CN108430457A - 作为药物的包含皮质类固醇的纳米脂质体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含至少一个外部脂质双层和被所述至少一个脂质双层包封的至少一种皮质类固醇的纳米脂质体，其中皮质类固醇与形成所述脂质双层的脂质之比优选在0.01‑0.5、0.1‑0.3或0.12‑0.18之间。所述皮质类固醇可以是B族皮质类固醇，包括曲安奈德、氟新诺龙丙酮、曲安西龙醇、莫米松、安西奈德、布地奈德、地奈德、氟轻松和哈西奈德。优选地，纳米脂质体的尺寸在10‑1000nm或50‑150nm之间。本发明还涉及本发明的纳米脂质体用作药物和用于治疗心血管疾病的用途。此外，本发明涉及制备本发明的纳米脂质体的方法，其还可包括挤出步骤。

Description

作为药物的包含皮质类固醇的纳米脂质体及其制备方法
发明领域
本发明属于生物药物化学领域，涉及包含至少一个外部脂质双层(outer lipidbilayer)和被所述至少一个脂质双层包封的至少一种皮质类固醇的纳米脂质体。本发明还涉及本发明的纳米脂质体用作药物和用于治疗心血管疾病的用途。此外，本发明涉及制备本发明的纳米脂质体的方法。
发明背景
动脉粥样硬化是一种全身性血管疾病，通常根据心血管疾病的广义术语来分组。心血管疾病占全球总死亡率的约30％，是需要可行的治疗方案的重要医疗问题。动脉粥样硬化据认为是全球性的社会经济问题伴有因人口特征和城市生活方式的变化而造成的巨大经济负担，而且无论是何种地理、性别或种族，这个问题都存在。目前用于动脉粥样硬化的治疗策略包括使用降低甘油三酯水平、LDL-胆固醇水平、降低血压和血小板聚集的药物。然而，目前治疗策略的局限性在于这些药物的活性不限于作用部位(即，动脉粥样硬化病变中)，另外，由于血浆半衰期较短和血浆清除率升高，这些药物显示治疗功效有限。大多数药物表现出中度至重度的全身副作用，例如抗血小板药物的不可控的出血以及纤维蛋白溶解药物，如组织纤溶酶原激活剂(tPA)和链激酶因迅速降解和洗出所致的功效降低。鉴于有证据表明炎症过程是疾病进展和发病的关键因素，最近的策略包括使用抗炎药物来治疗动脉粥样硬化。
治疗弥漫性(中晚期)动脉粥样硬化斑块的策略之一是用负载抗炎药物的纳米脂质体靶向单核细胞和巨噬细胞。先天免疫是人体防御机制的固有反应，其在血管修复中起主要作用。一旦遭遇损伤，巨噬细胞和单核细胞立即募集到损伤部位以便模拟正常伤口愈合过程。然后，募集的巨噬细胞激活并刺激导致细胞变化的一系列细胞信号传导机制，例如生长因子和细胞因子的表达，平滑肌细胞的增殖和迁移，其最终导致动脉粥样硬化病变和“泡沫”细胞(foam cell)的形成。以单核细胞和巨噬细胞作为主要靶点，负载抗炎药物的纳米脂质体将能够最大程度降低和消除亚内皮下间隙的不可控促炎反应，从而防止疾病进展。
因此，本领域需要开发将单核细胞和巨噬细胞靶向动脉粥样硬化斑块的纳米脂质体。
发明概述
本发明的目的是通过提供包含至少一个外部脂质双层和被所述至少一个脂质双层包封的至少一种皮质类固醇的纳米脂质体来满足上述需求。本发明人已经开发了包封皮质类固醇的缓释纳米脂质体，其可以通过全身施用成为动脉粥样硬化的潜在有效治疗策略。许多现有技术没有考虑动脉粥样硬化的持续给药需求，这可能是延长治疗效果的潜在缺陷。本发明基于以下假设：在全身注射纳米脂质体后，载药的纳米脂质体(通过被动或主动靶向)将转运至作用部位，即，动脉粥样硬化病变中，并长期释放(数天到数月)药物。这将极大提高患者的依从性，并最大程度减少为停止疾病进展而需要频繁注射的相关副作用。
在本申请中，本发明人采用被动装载能够实现脂质体中高负载浓度的皮质类固醇(最高1.2mg/ml)。此外，通过体外透析已经证实了各种皮质类固醇药物(例如氟新诺龙丙酮(fluocinolone acetonide)和曲安奈德)从纳米脂质体的受控和持续释放。药物释放在体外透析中持续长达40天。
此外，已经证明脂质体中皮质类固醇的高负载浓度。这些高负载浓度可能取决于用于制备本发明纳米脂质体的药物与脂质量之比。
在第一方面，本发明因此涉及包含至少一个外部脂质双层和和被所述至少一个脂质双层包封的至少一种皮质类固醇的纳米脂质体。
在第二方面，本发明涉及用作药物的本发明的纳米脂质体。
在进一步的方面，本发明涉及用于治疗心血管疾病的本发明的纳米脂质体。
最后，本发明在第四方面涉及制备本发明的纳米脂质体的方法，包括：a)提供包含形成所述至少一个脂质双层和溶剂的脂质的组合物；b)将所述至少一种皮质类固醇加入到步骤a)的组合物中；和c)除去溶剂以制备本发明的纳米脂质体。
附图简述
结合考虑非限制性实施例和附图，参考详述将更好地理解本发明。
图1显示了在4℃储存期间和在37℃，PBS缓冲液(pH 7.4)中进行体外药物释放研究之后的脂质体的尺寸测量值。
图2显示DPPC脂质体(药物/脂质摩尔比为0.135)和DPPC(95％)，DSPE-PEG 2K(5％)脂质体(药物/脂质摩尔比为0.151)的氟新诺龙丙酮的体外药物释放研究。(a)累积氟新诺龙丙酮释放(％)相对于时间(天)作图；和(b)用40mL PBS pH 7.4作透析的1mL脂质体溶液的氟新诺龙丙酮的每日释放量(μg)。
