CN100560198C - 一种低密度脂蛋白胆固醇的选择性吸附剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种低密度脂蛋白胆固醇的选择性吸附剂，其成分包括载体和功能配基两大部分，其中载体为表面含有游离官能基团羟基和/或胺基的天然的或者人工合成的高分子物质，配基包括肝素及其衍生物，或类肝素中一种或及其复合，配基通过偶联剂偶联固定在载体上。本发明还涉及吸附剂的制备。本发明选用表面富含官能基团的高分子为载体，采用共价键结合方式固定配基，保留了配基上的活性基团羧基和磺酸基，使配基的特异性吸附LDL的功能基得到了保留和不受破坏；同时保证材料在实际使用时配基不会脱落，增强了使用的安全性。此吸附剂制备过程简便、制作成本低廉。在临床治疗上将表现为降低病人的治疗费用，并且安全、有效。

Description

一种低密度脂蛋白胆固醇的选择性吸附剂及其制备方法

技术领域

本发明属于化学合成和蛋白质生物分离工程领域，特别涉及到一种用于血液净化中以选择性吸附去除低密度脂蛋白胆固醇的以肝素为配基的吸附剂，本发明还涉及所述吸附剂的制备方法。

技术背景

血液净化疗法是自20世纪80年代以来出现的一种非常规临床治疗方法，主要是通过清除血液中的某些致病物质来实现治疗某些病症的一种独特的治疗方法，其实质是生物分离技术在医学领域的应用。伴随着生物分离技术以及生物材料的发展，血液净化治疗技术也得到了长足的进步。血液净化疗法的特征是通过在体外建立临时的人体血液循环支路，使血液流经吸附柱以除去血液中的某些致病物质，净化人体的内环境，达到治疗某些疾病的目的。肝素诱导的体外低密度脂蛋白(LDL)沉淀法(简称H.E.L.P.法)是血液净化疗法中的一种重要的选择性治疗方法，其原理是在特定的条件下游离肝素与LDL在体外形成共沉淀而将LDL过滤去除，达到净化的目的。由于肝素不与Apo A、白蛋白或免疫球蛋白等形成沉淀，且对其他成份亦无影响，因此目前认为其是一种治疗高脂血症特别是家族性高脂血症较好的疗法，其除了应用在高脂血症的治疗外，还可以用在动脉粥样硬化、冠状动脉旁路手术病、高脂血肾病变综合征、突发性感觉神经性听力损失(SSHL)、外周动脉栓塞病、先兆子痫病、脑血管疾病等方面疾病，作为有效的辅助疗法，故其有着广阔的临床应用前景。

医学研究表明：人体血液中的LDL增高是导致心脑血管疾病的一个独立的致病因素。肝素是一种聚阴离子酸性粘多糖，其分子链上含有丰富的羟基、羧基、磺酸基等负电性基团，这是其能与带正电性的低密度脂蛋白LDL特异性静电结合的基础，利用肝素能与LDL特异性静电结合的特性可以将之从血液中除去，达到治疗某些高脂血症的目的。目前，临床上采用肝素诱导的体外LDL沉淀治疗方法中，由于肝素是游离的，在治疗循环过程中，不可避免会因为肝素的过量使用而有部分肝素随血液带选人体内。而肝素具有良好的抗凝血作用，过多的肝素残留在人体内可能会引起出血、不凝血等副作用。所以，在治疗中得增加阳离子吸附柱以除去过量肝素的单元，治疗结束后，根据需要还得外加鱼精蛋白以中和残留的肝素，使得治疗系统变得更加复杂繁琐，增加治疗成本，同时也使得此法在安全性上存在待改进之处。另外，此法还存在技术上保密和费用过高的缺憾。为此，为了完善此技术，同时也为了降低此法的治疗成本，提高其使用的普及性，将肝素固定到一种载体上之后再行使用将是最理想的做法。

发明内容

研究证实，肝素、肝素衍生物或类肝素能够吸附血液中带正电性的LDL，主要是靠其分子上丰富的带负电性的羧基和磺酸基的静电作用。为此，必须保留这两种基团不能参与反应和受到破坏，故本发明在将配基(肝素或肝素衍生物或类肝素)固定到载体上采用共价键结合方式而不采用离子键方式，从而防止羧基和磺酸基参与反应，使它们得到保留和不受破坏。

