CN116807982A - 一种兼具内毒素吸附和自由基清除功能的血液灌流用微球、其制备方法及应用 - Google Patents

一种兼具内毒素吸附和自由基清除功能的血液灌流用微球、其制备方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116807982A
CN116807982A CN202311086919.2A CN202311086919A CN116807982A CN 116807982 A CN116807982 A CN 116807982A CN 202311086919 A CN202311086919 A CN 202311086919A CN 116807982 A CN116807982 A CN 116807982A
Authority
CN
China
Prior art keywords
microsphere
endotoxin
blood
solution
microspheres
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311086919.2A
Other languages
English (en)
Inventor
赵长生
魏志伟
谢毅
杨李
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan University
Original Assignee
Sichuan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan University filed Critical Sichuan University
Priority to CN202311086919.2A priority Critical patent/CN116807982A/zh
Publication of CN116807982A publication Critical patent/CN116807982A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/167—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction with an outer layer or coating comprising drug; with chemically bound drugs or non-active substances on their surface
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1682—Processes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了一种兼具内毒素吸附和自由基清除功能的血液灌流用微球、其制备方法及应用，属于生物材料技术领域；所述微球由两部分组成，一部分是作为核心层组分的羧化壳聚糖微球；另一部分是作为功能层组分的位于所述羧化壳聚糖微球表面的多酚类化合物和阳离子聚合物层；本发明材料，对血液中的内毒素具有高效吸附能力，对血液中的活性氧和活性氮自由基具有良好的清除能力，同时与血液接触时具有良好的血液相容性；可应用于血液净化，为脓毒症患者提供一种高效且安全的内毒素吸附和抗氧化治疗方案；并且原料简单易得，制备微球的相转化和层层自组装工艺简单，易于实现工业量产。

Description

一种兼具内毒素吸附和自由基清除功能的血液灌流用微球、 其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，尤其涉及一种兼具内毒素吸附和自由基清除功能的血液灌流用微球、其制备方法及应用。
背景技术
脓毒症（Sepsis）是宿主对细菌感染的免疫反应引起的多器官功能障碍，是严重感染、创伤、烧伤休克和外科手术后常见的并发症，可导致感染性休克及多脏器功能障碍综合征（MODS）。近20年来，脓毒症因其较高的发病率、死亡率和治疗费用，已成为临床危重症患者死亡的重要原因之一。