图3总结了对于各种饱和的普通(plain)和PEG化纳米脂质体，挤出后的初始药物/脂质(D/L)、最终D/L比、最终药物浓度、分配系数(PC)、％包封率(EE)、％装载效率(LE)和平均尺寸。
图4显示DPPC脂质体的氟新诺龙丙酮(药物/脂质摩尔比为0.114)的体外药物释放研究。(a)累积的氟新诺龙丙酮释放(％)相对时间(天)作图，和(b)用40mL PBS pH 7.4作透析的1mL脂质体溶液的氟新诺龙丙酮的每日释放量(μg)。
图5显示DPPC(95％)、DSPE-PEG 2K(5％)脂质体(药物/脂质摩尔比为0.117)的氟新诺龙丙酮的体外药物释放研究。(a)累积的氟新诺龙丙酮释放(％)相对时间(天)作图，和(b)用40mL PBS pH 7.4作透析的1mL脂质体溶液的氟新诺龙丙酮的每日释放量(μg)。
图6总结了对于PEG化纳米脂质体，挤出后的初始药物/脂质(D/L)、最终D/L比、最终药物浓度、分配系数(PC)、％包封率(EE)、％装载效率(LE)和平均尺寸。
图7显示DPPC(95％)、DSPE-PEG 2K(5％)脂质体(药物/脂质摩尔比为0.096)的曲安奈德的体外药物释放研究。(a)累积的曲安奈德释放(％)相对时间(天)作图，和(b)用40mL PBS pH 7.4作透析的1mL脂质体溶液的曲安奈德的每日释放量(μg)。
图8总结了对于包含鞘磷脂(sphingomyelin)的纳米脂质体，挤出后的初始药物/脂质(D/L)、最终D/L比、分配系数(PC)、％包封率(EE)、％装载效率(LE)、最终药物浓度和平均尺寸。
图9显示鞘磷脂脂质体(药物/脂质摩尔比为0.087)的氟新诺龙丙酮的体外药物释放研究。(a)累积的氟新诺龙丙酮释放(％)相对时间(天)作图，和(b)用40mL PBS pH 7.4作透析的1mL脂质体溶液的氟新诺龙丙酮的每日释放量(μg)。
图10总结了对于包含荷电脂质的纳米脂质体，挤出后的初始药物/脂质(D/L)、最终D/L比、分配系数(PC)、％包封率(EE)、％装载效率(LE)、最终药物浓度、平均尺寸和ζ电势。
图11显示DPPC和DOTAP脂质体混合物(50％摩尔比)(药物/脂质摩尔比为0.157)的氟新诺龙丙酮的体外药物释放研究。(a)累积的氟新诺龙丙酮释放(％)相对时间(天)作图，和(b)用40mL PBS pH 7.4作透析的1mL脂质体溶液的氟新诺龙丙酮的每日释放量(μg)。
图12显示DMPC和DOTAP脂质体混合物(50％摩尔比)(药物/脂质摩尔比为0.157)的氟新诺龙丙酮的体外药物释放研究。(a)累积的氟新诺龙丙酮释放(％)相对时间(天)作图，和(b)用40mL PBS pH 7.4作透析的1mL脂质体溶液的氟新诺龙丙酮的每日释放量(μg)。
图13总结了对于包含DPPC并且脂质浓度为36mM的纳米脂质体，挤出后的初始药物/脂质(D/L)、最终D/L比、分配系数(PC)、％包封率(EE)、％装载效率(LE)和最终药物浓度。
图14显示DPPC脂质体混合物(脂质浓度36mM)(药物/脂质摩尔比为0.116)的氟新诺龙丙酮的体外药物释放研究。(a)累积的氟新诺龙丙酮释放(％)相对时间(天)作图，和(b)用40mL PBS pH 7.4作透析的1mL脂质体溶液的氟新诺龙丙酮的每日释放量(μg)。
发明详述
本发明人出乎意料地发现本发明的纳米脂质体具备皮质类固醇的缓释能力(最长40天)。此外，在储存条件下(4℃)，所述纳米脂质体在3个多月的时期稳定。此外，证实了脂质体中皮质类固醇的高负载浓度。这些高负载浓度可依赖于用于制备本发明的纳米脂质体的药物脂质量之比。
因此，在第一方面，本发明涉及包含至少一个外部脂质双层和被所述至少一个脂质双层包封的至少一种皮质类固醇的纳米脂质体。
本文所用的术语“脂质体”是指人工制备的脂质双层构成的囊泡。可以将脂质体分类为单层囊泡或多泡囊泡(multivesicular vesicle)。在本发明的优选实施方式中，所述脂质体是单层囊泡。
脂质体由包封水性内部隔室的至少一个脂质双层膜构成。可以通过膜类型和尺寸表征脂质体。小单层囊泡(SUV)可以具有单个膜，直径在约20nm至约50nm的范围内。大单层囊泡(LUV)的直径可为约50nm或更大。寡层(oligolamellar)大囊泡和多层囊泡可以具有多个，通常是同心的膜层，直径为约100nm或更大。具有几个非同心膜的脂质体，即，包含在大囊泡内的几个较小囊泡称为多泡囊泡。
脂质体可以是非刺激或刺激敏感性脂质体(即，对一种或多种刺激敏感)，刺激敏感性脂质体可以控制包封在其中的物质的释放。本文所用的对刺激“敏感”是指脂质体对暴露于一种或多种刺激起反应而释放其内容物或对一种或多种刺激起反应而分解的能力。刺激敏感脂质体的实例包括温度敏感性脂质体、pH敏感性脂质体、化学敏感性脂质体、辐射敏感性脂质体、超声敏感性脂质体或它们的任何组合。温度敏感性脂质体、pH敏感性脂质体、化学敏感性脂质体、辐射敏感性脂质体和超声敏感性脂质体可以在特定温度或温度范围内、特定pH或pH范围内、化学物质的存在下，辐射条件下和/或超声条件下释放其中包含的物质。温度可以是，例如在约25℃至约70℃、约25℃至约65℃、约25℃至约60℃、约25℃至约55℃、约25℃至约50℃、约30℃至约50℃、约35℃至约50℃或约37℃(体温)至约50℃的范围内。pH可以大于、等于或小于约5.5，其为盐溶液的pH。本文所用的“超声波”是指频率大于约16Hz至约20kHz的音频频率的波。超声可以是高强度聚焦超声(HIFU)，并且HIFU涉及在一个位置的高强度超声能量以创建集中的焦点。
