合物产生，所述硫酸化聚合物例如葡萄糖硫酸酯铵盐、肝素硫酸酯铵盐或硫糖铝。在脂质体形成和尺寸调整以后，外部介质与不含铵离子的介质交换。在该方法中，在装载过程中两亲弱碱与铵离子进行交换。

还有，在美国专利第5,939,096号中描述了另一种方法，在此以参考的方式引入。简言之，所述方法采用包括诸如乙酸等弱酸的盐的质子穿梭机制，所述弱酸盐的质子化形式跨过脂质体膜进行位置转移而形成内侧高/外侧低的pH梯度。然后将两亲弱酸化合物加入到预先形成的脂质体的介质中。所述两亲弱酸响应该梯度在脂质体内聚集，并通过阳离子(例如钙离子)促进的沉淀或跨脂质体膜低穿透性保留在脂质体中，即，所述两亲弱酸与乙酸交换。

装载有GC或GC衍生物的脂质体可以以多种方式施用。它可与本领域内已知的生理上可接受的赋形剂联合配制。根据本发明采用的可药用赋形剂通常包括优选不与脂质体反应的惰性无毒物质。所述赋形剂可以是任何通常使用的赋形剂并只受限于化学-物理考虑(例如溶解度和不具有与脂质体的反应性)和施用途径。赋形剂有时还可以具有提高所述脂质体制剂输送或渗到靶组织、提高所述脂质体制剂的稳定性、减缓清除速度、赋予缓释特性和减少不希望的副反应等作用。所述赋形剂也可以是稳定制剂的物质(例如防腐剂)，为制剂提供可食用香味等。所述赋形剂可以包括添加剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、湿润剂、防腐剂、香味剂以及药理学相容的载体。例如，当治疗神经变性症状时，所述赋形剂可以是已知能促进或协助通过血脑屏障(BBB)的分子，诸如转铁蛋白受体结合剂、抗体或者任何自身能通过BBB转移的药物。

本发明的药物组合物具有用于治疗多种症状的优点，所述症状通常是已知能通过施用GC进行治疗的症状(至少在其进程中的一个阶段)。这样的症状的实例包括神经变性症状和癌症，在后文中详细描述。因此，除GC或GC衍生物以外，本发明的脂质体制剂还可含有一种以上活性成分。附加的活性成分可以处于游离形式或者也包封在脂质体中(与含有GC衍生物脂质体在一起或者分离)。例如，当治疗癌症时，所述附加活性成分可以是包封在相同或不同脂质体中的细胞毒性药物，诸如阿霉素。用于治疗神经变性症状时，所述脂质体制剂可以与克帕松或者倍泰龙组合。

下述为可使用本发明的脂质体制剂治疗或防治的医学症状的非限制性列表，其他已知可受益于GC治疗的症状也包括在本发明的范围之中：

内分泌失调，包括原发性或继发性肾上腺皮质功能不全；先天性肾上腺增生、与癌症相关的高钙血综合征、非化脓性甲状腺炎。

胶原疾病，包括例如在以下选定案例中用于加重期或者作为维持疗法。

皮肤病，包括例如天疱疮、大疱皮炎、严重红斑多疱疹样形状(斯蒂文斯-约翰逊严重皮脂溢综合征)皮炎、剥脱性皮炎、严重牛皮癣、蕈样真菌病。

过敏状态，包括例如控制如下对常规治疗的充分试验不响应的严重或失能性过敏症状：支气管哮喘、药物超敏接触性皮炎反应、特应性皮炎、荨麻疹性输血反应、血清病反应、季节性或常年性急性非传染性过敏性鼻炎喉水肿。

眼部疾病，包括例如累及眼睛的严重急慢性过敏性和炎性过程，例如：眼带状疱疹、交感性眼炎、虹膜炎、虹膜睫状体炎、前段脉络膜视网膜炎、炎症扩散性后色素层炎、过敏性结膜炎和脉络膜炎、过敏性角膜边缘、视神经炎溃疡、角膜炎。

呼吸性疾病，包括例如症状性结节病、吕弗勒氏综合征非铍中毒(可受其他爆发性或传播性控制，不受其他方法控制)，吸入性肺炎、肺结核(可选地与合适的抗肺结核化学治疗法同时使用)。

血液疾病，包括获得性(自体免疫性)溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、继发性血小板减少症、成红细胞减少症(RBC贫血)、先天性(红细胞)再生不良性贫血。