进入体内的细菌裂解后会释放内毒素，并在患者体内的快速大量积累，同时内毒素会引发免疫和过度炎症反应、氧化应激、血管舒张性内皮渗漏和器官功能障碍。然后，压倒性的促炎环境导致强大的次级介质（细胞因子、活性氧（ROS））的释放，进而放大炎症过程。因此，循环内毒素已被认为是大多数脓毒性MODS患者的关键作用。临床证据还表明，高循环内毒素水平与脓毒症的多器官衰竭和死亡率密切相关。
近年来，除常规药物外，血液净化已成为降低脓毒症患者血液中内毒素和炎症细胞因子水平的必要治疗方法。血液净化是指通过各种技术和设备对血液中各种毒素进行体外治疗的方法。因为内毒素主链中存在双磷酸化基团而带负电荷，所以固定了阳离子配体的吸附剂已被广泛用于血液灌流中和内毒素的研究。最常见的阳离子吸附剂是多粘菌素B血液灌流柱（polymyxin B hemoperfusion, PMX-HP），它可以去除循环内毒素，提高临床疗效。然而，多粘菌素的毒性，如肾毒性和神经毒性，阻碍了其成功的临床应用。同时，PMX-HP治疗不能显著抑制炎症细胞因子的释放，因此无法改变器官功能障碍和死亡的风险。
这是由于忽视了内毒素积累诱发的氧化应激问题。此外，由于这些血液灌流器的生物相容性差，血液灌流过程本身也会加重脓毒症患者的氧化应激状态。
以往的研究主要集中在通过去除内毒素来治疗脓毒症，忽视了内毒素积累引起的氧化应激状态，这严重限制了脓毒症的治疗效果。氧化应激是体内氧化作用和抗氧化作用失衡，而倾向于氧化的一种状态，从而产生过量的高活性氧自由基（ROS），ROS包括超氧阴离子（.O2-）、羟自由基（.OH）和过氧化氢（H2O2）等。ROS的过量产生会破坏脂质、蛋白质、DNA，抑制其正常的生理功能，同时，高活性的ROS会导致线粒体功能障碍和细胞死亡，进一步造成多脏器损伤和功能障碍，严重影响脓毒症患者的治疗。
因此，发明一种同时具有级联内毒素吸附功能和自由基清除能力的血液灌流用微球材料，作为针对脓毒症患者的内毒素吸附剂和抗氧化剂，具有极大的研究意义和应用前景。
发明内容
本发明的目的之一，在于提供一种兼具内毒素吸附和自由基清除功能的血液灌流用微球，以解决上述问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种兼具内毒素吸附和自由基清除功能的血液灌流用微球，所述微球是以羧化壳聚糖微球为核心层，作为骨架支撑，以多酚类化合物和阳离子聚合物作为功能层，位于所述羧化壳聚糖微球表面。
其中，作为核心层的高分子微球，在本发明中仅起到骨架支撑的作用，吸附和清除的功能作用由其外层的多酚类化合物和阳离子聚合物完成，即本发明主要是通过阳离子聚合物和多酚自组装从而形成多层微球来发挥作用，核心层不局限于季铵盐化壳聚糖。
通过本发明方法可以将阳离子聚合物和多酚结合起来，稳定形成多层微球。而单独的多酚或者阳离子聚合物无法在微球上稳定存在。
作为优选的技术方案，所述高分子微球为羧化壳聚糖微球，所述羧化壳聚糖微球通过相转化方法合成得到，合成羧化壳聚糖微球时进行相分离，所述相分离采用的沉淀剂为0.1-1 mol/L的酸溶液，比如可以是盐酸、硫酸或醋酸溶液等无机或者有机酸溶液。
本发明的羧化壳聚糖微球，其原料是羧化壳聚糖，CAS号：9012-76-4，分子式(C6H11NO4)n，纯度BR。壳聚糖不溶于水，而羧化壳聚糖经羧化处理，易溶于水，具有良好的生物相容性；。
作为优选的技术方案，所述多酚类化合物选自没食子酸（CAS号：5995-86-8）、单宁酸（CAS号：1401-55-4）、鞣花酸（CAS号：476-66-4）、茶多酚（CAS号：84650-60-2）、或表没食子儿茶素没食子酸酯（CAS号：989-51-5）中的一种或多种。
作为优选的技术方案，所述阳离子聚合物选自季铵盐化壳聚糖或聚六亚甲基胍。