本发明的目的就是将配基(肝素或肝素衍生物或类肝素)固定到一种载体材料上，得到一种新的LDL选择性吸附材料，以弥补先前方式的不足，此吸附剂克服了现有技术中沉淀疗法存在的不足，能够降低临床应用中的副作用，并能降低成本，提高应用价值。同时本发明还提供一种所述配基的固定化途径。通过选择合适的载体，采用偶联剂偶联的方式将所述配基偶联固定到载体上去以制得所述吸附剂。

本发明的基本技术方案是：选用表面富含官能基团(羟基和/或氨基)且能满足临床应用要求的高聚物(如聚乙烯醇，其不需要预功能基化)作为载体材料，采用固-液合成法用偶联剂如戊二醛与载体如聚乙烯醇先反应生成中间体，然后此中间体再与配基如肝素反应而将配基共价固定到载体上得到所述吸附剂。本发明提供的制备方法能够保证其制备过程中吸附材料上保留配基分子的活性基团磺酸基和羧基不受损失和破坏。

为实现上述目的之一，本发明涉及的LDL选择性吸附剂的主要成分包括载体和功能配基两大部分。载体为表面含有游离官能基团(羟基和/或胺基)的天然的或者人工合成的高分子物质。比如聚乙烯醇为表面含有游离官能基团羟基的人工合成的高分子物质；聚酰亚胺为表面含有可反应的官能基团氨基的人工合成的高分子物质；壳聚糖为表面含有游离官能基团氨基和羟基的天然高分子物质。等等。

此外，还要求载体在37℃下不能溶解于体液中而始终保持其外形。

配基是本发明吸附剂发挥功能的关键成分。该配基分子上应含有带负电性的磺酸基和羧基。比如肝素，或者肝素衍生物(如硫酸肝素、乙酰肝素等等)，或者是类似肝素结构和功能的物质(如硫酸多聚糖等等)。

为了达到使用上的要求，每克所述载体上偶联固定不低于2μg的所述配基。

除了上述吸附剂的主体成分(载体和配基)外，还需要偶联剂的帮助将配基化学偶联固定到载体上。

被固定到载体上的配基要更好地发挥其选择性吸附LDL的功能，则应该降低该配基的空间受约束程度，这可以通过在配基和载体之间再连接上一种长链的分子，它主要起“空间臂”的作用，目的是起到降低配基的空间受约束性、增强配基的空间自由度。引入“空间臂”后，可以增强配基的空间自由度，更好地发挥功能，但是其制备路线将变得复杂且制备成本也将提高，故是否需要引入“空间臂”得视需要而定。所述的“空间臂”物质为两端分别含有羟基或羧酸基或者氨基的长链型分子，比如聚乙二醇、聚氧化乙烯、己二胺、己二酸等。

为实现上述目的之二，本发明吸附剂的制备方法的步骤如下：

(1)取载体置于适量惰性溶剂中，然后加入过量的偶联剂，(根据需要，有的反应体系须再添加适当适量的催化剂)，施加搅拌，在0～90℃下反应1～16小时。反应结束，将载体过滤出来，用大量清水反复冲洗，将残留的惰性溶剂和偶联剂冲洗掉，此即得中间产物。此中间产物的特征是：偶联剂分子上的一个官能基团与载体表面上的官能基团进行共价键化合，偶联剂分子上另外的一个或者2个及以上未参加反应的官能基团则保留下来以作下一步反应之用。

所述的惰性溶剂指不参与反应的溶剂，根据不同反应体系的要求，其选择不同，比如可用环己烷、1，4-二氧六环、水、二甲基甲酰胺、甲酰胺、二甲亚砜、乙酸乙酯等。

所述的偶联剂指含有两个或者以上官能基团的物质，这里多指含2个官能基团的物质，比如：二醛类、二酸类、二胺类、二异氰酸酯类，根据载体表面本身所含官能基团的不同，所选的偶联剂种类也不同。通过估算载体表面所含官能基团的多少并结合化学反应式来确定所需偶联剂的最小加入量。载体表面官能基团的最小量可以载体的此官能基团的总摩尔数的5％为最低测算量，故偶联剂的最小加入量以载体中此官能基团的总摩尔数的5％为其测算量。

所述的溶剂适量指所加的溶剂量至少要将所加入的载体全部淹没。因为载体的形状不同，密度不同，相同质量的载体，淹没其所需的溶剂量也有差别。

所述根据需要须再添加适当适量的催化剂，这里的催化剂根据载体表面所含官能基团的不同、所用偶联剂的不同，催化剂的选择也有差别。所能涉及到的催化剂包括强酸类(比如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、苯磺酸等)，弱酸类(如乙酸、丙酸等)，锡盐类(比如二月桂酸二丁基锡、二丁基氧化锡、马来酸锡、氯化亚锡等)，碳化二亚胺类。所指的适量一般以反应物总量的0.001％～3.0％为宜。