肿瘤病，包括例如，用于控制：白血病和淋巴瘤、骨髓瘤、乳癌和前列腺癌。

水肿状态，包括例如，在特发型或红斑狼疮引起的肾病综合征(没有尿毒症)中诱导利尿或缓解蛋白尿。

神经系统，包括例如多发性硬化(MS)的急性加重期。

以及其他症状，例如具有蛛网膜下腔阻滞或者趋于阻滞的结核性脑膜炎(当与合适的抗结核性化学治疗同时使用时)；累及神经系统或心肌的旋毛虫病。

因此，本发明也涉及一种用于治疗或防治疾病或病理症状的方法，所述方法包括向需要所述治疗的受试对象施用一定量的本发明的脂质体制剂，所述量为有效地治疗或防治所述疾病和病理症状的量(下文中为“有效量”)。由本发明治疗的优选症状是癌症和神经变性症状。

此处使用的术语“治疗”指施用一定量的包封在脂质体中的GC或GC衍生物(所述量对减轻与疾病相关的不希望的症状有效)以在所述症状出现前防止所述症状的显现，减缓疾病的进程、减缓与所述疾病相关的症状的恶化、加速疾病缓解期的出现、减缓所述疾病的进行性慢性期导致的不可逆损伤、延缓所述进行性阶段的出现、缓解严重性或治愈所述疾病、提高存活率或从如此疾病中更快的恢复、防止疾病的发生，或者上述作用中的两种以上的组合。

例如，当指神经变性症状时，治疗指抑制或减缓神经系统的异常恶化以及在具有发展神经变性症状的高易感性(如同通过精通药物的技术人员已知的考虑因素所确定的)的受试对象中进行预防，或者用于防止慢性病受试对象的神经变性症状急性阶段的复发。在后一种情况中，所述含有脂质体GC衍生物的药物组合物可施用于不具有神经变性症状但具有发展这些症状的高风险的受试对象，例如作为接触已知可导致异常生成反应性氧化性物种的试剂的结果，或者具有家族疾病史的受试对象(即遗传易感性)。

此外，例如，当所述疾病是癌症时，治疗尤其是指抑制或减少肿瘤细胞的生长和增殖：包括阻止原发性肿瘤的生长，或降低与癌症相关的死亡速率，或延缓与癌症相关的死亡率，这可导致减小肿瘤尺寸或者从个体体内将其完全清除，或者降低转移性肿瘤的发生率，或者减少在个体中转移性肿瘤出现的数目。

所述脂质体GC衍生物可以以单剂形式提供，然而优选为向需要治疗的受试个体以每日一剂、每日多剂或多日一剂等在较长时期或时间内施用(例如为产生累计有效量)。所述治疗策略和将施用的具体制剂取决于待治疗的疾病的类型并通过医疗领域里技术人员，例如主治医师等已知的多种考虑因素确定。

此处使用的术语“有效量”或“治疗有效量”指当在指定治疗策略中装载于脂质体中时，足以实现所需效果的GC衍生物的量，所述所需效果例如抑制或减少肿瘤细胞的生长和增殖，或者抑制或减少神经细胞的退化以及因此导致的神经系统的退化。所述量通过本领域内可已知的那些考虑因素决定并取决于待治疗的病症的类型和严重性以及治疗策略。通常在恰当设计的临床试验(剂量范围研究)中确定有效量并且本领域技术人员知道如何正确地进行这样的试验以确定有效量。正如通常已知，有效量取决于各种因素，包括施用模式、负载所述两亲弱酸/碱的载体的类型、所述GC衍生物的反应性、所述脂质体在体内的分布概况、诸如从脂质体中释放后在体内的半衰期等各种药物参数，取决于(如果有的话)不期望的副作用，取决于被治疗受试对象的诸如年龄和性别等因素，等等。

此处使用的“施用”用以指通过任何合适的用于输送脂质体制剂到受试对象中所期望的部位的途径而接触或分散、输送或应用所述脂质体制剂，所述途径包括口服、胃肠外(包括皮下、肌肉内和静脉内、动脉内、腹膜内)和鼻内施用以及通过鞘内或输注技术。

根据一个实施方案，根据本发明使用的制剂是适用于注射的形式。用于注射制剂的有效药物载体的要求对于本领域的普通技术人员是公知的，参见Pharmaceutics and Pharmacy Practice，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia，Pa.，Banker和Chalmers，编辑，第238-250页(1982)，和ASHPHandbook on Injectable Drugs，Toissel，第四版，第622-630页(1986)。

应当注意的是对人类的治疗通常长于在此处举例的实验动物，所述治疗的时间长短与疾病过程和活性剂效率成比例。所述剂量可以在几天的时间里施用的单剂或多剂。

虽然下列公开内容提供了使用动物模型的实验数据，但有多种用于将动物模型的剂量换算为人类用的剂量的可接受方法。例如，近似体表面积(BSA)方法的计算利用基于体重(BW)的简单异速生长关系，从而BSA等于体重(BW)的0.67次方[Freireich E.J.等，Cancer Chemother.Reports 1966，50(4)219-244；和Mordenti，J在如Dosage RegimenDesign for Pharmaceutical Studies Conducted in Animals中所分析的，J.Pharm.Sci.，75：852-57，1986]。此外，也已建立BSA数据的异速生长和表格[Extrapolation of Toxicological and Pharmacological Data from Animals toHumans，Chappell W & Mordenti J，Advances in Drug Research，卷20，1-116，1991(Academic Press Ltd出版)]。