其中，所述聚六亚甲基胍的CAS号：57028-96-3、分子式：(C7H15N3)n，10000<Mw<20000，是一类聚胍类高分子聚合物，其亲水基部分含有强烈的正电性，目前一般用于吸附通常呈负电性的各类细菌、病毒，进入细胞膜，抑制膜内脂质体合成，造成菌体凋亡，达到最佳的杀菌效果，未见将其用于脓毒症内毒素的吸附。本领域技术人员能够理解的，上述普通意义的杀菌作用，与本发明的脓毒症内毒素的吸附，二者具有本质的区别，杀菌只是将细菌灭活，而内毒素吸附是将细菌外膜成分的内毒素吸附在材料上，从而完成净化血液的目的。所述聚六亚甲基胍除了市购，也可以所用原料为盐酸胍（CAS号:50-01-1，分子式:NH2C(=NH)NH2·HCl））和1,6-已二胺（CAS号:124-09-4，分子式:C6H16N2））合成得到。
所述季铵盐化壳聚糖是一类具有抗菌性能的高分子化合物，其分子式为(C6H11NO4)n，50000<Mw<100000，是通过壳聚糖与季铵盐反应制备而成，季铵盐一般是四甲基溴化铵或三甲基氯化铵。
作为优选的技术方案，所述多酚类化合物在制备时采用浓度为10-20 mg/mL的溶液，所述阳离子聚合物采用浓度为15-25 mg/mL的溶液。
本发明的目的之二，在于提供一种上述兼具内毒素吸附和自由基清除功能的血液灌流用微球的制备方法，采用的技术方案为，包括以下步骤，其中的高分子微球以羧化壳聚糖为例：
1）羧化壳聚糖溶液的配制
定量称取羧化壳聚糖溶解于去离子水中，搅拌溶解12-24小时得到质量分数为8-12%的羧化壳聚糖溶液；
2）多酚类化合物溶液的配制
定量称取多酚类化合物溶解于去离子水中，搅拌溶解得到质量分数为10-20 mg/mL的单宁酸溶液；
3）阳离子聚合物溶液的配制：以聚六亚甲基胍为例，首先称取等摩尔质量的盐酸胍和1,6-已二胺于三颈烧瓶中，在120-140℃下反应直至没有氨气排出，将温度升至180-200℃反应6-8小时，在100-120℃真空干燥制得聚六亚甲基胍。然后定量称取聚六亚甲基胍，搅拌溶解得到聚六亚甲基胍溶液；
4）羧化壳聚糖微球的配制
将质量分数为8-12%的羧化壳聚糖溶液通过注射器针头滴入凝固浴中，发生相转换，得到微球材料，并在去离子水中浸泡清洗多遍制备得到羧化壳聚糖微球；
5）具有兼具内毒素吸附和自由基清除功能的微球的配制
首先，将上述羧化壳聚糖微球在10-20 mg/mL的多酚类化合物溶液浸沉涂泡5分钟，然后将浸涂了单宁酸的羧化壳聚糖微球再在为15-25 mg/mL的阳离子聚合物溶液中浸沉涂泡5-10分钟，然后在磁力搅拌下，将微球浸泡在去离子水中除去未反应和不稳定的多酚类化合物和阳离子聚合物，从而得到CPG-L1-MSs；重复上述步骤n次，从而得到微球材料CPG-Ln-MSs，n=1-10。
作为优选的技术方案，步骤4）中，通过调整注射器针头孔径，将微球的直径控制在2000-3000 μm。
作为优选的技术方案，步骤5）中，n取值为1-10。n=1-8时，内毒素吸附和自由基清除效果随着层数的增加而增加，n=8时，内毒素吸附和自由基清除效果最好，n>8时，多层微球结构发生塌陷，内毒素吸附和自由基清除性能下降。
本发明的目的之三，在于提供上述的兼具内毒素吸附和自由基清除功能的血液灌流用微球在制备血液净化器械中的应用。
作为优选的技术方案，所述血液净化为内毒素大量积累，并出现氧化应激状态的脓毒症患者。
现有针对脓毒症治疗的血液净化技术的核心材料通常不具备抗氧化功能，无法用于缓解血液净化过程中的氧化应激问题，且内毒素吸附效率低，生物毒性大。通过本发明的方法，利用简单的相分离法成球和层层自组装工艺，该微球可以用于实现高效的内毒素吸附，有效的氧化应激缓解，并具有理想的血液相容性。
本发明的兼具内毒素吸附和自由基清除功能的血液灌流用微球具有高效的内毒素清除能力，主要基于所添加的阳离子聚合物与内毒素静电相互作用，具体而言，在脓毒症患者的血液中，由于细菌入侵，所释放的内毒素在血液中快速大量累积，因此快速高效的清除内毒素是治疗脓毒症的重中之重。
本发明的兼具内毒素吸附和自由基清除功能的血液灌流用微球具有良好的抗氧化能力主要基于多酚涂层所具有的优异的抗氧化性能。