本文所用的术语“纳米”描述纳米尺寸的材料，例如单个脂质体，其小于150纳米，优选小于100纳米。
因此，本文所用的术语“纳米脂质体”是指具有上述特性并且直径在10nm至1000nm、优选50nm至150nm的脂质体。制备此类脂质体的方法包括挤出法、超声处理法和Mozafari方法(Blume,G；Cevc,G(1990)."用于体内药物缓释的脂质体(Liposomes for thesustained drug release in vivo)".Biochimica et Biophysica Acta.1029(1):92–97)。技术人员熟知制备过程的不同参数，例如挤出或超声处理的时间和强度、影响所得脂质体的直径大小。
在本文可互换使用的术语“至少一个”和“多个”涉及一个或多个，特别是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、500、1000或更多。
本文所用的术语“脂质双层”是指由两层脂质分子形成的膜。脂质双层可具有与天然存在的双层，如细胞膜、核膜和病毒包膜相似的厚度。例如，脂质双层可以具有约10nm或更小的厚度，例如，约1nm至约9nm、约2nm至约8nm、约2nm至约6nm、约2nm至约4nm或约2.5nm至约3.5nm的范围。脂双层是将离子、蛋白质和其它分子保持在一个区域内，和/或阻止它们扩散到其它区域的屏障。形成脂质双层的“脂质分子”或“脂质”可以是包括亲水性头部和疏水性尾部的分子。脂质分子可以具有14至50个碳原子。
在各种实施方式中，脂质双层可以是磷脂、与聚乙二醇(PEG)偶联的脂质、胆固醇、弹性蛋白样多肽、鞘脂类或它们的任何组合。
本文所用的“磷脂”是指在分子内包含磷酸酯的化合物脂质，其是生物膜，例如细胞膜、内质网、线粒体和神经纤维周围髓鞘的主要成分。磷脂包括亲水性头和两个疏水性尾部。当磷脂暴露于水中时，它们自身排列成双层片(双层)，所有尾部都指向片的中心。该双层的中心几乎不含水，也不包括溶解于水中但不溶于油的诸如糖或盐等分子。磷脂可以包括磷脂酸、磷脂酰乙醇胺，磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂或它们的任何组合。在本文可互换使用的磷脂酰胆碱或磷酸胆碱(PC)可包括胆碱作为头部基团和甘油磷酸作为尾部，其中甘油磷酸可以是饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸并具有14-50个碳原子。PC的例子包括1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、卵PC、大豆PC及它们的任何组合。
在一些实施方式中，所述脂质可以偶联于聚(乙二醇)(PEG)。PEG-脂质偶联物可以是，例如PEG化的磷脂酰乙醇胺(PE)-PEG。PE可以是饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、混合酰基链、溶血磷脂酰乙醇胺或它们的任何组合。与PEG偶联的脂质可以是，例如1,2-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲基-聚乙二醇(DSPE-PEG)。
本文所用的术语“胆固醇”是指任何类固醇化合物。胆固醇还包括胆固醇衍生物，其例子包括谷甾醇、麦角甾醇、豆甾醇、4,22-豆甾二烯-3-酮、豆甾醇乙酸酯、羊毛甾醇、环阿屯醇(cycloartenol)或它们的任何组合。胆固醇可以增强脂质双层的流动性并降低脂质双层的渗透性。
本文所用的术语“弹性蛋白样多肽(ELP)”是指一类根据温度经历构象改变的氨基酸聚合物。在一些实施方式中，ELP可以是具有“反相相变行为(inverse phasetransitioning behavior)”的聚合物。本文所用的术语“反相相变行为”是指在低于“反相相变温度(Tt)”的温度下，溶于水溶液中的物质或在高于Tt的温度下，不溶于水溶液中的物质。随着温度升高，ELP可能转变成紧密折叠的聚集体，其溶解度相比于高度可溶的长链显著降低。即，依据温度，ELP进一步包含6-转角或变形的6-结构可诱导这种反相相变。ELP的相变温度可在，例如约10℃至约70℃、约20℃至约70℃、约30℃至约70℃、约37℃(体温)至约70℃、约39℃至约70℃、约40℃至约70℃、约50℃至约70℃或约50℃至约70℃。
本文所用的“鞘脂”是通过水解产生鞘氨醇或其衍生物的任何一类脂质。鞘脂的非限制性例子包括鞘磷脂(sphingomyelins)和鞘糖脂(glycosphingolipid)，如脑苷脂、神经节苷脂和硫苷脂。术语“鞘脂”表示包含长链碱基(long-chain base，LCB)(即，鞘氨基醇(sphingoid)碱基，源自d-赤式-2-氨基-1,3-二醇的长链烃物质)的天然和合成物质，通常包含极性头部基团，并且可以包括进一步包含酰胺连接的脂肪酸的此类化合物，或对于N-去酰基化形式，通常称为“溶血鞘脂”的此类化合物，在该形式中通过酸-酰胺键键合于鞘氨醇的氨基的脂肪酸链被消除。本发明该方面中优选的鞘脂是溶血鞘脂，最优选鞘氨基醇碱基。