另一个换算剂量的方法是使用浓度时间曲线下面积(AUC)的基于药物代谢动力学的方法或者是以下所描述的基于生理学的药物代谢动力学(PBPK)方法[Voisin E.M.等Regul Toxicol Pharmacol.12(2)：107-116.(1990)]。

现在通过显示出SSL-MPS对EAE和淋巴细胞的作用的非限制性实施例的方式描述本发明。

实施例

概况

材料

氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)获自Lipoid KG(Ludwigshafen，德国)。

N-氨基甲酰基-聚-(乙二醇甲基醚)-1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺三乙基铵盐(PEG-DSPE)(该磷脂的聚乙烯部分具有2000Da的分子量)获自Genzyme Liestale，瑞士。

胆固醇(＞99％纯度)获自Sigma(St.Louis，MO，USA)。

[³H]胆固醇基十六烷基醚(每mmol 45Ci)来自NEN Life ScienceProducts(Boston，MA，USA)。叔丁醇(99％纯)购自BDH，Poole，UK。

弱酸性类固醇、药物前体甲泼尼龙半琥珀酸钠(MPS)和氢化可的松半琥珀酸钠(HYD)获自Pfeizer，Belgium。

所有其他化学试剂，包括缓冲剂都是分析级以上，并获自Sigma。纯化水获自WaterPro PS HPLC/Ultrafilter Hybrid型，(Labconco，KansasCity，Mo.，USA)。

方法

脂质体的制备

将摩尔比为55∶40∶5的HSPC/胆固醇/PEG-DSPE-2000储备溶液溶解在70℃乙醇中至62.5％(w/v)的最终凝胶脂质浓度。然后将所述溶液在70℃温育直到所有脂质溶解为清澈溶液。随后将所述储备溶液加入到70℃的200mM乙酸钙溶液中以得到10％脂质浓度(w/v)并因此达到16％(w/v)的最终乙醇浓度。将混合物在70℃持续搅拌得到奶状分散液，在此阶段脂质水合形成多层脂质体(MLV)分散液。

通过具有开始于400nm并结束于50nm孔径滤孔的特定孔径的聚碳酸酯过滤器挤出已形成的泡囊而使之尺寸变小，最后的挤出步骤在低压至中压下进行。该过程形成80±15nm的脂质体。在整个过程中将所述挤出装置(Northern Lipids，加拿大)保持在70℃恒温。

通过在4℃对5％蔗糖或0.9的生理盐水进行透析(4次交换×每次100体积，最后一次过夜)获得脂质体外(extraliposomal)乙酸钙的移除以产生乙酸钙梯度{脂质体中[乙酸钙]＞＞介质中[乙酸钙]}。

通过改进的Bartlet程序[Shmeeda，H.，等，在Methods in Enzymology“Liposomes”中，(Düzgünes，N.，编辑)，367：272-292(2003)]由有机磷浓度确定脂质体磷脂浓度。在所得脂质体储备溶液中的脂质浓度为约40mM。

通过使用原子吸收光谱法(AAS)测定脂质体内部的钙量。

放射性SSL的制备和表征

如上所述制备由HSPC∶Chol∶²⁰⁰⁰PEG-DSPE(55∶40∶5摩尔比)和痕量的[³H]胆固醇基十六烷基醚(0.125μCi/μmol PL)构成的[³H]胆固醇醚标记的空间稳定脂质体(SSL)。所述脂质体尺寸由动态光散射(DLS)测量为87±15nm。

将GC衍生物装载入脂质体

将甲泼尼龙半琥珀酸钠盐(MPS，所述GC衍生物)的储备溶液溶解在5％葡萄糖(pH 7.2)中得到约9mg/ml的浓度并在建立乙酸钙梯度后加入到预形成的SSL分散液中。MPS浓度为约9mg/ml而磷脂浓度为约32mM磷酸酯。

通过将上述成分在62℃(高于基质脂质T_m)温育所需时间实现所述装载。然后将脂质体冷却至4℃和在4℃对5％葡萄糖透析以去除装载时释放的乙酸盐和去除未装载的药物，或者作为另外一种选择通过离子交换器Dowex1×400目(Cl-形式)去除未装载的药物。