具体而言：在脓毒症患者的血液中，内毒素在人体血液中快速大量累积，同时诱导产生各种活性氧，比如过氧化氢，超氧阴离子自由基和羟基自由基。因此，在高效的吸附内毒素的同时，有效清除各种各样的高反应活性的活性氧是在脓毒症患者的血液净化过程中必须要考虑的问题。
发明人以一种在表面组装8层阳离子聚合物和多酚类化合物的微球为例，对内毒素的清除，以及H2O2，O2 .-，.OH等自由基的清除进行了测试，发现微球对内毒素和所有类型的活性氧自由基可以实现短时间内的高效清除。
本发明最大的特点就是通过相分离技术制备羧化壳聚糖微球，然后通过层层自组装工艺，将多酚类化合物和阳离子聚合物在羧化壳聚糖微球表面自组装，得到具有级联内毒素吸附和自由基清除功能的血液灌流微球材料，多酚的引入改善了微球的血液相容性，并使微球具有广谱自由基清除能力，阳离子聚合物的引入使得微球具有高效的内毒素吸附能力，并且通过这种方法制备的微球成本较低，且性能出众。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、本发明的血液灌流用微球，具有高效的内毒素吸附性能，单位内毒素吸附量可达455.37EU/g；
2、本发明的血液灌流用微球，具有良好的广谱自由基清除性能；
3、本发明的血液灌流用微球可以在生理盐水环境下稳定存在；
4、本发明的血液灌流用微球可用于脓毒症患者的血液净化，同时降低血液净化患者的内毒素水平和氧化应激状态；
5、本发明制备的血液灌流用微球具有优异的血液相容性，具有不高于1%的溶血率；
6、本发明制备的血液灌流用微球含有的多酚可选择范围广；
7、本发明制备的血液灌流用微球具有多层结构和良好的亲水性，能较快地降低血液中的内毒素和自由基水平，保护生物大分子免受氧化损伤；
8、本发明制备的血液灌流用微球所用原料为化工常用原料，可通过化工大量制得，资源丰富、成本低廉，有利于工业化。
附图说明
图1为实施例1的微球表面和断面的扫描电镜图；
图2为各实施例中微球对内毒素的清除能力；
图3为各实施例中微球对羟基自由基的清除能力；
图4为各实施例中微球对超氧阴离子自由基的清除能力；
图5为各实施例中微球对过氧化氢的清除能力；
图6为各实施例中微球催化过氧化氢产生氧气的能力；
图7为各实施例中微球的溶血率；
图8为各实施例中微球的浸泡液的紫外可见光光谱。
实施方式
下面将结合附图对本发明作进一步说明。
下面结合实施例对本发明进行进一步说明。
需要说明的是：本发明中的份数，除非特别说明，均是指重量份。
下述实施例和对比例中，
所采用的羧化壳聚糖，购于阿拉丁试剂有限公司，货号C105800-100g，为透明至半透明白色或微黄色不定形固体，羧化度≥60%，粘度10mpa.s-800mpa.s；
所采用的单宁酸，购于阿拉丁试剂有限公司，CAS号:1401-55-4，分子式:C76H52O46，为淡黄色粉末，易溶于水。
所采用的聚六亚甲基胍，制备方法如下：首先称取等摩尔质量的盐酸胍（CAS号:50-01-1，分子式:NH2C(=NH)NH2·HCl）和1,6-已二胺（CAS号:124-09-4，分子式:C6H16N2）于三颈烧瓶中，在120-140℃下反应直至没有氨气排出，将温度升至180-200℃反应6-8小时，在100-120℃真空干燥制得聚六亚甲基胍。然后定量称取聚六亚甲基胍，搅拌溶解得到聚六亚甲基胍溶液
所采用的季铵盐化壳聚糖，制备方法如下：称取壳聚糖8-12g溶解在1-2%的醋酸溶液中，再称取30-50g 2,3-环氧丙基三甲基氯化铵（CAS号：3033-77-0，分子式:C6H14ClNO）溶解于去离子水中并滴加到壳聚糖溶液中在60-80摄氏度反应10-12小时，将清澈淡黄色的反应液倒入冷丙酮中搅拌后放入冰箱过夜。随后，剩余凝胶状产物在甲醇中溶解，在1:4 (v/v)乙醇-丙酮混合物中重结晶。最后,产品在去离子水中透析1周。将溶液用冷冻干燥冻干机获得纯化的季铵盐化壳聚糖。
本发明所制得的微球的性能测试方法为：
对于微球的内毒素吸附测试，由以下方法得到。