(2)将(1)中所得的中间体置于惰性溶剂中，加入不低于载体质量0.005％的配基(如肝素)适量，然后在0～60℃下振荡反应8～72h。(根据所采用反应体系的不同，有的反应体系需要再加入催化剂)。反应结束，过滤出载体，然后反复清洗载体，再干燥，即得目标吸附剂。

所述的清洗为用水冲洗、浸泡，或者用PBS缓冲液冲洗、浸泡，或者两者的结合使用，目的为洗脱未被固定到载体上的游离配基。

所述的干燥为在60℃以下的干燥方式，比如风干、低温烘干、冷冻干燥、低温减压干燥等。

所述的根据需要须再加入的催化剂，这里的催化剂同前面(1)所述，根据反应体系的不同，所使用的催化剂有差别。

所述的惰性溶剂如(1)中所指，根据不同反应体系的要求，其选择有异。

(3)如果需要引入“空间臂”，可在(1)中所得的中间体的基础上，再连接上“空间臂”，然后再连接上偶联剂，最后再连接上配基，即得引入“空间臂”后的吸附剂。其冲洗干燥方式同(2)中所述。具体表述为：

以(1)中所得中间体为反应物，将之置于惰性溶剂中，加入“空间臂”物质，(必要时须再入催化剂)，在0～90℃下搅拌反应1～20h，反应结束，过滤掉溶剂，用纯的惰性溶剂冲洗掉多余的反应物即“空间臂”物质，即得连接了“空间臂”的中间体，然后又以该中间体为反应物，置于惰性溶剂中，加入偶联剂，(必要时须再入催化剂)，在0～90℃下反应1～20h，反应结束，过滤，再用纯的惰性溶剂冲洗掉多余的偶联剂后备用。

所述的起“空间臂”作用的物质在前面已说明。其用量为(1)中偶联剂用量摩尔数的2倍为其最大用量。

所述的惰性溶剂及其用量同(1)中的说明。反应体系不同，所使用的溶剂类别也有差别。

所述的催化剂及其用量同(1)中的说明。反应体系不同，催化剂的选择也有差别。

根据载体表面所含官能基团的不同，以及所使用的“空间臂”分子端官能基团的不同，在得到中间体2时，在某种情形下可以直接按照(2)中的步骤继续进行。

基于上述叙述，本发明具有以下优势和效果：

(1)选用表面富含官能基团的高分子(如聚乙烯醇)作为载体材料，为提高配基的固定量奠定了基础。

(2)采用共价键结合方式固定配基，保留了配基分子上的活性基团羧基和磺酸基，使配基的特异性吸附LDL的功能基得到了保留和不受破坏；同时，由于共价结合方式的牢固性，保证材料在实际使用时配基不会脱落，增强了使用上的安全性。

(3)此吸附剂制备过程简便、条件温和，原料丰富，制作成本低廉。

以上的优势在临床治疗上将表现为降低病人的治疗费用，同时安全性得到了增强，且其效果又能达到临床使用的要求，具有极大的可推广和普及的可能性和意义。

具体实施方式

现结合实施例，对本发明做进一步的描述。

实施示例1以人工合成的高分子物质聚乙烯醇为载体、以二醛类(戊二醛)为偶联剂为例：

取15g聚乙烯醇，加入25g戊二醛，再加入强酸催化剂盐酸600μL和溶剂环己烷80mL，然后在回流温度78℃下搅拌反应6～8个小时。反应结束，过滤，用清水反复清洗数次后，滤干，再加入蒸馏水30mL和弱酸催化剂乙酸400μL，最后加入2mg肝素，在60℃以下轻摇反应10～12h。反应结束，清水反复清洗，滤干，再在60℃以下风干即得。