MPS的聚集态、分配系数和表面张力

1.MPS的聚集态

使用分光荧光计在MPS没有吸收的条件下(激发和发射在相同波长Ex＝600nm，Em＝600nm)以与激发光束成90°时的光散射的强度作为所测定的浊度，通过浊度变化来判定MPS的聚集。由于聚集的形成，MPS溶液/分散液的光散射有很大提高。

散射光的强度(与激发成90°)也定义为浊度，与聚集体的浓度和尺寸成比例[Zuidam，N.J.和Barenholz，Y.，Biochim.Biophys.A cta1368：115-128(1998)]。按照如下方式测试MPS的聚集态：向石英比色杯中加入MPS浓度为约6.5mg/ml的MPS(2ml)。然后用HCl(1.756M)滴定所述溶液并使用都在600nm具有1％衰减的激发光和发射光散射并监测溶液的pH。

2.分配系数

通过如[Samuni，A.M.和Barenholz，Y.，Free Radicals Biol.Med.22：1165-1174(1997)]描述的“摇晃烧瓶(shake flask)”测定一些GC衍生物(两亲弱酸)的分配系数(logD)。

3.表面张力

通过使用μtrouge S(Kibron Inc.，Helsinki，芬兰)测量表面张力。将含有GC衍生物的溶液(300μl)在使用纯水和空气将传感器校准和归零后放置在井中。在26℃进行测量。

SSL内MPS的沉淀

如[Lasic，D.D.，Frederik，P.M.，Stuart，M.C.A.，Barenholz，Y.和McIntosh，T.J.，Gelation of liposome interior.A novel method for drugencapsulation.FEBS Lett.312，255-258(1992)；Lasic，D.D.，等Biochim.Biophys.Acta 1239，145-156(1995)]所述使用Cryo TEM使泡囊的脂质体内水相中的MPS沉淀可视化。

沉淀研究

在63℃，在不同pH点下向600mOsm的乙酸钙溶液中加入MPS使最终浓度为5mg/ml，然后将所得混合溶液温育40分钟，然后离心所述溶液并使用HPLC分析上清液。

装载效率

装载效率是装载后和装载前的MPS/磷脂浓度间的比例。如Anderson，和Taphouse 1981[Anderson B.D.和Taphouse.V.J Pharm Sci，70：181-6(1981)]所描述在HPLC装置中完成MPS的定量，通过改进的Bartlet程序[Shmeeda，H.，等在Methods in Enzymology“Liposomes”中，(Düzgünes，N.编辑)，367：272-292(2003)]完成磷脂的定量。

稳定性测定

MPS从脂质体中释放的测定

通过使用凝胶排阻色谱法在琼脂糖交联CL-4B柱上首先从游离MPS中分离出脂质体来测定从SSL-MPS释放的MPS的水平。脂质体在外水体积中洗脱而游离MPS在随后的洗脱级分中(图3A-3B)。

保存在4℃的稳定性和在37℃的80％血浆中的释放动力学通过上述的凝胶排阻色谱法测定。然后如上所述对不同的柱级分进行分析以确定在外水体积级分中的MPS、磷脂和Ca。

另外，在37℃，SSL-MPS与80％的人发炎滑液在80％血浆的比例下温育。然后在不同的时间点将样品与阴离子交换树脂(DOWEX，1×400目(Cl-形式))涡旋，所述树脂只与游离MPS结合。分析所述样品以确定脂质体包封的MPS和脂质体磷脂含量。

结果

下列表1提供了所测试的GC衍生物的logD和pKa，其使用AdvancedChemistry Development(ACD/Labs)[Software Solaris V4.67(&#61651；1994-2005 ACD/Labs)SciFinder SCHOLAR Version 2004.2

AmericanChemical Society 2004]进行计算。

表1：不同GC衍生物的logD和pKa

修饰的GC	pH7时的logD	pKa
			磷酸泼尼松龙	-4.25	1.67±0.10
半琥珀酸泼尼松龙	-0.64	4.29±0.17
			磷酸甲泼尼龙	-3.76	1.67±0.10
半琥珀酸甲泼尼龙	-0.15	4.29±0.17
			磷酸地塞米松	-3.88	1.67±0.10
半琥珀酸地塞米松	-0.27	4.29±0.17

MPS的浊度、分配系数和表面张力

测定MPS的浊度(指示聚集度)。图1A中显示的结果指出在pH 7.2所述两亲弱酸衍生物(药物前体)是非聚集水溶性的，而在酸性pH其则聚集，因此表现出浊度的增加。在很低的pH观察到浊度的降低，这是由于形成非常大的沉淀的聚集体。点状线箭头指出从使用HCl(μmol H⁺，箭头左侧)滴定到使用NaOH(μmol OH^-，箭头右侧)滴定的转换点。