采用鲎试剂(Solarbio, T7571)测定CPG-Ln-MSs的内毒素吸附量。所有试管、移液头、实验用水均由试剂盒提供去热原处理。使用试剂盒中具有标准浓度的内毒素(LPS)溶液测量并计算标准拟合曲线。然后，采用阿拉丁化学有限公司采购的LPS制备较高浓度的 LPS溶液。样品中的内毒素激活一系列酶，被激活的酶分解合成底物，释放出黄色的产物，最大吸光度为405 nm。黄色产物可进一步与重氮试剂反应形成紫色产物，最大吸光度在545 nm处。黄色产品和紫色产品的吸光度与内毒素水平成正比，因此内毒素是量化的。设定初始内毒素浓度为5 EU/mL。然后，将相同数量、一定干重的各种CPG-Ln-MSs加入到配制好的内毒素溶液中，每15分钟监测一次溶液的内毒素浓度。
对于微球的活性氧测试，由以下方法得到。
（1）羟基自由基清除能力：采用羟基自由基测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国南京)按照说明书测定CPG-Ln-MSs对羟基自由基(HO.)的清除能力。将CPG-Ln-MSs分散在工作液中，按照说明书进行测试。然后用酶标仪测量550 nm处的吸光度。然后，根据制造商的说明书，计算CPG-Ln-MSs对HO.的清除活性。
（2）超氧自由基清除能力：将CPG-Ln-MSs加入上述含核黄素（20 μM）、蛋氨酸（12.5mM）和NBT（75 μM）的混合溶液(1.5 mL)中。将混合溶液在恒定强度的紫外光下照射10分钟，然后在560 nm处测量溶液的吸光度。
（3）过氧化氢清除能力：通常情况下，在500 μL 2.5 mM的H2O2溶液中加入CPG-Ln-MSs。将混合溶液孵育过夜(12 h)，然后将50 μL混合溶液加入上述Ti(SO4)2溶液的100 μL中。每30分钟在405 nm处测量混合溶液的吸光度。为测量CPG-Ln-MSs的产氧活性，将H2O2 (2M)和CPG-Ln-MSs 溶于20 mL的去离子水中，室温下混合，然后每1分钟使用溶解氧计测量O2浓度。
对于微球的血液相容性测试，以溶血率测试为例。将5 mg CPG-Ln-MSs微球样品用磷酸盐缓冲液浸泡预处理12小时，在37 ℃孵育1小时。将磷酸缓冲液按与全血的体积比为1：1的比例加入全血，使用离心机分离15分钟，离心速率为2000 rpm，得到红细胞。上分离得到红细胞的操作重复5次。将0.2 mL的红细胞和0.8 mL磷酸缓冲液被添加到上述经过预处理的微球样品，在37 ℃孵化箱中振荡2小时。使用离心机在8000 rpm离心速率下离心5分钟得到悬浮液。使用紫外可见光谱仪测试悬浮液的吸光度。设置去离子水和磷酸缓冲液分别作为正对照和负对照。溶血率计算公式如下:
溶血率（%）=（悬浮液吸光度 - 负对照的吸光度）/（正对照的吸光度 – 负对照的吸光度）×100 %。
实施例 1.
本实施例旨在说明一种较为理想的具有级联内毒素吸附和自由基清除功能的血液灌流用微球的制备方法：
将羧化壳聚糖溶液（10份羧化壳聚糖，90份去离子水）滴入凝固浴，即盐酸溶液（0.1 M）中，通过现有的相转换技术，得到微球材料，并在去离子水中浸泡清洗多遍制备得到羧化壳聚糖微球，直径为2031μm。将上述羧化壳聚糖微球在17 mg/mL的单宁酸溶液（去离子水作为溶剂）浸沉涂泡5分钟，然后将浸涂了单宁酸的羧化壳聚糖微球再在20 mg/mL的聚六亚甲基胍溶液（去离子水作为溶剂）中浸沉涂泡5分钟，重复上述步骤8次，从而得到CPG-L8-MSs，直径为2110μm。
微球冷冻干燥后表面和切半剖面的扫描电镜图如图1所示，从图1中可以看出，微球形貌良好，表面光滑规整，内部结构则具有多层特征。
按照上述的方法进行内毒素吸附、羟基自由基清除、超氧阴离子自由基清除以及过氧化氢清除能力和溶血率测试，其结果见图2、3、4、5、6和7，从图中可以看出，本实施例的微球具有高效的内毒素吸附能力（455.4 EU/g）和优良的羟基自由基清除能力（768.4 U/g）、超氧阴离子自由基清除能力（48.7%）、过氧化氢清除能力（29.9%）、氧气生成能力（14.9ppm），与较低的溶血率（0.29%）。而且图8的紫外-可见光光谱中可以看出，单宁酸和聚六亚甲基胍可以稳定在羧化壳聚糖微球上稳定存在。
实施例 2.