本文所用的术语“鞘氨基醇碱基”是指可以在烷基链长度和分支延伸程度上不同的长链氨基醇。哺乳动物中最常见的长链碱基是鞘氨醇、二氢鞘氨醇和植物鞘氨醇。
在本发明的各种实施方式中，所述至少一个脂质双层的脂质选自下组：二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、鞘磷脂、N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基甲基硫酸铵(DOTAP)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DMPG)、大豆氢化L-α-磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DSPG)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DPPG)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、来自鸡蛋、大豆油和聚山梨酯80的磷脂。
本文所用的术语“皮质类固醇”是指与皮质醇，一种肾上腺皮质中天然产生的激素密切相关的各种药物中的任何一种。皮质类固醇细分为A、B、C、D1和D2组。A组包括以下化合物：氢化可的松、醋酸氢化可的松、醋酸可的松、特戊酸泰可可酯、泼尼松龙、甲基泼尼松龙和泼尼松。B组包括曲安奈德、曲安西龙醇、莫米松、安西奈德、布地奈德、地奈德、氟轻松、氟新诺龙丙酮和哈西奈德。C组包括以下化合物：倍他米松、倍他米松磷酸钠、地塞米松、地塞米松磷酸钠和氟可龙。D1组包括以下化合物：氢化可的松-17-戊酸酯、卤美松、二丙酸阿洛米松、戊酸倍他米松、二丙酸倍他米松、泼尼卡酯(prednicarbate)、氯倍他松-17-丁酸盐、氯倍他索-17-丙酸盐、氟可托龙己酸盐、氟可龙新戊酸盐和氟泼尼定乙酸盐。D2组包括以下化合物：氢化可的松-17-丁酸酯、氢化可的松-17-醋酸酯、氢化可的松-17-丁酸酯、环索奈德和泼尼卡特酯。在优选的实施方式中，皮质类固醇是B组皮质类固醇。在其他优选的实施方式中，皮质类固醇选自：曲安奈德、氟新诺龙丙酮、曲安西龙醇、莫米松、安西奈德、布地奈德、地奈德、氟轻松和哈西奈德。
在本发明的优选实施方式中，至少一种皮质类固醇和形成所述至少一种脂质双层的脂质的比率在0.01和0.5之间，优选0.1和0.3之间，更优选0.12和0.18之间。该比率是指皮质类固醇和形成脂质双分子层的脂质的总量。该量是通过皮质类固醇和脂质的重量来测量的。因此，例如，如果1g皮质类固醇和1g脂质A以及1g脂质B用于制备本发明的纳米脂质体，则所得药物/脂质比率为0.5(1g皮质类固醇/1g脂质A+1g脂质B])。
在其它优选的实施方式中，脂质体的尺寸在10nm至1000nm之间，优选50nm至150nm之间。本文所用的术语“脂质体的尺寸”是指脂质体的最外部脂质双层的直径。
在本发明的各种实施方式中，所述至少一种脂质双层包含至少两种不同类的脂质。因此，脂双层可以由DPPC/DSPE-PEG、DPPC/DOTAP或DMPC/DOTAP的组合形成。
本发明范围内还包括这样的实施方式，其中形成所述至少一个脂质双层的脂质被聚乙二醇(PEG)修饰和/或所述至少一个脂质双层包含非偶联的聚乙二醇(PEG)。本文所用的术语“PEG”是指聚乙二醇分子。在其典型形式中，PEG是具有末端羟基的线性聚合物并具有式HO-CH2CH2-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH，其中n为约8至约4000。通常，n不是离散值，而是构成了平均值附近具有近似高斯分布的范围。末端氢可以被诸如烷基或链烷醇基团等封端基团取代。优选地，PEG具有至少一个羟基，更优选它是末端羟基。该羟基优选与可与脂质反应形成共价键的接头部分连接。本领域存在许多PEG的衍生物。(参见，例如，美国专利号5445090；5900461；5932462；6436386；6448369；6437025；6448369；6495659；6515100和6514491和Zalipsky,S.Bioconjugate Chem.6:150-165,1995)。游离或共价连接至形成双层的脂质的PEG分子可以具有约10,000、20,000、30,000或40,000道尔顿的平均分子量。PEG分子优选18,000至22,000道尔顿。更优选地，它是19,000至21,000道尔顿。最优选它是20,000至21,000道尔顿。甚至更优选约20,000道尔顿。PEG化试剂可以是线性或分支的分子，并且可以单独存在或先后存在。本文可互换使用的术语“PEG化”或“用PEG修饰”是指将如上所述的一个或多个PEG分子共价连接至形成本发明的纳米脂质体的脂质双层的脂质分子。本文所用的“非偶联”或“游离”PEG分子是指不与另一分子共价结合的PEG分子。然而，此类PEG分子可能通过非共价相互作用，例如离子相互作用、疏水相互作用、氢键、范德华力等与其它分子相互作用。
在优选的实施方式中，所述至少一个脂质双层还包含将纳米脂质体靶向泡沫细胞的分子。本文所用的术语“泡沫细胞”是指已经被泡沫细胞刺激性配体刺激的细胞，与没有被刺激的细胞相比，吸收脂蛋白的能力增强。增强摄取可以根据本领域已知的常规程序来测量。也可以在形态上识别泡沫细胞。一旦它们摄取了脂质，它们看起来大于正常巨噬细胞，但小于巨细胞(giant cell)。它们似乎缺乏交叉伪足。它们充满脂质，装载有脂质液滴从而在视觉上明显排除内质网和细胞器。液滴大约是核大小的十分之一。
本文可互换使用的术语“将纳米脂质体靶向泡沫细胞的分子”或“靶向分子”包括这样的分子，其含有至少一个特异性结合位于泡沫细胞中的结构或结合伴侣的结合位点。“特异性结合”是指结合分子(结合部分)表现出与结合分子或结构有实质性的背景结合。本文所用的术语“特异性”是指相比于不同抗原，结合部分优先结合一种结合分子的能力，并且不一定意味着高亲和力(如本文进一步定义的)。可以特异性结合和/或对特定结合分子具有亲和力的结合部分被认为是“针对”或“直接针对”所述抗原或抗原决定簇。对于两种不同的分析物分子，如果对这两种不同的分析物分子都是特异性的，则称本发明的靶向分子是“交叉反应的”。本文所用的术语“亲和力”是指结合分子与分析物分子结合的程度，从而将游离分析物分子和结合分子的平衡移向因其结合形成的复合物的存在。因此，例如，当靶向分子和结合分子以较为相等的浓度结合时，高亲和力的靶向分子将结合可用的结合分子，从而将平衡移向高浓度的所得复合物。解离常数(Kd)通常用于描述结合分子与其靶标之间的亲和力。通常，解离常数低于105M。优选解离常数低于106M，更优选低于107M。最优选解离常数低于108M。
本文所用的术语“特异性地结合”和“特异性结合”通常是指靶向分子优先结合存在于泡沫细胞中的特定结合分子的能力。在某些实施方式中，特异性结合相互作用将区分细胞中需要的和不需要的分子，在一些实施方式中，超过约10至100倍或更多(例如，超过约1000或10,000倍)。
在各种实施方式中，靶向分子选自：蛋白质，优选抗体，核苷酸和天然配体。本文所用的术语“蛋白质”涉及一种或多种多肽，其中多肽由通过肽(酰胺)键偶联的氨基酸组成。术语多肽是指由共价连接的氨基酸残基组成的聚合化合物。氨基酸优选20种天然存在的氨基酸，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、酪氨酸和色氨酸。
本文所用的术语“抗体”是指完整的免疫球蛋白，包括单克隆抗体，例如嵌合抗体、人源化抗体或人单克隆抗体，或涉及免疫球蛋白的抗原结合片段和/或包含可变结构域的片段，所述片段与完整的免疫球蛋白竞争特异性结合该免疫球蛋白的结合伴侣。无论结构如何，抗原结合片段都与完整免疫球蛋白识别的同一抗原结合。本文所用的术语“抗体”包括来自完整抗体的类别和亚类的免疫球蛋白。这些包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中的一些可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4及其抗原结合片段。
抗原结合片段尤其包括Fab、F(ab′)、F(ab′)2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、双抗体、三抗体、四抗体、含有免疫球蛋白的至少一片段的(多)肽，所述免疫球蛋白足以赋予特定抗原与该(多)肽结合，等等。上述片段可以通过合成或通过酶学或化学切割完整免疫球蛋白产生或者它们可以通过重组DNA技术进行基因工程改造。生产方法是本领域公知的，并且描述于，例如由E.Harlow和D.Lane编辑的《抗体：实验室手册》(Antibodies:A Laboratory Manual)(1988)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，通过引用纳入本文。结合分子或其抗原结合片段可以具有一个或多个结合位点。如果存在多于一个结合位点，则结合位点可以彼此相同或者它们可以不同。
本文所用的术语“核苷酸”是指任何磷酸化状态的核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、双脱氧核苷酸、核苷酸的无环衍生物及其功能等同物。核苷酸的功能等同物是可以在聚合酶或其他酶促反应中，例如在扩增或引物延伸方法中功能性取代任何标准核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的那些。核苷酸的功能等价物也可以是形成保留以序列特异性方式与靶多核苷酸杂交的能力的多核苷酸的那些。