在不同pH点测定MPS的分配系数。如图1B所示，MPS实际是两亲物质。

另外，测定了MPS的表面张力并在图3C中明显示出，MPS在使用的所有浓度(0.785mM～30mM)具有表面活性并在约5mM具有CAC(临界离解/聚集浓度)点，而诸如磷酸地塞米松等具有磷酸酯基团(强酸性基团)的GC在至少高至50mM的浓度下没有表面活性且并不自离解形成胶束和/或其他有规装配体。

通过钙离子的MPS的沉淀

如上所述测定了在存在乙酸钙溶液时MPS的沉淀。表2显示了存在钙离子时，即在不同pH时沉淀的MPS的百分比。如所示，在pH6.8时已发生沉淀。在pH位于GC的pKa(pH 4.5)附近时沉淀增加到极大程度(97％的MPS)。

表2：MPS的沉淀

pH	％(已沉淀的MPS)
		6.8	44.1
6.2	42.8
		4.5	96.6

不同脂质体制剂的普通装载效率

1.脂质体装载效率

使用三个单独批次(由日期进行区别)以测定药物装载入脂质体的效率(HSPC∶Chol∶²⁰⁰⁰PEG-DSPE(55∶40∶5摩尔比))，总结在表3中。

表3：装载入脂质体的效率

04年7月18日	mg/ml MPS	mM磷酸酯	MPS/脂质(mg/μmole)	包封％
					透析前^(a)	7.46	39.80	0.188
透析后^(b)	7.56	40.70	0.186	99.1
					05年4月6日	mg/ml MPS	mM磷酸酯	MPS/脂质(mg/μmole)	包封％
透析前^(a)	6.22	33.20	0.19
					透析后^(b)	4.99	27.60	0.18	96.6
05年5月4日	mg/ml MPS	mM磷酸酯	MPS/脂质(mg/μmole)	包封％
					透析前^(a)	9.68	45.73	0.21
透析后^(b)	6.35	32.19	0.20	93.2

^(a)脂质体中的MPS+脂质体外介质中的MPS

^(b)仅在脂质体中的MPS

2.不同脂质体制剂的MPS装载效率

已确定用于有效装载的最佳条件包括约600mOsm的乙酸钙。在使用初始药物前体浓度为5mg/ml～10mg/ml，优选为9mg/ml时，获得MPS在HSPC∶Chol∶²⁰⁰⁰PEG-DSPE(55∶40∶5摩尔比)的脂质体中具有该MPS/磷脂比例的装载效率。药物前体在最终制剂中的浓度为约6.5mg/ml，其用于后续实验(下文中称为SSL-MPS制剂或简称为SSL-MPS)。

图2A-2B是在装载前(图2A)和装载后(图2B)脂质体的Cryo-TEM图像，清晰地显示出沉淀在脂质体内部水相空间中的位置。

脂质体制剂的稳定性

如上所述测定14个月期间在SSL-MPS(即完整的脂质体制剂)中MPS的浓度。图3A显示在14个月以后约80％的MPS保留在脂质体中。部分游离MPS水解为其活性形式：甲泼尼龙(MP)。图3B提供了在4℃保存14个月以后的脂质体制剂的琼脂糖4B尺寸排阻色谱图，以及该色谱图在级分8～17处的放大图(图3C)，显示出游离MPS以及游离MP的存在。

此外，测定了在临床相关环境中SSL-MPS的稳定性。图4显示了脂质体制剂在人类血浆中的稳定性。在MPS被释放(在脂质体中的半衰期为50小时)的条件下100％的包封钙保留在包封脂质体中，这说明所述脂质体可以在血浆中完整保留至少66个小时。这表明MPS的释放是由于其两亲性。MPS释放的半衰期是与SSL经i.v.(静脉内)注射后在血浆中的半衰期相似的值。

实施例1-多发性硬化(MS)

使用蛋白脂质蛋白(PLP)来诱导急性EAE实验动物模型

通过皮下注射含有蛋白脂质蛋白(PLP)139-151肽和完全弗氏佐剂(CFA)，含有150μg肽和200μg结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的乳剂对6～7周龄的S几雌性小鼠进行免疫。为了增强免疫系统，在第一天和48小时后向小鼠腹膜内(i.p.)注射150ng百日咳毒素(PT)。

每日使用下表4检查每只小鼠的EAE临床征兆：

表4：临床征兆评分

评分	症状	描述
			0	行为正常	无神经病学征兆
1	尾末端无力	尾末端部分是无力的并下垂
			1.5	全尾无力	全尾松软并下垂
2	伴随正位反射的全尾无力	全尾松软并下垂。当动物面朝上躺着时难以翻身以四足站立
			3	共济失调	行走不稳(woobly walk)-当小鼠行走时后肢不稳
4	早期瘫痪	小鼠难以后肢站立但仍残余有活动能力
			5	完全瘫痪	小鼠完全不能移动其四肢，看起来较消瘦和衰弱。失禁
6	濒于死亡/死亡