本实施例旨在说明减少多酚/阳离子聚合物层数对多酚/阳离子聚合物层层自组装微球的内毒素吸附和自由基清除效果的影响，本实施例与实施例1的区别在于减少了微球的多酚/阳离子聚合物层数：
将羧化壳聚糖溶液（10份羧化壳聚糖，90份去离子水）滴入凝固浴——盐酸溶液（0.1 M）中，通过相转换技术，得到微球材料，并在去离子水中浸泡清洗多遍制备得到羧化壳聚糖微球。将上述羧化壳聚糖微球在质量分数为17 mg/mL的单宁酸溶液（去离子水作为溶剂）浸沉涂泡5分钟，然后将浸涂了单宁酸的羧化壳聚糖微球再在20 mg/mL的聚六亚甲基胍溶液（去离子水作为溶剂）中浸沉涂泡5分钟，接下来在磁力搅拌下，将微球浸泡在去离子水中除去未反应和不稳定的多酚和阳离子聚合物，从而得到CPG-L1-MSs。重复上述步骤6次，从而得到CPG-L6-MSs，直径为2080μm。
按照上述的方法进行内毒素吸附、羟基自由基清除、超氧阴离子自由基清除以及过氧化氢清除能力和溶血率测试，其结果见图2、3、4、5、6和7，从图中可以看出，本实施例的微球具有较好的内毒素吸附能力（400.4 EU/g）和较好的羟基自由基清除能力（442.6 U/g）、超氧阴离子自由基清除能力（33.2%）、过氧化氢清除能力（28.4%）、氧气生成能力（14.7ppm），与较低的溶血率（0.38%）。但是相比实施例1有所下降，溶血率相比实施例1相近。
实施例 3.
本实施例旨在说明增加多酚/阳离子聚合物层数对多酚/阳离子聚合物层层自组装微球的内毒素吸附和自由基清除效果的影响，本实施例与实施例1的区别在于增加了微球的多酚/阳离子聚合物层数：
将羧化壳聚糖溶液（10份羧化壳聚糖，90份去离子水）滴入凝固浴，即盐酸溶液（0.1 M）中，通过相转换技术，得到微球材料，并在去离子水中浸泡清洗多遍制备得到羧化壳聚糖微球。将上述羧化壳聚糖微球在17 mg/mL的单宁酸溶液（去离子水作为溶剂）浸沉涂泡5分钟，然后将浸涂了单宁酸的羧化壳聚糖微球再在20 mg/mL的聚六亚甲基胍溶液（去离子水作为溶剂）中浸沉涂泡5分钟，接下来在磁力搅拌下，将微球浸泡在去离子水中除去未反应和不稳定的多酚和阳离子聚合物，从而得到CPG-L1-MSs。重复上述步骤10次，从而得到CPG-L10-MSs，直径为1742μm。
按照上述的方法进行内毒素吸附、羟基自由基清除、超氧阴离子自由基清除以及过氧化氢清除能力和溶血率测试，其结果见图2、3、4、5、6和7，从图中可以看出，从图中可以看出，本实施例制备的微球具有内毒素吸附能力（301.3 EU/g）和较好的羟基自由基清除能力（471.6 U/g）、超氧阴离子自由基清除能力（45.3%）、过氧化氢清除能力（24.2%）、氧气生成能力（14.1 ppm），但是相比实施例1都有所下降，相比于2，内毒素吸附和过氧化氢清除率有所下降，但是羟基自由基和超氧阴离子自由基清除能力有所提高，溶血率相比实施例1和2相近（0.75%）。
实施例 4.