本文所用的术语“配体”是指能够结合靶蛋白的分子或更常见是指化合物。靶蛋白可以具有与其结合的辅因子或生理学底物。感兴趣的配体可以结合在蛋白质上的它处或可以竞争与，例如生理配体结合。感兴趣的配体可以是药物或候选药物或天然存在的结合伴侣、生理学底物等。因此，配体可以与靶标结合形成更大的复合物。配体可以以任何亲和力，即以高或低亲和力结合靶标。一般而言，与以较低亲和力与靶标结合的配体相比，以高亲和力与靶标结合的配体可产生热力学上更稳定的靶标。典型地，能够结合靶标的配体可以导致该靶蛋白的热稳定至少0.25或0.5℃，优选至少1、1.5或2℃。
在优选的实施方案中，靶向分子是叶酸和/或SEQ ID NO:1所示的Lyp-1肽。术语“叶酸”在本文中用作包含蝶啶环、对-氨基苯甲酸和一个或多个谷氨酸残基的天然存在或合成化合物的统称。本文所用的术语“叶酸”还包括这些化合物的生物活性形式，例如四氢叶酸。
本文所用的术语“Lyp-1肽”是指具有H-Cys-Gly-Asn-Lys-Arg-Thr-Arg-Gly-Cys-OH(SEQ ID NO:1)所示氨基酸序列的肽。在一些实施方式中，Cys残基可以通过二硫键连接(S-S键合)。在其它实施方式中，通过改变纳米脂质体暴露于其中的环境的氧化还原条件，在掺入纳米脂质体后，Cys残基彼此不连接或相互连接。
在第二方面，本发明涉及用作药物的本发明的纳米脂质体。
另一方面，本发明涉及本发明的纳米脂质体，用于治疗心血管疾病。本文所用的术语“心血管疾病”旨在指代导致整个身体的血管(包括动脉、静脉、小动脉、小静脉和毛细血管)变窄和/或闭塞的所有病理学状态。具体而言，术语“心血管疾病”是指包括动脉粥样硬化、血栓形成和其它相关病理状态的病症，尤其是在心脏和大脑的动脉内。因此，术语“心血管疾病”包括但不限于各种类型的心脏病，以及阿尔茨海默病、血管维度(vasculardimension)、动脉硬化症、高脂血综合征、冠状动脉痉挛、充血性心力衰竭(HF)、冠状动脉疾病(CAD)、心脏病心律失常、心包炎和极端心肌梗塞(MI)。在本发明的优选实施方式中，心血管疾病是动脉粥样硬化。
本文所用的“动脉粥样硬化”是指一种血管疾病形式，其特征在于含有胆固醇和脂质的粥样斑块在大中型动脉壁的最内层上沉积。动脉粥样硬化包括相关医学领域中实践的医生所认可和理解的血管疾病和病症。动脉粥样硬化性心血管疾病，包括血管重建过程后的再狭窄、冠心病(也称为冠状动脉疾病或缺血性心脏病)、包括多发梗塞性痴呆在内的脑血管疾病和包括勃起功能障碍在内的外周血管疾病，均是动脉粥样硬化的临床表现，因此包括在术语“动脉粥样硬化”和“动脉粥样硬化病”中。
在优选的实施方式中，动脉粥样硬化的治疗包括中期至晚期动脉粥样硬化斑块的治疗。本文所用的术语“动脉粥样硬化斑块”是指在动脉内形成的结构。斑块由胆固醇、脂肪物质、细胞废物、钙和纤维蛋白组成并阻塞血管。动脉粥样硬化分为三个子阶段。动脉粥样硬化的第一(早期)阶段是在动脉的内皮衬里(内层)上形成脂肪条纹。在动脉内壁形成纤维斑块是动脉粥样硬化的第二阶段(中期)。斑块还包含巨大数量的巨噬细胞、平滑肌细胞和淋巴细胞。当纤维斑块破裂时，动脉粥样硬化的最后(晚期)阶段将开始，显露其下的胆固醇和结缔组织层，从而引发强烈的凝血反应(导致形成多个血块或血栓)。
最后，在第四方面，本发明涉及制备本发明的纳米脂质体的方法，包括：a)提供包含形成所述至少一个脂质双层的脂质和溶剂的组合物；b)将所述至少一种皮质类固醇加入步骤a)的组合物中；和c)除去溶剂以制备本发明的纳米脂质体。本文所用的术语“除去”或“基本除去”是指从组合物中去除至少10％、更优选至少50％、还要优选至少80％或至少90％或至少95％的溶剂以制备本发明的纳米脂质体。
本文所用的术语“溶剂”是指具有至少一种非水性液体的液体。可以使用的适用于非水液体的候选实例包括但不限于C1至C30烃及其组合，更优选C1至C5烃。此处优选的烃包括C1-C3。合适的烃的例子包括但不限于甲醇、乙醇、异丙醇、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、线性和环状链烷烃、稀释剂、煤油、轻重石脑油和它们的组合。本文所用的术语“溶剂”还指不同液体的组合物。
在优选的实施方式中，所述方法在去除溶剂之后进一步包括挤出步骤。此类挤出步骤对技术人员来说是公知的(Hope,M.J.等，《脂质体技术》(Liposome Technology)，第8章，“通过挤出技术降低脂质体尺寸和单层囊泡的制备”(REDUCTION OF LIPOSOME SIZEAND PREPARATION OF UNILAMELLAR VESICLES BY EXTRUSION TECHNIQUES)，卷I，1993，第123-139页，CRC出版社)。
实施例
实施例1：氟新诺龙丙酮(FA)
这是第一项研究，显示氟新诺龙丙酮化合物以高负载浓度包封到纳米脂质体中。在包含饱和和不饱和脂质的普通和聚乙二醇化脂质体中测试不同的药物/脂质摩尔比(D/L比率最高0.2)。
样品1：药物/脂质比为0.15
制备大单层囊泡(LUV)
通过薄膜水合技术制备脂质体制剂。称取DPPC和DSPE-PEG 2K并溶解在圆底烧瓶中的氯仿:甲醇(2:1v/v)溶剂混合物中。以0.15:1的药物:脂质摩尔比向该脂质溶剂混合物中加入氟新诺龙丙酮。使用连接到保持在40℃的水浴的旋转蒸发仪除去溶剂混合物。将烧瓶以150rpm旋转1小时以彻底除去溶剂，从而产生载有药物的薄脂质膜。向该薄膜中加入等渗磷酸盐缓冲盐水(PBS；150mM，pH7.4)以形成多层囊泡(MLV)。将MLV通过聚碳酸酯过滤器(0.2μm，5次/0.08μm，7次)依次挤出以形成尺寸分布为0.08-0.12μm直径的LUV。