合计各动物组中发病(患病)小鼠的数目并计算其百分比。

此外，平均最大评分(MMS)可如下获得：通过合计所述组中10只小鼠中每一只的最大评分并在此基础上根据如下等式计算该组的平均最大评分：

∑每只小鼠的最大评分/该组中小鼠的数目

另外，以天数表示的疾病平均持续时间(MDD)根据如下等式计算：

∑每只小鼠的疾病持续时间/该组中小鼠的数目

另外，通过合计所述组中10只小鼠中的每一只的评分并根据如下等式计算每天的平均评分来确定每组的平均评分(GMS)(疾病负荷)：

∑每只小鼠每天的总评分/该组中小鼠的数目

使用SSL-MPS治疗EAE

根据下表5将EAE诱导小鼠分为治疗组。

表5：治疗设计

治疗	小鼠数目/组	注射日	注射次数
				对照	8	0	0
游离MPS 50mg/kg BW	9	14	1
				SSL-MPS 50mg/kg BW	9	14	1

在三周的时间里进行随查，并在不同时间点判定EAE临床征兆。对于每一组，确定发病率、MMS＝平均最大评分；MDD＝平均疾病持续时间(天数)；MDO＝平均发作日和平均评分(表6)。此外，确定了每一组在各时间点的平均临床评分(图5)。

表6：观察到的临床征兆

组	发病率	MMS	MDO	MDD	平均评分
						对照	6/8	3±0.365	13.7±0.667	18.5±0.5	1.4±0.104
SSL-MPS	5/9	2.2±0.583	20.4±2.16	6±2.07	0.444±0.090
						游离MPS	7/9	2.35±0.39	16.7±1.83	10.9±2.7	0.861±0.105

严重疾病负荷的治疗

对于表现出严重疾病负荷的小鼠(通过合计所述组中10只小鼠中每一只的评分并根据下述等式计算每天的平均评分：∑每只小鼠每天的总评分/该组中小鼠的数目来确定)采用不同的治疗方案。具体地说，在上述免疫后，使用50mg/kg BW SSL-MPS(第10日、14日和18日)或者使用游离MPS 50mg/kg BW(第10日、14日和18日)或葡萄糖5％(第10日、14日和18日)对小鼠进行治疗。对于每一组，确定发病率、MMS＝平均最大评分；MDD＝平均疾病持续时间(天数)；MDO＝平均发作日和平均评分(表7)。此外，确定了每一组在各时间点的平均临床评分(图6B)以及存活曲线(图6A)。

表7：观察到的临床征兆

组	发病率(死亡数)	MMS	MDO	MDD	平均评分
						对照	9/9(6)	5.56±0.24	11.3±0.28	7.56±2.37	4.18±0.203
SSL-MPS	9/9(0)	2.61±0.36	13.9±0.92	6.78±1.88	0.705±0.09
						游离MPS	9/9(3)	4.44±0.50	12.67±0.65	10.11±1.92	2.62±0.208

在对照组(未治疗)中9只小鼠中6只死亡和对照组的较高平均临床评分的事实证实产生的疾病是严重的(与其中显示了在产生轻微疾病的动物中的效果的表6相比，在表6中没有小鼠死亡并且未治疗对照组的疾病平均评分小于2。)。

存活曲线(图6A)，和平均临床评分(图6B)，也都显示出产生了疾病并具有严重的平均评分。

关于产生了疾病严重负荷的动物，应当对下述观察予以特别重视：

1.当在对照组和游离MPS组中出现死亡时，SSL-MPS治疗组中的所有动物均存活；

2.在第19日(图6B)与游离MPS治疗组或对照组的平均临床评分分别为约3和约4.8相比，使用SSL-MPS治疗使得平均临床评分接近于0。

3.所述SSL-MPS治疗组的平均疾病评分(表5)比对照组的平均疾病评分低4倍，比游离MPS治疗组的平均疾病评分低约2倍。

因此，可以得出结论：与游离MPS相比，在疾病的严重状态，SSL-MPS具有有益的治疗效果。

在急性EAE模型中与常规MS药物的对比

如上所述对SJL雌性小鼠(6～7周龄)进行免疫。将所述已免疫的小鼠分组并且在免疫后的第8日、11日和14日按照如下治疗制剂对各组进行治疗：

组I：50mg/kg BW SSL-MPS；

组II：游离MPS 50mg/kg BW；

组III：葡萄糖5％；

组IV：克帕松250μg/0.1cc；

组VI：倍泰龙人2000ui/0.1cc。

对于每一组，确定发病率、MMS＝平均最大评分；MDD＝平均疾病持续时间(天数)；MDO＝平均发作日和平均评分(表8)。此外，确定了每一组在各时间点的平均临床评分(图7)。