本实施例旨在说明多酚和阳离子聚合物的存在对多酚/阳离子聚合物层层自组装微球的内毒素吸附和自由基清除效果的影响，本实施例与实施例1的区别在于没有添加多酚和阳离子聚合物涂层：
将羧化壳聚糖溶液（10份羧化壳聚糖，90份去离子水）滴入凝固浴，即盐酸溶液（0.1 M）中，通过相转换技术，得到微球材料，并在去离子水中浸泡清洗多遍制备得到羧化壳聚糖微球，从而得到CPG-L0-MSs，直径为2031μm。
按照上述的方法进行内毒素吸附、羟基自由基清除、超氧阴离子自由基清除以及过氧化氢清除能力和溶血率测试，其结果见图2、3、4、5、6和7，从图中可以看出，本实施例的微球具有微弱的内毒素吸附能力（127.5 EU/g）和有限的羟基自由基清除能力（387.1 U/g）、超氧阴离子自由基清除能力（2.4%）、过氧化氢清除能力（1.5%）、氧气生成能力（10.4ppm），性能相比实施例1大幅度下降，溶血率相比实施例1变化不明显（0%）。
对比例1
将羧化壳聚糖溶液（10份羧化壳聚糖，90份去离子水）滴入凝固浴-盐酸溶液（0.1M）中，通过相转换技术，得到微球材料，并在去离子水中浸泡清洗多遍制备得到羧化壳聚糖微球。将上述羧化壳聚糖微球在浓度为17 mg/mL的单宁酸溶液（去离子水作为溶剂）浸沉涂泡5分钟，并在去离子水中浸泡清洗多遍制备得到单宁酸涂覆的羧化壳聚糖微球，从而得到TA-CPG-L0-MSs。
与实施例1相比，对比例1仅添加单宁酸，而不添加阳离子聚合物组分，但是从图8的紫外可见光光谱中可以看出，单独的单宁酸和羧化壳聚糖微球的相互作用微弱，不能在羧化壳聚糖微球上稳定存在，在存放过程中从微球上解离下来脱落到水中。
对比例2
将羧化壳聚糖溶液（10份羧化壳聚糖，90份去离子水）滴入凝固浴-盐酸溶液（0.1M）中，通过相转换技术，得到微球材料，并在去离子水中浸泡清洗多遍制备得到羧化壳聚糖微球。将上述羧化壳聚糖微球在浓度为20 mg/mL的聚六亚甲基胍溶液（去离子水作为溶剂）浸沉涂泡5分钟，并在去离子水中浸泡清洗多遍制备得到聚六亚甲基胍涂覆的羧化壳聚糖微球，从而得到PHMG-CPG-L0-MSs。
与实施例1相比，本对比例仅添加聚六亚甲基胍，而不添加多酚组分，从图8的紫外可见光光谱中可以看出，聚六亚甲基胍不能在羧化壳聚糖微球上稳定存在，在存放过程中从微球上解离下来脱落到水中。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种兼具内毒素吸附和自由基清除功能的血液灌流用微球，其特征在于：所述微球是以高分子微球为核心层，以多酚类化合物和阳离子聚合物作为功能层。
2.根据权利要求1所述的兼具内毒素吸附和自由基清除功能的血液灌流用微球，其特征在于，所述高分子微球为羧化壳聚糖微球，所述羧化壳聚糖微球通过相转化方法合成得到，合成羧化壳聚糖微球时进行相分离，所述相分离采用的沉淀剂为0.1-1 mol/L的酸溶液。
3.根据权利要求1所述的兼具内毒素吸附和自由基清除功能的血液灌流用微球，其特征在于，所述多酚类化合物选自没食子酸、单宁酸、鞣花酸、茶多酚、或表没食子儿茶素没食子酸酯中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的兼具内毒素吸附和自由基清除功能的血液灌流用微球，其特征在于：所述阳离子聚合物选自季铵盐化壳聚糖或聚六亚甲基胍。
5.根据权利要求1所述的兼具内毒素吸附和自由基清除功能的血液灌流用微球，其特征在于，所述多酚类化合物在制备时采用浓度为10-20 mg/mL的溶液，所述阳离子聚合物采用浓度为15-25 mg/mL的溶液。
6. 权利要求1-5任意一项的兼具内毒素吸附和自由基清除功能的血液灌流用微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）高分子溶液的配制
定量称取高分子化合物溶解于去离子水中，搅拌溶解12-24小时得到质量分数为8-12%的高分子溶液；
2）多酚类化合物溶液的配制
定量称取多酚类化合物溶解于去离子水中，搅拌溶解得到质量分数为10-20 mg/mL的多酚溶液；
3）阳离子聚合物溶液的配制：以聚六亚甲基胍为例，首先称取等摩尔质量的盐酸胍和1,6-已二胺于三颈烧瓶中，在120-140℃下反应直至没有氨气排出，将温度升至180-200℃反应6-8小时，在100-120℃真空干燥制得聚六亚甲基胍。然后定量称取聚六亚甲基胍，搅拌溶解得到聚六亚甲基胍溶液；
4）羧化壳聚糖微球的配制
将质量分数为8-12%的高分子溶液通过注射器针头滴入凝固浴中，发生相转换，得到微球材料，并在去离子水中浸泡清洗多遍制备得到高分子微球；
5）具有兼具内毒素吸附和自由基清除功能的微球的配制
首先，将上述羧化壳聚糖微球在10-20 mg/mL的多酚类化合物溶液浸沉涂泡5分钟，然后将浸涂了单宁酸的羧化壳聚糖微球再在15-25 mg/mL的阳离子聚合物溶液中浸沉涂泡5-10分钟，然后在磁力搅拌下，将微球浸泡在去离子水中除去未反应和不稳定的多酚类化合物和阳离子聚合物，从而得到CPG-L1-MSs；重复上述步骤n次，从而得到微球材料CPG-Ln-MSs，n=1-10。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤4）中，通过调整注射器针头孔径，将微球的直径控制在2000-3000μm。
8. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤5）中， n=8。
9.权利要求1-5任意一项的兼具内毒素吸附和自由基清除功能的血液灌流用微球在制备血液净化器械中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述血液净化为内毒素大量积累，并出现氧化应激状态的脓毒症患者。