实施示例2以人工合成的高分子物质聚乙烯醇为载体、以二异氰酸酯类(甲苯二异氰酸酯)为偶联剂、引入“空间臂”聚乙二醇(PEG)为例：

取80克聚乙烯醇，加入200mL的溶剂N，N’-二甲基甲酰胺，加入40mL甲苯二异氰酸酯(TDI)，加入1mL催化剂二月桂酸二丁基锡(TDBAL)，在70℃下搅拌反应6h。然后倾滤，用无水的乙酸乙酯清洗数次。再加入200mL的乙酸乙酯，加入60g PEG6000，加入1mL催化剂TDBAL，在60℃下反应8h。然后用60℃的乙酸乙酯清洗数次。再加上肝素10mg，催化剂碳化二亚胺50mg，水100mL，在室温下搅拌反应1～3天。反应完毕后在清水中冲洗，然后在磷酸缓冲液PBS＝7.4的缓冲液中浸泡10～16h以上。然后倾滤，清水冲洗，60℃以下风干。

实施示例3以人工合成的高分子物质聚乙烯醇为载体、以二异氰酸酯类(甲苯二异氰酸酯)为偶联剂、引入“空间臂”己二胺为例：

100g聚乙烯醇加30mL TDI，加1mL TDBAL，加溶剂乙酸乙酯150mL，在60℃下搅拌反应6h。然后倾滤，再用无水乙酸乙酯冲洗数次。加上30mL预先融化的己二胺，加无水乙酸乙酯100mL，在常温下振荡反应1h。然后倾滤，用无水乙酸乙酯清洗数次。再加上10mL TDI，加上100mL乙酸乙酯，在常温下振荡反应1h。倾滤，用无水乙酸乙酯冲洗。然后加上100mL甲酰胺，加上20mg肝素，加上1mL TDBAL，在37～40℃下反应12h。然后倾滤，清水冲洗，再在PH＝7.4的缓冲液中振荡浸泡10～12h，再倾滤，清水冲洗，然后再在60℃以下风干。

实施示例4以人工合成的高分子物质聚酰亚胺为载体、以二醛类(戊二醛)为偶联剂为例：

取15g聚酰亚胺，加入20g戊二醛，再加入催化剂乙酸450μL和溶剂水20mL，然后在60℃下搅拌反应3～5个小时。反应结束，过滤，用清水反复清洗数次后，滤干，再加入蒸馏水20mL和催化剂乙酸400μL，最后加入1mg肝素，在60℃以下轻摇反应8～12h。反应结束，清水反复清洗，滤干，再在60℃以下风干即得。

实施示例5以天然的水不溶性高分子物质壳聚糖为载体、以二醛类(戊二醛)为偶联剂为例：

取15g壳聚糖，加入30g戊二醛，再加入催化剂乙酸450μL和溶剂水20mL，然后在60℃下搅拌反应3～5个小时。反应结束，过滤，用清水反复清洗数次后，滤干，再加入蒸馏水20mL和催化剂乙酸400μL，最后加入2mg肝素，在60℃以下轻摇反应10～14h。反应结束，清水反复清洗，滤干，再在60℃以下风干即得。

实施示例6以人工合成的高分子物质聚乙烯醇为载体、以二醛类(戊二醛)为偶联剂、以肝素及其衍生物(硫酸肝素)的混合物为复合配基为例：

取15g聚乙烯醇，加入25g戊二醛，再加入强酸催化剂盐酸600μL和溶剂环己烷80mL，然后在回流温度78℃下搅拌反应6～8个小时。反应结束，过滤，用清水反复清洗数次后，滤干，再加入蒸馏水30mL和弱酸催化剂乙酸400μL，最后加入2mg复合配基(肝素最容易获取，因此复合配基中肝素占50～70％)，在60℃以下轻摇反应10～16h。反应结束，清水反复清洗，滤干，再在60℃以下风干即得。

实施示例7被固定了的肝素的含量检测1

对于不引入“空间臂”的情况，比如实施示例1，4，5，6，采用固定化肝素含量检测的分析方法——甲苯胺蓝法对被固定了的肝素含量进行分析，由于不引入空间臂，反应相对简单，反应效率较高，肝素的固定量为每克吸附剂不低于10μg，满足使用的需要。

实施示例8被固定了的肝素的含量检测2

对于引入“空间臂”的情况，比如实施示例2，3，采用固定化肝素含量检测的分析方法——甲苯胺蓝法对被固定了的肝素含量进行分析，由于引入“空间臂”，反应相对复杂、步骤多使得反应效率下降，肝素的固定量为每克吸附剂不低于2.2μg，满足使用的需要。

实施示例9肝素固定在载体上的稳定性试验

取吸附剂100g，装入吸附柱中，用400mL 37℃的PBS循环地动态流经吸附柱，循环4h后，结束循环，取最终的循环液用甲苯胺蓝比色法进行检测所脱落出来的肝素量。检测结果表明，在该检测方法的灵敏度范围(0.1μg级)内未检测到最终的循环液中存在脱落出来的游离肝素，此表明固定化的牢固性。

实施示例10单柱效率试验

取该吸附剂100克装入吸附柱中。将400mL稀释后的血浆(1份血浆+1份缓冲稀释液)循环地通过该吸附柱。经过2～5h的动态滤过实验，该血浆的LDL水平下降了40％以上。

实施示例11双柱效率试验

取该吸附剂200克等量分装入两根吸附柱中。将400mL稀释后的血浆(1份血浆+1份缓冲稀释液)循环地通过此两根吸附柱。经过≥2～5h的动态滤过实验，该血浆的LDL水平下降了70％以上。

实施示例12引入“空间臂”的吸附剂A和不引入“空间臂”吸附剂B的效率对照试验

分别取吸附剂A，B各100克装入吸附柱中。将400mL稀释后的血浆(1份血浆+1份缓冲稀释液)循环地通过该吸附柱。经过≥2h的动态滤过实验，对于吸附剂A，该血浆的LDL水平下降了60％以上；对于吸附剂B，该血浆的LDL水平下降了40％以上。表明引入“空间臂”增强了配基的空间自由性从而提高了吸附效率，但以反应步骤增多、反应过程复杂、反应效率降低、制备成本增加为代价。

Claims (4)

1.一种制备低密度脂蛋白胆固醇的选择性吸附剂的方法，其特征是：包括以下步骤：

(1)取载体全部淹没于惰性溶剂中，然后加入偶联剂，或再添加适当适量的催化剂，施加搅拌，在0～90℃下反应1～16小时；反应结束，将载体过滤出来，用纯的惰性溶剂反复冲洗，将残留的偶联剂和/或催化剂冲洗掉，此即得中间产物备用；

或(2)：以步骤(1)中所得中间产物为反应物，将之置于惰性溶剂中，加入空间臂物质，或再添加适当适量的催化剂，在0～90℃下搅拌反应1～20h，反应结束，过滤掉溶剂，用纯的惰性溶剂冲洗掉多余的空间臂物质和/或催化剂，即得连接了空间臂的中间体，然后又以该中间体为反应物，置于惰性溶剂中，加入偶联剂，或再添加适当适量的催化剂，在0～90℃下反应1～20h，反应结束，过滤，再用纯的惰性溶剂冲洗掉多余的偶联剂和/或催化剂后备用；

(3)将(1)或(2)中所得的产物置于惰性溶剂中，加入不低于载体质量0.005％的功能配基，然后在0～60℃下振荡反应8～72h，反应结束，过滤出载体，然后反复清洗载体，洗脱未被固定到载体上的游离功能配基，再干燥，即得低密度脂蛋白胆固醇的选择性吸附剂，

所制得的吸附剂的成分包括载体和功能配基两大部分，其中载体为表面含有游离官能基团羟基和/或胺基在37℃下不能溶解于体液中且始终保持其外形的天然的或者人工合成的壳聚糖、聚乙烯醇、聚酰亚胺、聚氨酯，功能配基为肝素，肝素衍生物，或类肝素中的一种或两种以上的混合，肝素衍生物为硫酸肝素、乙酰肝素，类肝素为硫酸多聚糖，功能配基通过偶联剂偶联固定在载体上，其中，每克载体上偶联固定至少2μg功能配基，所述的偶联剂为二醛、二酸、二胺、二异氰酸酯，所述的空间臂物质为聚乙二醇、聚氧化乙烯、己二胺，空间臂物质的用量与步骤(1)中偶联剂用量的摩尔数之比为大于0且小于等于2，步骤(1)、(2)中所述催化剂为盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、苯磺酸；乙酸、丙酸；二月桂酸二丁基锡、二丁基氧化锡、马来酸锡、氯化亚锡；催化剂用量为反应物总量的0.001％～3.0％。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述的惰性溶剂为环己烷、1，4-二氧六环、二甲基甲酰胺、甲酰胺、二甲基亚砜或乙酸乙酯。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：偶联剂的最小加入量以载体中所含官能基团的总摩尔数的5％为其测算量。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤(3)中的所述的清洗为用水冲洗、浸泡，或者用PBS缓冲液冲洗、浸泡，或者两者的结合使用；所述的干燥为风干、低温烘干、冷冻干燥、低温减压干燥，干燥在60℃以下进行。