表8：观察到的临床征兆

组	发病率(#死亡数)	MMS	MDO	MDD	平均评分
						对照	10/10(3)	3.9±0.526	11±0	9.8±1.2	2.3±0.223
倍泰龙	10/8(3)	3.15±0.753	10.3±1.84	7.7±1.51	1.8±0.245
						可帕松	10/8(3)	2.9±0.69	9.9±1.74	8.1±1.72	1.8±0.219
SSL-MPS	10/9(1)	2.7±0.578	11.3±1.48	3.5±1.13	0.74±0158

图7表示在随查期不同时间点的临床评分。如所观察到的，SSL-MPS对疾病平均负荷的总体效果低于游离MPS治疗组对照的3倍。此外，SSL-MPS有效地使平均临床评分从早期瘫痪的严重水平降低到尾末端无力。在SSL-MPS治疗组中仅有一只小鼠死亡，而相比在其它组中为3例和5例死亡。

因此，可以得出结论：当前SSL-MPS具有比当前临床可用药优异得多的有益效果并且该制剂具有将平均临床评分从早期瘫痪的严重状态降低到轻微状态的能力。

使用MOG(鞘磷脂少突胶质细胞糖蛋白)诱导急性EAE

按照[Offen D等，J Mol Neurosci.15(3)：167-76(2000)]所描述的，使用MOG 35-55肽进行慢性EAE的诱导。通常，用致脑炎乳剂(MOG加上富含MT(结核分枝杆菌)的CFA)对雌性C57B1/6小鼠进行接种(在右胁腹皮下(s.c.)注射)。在接种当天和48小时后i.p.(腹膜内)注射百日咳毒素(250ng/小鼠)。在首次注射后一周在右胁腹中皮下注射MOG乳剂加强针。

在上述免疫后，使用50mg/kg BW SSL-MPS治疗(第12日、14日和16日)小鼠。确定各时间点的平均临床评分(图8)。如所示，SSL-MPS有效地缓解急性EAE的临床征兆。

实施例2：癌症

已证实皮质类固醇对多种癌症类型具有治疗效果并广泛用于癌症治疗中，特别用于血液学恶性肿瘤(白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)和激素响应性癌症(乳癌和前列腺癌)。通常，皮质类固醇在包括化学疗法的治疗手段的框架中使用。[Lorraine I.McKay和John A.Cidlowski，corticosteroidsCancer Medicine e.5B.C.Decker Inc.，SBN 1-55009-113-12000，BC DeckerInc出版，1981年第一次出版，第五版2000，01 02 QP 9 8 7 6 5 4 3在加拿大印刷]。

在实验的第1日，给BALB/C小鼠i.p.(腹膜内)注射1百万J6456淋巴瘤细胞(小鼠T-细胞淋巴瘤)，然后将小鼠分组并按照下述治疗日程(表9)通过i.v.(静脉内)注射游离MPS或SSL-MPS进行治疗。在治疗第14日确定存活中值并同样显示在表9中：

表9：治疗日程

组	小鼠数目	注射日	注射次数	存活中值
					对照	6	0	0	16
游离MPS15mg/kg BW	10	5、9、12	3	16
					游离MPS50mg/kgBW	10	5、9、12	4	16
SSL-MPS15mg/kg BW	10	5、9、12、16	4	19
					SSL-MPS30mg/kg BW	10	5、9、12、16	4	21
SSL-MPS50mg/kg BW	10	5、9、12、16	4	23

上述结果显示：SSL-MPS治疗以剂量依赖方式延长存活时间中值。

在其他试验中，测定了携带BCL-1(小鼠B细胞淋巴系白血病)肿瘤的小鼠的存活情况。根据该试验，在实验的第1日，给BALB/C小鼠i.p.(腹膜内)注射1百万BCL-1淋巴瘤细胞(B细胞系，MPS的IC50在纳摩尔范围)，然后将小鼠分组并使用如下治疗制剂在第5日、9日、12日、16日通过i.v.(静脉内)注射进行治疗：

组I：5mg/kg BW游离MPS；

组II：25mg/kg BW游离MPS；

组III：5mg/kg BW SSL-MPS；

组IV：50mg/kg BW SSL-MPS。

确定不同组的存活中值并总结在表10中。

表10：存活中值

组	中值
		对照	19
游离MPS 5mg/kg BW	19
		游离MPS 25mg/kg BW	19
SSL-MPS 5mg/kg BW	35
		SSL-MPS 50mg/kg BW	47

