CN100998651A - 治疗血栓栓塞性疾病的药物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗血栓栓塞性疾病的药物及其制备方法，由香椿子萃取物组成。本发明能明显有明显的抗凝血及抗血栓作用，能抑制血小板聚集，扩张血管，延长出、凝血时间，且具有相对安全、价廉、有效、方便、副作用小的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗血栓栓塞性疾病的药物及其制备方法
背景技术
血栓栓塞性疾病是严重危害人类健康的疾病之一，其致残率和死亡率较高。近年来随着对血栓栓塞性疾病危害性的研究，寻找和研制效果好、副作用小的治疗药物对人类健康具有十分重要的意义。目前，临床推荐使用的抗血栓药物虽然疗效确切，能降低心脑血管疾病的危害性，但不良反应明显，限制了在临床上长期使用。一些新的抗血栓西药虽然取得了疗效，但是价格较昂贵，且不良反应多，故找到一种价格适中，疗效好的药品是非常具有市场前景的。在中药治疗血栓栓塞性疾病方面，研究也较多，如湖南中医学院学报，2006，26(3)：63-64“中药抗血栓的实验研究进展”记载药方水蛭素、僵蚕、、丹参、土錜虫、红花、川芎、羌活、灯盏花素、陈皮、茶叶等。
目前，临床推荐使用的抗血栓药物虽然疗效确切，能降低心脑血管疾病的危害性，但不良反应明显，限制了在临床上长期使用。治疗血栓药物的缺点是t1/2短，用药时间长，有效率最高仅为75％，在体内易降解血中的血浆蛋白，且价钱昂贵等，因此寻找新的抗血栓药物成为国内外医药界的研究热点。理想的抗血栓药应当是有效(与梗死相关的动脉开通率较高)、安全(出血发生率低，特别是颅内出血)、给药方便、能溶解陈旧血栓、能抗PAI、无抗凝血反应、复发率低、对血压无影响、无抗原性、价格合理等。我国中医药研究表明，具有活血化淤或理气化瘀作用的中药及其单体化合物具有不同的调节内皮细胞抗血栓作用。与目前已经上市的抗血栓西药和生物技术产品相比，天然中草药安全性好，口服有效。因此，发展纯天然的抗血栓药物是目前研制新型抗血栓药物的有效途径。
香椿子(《东北药植志》)为楝科植物香椿的果实，秋季采收，晒干。又名椿树子(《生生编》)，椿芽树花(《民间常用草药汇编》)，椿花(《四川中药志》)，春尖花(《重庆草药》)，香椿铃(《陕西中药志》)。药材为干燥果实，长2.5-3.5厘米。果皮开裂为5瓣，深裂至全长2/3左右，裂片披针形，先端尖，外表黑褐色，有细纹理，内表黄棕色，光滑，厚约2.5毫米，质脆。果轴呈圆锥形，顶端钝尖，黄棕色，有5条棕褐色棱线。断面内心松泡色黄白。种子着生于果轴及果瓣之间，5列，种子有极薄的种翅，黄白色，半透明，基部斜口状，种仁细小不明显。气微弱。以完整、干燥者为佳。主产四川。
据《四川中药志》记载，香椿子性温、味辛苦、无毒，入肝、肺经。具祛风、散寒、止痛之功效，主治风寒外感、心胃气痛，风湿关节痛、疝气及冷骨风。《民间常用草药汇编》用香椿子治心胃气痛。《湖南中药志》将香椿子与龙骨研末冲开水服治胸痛。香椿子五钱水煎服治疝气痛。《贵州中医验方》用香椿子和饴糖蒸服治痔漏。
而香椿子治疗血栓栓塞性疾病在国内外各文献中并无明确记载。
发明内容
本发明的目的是提供一种相对安全、价廉、有效、方便、副作用小的治疗血栓栓塞性疾病的药物。
本发明的另一个目的是提供一种治疗血栓栓塞性疾病的药物的制备方法。
本发明的目的是这样实现的：一种治疗血栓栓塞性疾病的药物，其特征在于它由香椿子萃取物组成。
制备上述的治疗血栓栓塞性疾病的药物，香椿子粉碎后筛，用78％工业乙醇回流提取3次，减压回收乙醇并浓缩至小体积，依次用石油醚、乙酸乙醋、正丁醇萃取，各萃取液均回收尽溶剂，然后用不同比例的石油醚-乙酸乙醋、环已烷-丙酮等进行硅胶柱层析，经反复制备性重结晶后得有效成份，石油醚-乙酸乙醋1∶1、环已烷-丙酮比例为2∶1。
制备上述的治疗血栓栓塞性疾病的药物，取香椿子粉碎后过筛，水蒸汽蒸馏，将馏出物移至分液漏斗中，再用无水乙醚萃取，取上层油相于具塞试管中，用无水Na2SO4干燥后，50℃水浴回收乙醚得油状物。
本发明有明显的抗凝血及抗血栓作用，能抑制血小板聚集，扩张血管，延长出、凝血时间，且具有相对安全、价廉、有效、方便、副作用小的优点。
具体实施方式
以下通过试验例来进一步说明本发明的有益效果。
试验例本发明对内源性凝血途径、外源性凝血途径的抑制作用
1实验材料
1.1动物 昆明种小鼠，体重18～22g，雌雄兼用。SD大鼠，180～250g。清洁级，购于武汉华中科技大学同济医学院实验动物中心，批号：SCXK(鄂)2004-0007。
1.2药品及试剂：香椿子采集于三峡地区，经三峡大学医学院药理教研室晒干备用。取干透的香椿子500g，加入5000ml蒸馏水浸泡，过夜，次日加热煮沸40min后，过滤，药渣加5000ml水，加热煮沸30min，过滤，合并滤液，放水浴上蒸发浓缩至每ml含1g生药，高压灭菌后4℃保存。临用时稀释成各实验所需浓度。阿司匹林，神威药业有限公司(0604092)。血塞通，云南玉溪维和制药有限公司(20060419)。枸橼酸钠，上海宏申化工厂(20040703)。氯化钙，上海宏申化工厂(20060102)。醋酸，天津市泰兴试剂厂(200405021)。测定凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间试剂盒均购自上海太阳生物技术有限公司。
1.3仪器：MA200型电子分析天平，上海第二天平仪器厂。80-2型电动离心机，江苏恒丰仪器厂。DK-S26型电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司。
2方法
2.1对小鼠凝血时间的影响
2.1.1毛细玻管法 取小鼠63只，随机分为9组，分别为生理盐水(NS)对照组，香椿子水煎液1组(200mg/Kg)，香椿子水煎液2组(400mg/Kg)，香椿子水煎液3组(600mg/Kg)，香椿子水煎液4组(800mg/Kg)，香椿子水煎液5组(1000mg/Kg)，香椿子水煎液6组(1200mg/Kg)，香椿子水煎液7组(1400mg/Kg)，香椿子水煎液8组(1600mg/Kg)。连续灌胃7天，末次给药1h后，用内径为1mm的毛细玻璃管插入小鼠眼内眦球后静脉丛取血。毛细玻管内血柱达5cm后，每隔30s折断一小段，检查有无出现血凝丝。计算从毛细玻管采血到出现血凝丝的时间，即为凝血时间。
2.1.2玻片法 取小鼠60只，随机分为生理盐水(NS)对照组，阿司匹林(ASP)组(200mg/Kg)，血塞通(XST)组(135mg/Kg)和香椿子水煎液低、中、高剂量组(400mg/Kg、1000mg/Kg、1400mg/Kg)，每组10只。连续灌胃7天，末次给药1h后，将内径为1mm的玻璃毛细管插入小鼠眼眶内，使血自动流出，弃去第一滴血，再滴血于清洁载玻片上，血滴直径为5～10mm。立即开始计时，此后每隔30s用干燥针头挑动血液1次，至针头能挑起纤维蛋白丝为止，即为凝血时间。
2.2对小鼠出血时间的影响(断尾法) 取健康小鼠20只，随机分为生理盐水(NS)对照组和香椿子水煎液低、中、高剂量组，每组5只，香椿子给药剂量同2.1.2。连续灌胃7天，，第7天灌胃1h后，固定小鼠，以毫米尺测量鼠尾长度并标记，后以利剪在小鼠尾尖3mm处横断，待血液自行溢出时开始计时，每隔30s用滤纸吸去血滴1次，直至血液自然停止(滤纸吸时无血)为止，即为出血时间。
2.3对小鼠血浆复钙时间(Re-calcium Time，RT)的影响 取健康小鼠30只，分组及给药剂量同2.1.2。每组5只。在去Ca2+血浆中重新加入适量Ca2+，内源凝血过程得以重新恢复，所需要的时间就是RT。小鼠摘眼球采血1ml于装有3.8％枸橼酸钠的EP管中(血液∶抗凝剂＝9∶1)，1000r/min离心10min，分离血浆。取100μl分离好的血浆于37℃水浴1min，加入37℃预热的25mmol/L的CaCl2溶液100μl，立刻计时。在37℃水浴中观察，出现纤维蛋白丝时立刻停止计时，该时间即为RT。
2.4对大鼠凝血酶原时间(PT)的影响 大鼠50只，分为5组，每组10只。每组每日分别以血塞通(94.5mg/Kg)，香椿子水煎液280mg/Kg、700mg/Kg、980mg/Kg及等体积的生理盐水连续灌胃7天，第7天灌胃1h后，心脏取血2.7ml，以3.8％的枸橼酸钠1∶9抗凝，3000r/min离心10min，分离血浆待测。取待测血浆0.1ml，37℃孵育3min，加入37℃预温PT试剂0.2ml，立即计时。每隔5s倾斜试管一次，记录纤维蛋白凝固(液面不动)所需的时间(PT)。
2.5对大鼠活化部分凝血活酶时间(APTT)的影响 大鼠50只，分组、给药及血浆采集同2.4，测定时取待测血浆0.1ml加入37℃预温APTT试剂0.1ml，37℃孵育5min。再加入37℃预温25mmol/L CaCl2溶液0.1ml，立即计时。每隔5s倾斜试管一次，记录纤维蛋白凝固(液面不动)所需的时间(APTT)。
2.6对大鼠凝血酶时间(TT)的影响 大鼠50只，分组、给药处理及血浆采集同2.4。测定时取待测血浆0.2ml加入TT试剂0.2ml，立即计时。每隔5s倾斜试管一次，记录纤维蛋白凝固(液面不动)所需的时间(TT)。
2.7对大鼠优球蛋白溶解时间(ELT)的影响 大鼠35只，分组、给药处理及血浆采集同2.4，每组7只。取待测血浆0.5ml加蒸馏水9ml和10mol/L醋酸0.1ml，置于4℃冰箱内30min后，再以3000r/min离心15min，加入硼酸钠缓冲液(pH9.0)0.5ml使沉淀溶解。后置于37℃恒温箱中水浴，向管内加25mmol/LCaCl2溶液0.5ml，观察从凝块形成到完全溶解的时间，即为优球蛋白溶解时间。
2.8静脉血栓模型的复制及观察方法 大鼠35只，分组及给药处理同2.5，每组7只。连续给药7d。末次给药后30min，大鼠以3％戊巴比妥钠麻醉。腹部正中切口切开腹腔，分离下腔静脉，于左肾静脉下方用粗丝线结扎下腔静脉，缝合腹腔，结扎4h后处死大鼠，打开腹腔，在结扎下方2cm处夹闭管腔取出瘀血段血管，剖开管腔，取出血栓，放在滤纸上，吸干血液，用微量电子天平称取血栓湿重(mg).
2.9统计处理 实验数据均以均数±标准差(x±s)表示。所有实验数据均采用单因素方差分析。分析软件均为SPSS10.0。
3结果
3.1对小鼠凝血时间的影响：
3.1.1毛细玻管法结果见表1。香椿子5、6、7、8组与生理盐水比较能显著延长小鼠的凝血时间。而1、2、3、4组虽然在统计学上无明显差异，但从均数上看凝血时间要明显长于生理盐水组，提示香椿子能抑制小鼠的凝血功能，且随香椿子剂量增大，作用更明显、更稳定，与对照组的差异更显著，有明显的量效关系。
表1香椿子对小鼠凝血时间的影响(毛细玻管法)
| 组别 | 动物数(只) | 剂量(mg/Kg) | 凝血时间(秒) |
| 生理盐水组香椿子1组香椿子2组香椿子3组香椿子4组香椿子5组香椿子6组香椿子7组香椿子8组 | 777777777 | -2004006008001000120014001600 | 192.86±16.04195.00±25.1210.00±34.64244.29±63.47245.00±29.50300.00±75.89b292.50±89.58a381.43±96.00b282.86±62.11b |
与生理盐水组比较，ap＜0.05，bp＜0.01。
3.1.2玻片法结果见表2。香椿子低、中剂量组与生理盐水组比较能显著延长小鼠的凝血时间，其作用要远强于血塞通。低、中剂量组在延长凝血时间上虽然与阿司匹林组没有明显差异，但从均数上观察其作用要稍强于阿司匹林。高剂量组与生理盐水组没有明显差异，这可能与其剂量增加而由抗凝作用变化为促凝作用或毒性作用有关。
3.2对小鼠出血时间的影响：结果见表3。香椿子低、中、高剂量组的出血时间均明显长于生理盐水组，提示香椿子能抑制小鼠的血小板凝集功能。且低、中、高剂量组之间呈现出逐渐增加的剂量关系。
表2香椿子对小鼠凝血时间的影响(玻片法)
| 组别 | 动物数(只) | 剂量(mg/Kg) | 凝血时间(秒) |
| 生理盐水组阿司匹林组血塞通组香椿子低剂量组香椿子中剂量组香椿子高剂量组 | 101010101010 | -20013540010001400 | 155.50±21.60294.30±114.26a154.89±109.65b340.70±100.50ad316.80±114.24ad202.30±35.90cef |
与生理盐水组比较，ap＜0.01；与阿司匹林组比较，cp＜0.05，bp＜0.01；与血塞通组比较，dp＜0.01；与香椿子低剂量组比较，ep＜0.01；与香椿子中剂量组比较，fp＜0.01
表3荨麻对小鼠出血时间的影响(断尾法)
| 组别 | 动物数(只) | 剂量(mg/Kg) | 凝血时间(秒) |
| 生理盐水组香椿子低剂量组香椿子中剂量组香椿子高剂量组 | 5555 | -40010001400 | 372.00±93.911080.00±512.20a1386.00±690.13b2202.00±593.06b |
与生理盐水组比较，ap＜0.05，bp＜0.01。
3.3香椿子对血浆复钙时间的影响：结果见表4。香椿子中、高剂量组与生理盐水组比较，均明显延长了血浆复钙时间(P＜0.01)。低剂量组与生理盐水组没有明显差异。香椿子三个组与阿司匹林组及血塞通组之间无明显差异。
表4香椿子对血浆复钙时间的影响
| 组别 | 动物数 | 剂量 | 凝血时间 |
| (只) | (mg/Kg) | (秒) | |
| 生理盐水组 | 5 | - | 105.40±25.74 |
| 阿司匹林组 | 5 | 200 | 167.33±22.96 |
| 血塞通组 | 5 | 135 | 191.33±60.27a |
| 香椿子低剂量组 | 5 | 400 | 123.00±79.28 |
| 香椿子中剂量组 | 5 | 1000 | 209.00±60.78bc |
| 香椿子高剂量组 | 5 | 1400 | 198.29±65.83bc |
与生理盐水组比较，ap＜0.05，bp＜0.01；与香椿子低剂量组比较，cp＜0.05。
3.4香椿子对大鼠PT、APTT及TT的影响：结果见表5。香椿子低、中、高剂量组均显著延长了大鼠PT及TT，与血塞通组比较无明显差异。高剂量组与生理盐水组比较能显著延长大鼠的APTT，且其作用要强于血塞通组。低、中剂量组在延长凝血时间上虽然在统计学上与生理盐水组没有明显差异，但从均数上观察其APTT均较生理盐水组长。
表5香椿子对大鼠PT、APTT及TT的影响
| 组别 | 动物数(只) | 剂量(mg/Kg) | PT(秒) | APTT(秒) | TT(秒) |
| 生理盐水组血塞通组香椿子低剂量组香椿子中剂量组香椿子高剂量组 | 1010101010 | -94.5280700980 | 14.66±3.5621.30±1.93b22.80±4.99b21.06±2.29b22.94±5.12b | 22.30±2.5527.91±7.4928.23±9.7025.30±5.5431.97±6.56bc | 39.12±3.6646.15±4.29a49.79±6.76b45.37±6.06a45.11±3.96a |
与生理盐水组比较，ap＜0.o5，bp＜0.01；与香椿子中剂量组比较，cp＜0.05
3.5对大鼠优球蛋白溶解时间(ELT)的影响：结果见表6。香椿子低、中、高剂量组均显著缩短了大鼠ELT，与血塞通组比较无明显差异。但香椿子三组之间无明显的量效关系。
3.6对大鼠血栓湿重的影响：结果见表6。结果表明，香椿子高剂量组和中剂量组的湿重与空白对照组比较均有显著性差异，与血塞通组无明显差异，提示香椿子对大鼠体内血栓模型动物的血栓形成有明显的抑制作用。
表6对大鼠优球蛋白溶解时间(ELT)及血栓湿重的影响
| 组别 | 动物数(只) | 剂量(mg/Kg) | ELT(min) | 血栓湿重(mg) |
| 生理盐水组血塞通组香椿子低剂量组香椿子中剂量组香椿子高剂量组 | 77777 | -94.5280700980 | 149.43±13.0566.29±11.81b73.86±8.71b69.00±24.45b67.71±15.96b | 32.72±6.5721.60±6.36b26.61±4.5821.40±4.93b23.09±7.66a |
与生理盐水组比较，ap＜0.05；bp＜0.01。
大量实验与临床资料表明，许多严重危害人类健康的疾病，如脑血栓、心肌梗死、弥漫性血管内凝血、肺栓塞、深部静脉血栓等的发生、发展与血栓形成密切相关。对于血栓形成的防治，必须从保护血管内皮、降低血小板功能、抑制血液凝固、促进纤溶活性、降低血液粘滞性、改善血流动力与流态条件等多个环节采取措施。因此，寻找具有抗血栓作用的中药方剂或单味中药有效成分，对临床防治血栓形成具有实践意义。
机体凝血过程可分为3个阶段：凝血酶原激活物的形成，凝血酶原被激活成凝血酶，纤维蛋白原转变成纤维蛋白。凝血酶原的激活有两种途径，即内源性途径和外源性途径。凝血时间和凝血酶原时间可分别反映内凝和外凝系统的功能状况。凝血时间是指血液自离体至凝固所需时间，大部分是内源性凝血活酶生成所需时间，其长短与第VIII、IV、XI等因子关系很大。测定凝血时间是观察受试药物对血凝机制有无影响的第一步。血浆复钙时间的测定是检验内源性凝血系统功能的简便方法，此法可作为活血化瘀药物的快速筛选方法。APTT，TT和PT是各自独立的基础性凝血途径筛查指标，APTT和TT的延长与内源系统凝血酶的抑制有关，PT是反映外源性凝血途径的指标。优球蛋白是溶于盐而不溶于水的一类球蛋白，它含有纤维蛋白原、纤维蛋白酶原及其激活物。优球蛋白溶解时间是检测受试药物对血液中纤维蛋白溶解活性影响的较为敏感的指标之一。
香椿子能显著延长小鼠凝血时间、出血时间和血浆复钙时间，表明其对内源性凝血途径有抑制作用，香椿子还能显著延长大鼠PT，表明其对外源性凝血途径也有抑制作用。香椿子能够抑制内源性和外源性凝血途径，从而抑制了凝血活酶的形成。香椿子显著延长大鼠APTT和TT的结果更充分说明了这一点。香椿子能够延长优球蛋白溶解时间，这说明其能抑制纤溶酶活性，此作用可能与抑制纤溶酶激活物和激活纤溶酶抑制物有关。此外对实验性动物模型血栓的形成均也有显著的抑制作用。研究表明，香椿子具有较强的抗凝血及抗血栓作用。其详细作用机制有待于进一步研究。
实施例
一种治疗血栓栓塞性疾病的药物，其特征在于它由香椿子萃取物组成。
制备上述的治疗血栓栓塞性疾病的药物，香椿子粉碎后筛，用78％工业乙醇回流提取3次，减压回收乙醇并浓缩至小体积，依次用石油醚、乙酸乙醋、正丁醇萃取，各萃取液均回收尽溶剂，然后用不同比例的石油醚-乙酸乙醋、环已烷-丙酮等进行硅胶柱层析，经反复制备性重结晶后得有效成份，石油醚-乙酸乙醋1∶1、环已烷-丙酮比例为2∶1。
制备上述的治疗血栓栓塞性疾病的药物，取香椿子粉碎后过筛，水蒸汽蒸馏，将馏出物移至分液漏斗中，再用无水乙醚萃取，取上层油相于具塞试管中，用无水Na2SO4干燥后，50℃水浴回收乙醚得油状物。
Claims (3)
1、一种治疗血栓栓塞性疾病的药物，其特征在于它由香椿子萃取物组成。
2、制备权利要求书1所述的治疗血栓栓塞性疾病的药物，其特征在于：香椿子粉碎后筛，用78％工业乙醇回流提取3次，减压回收乙醇并浓缩至小体积，依次用石油醚、乙酸乙醋、正丁醇萃取，各萃取液均回收尽溶剂，然后用不同比例的石油醚-乙酸乙醋、环己烷-丙酮等进行硅胶柱层析，经反复制备性重结晶后得有效成份，环己烷-丙酮比例为2∶1。
3、制备权利要求书1所述的治疗血栓栓塞性疾病的药物，其特征在于：取香椿子粉碎后过筛，水蒸汽蒸馏，将馏出物移至分液漏斗中，再用无水乙醚萃取，取上层油相于具塞试管中，用无水Na2SO4干燥后，50℃水浴回收乙醚得油状物。
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| CN110467685A (zh) * | 2019-08-13 | 2019-11-19 | 安徽工程大学 | 一种香椿子多糖的制备、纯化方法及其应用 |
| CN110467685B (zh) * | 2019-08-13 | 2021-05-04 | 安徽工程大学 | 一种香椿子多糖的制备、纯化方法及其应用 |
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| CN100998651B (zh) | 2011-06-15 |
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