载药脂质体的表征
尺寸稳定性研究
使用Malvern Zetasizer Nano ZS来表征脂质体的平均尺寸以及尺寸分布(多分散指数)。制备后测量颗粒大小，并在储存(4℃)下和体外药物释放后连续监测。
药物分配系数估算
药物分配系数的值由与脂质体相关的药物浓度与分布在含水连续相中的药物浓度之比确定。估算在挤出步骤之前完成。将已知的MLV样品体积收集在微量离心管中，并以13000rpm离心20分钟。MLV因其尺寸大而从澄清的上清液中分离出来。从上清液估计药物浓度作为脂质体非相关药物浓度的量度。当从总药物浓度中减去该值时，产生脂质体相关的药物浓度。通过以1:4的体积比混合已知体积的脂质体与异丙醇来估计总药物浓度。
药物释放研究
将1mL体积的载药脂质体悬浮液置于纤维素酯透析袋中(100kDa MWCO，1.6cm直径×6cm长度)，并用40mL PBS pH 7.4作透析。保持在37℃的恒温箱内，在以50rpm运行的定轨振荡器上进行透析。每24小时从释放介质中取出等分试样并测定释放的药物。每24小时用新鲜的PBS pH 7.4完全更换释放介质以保持动态槽状态。
药物浓度估算
使用UV/Vis分光光度计(Tecan，infinite M200)在波长243nm处估算醋酸氟新诺龙丙酮的浓度。在96孔微量培养板(Costar 3635)中使用150μL的样品体积。将药物评估与在pH7.4的PBS中的氟新诺龙丙酮化合物的标准校准曲线进行比较。
结果
药物分配系数值和药物加载效率
DPPC和掺入DPPC多层脂质体制剂的5mol％DSPE-PEG 2K的分配系数值均为5±1。该值意味着脂质体相关的药物的80-85％。对于初始药物与脂质摩尔比为0.15的两种制剂，在(93±10)％下达到高负载效率。加载效率指示挤出后药物保留在脂质体系统中的百分比。挤出后，两种制剂中氟新诺龙丙酮的最终浓度估计约为1mg/mL。最终的药物/脂质摩尔比估计为0.138±0.015。
体外尺寸稳定性
使用Zetasizer(英国马尔文市马尔文仪器公司-Malvern Instruments)连续监测脂质体在储存后以及药物释放研究期间的尺寸变化。如图1所示，在4℃储存时，两种载有氟新诺龙丙酮的脂质体制剂均稳定至少3个月。在整个37℃释放研究期间，颗粒大小也是稳定的。
体外药物释放研究
通过透析技术评估从脂质体释放的氟新诺龙丙酮，并且表示为随时间的累积药物释放(％)，如图2所示。在体外，FA从脂质体中释放持续最高30天。掺入5mol％DSPE-PEG 2K对释放行为没有显示任何显著影响，并且与普通DPPC脂质体相似。此外，在体外药物释放研究时期结束时，囊泡尺寸变化很小。结果总结在图3中。
样品2：药物/脂质比为0.10
实验过程与样品1中描述的方法类似。每天的释放行为和释放量示于图4。
样品3：药物/脂质比为0.20
实验过程与样品1中描述的方法类似。每天的释放行为和释放量示于图5。
实施例2：曲安奈德(TA)
另一种皮质类固醇药物，曲安奈德(TA)也证实从纳米脂质体中持续释放，这是第一项显示该药物从纳米脂质体中的高载药量和持续释放的首次研究。制备和释放与之前描述的方法完全相似。图6和图7分别显示了PEG化脂质体的TA加载和释放的结果。
实施例3：包含鞘脂的纳米脂质体
实验过程与前述方法类似。测试初始药物/脂质摩尔比为0.15。图8和图9分别显示了从包含鞘脂的纳米脂质体加载和释放FA的结果。
实施例4：包含荷电脂质的纳米脂质体
实验过程与前述方法类似。已经证实了基于DPPC-和DMPC-的荷电纳米脂质体持续释放氟新诺龙丙酮(FA)。载药和释放的结果示于图10-12。
实施例5：36mM的较高脂质浓度的纳米脂质体
已经证实了DPPC纳米脂质体的氟新诺龙丙酮(FA)持续释放，其脂质浓度是先前测试的两倍(36mM对18mM)。实验过程与之前描述的方法完全相似。测试的初始药物/脂质摩尔比为0.3。图13和图14显示了其FA加载和释放的结果。
本文广泛地和一般性地描述了本发明。落入泛泛公开内容中的每个较窄种类和亚群组也构成本发明的一部分。这包括本发明的一般性描述以及从该种中除去任何主题的附带条件或负限定，而不管本文是否具体列举了所排除的物质。其它实施方式落在以下权利要求内。另外，如果根据马库什组描述本发明的诸特征或方面，本领域技术人员将认识到，本发明也由此根据马库什组的任何成员或亚组成员进行了描述。
本领域的技术人员不难理解，本发明非常适合于实现所述目的并获得所提及的目标和优点以及其中固有的目标和优点。此外，对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对本文公开的发明进行各种替换和修改。本文所述的组合物、方法、过程、处理、分子和具体化合物的目前优选实施方式的代表，是示例性的，并不试图限制本发明的范围。本领域技术人员将会想到其中的改变和其它用途，这些改变和其它用途包含在由权利要求的范围限定的本发明构思内。本说明书中先前公开的文件的清单或讨论不能视作承认该文件是现有技术状的一部分，或者是公知常识。
本文中说明性描述的本发明可以在没有任何一个或多个元件、一个或多个限制条件的情况下适当地实施，本文未具体公开。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当被广义地理解并且没有限制。词语“包含”或诸如“包括”或“包含有”等改变形式将相应理解为暗示包括所陈述的一个或多个整数或组，但不排除任何其它整数或组。另外，本文使用的术语和表述方式用作描述性术语而非限制，并且不希望使用此类术语和表述方式来排除所示出和描述的特征的任何等同物或其诸部分，但是应认识到在请求保护的本发明范围内可能作出各种修改。因此，应该理解，虽然已经通过示例性实施例和任选特征具体公开了本发明，但本领域技术人员可以想到本文公开的本发明的修改和变化，并且这些修改和变化认为是在本发明的范围内。
本文引用的所有文献和专利文献的内容全文引入作为参考。
序列表
<110> 南洋理工大学
<120> 作为药物的纳米脂质体及其制备方法
<130> P111426
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
Cys Gly Asn Lys Arg Thr Arg Gly Cys
1 5

Claims (19)

1.一种纳米脂质体，其特征在于，包含至少一个外部脂质双层和由所述至少一个脂质双层包封的至少一种皮质类固醇。
2.如权利要求1所述的纳米脂质体，其特征在于，所述至少一种皮质类固醇和形成所述至少一个脂质双层的脂质之比在0.01和0.5之间。
3.如权利要求1或2所述的纳米脂质体，其特征在于，所述至少一种皮质类固醇和形成所述至少一个脂质双层的脂质之比在0.1和0.3之间。
4.如权利要求1-3中任一项所述的纳米脂质体，其特征在于，所述至少一种皮质类固醇与形成所述至少一个脂质双层的脂质之比在0.12和0.18之间。
5.如权利要求1-4中任一项所述的纳米脂质体，其特征在于，所述脂质体的尺寸在10nm至1000nm之间，优选在50nm至150nm之间。
6.如权利要求1-5中任一项所述的纳米脂质体，其特征在于，所述至少一个脂质双层包含至少两种不同类型的脂质。
7.如权利要求1-6中任一项所述的纳米脂质体，其特征在于，形成所述至少一个脂质双层的脂质通过聚乙二醇(PEG)作修饰和/或所述至少一个脂双层包含非偶联的聚乙二醇(PEG)。
8.如权利要求1-7中任一项所述的纳米脂质体，其特征在于，所述至少一个脂质双层的脂质选自下组：磷酸胆碱和鞘脂。
9.如权利要求1-8中任一项所述的纳米脂质体，其特征在于，所述至少一个脂质双层的脂质选自下组：二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、鞘磷脂、N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基甲基硫酸铵(DOTAP)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DMPG)、大豆氢化L-α-磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DSPG)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DPPG)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、来自鸡蛋、大豆油和聚山梨酯80的磷脂。
10.如权利要求1-9中任一项所述的纳米脂质体，其特征在于，所述皮质类固醇是B族皮质类固醇。
11.如权利要求1-10中任一项所述的纳米脂质体，其特征在于，所述皮质类固醇选自下组：曲安奈德、氟新诺龙丙酮、曲安西龙醇、莫米松、安西奈德、布地奈德、地奈德、氟轻松和哈西奈德。
12.如权利要求1-11中任一项所述的纳米脂质体，其特征在于，所述至少一个脂质双层还包含将所述纳米脂质体靶向泡沫细胞的分子。
13.如权利要求12所述的纳米脂质体，其特征在于，所述靶向分子是叶酸和/或如SEQID NO:1所示的Lyp-1肽。
14.如权利要求1-13中任一项所述的纳米脂质体，用作药物。
15.如权利要求1-13中任一项所述的纳米脂质体，用于治疗心血管疾病。
16.如权利要求15所述应用的纳米脂质体，其特征在于，所述心血管疾病是动脉粥样硬化。
17.如权利要求16所述应用的纳米脂质体，其特征在于，所述动脉粥样硬化的治疗包括治疗中期至晚期动脉粥样硬化斑块。
18.制备如权利要求1-13中任一项所述的纳米脂质体的方法，其特征在于，包括：
a)提供包含形成所述至少一个脂质双层的脂质和溶剂的组合物；
b)将所述至少一种皮质类固醇加入步骤a)的组合物中；和
c)去除所述溶剂以制备如权利要求1-13中任一项所述的纳米脂质体。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述去除溶剂之后，所述方法还包括挤出步骤。
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