图9所示的存活曲线表现出：SSL-MPS与游离MPS或对照组相比的有益效果。非常重要的是应当注意到该细胞系对MPS高度敏感。

现有技术列表

以下列出了被认为与描述本发明领域内技术状况相关的现有技术列表。

Gonzalez-Rothi，Ricardo J等，Pharmaceutical Research 13(11)：1699-1703(1996)；

Schmidt J等，Brain 126(8)：1895-1904(2003)；

Fildes FJ等，J Pharm.Pharmacol.30(6)：337-42(1978)；

Mishina EV等，Pharm Res 13(1)：141-5(1996)；

Almawi WY和Melemedjian OK，J Leukoc Biol 71：9-15(2002)；

Coleman RE Biotherapy 4：37-44(1992)；

Folkman J等，Science 221：719-725(1983)；

Swain S.M.，Endocrine therapies of cancer，Cancer Chemotherapy andBiotherapy，第二版，Chabner BA和Longo DL编辑，Lippincott-Raven，Philadelphia，1996，(第59-108页)；

Haskell CM.，Cancer Treatment，第四版，Haskell CM和Berek JS.编辑，WB Saunders Co，Philadelphia，1995(第78-80页，第105-106页，第151-152页)；

Josbert M.Metselaar，Liposomal targeting of glucocorticoids.A noveltreatment approach for inflammatory disorders.第6章，第91-106页，第7章，第107-122页，2003，博士论文，Utrecht University，Faculty ofPharmaceutical Sciences，Faculty of Veterinary Medicine ISBN90-393-3285-1。

Claims

1.一种含有包封有糖皮质激素或其药物前体的脂质体的药物组合物，所述的其药物前体是从所述脂质体释放进入体液后转变为活性糖皮质激素的药物前体，其中至少80％所述糖皮质激素或其药物前体保留在所述脂质体中6个月，所述糖皮质激素或其药物前体选自：

具有pKa大于3.5且在pH 7时logD为-1.5～1.0的两亲弱酸性糖皮质激素或其药物前体；并且

所述脂质体包含：(i)聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的脂聚合物；(ii)胆固醇；和(iii)磷脂，所述磷脂选自磷脂酰胆碱、蛋黄磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、氢化大豆磷脂酰胆碱和具有12～24个碳原子酰基链或烷基链的鞘磷脂，

其中所述脂质体在其脂质体内部水相中包含在预先俘获的反离子存在下沉淀的糖皮质激素或其药物前体。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述的药物前体是酸性糖皮质激素。

3.如权利要求2所述的药物组合物，其中所述酸性糖皮质激素选自甲泼尼龙半琥珀酸钠、氢化可的松半琥珀酸钠、半琥珀酸地塞米松、半琥珀酸泼尼松龙。

4.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述脂质体包含氢化大豆磷脂酰胆碱、聚乙二醇包覆的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和胆固醇的组合。

5.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述脂质体是空间稳定的脂质体。

6.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述糖皮质激素或其药物前体与所述磷脂间的摩尔比为0.01～2.0。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述糖皮质激素或其药物前体与所述磷脂间的摩尔比为0.04～0.25。

8.如权利要求1所述的药物组合物，所述药物组合物用于神经变性失调的治疗。

9.如权利要求9所述的药物组合物，所述药物组合物用于多发性硬化的治疗。

10.如权利要求1所述的药物组合物，所述药物组合物用于癌症的治疗。

11.包封在脂质体中的糖皮质激素或其药物前体在制备药物组合物中的应用，所述的其药物前体是从所述脂质体释放进入体液后转变为活性糖皮质激素的药物前体，其中至少80％所述糖皮质激素或其药物前体保留在所述脂质体中6个月，所述糖皮质激素或其药物前体选自：

所述脂质体包括：(i)聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的脂聚合物；(ii)胆固醇；和(iii)磷脂，所述磷脂选自磷脂酰胆碱、蛋黄磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、氢化大豆磷脂酰胆碱和具有12～24个碳原子酰基链或烷基链的鞘磷脂，

12.如权利要求11所述的应用，其中所述糖皮质激素选自甲泼尼龙半琥珀酸钠、氢化可的松半琥珀酸钠、半琥珀酸地塞米松、半琥珀酸泼尼松龙。

13.如权利要求11所述的应用，其中所述脂质体包含氢化大豆磷脂酰胆碱、聚乙二醇包覆的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和胆固醇的组合。

14.如权利要求11所述的应用，其中所述糖皮质激素或其药物前体与所述磷脂间的摩尔比为0.01～2.0。

15.如权利要求14所述的应用，其中所述糖皮质激素或其药物前体与所述磷脂间的摩尔比为0.04～0.25。

16.如权利要求11所述的应用，其用于制备用于治疗神经变性失调的药物组合物。

17.如权利要求11所述的应用，其用于制备用于治疗癌症的药物组合物。