CN202311086919.2A 2023-08-28 2023-08-28 一种兼具内毒素吸附和自由基清除功能的血液灌流用微球、其制备方法及应用 Pending CN116807982A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311086919.2A CN116807982A (zh) 2023-08-28 2023-08-28 一种兼具内毒素吸附和自由基清除功能的血液灌流用微球、其制备方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311086919.2A CN116807982A (zh) 2023-08-28 2023-08-28 一种兼具内毒素吸附和自由基清除功能的血液灌流用微球、其制备方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116807982A true CN116807982A (zh) 2023-09-29

Family

ID=88124321

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311086919.2A Pending CN116807982A (zh) 2023-08-28 2023-08-28 一种兼具内毒素吸附和自由基清除功能的血液灌流用微球、其制备方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116807982A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
He et al. Graphene oxide based heparin-mimicking and hemocompatible polymeric hydrogels for versatile biomedical applications
US8894985B2 (en) Nitric oxide-releasing polymers
Dang et al. Heparin as a molecular spacer immobilized on microspheres to improve blood compatibility in hemoperfusion
JP2009518516A (ja) 一酸化窒素放出ポリマー
CN113769150B (zh) 一种具有快速凝血作用的复合材料及其制备方法
Luo et al. An NIF-doped ZIF-8 hybrid membrane for continuous antimicrobial treatment
US9127250B2 (en) Immunosuppressive cell-capturing material and immunosuppressive cell-capturing column
Chen et al. Intervening oxidative stress integrated with an excellent biocompatibility of hemodialysis membrane fabricated by nucleobase-recognized co-immobilization strategy of tannic acid, looped PEtOx brush and heparin
CN116270427A (zh) 一种局部产氧递药的复合水凝胶、其制备方法及其用途
Chen et al. Constructing hierarchical surface structure of hemodialysis membranes to intervene in oxidative stress through Michael addition reaction between tannic acid and PEtOx brushes
Yin et al. Molecularly-imprinted hydrogel beads via self-sacrificing micro-reactors as safe and selective bilirubin adsorbents
CN114989345A (zh) 一种具有自修复功能的抑菌抗氧化水凝胶及其制备方法
Da et al. Functionalized prussian blue nanozyme as dual-responsive drug therapeutic nanoplatform against maxillofacial infection via macrophage polarization
CN116807982A (zh) 一种兼具内毒素吸附和自由基清除功能的血液灌流用微球、其制备方法及应用
Li et al. A metalloporphyrin and hydantoin functionalized nanozyme with synergistically enhanced bacterial inhibition
CN110527108B (zh) 一种聚轮烷结构no供体材料及其制备方法与应用
CN116920165A (zh) 一种原位产氧的水凝胶及其制备方法和应用
CN115105629B (zh) 一种抗菌水凝胶及其制备方法和应用
CN1923357A (zh) 一种低密度脂蛋白胆固醇的选择性吸附剂及其制备方法
CN113940923A (zh) 一种智能释放药物的柔性纤维药盒及其制备和应用
Sachinvala et al. Silver (I) antimicrobial cotton nonwovens and printcloth
CN112876722A (zh) 一种提高医疗器械表面生物相容性的中药涂层及其制备方法
JP4385497B2 (ja) 急性炎症性疾患治療用カラム
EP2813546A1 (en) Organic-inorganic hybrid complex of high-molecular-weight nitroxide compound and inorganic particle
EP2396008A1 (en) Use of a chitosan polymer for heparin neutralization

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination