JP4385497B2 - 急性炎症性疾患治療用カラム - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エンドトキシンなどの白血球活性化物質とそれに反応する炎症性白血球を同時に除去することによって炎症性疾患を治療するためのカラムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
潰瘍性大腸炎、クローン病、感染症などの炎症性疾患では血液中にエンドトキシン、ロイコトリエン、ヌクレオチド、サイトカイン類等の白血球活性化物質や顆粒球や単球などの炎症性白血球が増えてくることは以前から知られている。白血球活性化物質は外来性のものだけでなく、炎症性白血球自身から放出されるものもある。そして、これら白血球活性化物質と炎症性白血球は互いに強め合う性質があるので、一方を残すと、他方が直ぐに増えてしまう。従って、双方を同時に除いた方が良いと考えられる。
【０００３】
白血球を吸着する吸着材としては、酢酸セルロースビーズ（特許番号２５０１５００）やポリエステル不織布が知られているが、これらは、白血球、とりわけ、顆粒球を良く吸着するものの、エンドトキシンなどの顆粒球活性化物質を吸着しない。むしろ、逆に、白血球を活性化する性質があり、炎症性のサイトカインであるＴＮＦを誘導する（特開平６ー２０９９９２号公報）。顆粒球の血中半減期は５時間であるので、これらの材料で顆粒球を除去しても、骨髄プールから直ぐに補充される。従って、補充された顆粒球は、残っていたエンドトキシンや材料の刺激で生成したＴＮＦ等の白血球活性化物質によって、再び、活性化されるので、これらの吸着材では、満足な効果が得られない。
【０００４】
一方、エンドトキシン等の白血球活性化物質を吸着する性質のある吸着材としては、ポリミキシン固定化ポリスチレン繊維が知られている（特公平３−３５９４号公報）が、これは顆粒球を吸着する性質は低い。両者を組み合わせて使うことも当然考えられるが、カラム全体のサイズが大きくなり、患者の血液を沢山体外に出さねばいけなくなり、好ましくない。そこで、我々は、白血球活性化物質を吸着する可能性があり、且つ、活性化白血球も吸着する吸着材として、ポリミキシン固定化ポリスルホン（特開平１1−２４４６９３号公報）を提唱しているが、顆粒球は、感染防御の役割を持っている一面もあるので、際限なく除去してはいけないと考えられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、かかる従来技術の背景に鑑み、過剰に出現した活性化白血球、および、白血球を活性化する物質を同時に除去できる急性の炎症性疾患の治療に有効な炎症性疾患治療用カラムを提供せんとするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、かかる課題を解決するために、次のような手段を採用するものである。すなわち、本発明の炎症性疾患治療用カラムは、血液中の白血球活性化物質と炎症性白血球の双方を同時に吸着する吸着材が、被治療動物の体重１ｋｇ当たり、表面積が４００〜４０００ｃｍ2 の量で充填されていることを特徴するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明は、前記課題、つまり過剰に出現した活性化白血球、および、白血球を活性化する物質を同時に除去できる急性の炎症性疾患の治療に有効な炎症性疾患治療用カラムについて、鋭意検討した結果、ポリミキシンＢ結合アセトアミドメチル化ポリスルホン吸着材の使用量に依存して、病態モデルラットの生死が分かれること、即ち、用いる吸着材の表面積とラットの体重との比で生死が分かれることを見出し、血液中の白血球活性化物質と炎症性白血球の双方を同時に吸着する吸着材が、被治療動物の体重１ｋｇ当たり、表面積が特定量となる量充填してみたところ、意外にも、かかる課題を一挙に解決することを究明したものである。
【０００８】
本発明でいう炎症性白血球とは、顆粒球、単球、活性化リンパ球を意味する。
【０００９】
本発明でいう白血球活性化物質とは、エンドトキシン、菌体細胞壁成分、ペプチドグリカン、スーパー抗原、ロイコトリエン、ヌクレオチド、サイトカイン類等の白血球の顆粒の放出を促進したり、走化性を増大させる物質を意味する。
【００１０】
本発明のカラムに充填される吸着材は、白血球活性化物質と炎症性白血球の双方を吸着するものであればよく、特に制限はない。吸着材の充填量は、少なすぎては治療効果が出ず、多すぎては体外に出す血液量が多くなりすぎて、治療効果が出にくくなるので、４００〜４０００ｃｍ2 の範囲の表面積となるように充填されていることが重要である。かかる吸着材としては、好ましくは２００〜８００ｃｍ2 /ｇの比表面積を有するものが、作りやすくてよい。
【００１１】
本発明で用いる吸着材は、炎症性白血球材料と白血球活性化物質の双方を吸着できるポリマーを使用することが重要であり、その具体例としては、分子量５００以上のアミノ基をもつ環状ペプチド化合物を固定化したポリマーを表面に有する成型品が好ましく使用される。
【００１２】
かかるアミノ基をもつ環状ペプチド化合物としては、好ましくは２〜５０個、より好ましくは４〜１６個のアミノ酸からなる環状ペプチドであって、そのアミノ酸の側鎖に１個以上のアミノ基をもつものが使用される。その具体例としてはポリミキシンＢ、ポリミキシンＥ、コリスチン、グラミシジンＳあるいはこれらのアルキルあるいはアシル誘導体などを採用することができる。ここでのアミノ基の一部は、担体ポリマーとの結合に利用されると共に、吸着の特異性を発揮するために利用される。
【００１３】
環状ペプチド化合物が幹となる重合体（水不溶性担体）との結合した部分の残基を化学式で表すと、下記一般式(1)で示される。
【００１４】
−（ＣＨ2 ）n −Ａ−（ＣＨ2 ）m −Ｙ （1）
（式中、ｎとｍは、０以上２０以下の整数を表し、ｎとｍは、同一でも異なっていてもよい。Ａは、酸素原子、硫黄原子、窒素原子、尿素基、アミド基またはメチレン基を示し、Ｙは、分子量５００以上のアミノ基含有環状ペプチド殘基を示す。）
本発明の吸着材の重合体中における環状ペプチド化合物の適正な結合量、即ち、固定化密度は、繰り返し単位当たり、好ましくは０．０００１〜１個、より好ましくは０．００１〜０．２個が好ましい。かかる固定化密度は、不溶性担体の化学構造および用途によって異なるが、少なすぎるとその機能が発現されるし、一方、環状ペプチド残基の結合量が多すぎると、幹ポリマーの優れた機械的性質が失われ、単独では、強靭な膜になりにくくなる傾向があり、このような重合体を他の成型品にコーティングしても、被膜が粉化する恐れがあり好ましくない。また、それを補うために、未置換の重合体と混合して用いる場合にしても、そのポリマーとの相溶性が悪くなり、うまく成膜できなくなる。
【００１５】
本発明でいう不溶性担体とは、水に不溶で、かつ、分子量５００以上のアミノ化合物を共有結合で固定化できるものであれば、特に制限することなく使用することができる。その具体例としては、たとえばポリスチレンで代表される芳香族ポリビニル化合物、ポリ（ｐ−フェニレンエーテルスルホン）：−｛（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−ＳＯ2 −（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｏ−｝ｎ−や、ユーデル・ポリスルホン：−｛（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−ＳＯ2 −（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｏ−（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｃ（ＣＨ3 ）2 −（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｏ｝ｎ−のほか、−｛（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−ＳＯ２ −（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｏ−（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｏ｝ｎ−、−｛（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−ＳＯ2 −（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｓ−（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｏ｝ｎ−、−｛（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−ＳＯ2 −（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｏ−（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｃ（ＣＦ3 ）2 −（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｏ｝ｎ−などで代表されるポリスルホン、ポリエーテルイミド、ポリアミド、ポリイミド、ポリエーテル、ポリフェニレンサルファイド、ポリスチレンなどで、かつ、アミノ化合物を共有結合で固定化できる反応性官能基をもつものが使用される。
【００１６】
反応性官能基としては、ハロメチル基、ハロアセチル基、ハロアセトアミドメチル基、ハロゲン化アルキル基などの活性ハロゲン基、エポキサイド基、カルボキシル基、イソシアン酸基、チオイソシアン酸基および酸無水物基などを使用することができるが、とりわけ、活性ハロゲン基は、製造が容易な上に、反応性が高く、固定化反応を温和な条件で遂行できると共に、この際生じる共有結合が化学的に安定なので、好ましく用いられる。
【００１７】
さらに反応性官能基をもつ水不溶性担体の具体的な例としては、たとえばクロルアセトアミドメチルポリスチレン、クロルアセトアミドメチル化したユーデル・ポリスルホン、クロルアセトアミドメチル化したポリエーテルイミドなどが使用される。さらに、これらの重合体は有機溶媒に対し可溶性であると成形しやすので、特に好ましく使用される。
【００１８】
本発明の吸着材の重合体は、可溶性重合体であっても、架橋された不溶性の重合体であってもよいが、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドおよびジメチルスルホキシドなどの有機溶媒に可溶であると、種々の形に成形したり、既存の成型品の上にコーティングすることができるので、特に好ましく使用される。さらに、可溶性であることは、該環状ペプチドで架橋が起きてないことを意味し、さらに、該環状ペプチド残基の自由度が高いことを意味するが、それによって細胞に対する作用が強くなることに繋がるので、とりわけ好ましい。
【００１９】
本発明の吸着材は、環状ペプチドの溶液を水不溶性重合体の溶液と混合するか、水不溶性重合体の成形品と接触させるかのいずれかの方法で製造することができる。
【００２０】
本発明の吸着材は、これを直接、繊維状や膜状等に成形して用いることができる。また、本発明の吸着材を、ナイロン、ポリエステル、ポリイミド、ポリウレタン、ポリプロピレン繊維などの成形品の表面にコーティング等によって塗布すると、簡単に表面積の大きな高次の成形品が得られるので、実用上好ましい実施態様である。かかるコーティングは、本発明の吸着材を、塩化メチレンやテトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどの低沸点溶媒に溶かした溶液等に、ナイロン繊維等からなる編地や織物を浸した後、溶媒を蒸発させることにより、容易に実施することができる。また、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどの溶媒に溶かしたものを水などの貧溶媒に入れる湿式コーティング法も利用することができる。
【００２１】
かくして提供される本発明の炎症性疾患治療用カラムは、ＳＩＲＳやＡＲＤＳおよび敗血症などの急性炎症症候群や疎血再環流障害の治療具として好適に供される。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
【００２３】
なお、本実施例中の血球の評価方法は、以下に従った。
１．試験管評価サンプルの前処理
編み地１００ｍｇ（表面積約４２ｃｍ2 ）を秤量し、生理食塩水中で、１２０℃、２０分間、蒸気滅菌した後、０．２ｍｇ／ｍＬ濃度のヘパリンナトリウム・ＰＢＳ（ー）３０ｍＬ中、３７℃、１時間処理し、次いで、生理食塩水で洗浄して用いた。なお、蒸気滅菌できない試料は、７０％エタノールに一夜浸せきしてから、上記のようにヘパリン処理して用いた。
２．血算の測定
白血球、赤血球、血小板の数の測定は、日本光電社製の全自動血球計数器ＭＥＫ−６２０８を用いて行った。
３．エンドトキシン濃度の測定
和光純薬製のリムラスＥＳテストワコー試薬とトキシノメーターを用いて測定した。
[吸着材の製造]
ニトロベンゼン２１ｍＬと硫酸４２ｍＬの混合溶液を０℃に冷却後、５．７ｇのＮ−メチロール−α−クロルアセトアミドを加えて溶解し、これに５００ｍＬの冷ニトロベンゼンを加えた後、これに、２０４ｇのユーデルポリスルホンＰ３５００（ポリマーの分子量は３万ダルトン）を２Ｌのニトロベンゼンに溶かした溶液を、よく撹拌しながら加えた。そして、これをさらに室温で３時間撹拌した。その後、反応混合物を大過剰の冷メタノール中に入れ、ポリマーを沈殿させた。沈殿物をメタノールでよく洗った後、乾燥して、置換率０．１のα−クロルアセトアミドメチル化ポリスルホン２０７ｇを得た。さらに、これを２Ｌのジメチルホルムアミドに溶解し、大過剰のメタノール中に入れ、ポリマーを沈殿させて精製した（重合体−Ａ）。
【００２４】
ポリミキシンＢ結合ポリスルホン系吸着材の製造：
次に、ポリミキシンＢ硫酸塩８ｇを２８０ｍＬのジメチルスルホキシドと２００ｍＬのジメチルアセトアミドの混合溶媒に溶かし、５Ｎ−水酸化ナトリウム５ｍＬを加えた溶液に、上記で得た重合体−Ａの１６ｇを２００ｍＬのジメチルアセトアミドと２００ｍＬのジメチルスルホキシドからなる混合溶媒に溶かしたものを加え、室温で４８時間撹拌した。反応混合物を大過剰の希塩酸中に入れ、ポリマーを沈殿させ、沈殿物を水でよく洗った後、乾燥して、１７．５ｇの重合体を得た。これを２００ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解し、水１．５Ｌの水で再沈殿させ、精製して、重合体−１を得た。
【００２５】
このポリマーをアミノ酸分析した結果、ポリミキシンＢ結合量はポリマー１ｇあたり２４ｍｇであった。
【００２６】
上記の重合体ー１の５ｇを含むＤＭＦ２５０ｍｌの溶液に、７０デニール・９８フィラメントの筒編み２０ｇを浸漬し、２０時間後にその編み地を取り出し、絞液後に真空乾燥し、コーティング編み地（吸着材１）を得た。
【００２７】
コリスチン結合ポリスルホン系吸着材の製造：
次に、コリスチン・メタンスルホン酸塩８ｇを２８０ｍＬのジメチルスルホキシドと２００ｍＬのジメチルアセトアミドの混合溶媒に溶かし、８Ｎ−水酸化ナトリウム４ｍＬを加えた溶液に、上記で得た重合体−Ａの１６ｇを２００ｍＬのジメチルアセトアミドと２００ｍＬのジメチルスルホキシドからなる混合溶媒に溶かしたものを加え、室温で７２時間撹拌した。反応混合物を大過剰の希塩酸中に入れ、ポリマーを沈殿させ、沈殿物を水でよく洗った後、乾燥した。これを２００ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解し、水１．５Ｌの水で再沈殿させ、精製して、１５．４ｇの本発明の重合体−２を得た。
【００２８】
このポリマーをアミノ酸分析した結果、コリスチン結合量はポリマー１ｇあたり２０ｍｇであった。
【００２９】
上記の重合体ー２の５ｇを含むＤＭＦ２５０ｍｌの溶液に、７０デニール・９８フィラメントのナイロン６筒編み２０ｇを浸漬し、２０時間後にその編み地を取り出し、絞液後に真空乾燥し、コーティング編み地（吸着材２）を得た。
【００３０】
グラミシジンＳ結合ポリスルホン系吸着材の製造：
次に、グラミシジンＳ２ｇを１００ｍＬのジメチルアセトアミドの混合溶媒に溶かし、５Ｎ−水酸化ナトリウム２ｍＬを加えた溶液に、上記で得た重合体−Ａの８ｇを１００ｍＬのジメチルアセトアミドに溶かしたものを加え、室温で４８時間撹拌した。反応混合物を２０ミリモルの塩酸を含む１Ｌの水中に入れ、ポリマーを沈殿させ、沈殿物を水でよく洗った後、乾燥して、9.0ｇの本発明の重合体−３を得た。このポリマーをＤＭＦに溶かし水で再沈殿させて精製した。
【００３１】
このポリマーをアミノ酸分析した結果、ポリミキシンＢ結合量はポリマー１ｇあたり２１ｍｇであった。
【００３２】
上記の重合体ー３の５ｇを含むＤＭＦ２５０ｍｌの溶液に、７０デニール・９８フィラメントの筒編み２０ｇを浸漬し、２０時間後にその編み地を取り出し、絞液後に真空乾燥し、コーティング編み地（吸着材３）を得た。
【００３３】
吸着材１および吸着材２の基本的性能を調べた結果、表１および表２のようになった。
【００３４】
但し、表１は、顆粒球増多症モデルウサギ（体重３．５ｋｇのニュージランド・ホワイト種ウサギに１００μｇ／ｍＬ濃度のＥ．ｃｏｌｉＯ１１１：Ｂ４ーＬＰＳ・生理食塩水溶液を、体重１ｋｇあたり５μｇ、耳静脈から投与し、３週間後に再度ＬＰＳの同量を投与して作成；２度目のＬＰＳ投与から２４時間後に耳動脈から採血）の血液２ｍＬに１００ｍｇの各試料を加えて吸着評価（３７℃、１時間）を行ったものである。また、表中の参考試料１はコーティングする前のナイロン編み地であり、参考試料２は重合体Ａをこの編み地にコーティングしたものである。また、表２は、各試料の０．５ｇ（表面積約２１０ｃｍ2 ）を、エンドトキシンの牛胎児血清溶液（Ｅ．ｃｏｌｉＯ１１１：Ｂ４を１０ｎｇ／ｍＬ濃度に溶かしたもの）１５ｍＬ中に入れ、１時間振盪した後、溶液中のエンドトキシンを測定した結果である。
【００３５】
【表１】
【００３６】
【表２】
【００３７】
実施例１
吸着材１を０．３ｇ（表面積約１２６ｃｍ2 ）採取して、内容積２ｍｌの円筒状カラムに充填した。これに、生理食塩水５００ｍｌを流して洗浄した後、オートクレーブで１２０℃、２５分間の滅菌をした。カラムに生理食塩水２００ｍｌを流し、次に、ヘパリンナトリウム０．５ｍｇ／ｍｌＰＢＳ（−）溶液１００ｍｌを流し、さらに生理食塩水５０ｍｌを流して、体外循環の準備をした。
【００３８】
雄性ウィスターラット（体重２００-２５０ｇ）１２匹をペントバルビタール痲酔下に開腹し、左肝動脈・門脈を１時間クランプした後、クランプを外して再環流する肝臓虚血再環流モデルを作製した。再環流開始後、６匹について左総頸動脈から脱血し、ペリスタポンプとカラムを通した後、外頸静脈に返血する体外循環を施行した。抗凝固剤として回路にヘパリンを体外循環開始時に５０単位、持続的に１単位／分投与しながら、１ｍＬ／分の速度で、４５分間体外循環した。再環流後、２４時間経過時に採血し、血液中のＧＯＴ、ＧＰＴおよびＩＬ−６を測定し、表３の結果を得た。
【００３９】
但し、表中の比較例１は、手術後、体外循環治療しなかったものである。
【００４０】
【表３】
【００４１】
表３から、実施例１のカラムで治療すると、比較例１に比し、肝機能の損傷を示すＧＯＴ、ＧＰＴ値が低く抑えられ、且つ、炎症の大きさ反映するＩＬ−６も低く抑えられているので、本発明カラムによる治療の効果が出ていることが分かる。
実施例２〜３
吸着材１を０．３〜０．４ｇ採取して、内容積２ｍｌの円筒状カラムに充填し、生理食塩水５００ｍｌを流して洗浄した後、オートクレーブで１２０℃、２５分間の滅菌をした。カラムに生理食塩水２００ｍｌを流し、次に、ヘパリンナトリウム０．５ｍｇ／ｍｌＰＢＳ（−）溶液１００ｍｌを流し、さらに生理食塩水５０ｍｌを流して、体外循環の準備をした。
【００４２】
雄性ウィスターラット（体重２００-２５０ｇ）をペントバルビタール痲酔下に開腹し、左肝動脈・門脈を１時間クランプした後、クランプを外して再環流する肝臓虚血再環流モデルを作製した。再環流開始後、６匹について左総頸動脈から脱血し、ペリスタポンプとカラムを通した後、外頸静脈に返血する体外循環を施行した。抗凝固剤として回路にヘパリンを体外循環開始時に５０単位、持続的に１単位／分投与しながら、１ｍＬ／分の速度で、４５分間体外循環した。再環流後、２４時間経過時に採血し、血液中のＧＯＴ、ＧＰＴおよびＩＬ−６を測定し、表４の結果を得た。表中の比較例２および３は、吸着材１を０．１ｇまたは０．２ｇ充填したカラムを用いて同様に評価したものである。
【００４３】
但し、表中のラット体重当たりの表面積とは、カラム内に充填した吸着材の総表面積を、用いたラットの体重で除したものである。
【００４４】
【表４】
【００４５】
表４から、ラット体重当たりの吸着材の量（表面積）が低いと生存率が低いことが分かる。
実施例４
吸着材１を０．３ｇ採取して、内容積２ｍｌの円筒状カラムに充填し、生理食塩水５００ｍｌを流して洗浄した後、オートクレーブで１２０℃、２５分間の滅菌をした。このカラムに生理食塩水２００ｍｌを流し、次に、ヘパリンナトリウム０．５ｍｇ／ｍｌＰＢＳ（−）溶液１００ｍｌを流し、さらに生理食塩水５０ｍｌを流して、体外循環の準備をした。
【００４６】
一晩絶食させた雄性ウィスターラット（体重２００-２５０ｇ）１２匹をペントバルビタール痲酔下に腹部正中切開を行い、盲腸結紮後、１９ゲージ針にて穿刺する盲腸結紮穿孔法を行った。結紮３時間に後、実施例３と同様にして１ｍＬ／分の速度で、４５分間体外循環を施行した。６匹には吸着材１カラムを、残りの６匹には比較試料２カラムを使用した。結紮開始後、１２時間経過時に採血し、血液中のＴＮＦαおよびＩＬ−６を測定し、表５の結果を得た。但し、比較例４は、重合体Ａをコーティングしたナイロン編み地を０．３ｇ充填したカラムを７５％エタノールを満たし、２４時間静置して滅菌した後、実施例４と同様に処理したものである。
【００４７】
【表５】
【００４８】
表５から、比較例４に比べ、実施例４のカラムは、炎症の大きさを反映するＴＮＦαおよびＩＬ−６が低く抑えられおり、治療の効果が出ていることが分かる。
実施例５
吸着材１を０．４ｇ採取して、内容積２ｍｌの円筒状カラムに充填し、生理食塩水５００ｍｌを流して洗浄した後、オートクレーブで１２０℃、２５分間の滅菌をした。カラムに生理食塩水２００ｍｌを流し、次に、ヘパリンナトリウム０．５ｍｇ／ｍｌＰＢＳ（−）溶液１００ｍｌを流し、さらに生理食塩水５０ｍｌを流して、体外循環の準備をした。
【００４９】
一晩絶食させた雄性ウィスターラット（体重２００-２５０ｇ）１２匹をペントバルビタール痲酔下に腹部正中切開を行い、盲腸結紮後、１９ゲージ針にて穿刺する盲腸結紮穿孔法を行った。結紮３時間に後、実施例３と同様にして１ｍＬ／分の速度で、４５分間体外循環を施行した。比較例５として、重合体Ａをコーティングしたナイロン６編み地を０．４ｇ充填したカラムを７５％エタノールを満たし、２４時間静置して滅菌した後、実施例５と同様に処理したカラムを用いた。実施例５、比較例５とも６匹ずつで試験した。
【００５０】
結紮開始後、１２時間経過時に採血し、血液中のＴＮＦαおよびＩＬ−６を測定し、表６の結果を得た。
【００５１】
【表６】
【００５２】
表６から、吸着材１のカラムを用いた実施例５の方が、比較例５より生存率が高く、治療効果が高いことが分かる。
実施例６〜７
吸着材２を０．３〜０．４ｇ採取して、内容積２ｍｌの円筒状カラムに充填し、生理食塩水５００ｍｌを流して洗浄した後、オートクレーブで１２０℃、２５分間の滅菌をした。カラムに生理食塩水２００ｍｌを流し、次に、ヘパリンナトリウム０．５ｍｇ／ｍｌＰＢＳ（−）溶液１００ｍｌを流し、さらに生理食塩水５０ｍｌを流して、体外循環の準備をした。
【００５３】
一晩絶食させた雄性ウィスターラット（体重２００-２５０ｇ）をペントバルビタール痲酔下に腹部正中切開を行い、盲腸結紮後、１９ゲージ針にて穿刺する盲腸結紮穿孔法を行った。結紮３時間に後、実施例４と同様にして１ｍＬ／分の速度で、４５分間体外循環を施行し、表７の結果を得た。表中の比較例６は０．２ｇの吸着材１を充填したカラムを用いて同様に評価したものであり、また、比較例７は０．４ｇのナイロン編み地を充填したカラムを用いて同様に評価したものである。
【００５４】
【表７】
【００５５】
表７から、ラット体重当たりの吸着材の量（表面積）が少なかったり、比較例７のように、ただのナイロンの編み地のようなものでは、十分な表面積のものを充填しても、治療効果が出ないことがわかる。
【００５６】
【発明の効果】
本発明によれば、ＳＩＲＳやＡＲＤＳおよび敗血症などの急性炎症症候群や疎血再環流障害の治療具として好適な炎症性疾患治療用カラム、特に体外循環用カラムを提供することができる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、エンドトキシンなどの白血球活性化物質とそれに反応する炎症性白血球を同時に除去することによって炎症性疾患を治療するためのカラムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
潰瘍性大腸炎、クローン病、感染症などの炎症性疾患では血液中にエンドトキシン、ロイコトリエン、ヌクレオチド、サイトカイン類等の白血球活性化物質や顆粒球や単球などの炎症性白血球が増えてくることは以前から知られている。白血球活性化物質は外来性のものだけでなく、炎症性白血球自身から放出されるものもある。そして、これら白血球活性化物質と炎症性白血球は互いに強め合う性質があるので、一方を残すと、他方が直ぐに増えてしまう。従って、双方を同時に除いた方が良いと考えられる。
【０００３】
白血球を吸着する吸着材としては、酢酸セルロースビーズ（特許番号２５０１５００）やポリエステル不織布が知られているが、これらは、白血球、とりわけ、顆粒球を良く吸着するものの、エンドトキシンなどの顆粒球活性化物質を吸着しない。むしろ、逆に、白血球を活性化する性質があり、炎症性のサイトカインであるＴＮＦを誘導する（特開平６ー２０９９９２号公報）。顆粒球の血中半減期は５時間であるので、これらの材料で顆粒球を除去しても、骨髄プールから直ぐに補充される。従って、補充された顆粒球は、残っていたエンドトキシンや材料の刺激で生成したＴＮＦ等の白血球活性化物質によって、再び、活性化されるので、これらの吸着材では、満足な効果が得られない。
【０００４】
一方、エンドトキシン等の白血球活性化物質を吸着する性質のある吸着材としては、ポリミキシン固定化ポリスチレン繊維が知られている（特公平３−３５９４号公報）が、これは顆粒球を吸着する性質は低い。両者を組み合わせて使うことも当然考えられるが、カラム全体のサイズが大きくなり、患者の血液を沢山体外に出さねばいけなくなり、好ましくない。そこで、我々は、白血球活性化物質を吸着する可能性があり、且つ、活性化白血球も吸着する吸着材として、ポリミキシン固定化ポリスルホン（特開平１1−２４４６９３号公報）を提唱しているが、顆粒球は、感染防御の役割を持っている一面もあるので、際限なく除去してはいけないと考えられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、かかる従来技術の背景に鑑み、過剰に出現した活性化白血球、および、白血球を活性化する物質を同時に除去できる急性の炎症性疾患の治療に有効な炎症性疾患治療用カラムを提供せんとするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、かかる課題を解決するために、次のような手段を採用するものである。すなわち、本発明の炎症性疾患治療用カラムは、血液中の白血球活性化物質と炎症性白血球の双方を同時に吸着する吸着材が、被治療動物の体重１ｋｇ当たり、表面積が４００〜４０００ｃｍ2 の量で充填されていることを特徴するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明は、前記課題、つまり過剰に出現した活性化白血球、および、白血球を活性化する物質を同時に除去できる急性の炎症性疾患の治療に有効な炎症性疾患治療用カラムについて、鋭意検討した結果、ポリミキシンＢ結合アセトアミドメチル化ポリスルホン吸着材の使用量に依存して、病態モデルラットの生死が分かれること、即ち、用いる吸着材の表面積とラットの体重との比で生死が分かれることを見出し、血液中の白血球活性化物質と炎症性白血球の双方を同時に吸着する吸着材が、被治療動物の体重１ｋｇ当たり、表面積が特定量となる量充填してみたところ、意外にも、かかる課題を一挙に解決することを究明したものである。
【０００８】
本発明でいう炎症性白血球とは、顆粒球、単球、活性化リンパ球を意味する。
【０００９】
本発明でいう白血球活性化物質とは、エンドトキシン、菌体細胞壁成分、ペプチドグリカン、スーパー抗原、ロイコトリエン、ヌクレオチド、サイトカイン類等の白血球の顆粒の放出を促進したり、走化性を増大させる物質を意味する。
【００１０】
本発明のカラムに充填される吸着材は、白血球活性化物質と炎症性白血球の双方を吸着するものであればよく、特に制限はない。吸着材の充填量は、少なすぎては治療効果が出ず、多すぎては体外に出す血液量が多くなりすぎて、治療効果が出にくくなるので、４００〜４０００ｃｍ2 の範囲の表面積となるように充填されていることが重要である。かかる吸着材としては、好ましくは２００〜８００ｃｍ2 /ｇの比表面積を有するものが、作りやすくてよい。
【００１１】
本発明で用いる吸着材は、炎症性白血球材料と白血球活性化物質の双方を吸着できるポリマーを使用することが重要であり、その具体例としては、分子量５００以上のアミノ基をもつ環状ペプチド化合物を固定化したポリマーを表面に有する成型品が好ましく使用される。
【００１２】
かかるアミノ基をもつ環状ペプチド化合物としては、好ましくは２〜５０個、より好ましくは４〜１６個のアミノ酸からなる環状ペプチドであって、そのアミノ酸の側鎖に１個以上のアミノ基をもつものが使用される。その具体例としてはポリミキシンＢ、ポリミキシンＥ、コリスチン、グラミシジンＳあるいはこれらのアルキルあるいはアシル誘導体などを採用することができる。ここでのアミノ基の一部は、担体ポリマーとの結合に利用されると共に、吸着の特異性を発揮するために利用される。
【００１３】
環状ペプチド化合物が幹となる重合体（水不溶性担体）との結合した部分の残基を化学式で表すと、下記一般式(1)で示される。
【００１４】
−（ＣＨ2 ）n −Ａ−（ＣＨ2 ）m −Ｙ （1）
（式中、ｎとｍは、０以上２０以下の整数を表し、ｎとｍは、同一でも異なっていてもよい。Ａは、酸素原子、硫黄原子、窒素原子、尿素基、アミド基またはメチレン基を示し、Ｙは、分子量５００以上のアミノ基含有環状ペプチド殘基を示す。）
本発明の吸着材の重合体中における環状ペプチド化合物の適正な結合量、即ち、固定化密度は、繰り返し単位当たり、好ましくは０．０００１〜１個、より好ましくは０．００１〜０．２個が好ましい。かかる固定化密度は、不溶性担体の化学構造および用途によって異なるが、少なすぎるとその機能が発現されるし、一方、環状ペプチド残基の結合量が多すぎると、幹ポリマーの優れた機械的性質が失われ、単独では、強靭な膜になりにくくなる傾向があり、このような重合体を他の成型品にコーティングしても、被膜が粉化する恐れがあり好ましくない。また、それを補うために、未置換の重合体と混合して用いる場合にしても、そのポリマーとの相溶性が悪くなり、うまく成膜できなくなる。
【００１５】
本発明でいう不溶性担体とは、水に不溶で、かつ、分子量５００以上のアミノ化合物を共有結合で固定化できるものであれば、特に制限することなく使用することができる。その具体例としては、たとえばポリスチレンで代表される芳香族ポリビニル化合物、ポリ（ｐ−フェニレンエーテルスルホン）：−｛（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−ＳＯ2 −（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｏ−｝ｎ−や、ユーデル・ポリスルホン：−｛（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−ＳＯ2 −（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｏ−（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｃ（ＣＨ3 ）2 −（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｏ｝ｎ−のほか、−｛（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−ＳＯ２ −（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｏ−（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｏ｝ｎ−、−｛（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−ＳＯ2 −（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｓ−（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｏ｝ｎ−、−｛（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−ＳＯ2 −（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｏ−（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｃ（ＣＦ3 ）2 −（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｏ｝ｎ−などで代表されるポリスルホン、ポリエーテルイミド、ポリアミド、ポリイミド、ポリエーテル、ポリフェニレンサルファイド、ポリスチレンなどで、かつ、アミノ化合物を共有結合で固定化できる反応性官能基をもつものが使用される。
【００１６】
反応性官能基としては、ハロメチル基、ハロアセチル基、ハロアセトアミドメチル基、ハロゲン化アルキル基などの活性ハロゲン基、エポキサイド基、カルボキシル基、イソシアン酸基、チオイソシアン酸基および酸無水物基などを使用することができるが、とりわけ、活性ハロゲン基は、製造が容易な上に、反応性が高く、固定化反応を温和な条件で遂行できると共に、この際生じる共有結合が化学的に安定なので、好ましく用いられる。
【００１７】
さらに反応性官能基をもつ水不溶性担体の具体的な例としては、たとえばクロルアセトアミドメチルポリスチレン、クロルアセトアミドメチル化したユーデル・ポリスルホン、クロルアセトアミドメチル化したポリエーテルイミドなどが使用される。さらに、これらの重合体は有機溶媒に対し可溶性であると成形しやすので、特に好ましく使用される。
【００１８】
本発明の吸着材の重合体は、可溶性重合体であっても、架橋された不溶性の重合体であってもよいが、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドおよびジメチルスルホキシドなどの有機溶媒に可溶であると、種々の形に成形したり、既存の成型品の上にコーティングすることができるので、特に好ましく使用される。さらに、可溶性であることは、該環状ペプチドで架橋が起きてないことを意味し、さらに、該環状ペプチド残基の自由度が高いことを意味するが、それによって細胞に対する作用が強くなることに繋がるので、とりわけ好ましい。
【００１９】
本発明の吸着材は、環状ペプチドの溶液を水不溶性重合体の溶液と混合するか、水不溶性重合体の成形品と接触させるかのいずれかの方法で製造することができる。
【００２０】
本発明の吸着材は、これを直接、繊維状や膜状等に成形して用いることができる。また、本発明の吸着材を、ナイロン、ポリエステル、ポリイミド、ポリウレタン、ポリプロピレン繊維などの成形品の表面にコーティング等によって塗布すると、簡単に表面積の大きな高次の成形品が得られるので、実用上好ましい実施態様である。かかるコーティングは、本発明の吸着材を、塩化メチレンやテトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどの低沸点溶媒に溶かした溶液等に、ナイロン繊維等からなる編地や織物を浸した後、溶媒を蒸発させることにより、容易に実施することができる。また、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどの溶媒に溶かしたものを水などの貧溶媒に入れる湿式コーティング法も利用することができる。
【００２１】
かくして提供される本発明の炎症性疾患治療用カラムは、ＳＩＲＳやＡＲＤＳおよび敗血症などの急性炎症症候群や疎血再環流障害の治療具として好適に供される。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
【００２３】
なお、本実施例中の血球の評価方法は、以下に従った。
１．試験管評価サンプルの前処理
編み地１００ｍｇ（表面積約４２ｃｍ2 ）を秤量し、生理食塩水中で、１２０℃、２０分間、蒸気滅菌した後、０．２ｍｇ／ｍＬ濃度のヘパリンナトリウム・ＰＢＳ（ー）３０ｍＬ中、３７℃、１時間処理し、次いで、生理食塩水で洗浄して用いた。なお、蒸気滅菌できない試料は、７０％エタノールに一夜浸せきしてから、上記のようにヘパリン処理して用いた。
２．血算の測定
白血球、赤血球、血小板の数の測定は、日本光電社製の全自動血球計数器ＭＥＫ−６２０８を用いて行った。
３．エンドトキシン濃度の測定
和光純薬製のリムラスＥＳテストワコー試薬とトキシノメーターを用いて測定した。
[吸着材の製造]
ニトロベンゼン２１ｍＬと硫酸４２ｍＬの混合溶液を０℃に冷却後、５．７ｇのＮ−メチロール−α−クロルアセトアミドを加えて溶解し、これに５００ｍＬの冷ニトロベンゼンを加えた後、これに、２０４ｇのユーデルポリスルホンＰ３５００（ポリマーの分子量は３万ダルトン）を２Ｌのニトロベンゼンに溶かした溶液を、よく撹拌しながら加えた。そして、これをさらに室温で３時間撹拌した。その後、反応混合物を大過剰の冷メタノール中に入れ、ポリマーを沈殿させた。沈殿物をメタノールでよく洗った後、乾燥して、置換率０．１のα−クロルアセトアミドメチル化ポリスルホン２０７ｇを得た。さらに、これを２Ｌのジメチルホルムアミドに溶解し、大過剰のメタノール中に入れ、ポリマーを沈殿させて精製した（重合体−Ａ）。
【００２４】
ポリミキシンＢ結合ポリスルホン系吸着材の製造：
次に、ポリミキシンＢ硫酸塩８ｇを２８０ｍＬのジメチルスルホキシドと２００ｍＬのジメチルアセトアミドの混合溶媒に溶かし、５Ｎ−水酸化ナトリウム５ｍＬを加えた溶液に、上記で得た重合体−Ａの１６ｇを２００ｍＬのジメチルアセトアミドと２００ｍＬのジメチルスルホキシドからなる混合溶媒に溶かしたものを加え、室温で４８時間撹拌した。反応混合物を大過剰の希塩酸中に入れ、ポリマーを沈殿させ、沈殿物を水でよく洗った後、乾燥して、１７．５ｇの重合体を得た。これを２００ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解し、水１．５Ｌの水で再沈殿させ、精製して、重合体−１を得た。
【００２５】
このポリマーをアミノ酸分析した結果、ポリミキシンＢ結合量はポリマー１ｇあたり２４ｍｇであった。
【００２６】
上記の重合体ー１の５ｇを含むＤＭＦ２５０ｍｌの溶液に、７０デニール・９８フィラメントの筒編み２０ｇを浸漬し、２０時間後にその編み地を取り出し、絞液後に真空乾燥し、コーティング編み地（吸着材１）を得た。
【００２７】
コリスチン結合ポリスルホン系吸着材の製造：
次に、コリスチン・メタンスルホン酸塩８ｇを２８０ｍＬのジメチルスルホキシドと２００ｍＬのジメチルアセトアミドの混合溶媒に溶かし、８Ｎ−水酸化ナトリウム４ｍＬを加えた溶液に、上記で得た重合体−Ａの１６ｇを２００ｍＬのジメチルアセトアミドと２００ｍＬのジメチルスルホキシドからなる混合溶媒に溶かしたものを加え、室温で７２時間撹拌した。反応混合物を大過剰の希塩酸中に入れ、ポリマーを沈殿させ、沈殿物を水でよく洗った後、乾燥した。これを２００ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解し、水１．５Ｌの水で再沈殿させ、精製して、１５．４ｇの本発明の重合体−２を得た。
【００２８】
このポリマーをアミノ酸分析した結果、コリスチン結合量はポリマー１ｇあたり２０ｍｇであった。
【００２９】
上記の重合体ー２の５ｇを含むＤＭＦ２５０ｍｌの溶液に、７０デニール・９８フィラメントのナイロン６筒編み２０ｇを浸漬し、２０時間後にその編み地を取り出し、絞液後に真空乾燥し、コーティング編み地（吸着材２）を得た。
【００３０】
グラミシジンＳ結合ポリスルホン系吸着材の製造：
次に、グラミシジンＳ２ｇを１００ｍＬのジメチルアセトアミドの混合溶媒に溶かし、５Ｎ−水酸化ナトリウム２ｍＬを加えた溶液に、上記で得た重合体−Ａの８ｇを１００ｍＬのジメチルアセトアミドに溶かしたものを加え、室温で４８時間撹拌した。反応混合物を２０ミリモルの塩酸を含む１Ｌの水中に入れ、ポリマーを沈殿させ、沈殿物を水でよく洗った後、乾燥して、9.0ｇの本発明の重合体−３を得た。このポリマーをＤＭＦに溶かし水で再沈殿させて精製した。
【００３１】
このポリマーをアミノ酸分析した結果、ポリミキシンＢ結合量はポリマー１ｇあたり２１ｍｇであった。
【００３２】
上記の重合体ー３の５ｇを含むＤＭＦ２５０ｍｌの溶液に、７０デニール・９８フィラメントの筒編み２０ｇを浸漬し、２０時間後にその編み地を取り出し、絞液後に真空乾燥し、コーティング編み地（吸着材３）を得た。
【００３３】
吸着材１および吸着材２の基本的性能を調べた結果、表１および表２のようになった。
【００３４】
但し、表１は、顆粒球増多症モデルウサギ（体重３．５ｋｇのニュージランド・ホワイト種ウサギに１００μｇ／ｍＬ濃度のＥ．ｃｏｌｉＯ１１１：Ｂ４ーＬＰＳ・生理食塩水溶液を、体重１ｋｇあたり５μｇ、耳静脈から投与し、３週間後に再度ＬＰＳの同量を投与して作成；２度目のＬＰＳ投与から２４時間後に耳動脈から採血）の血液２ｍＬに１００ｍｇの各試料を加えて吸着評価（３７℃、１時間）を行ったものである。また、表中の参考試料１はコーティングする前のナイロン編み地であり、参考試料２は重合体Ａをこの編み地にコーティングしたものである。また、表２は、各試料の０．５ｇ（表面積約２１０ｃｍ2 ）を、エンドトキシンの牛胎児血清溶液（Ｅ．ｃｏｌｉＯ１１１：Ｂ４を１０ｎｇ／ｍＬ濃度に溶かしたもの）１５ｍＬ中に入れ、１時間振盪した後、溶液中のエンドトキシンを測定した結果である。
【００３５】
【表１】
【表２】
実施例１
吸着材１を０．３ｇ（表面積約１２６ｃｍ2 ）採取して、内容積２ｍｌの円筒状カラムに充填した。これに、生理食塩水５００ｍｌを流して洗浄した後、オートクレーブで１２０℃、２５分間の滅菌をした。カラムに生理食塩水２００ｍｌを流し、次に、ヘパリンナトリウム０．５ｍｇ／ｍｌＰＢＳ（−）溶液１００ｍｌを流し、さらに生理食塩水５０ｍｌを流して、体外循環の準備をした。
【００３８】
雄性ウィスターラット（体重２００-２５０ｇ）１２匹をペントバルビタール痲酔下に開腹し、左肝動脈・門脈を１時間クランプした後、クランプを外して再環流する肝臓虚血再環流モデルを作製した。再環流開始後、６匹について左総頸動脈から脱血し、ペリスタポンプとカラムを通した後、外頸静脈に返血する体外循環を施行した。抗凝固剤として回路にヘパリンを体外循環開始時に５０単位、持続的に１単位／分投与しながら、１ｍＬ／分の速度で、４５分間体外循環した。再環流後、２４時間経過時に採血し、血液中のＧＯＴ、ＧＰＴおよびＩＬ−６を測定し、表３の結果を得た。
【００３９】
但し、表中の比較例１は、手術後、体外循環治療しなかったものである。
【００４０】
【表３】
表３から、実施例１のカラムで治療すると、比較例１に比し、肝機能の損傷を示すＧＯＴ、ＧＰＴ値が低く抑えられ、且つ、炎症の大きさ反映するＩＬ−６も低く抑えられているので、本発明カラムによる治療の効果が出ていることが分かる。
実施例２〜３
吸着材１を０．３〜０．４ｇ採取して、内容積２ｍｌの円筒状カラムに充填し、生理食塩水５００ｍｌを流して洗浄した後、オートクレーブで１２０℃、２５分間の滅菌をした。カラムに生理食塩水２００ｍｌを流し、次に、ヘパリンナトリウム０．５ｍｇ／ｍｌＰＢＳ（−）溶液１００ｍｌを流し、さらに生理食塩水５０ｍｌを流して、体外循環の準備をした。
【００４２】
雄性ウィスターラット（体重２００-２５０ｇ）をペントバルビタール痲酔下に開腹し、左肝動脈・門脈を１時間クランプした後、クランプを外して再環流する肝臓虚血再環流モデルを作製した。再環流開始後、６匹について左総頸動脈から脱血し、ペリスタポンプとカラムを通した後、外頸静脈に返血する体外循環を施行した。抗凝固剤として回路にヘパリンを体外循環開始時に５０単位、持続的に１単位／分投与しながら、１ｍＬ／分の速度で、４５分間体外循環した。再環流後、２４時間経過時に採血し、血液中のＧＯＴ、ＧＰＴおよびＩＬ−６を測定し、表４の結果を得た。表中の比較例２および３は、吸着材１を０．１ｇまたは０．２ｇ充填したカラムを用いて同様に評価したものである。
【００４３】
但し、表中のラット体重当たりの表面積とは、カラム内に充填した吸着材の総表面積を、用いたラットの体重で除したものである。
【００４４】
【表４】
表４から、ラット体重当たりの吸着材の量（表面積）が低いと生存率が低いことが分かる。
実施例４
吸着材１を０．３ｇ採取して、内容積２ｍｌの円筒状カラムに充填し、生理食塩水５００ｍｌを流して洗浄した後、オートクレーブで１２０℃、２５分間の滅菌をした。このカラムに生理食塩水２００ｍｌを流し、次に、ヘパリンナトリウム０．５ｍｇ／ｍｌＰＢＳ（−）溶液１００ｍｌを流し、さらに生理食塩水５０ｍｌを流して、体外循環の準備をした。
【００４６】
一晩絶食させた雄性ウィスターラット（体重２００-２５０ｇ）１２匹をペントバルビタール痲酔下に腹部正中切開を行い、盲腸結紮後、１９ゲージ針にて穿刺する盲腸結紮穿孔法を行った。結紮３時間に後、実施例３と同様にして１ｍＬ／分の速度で、４５分間体外循環を施行した。６匹には吸着材１カラムを、残りの６匹には比較試料２カラムを使用した。結紮開始後、１２時間経過時に採血し、血液中のＴＮＦαおよびＩＬ−６を測定し、表５の結果を得た。但し、比較例４は、重合体Ａをコーティングしたナイロン編み地を０．３ｇ充填したカラムを７５％エタノールを満たし、２４時間静置して滅菌した後、実施例４と同様に処理したものである。
【００４７】
【表５】
表５から、比較例４に比べ、実施例４のカラムは、炎症の大きさを反映するＴＮＦαおよびＩＬ−６が低く抑えられおり、治療の効果が出ていることが分かる。
実施例５
吸着材１を０．４ｇ採取して、内容積２ｍｌの円筒状カラムに充填し、生理食塩水５００ｍｌを流して洗浄した後、オートクレーブで１２０℃、２５分間の滅菌をした。カラムに生理食塩水２００ｍｌを流し、次に、ヘパリンナトリウム０．５ｍｇ／ｍｌＰＢＳ（−）溶液１００ｍｌを流し、さらに生理食塩水５０ｍｌを流して、体外循環の準備をした。
【００４９】
一晩絶食させた雄性ウィスターラット（体重２００-２５０ｇ）１２匹をペントバルビタール痲酔下に腹部正中切開を行い、盲腸結紮後、１９ゲージ針にて穿刺する盲腸結紮穿孔法を行った。結紮３時間に後、実施例３と同様にして１ｍＬ／分の速度で、４５分間体外循環を施行した。比較例５として、重合体Ａをコーティングしたナイロン６編み地を０．４ｇ充填したカラムを７５％エタノールを満たし、２４時間静置して滅菌した後、実施例５と同様に処理したカラムを用いた。実施例５、比較例５とも６匹ずつで試験した。
【００５０】
結紮開始後、１２時間経過時に採血し、血液中のＴＮＦαおよびＩＬ−６を測定し、表６の結果を得た。
【００５１】
【表６】
表６から、吸着材１のカラムを用いた実施例５の方が、比較例５より生存率が高く、治療効果が高いことが分かる。
実施例６〜７
吸着材２を０．３〜０．４ｇ採取して、内容積２ｍｌの円筒状カラムに充填し、生理食塩水５００ｍｌを流して洗浄した後、オートクレーブで１２０℃、２５分間の滅菌をした。カラムに生理食塩水２００ｍｌを流し、次に、ヘパリンナトリウム０．５ｍｇ／ｍｌＰＢＳ（−）溶液１００ｍｌを流し、さらに生理食塩水５０ｍｌを流して、体外循環の準備をした。
【００５３】
一晩絶食させた雄性ウィスターラット（体重２００-２５０ｇ）をペントバルビタール痲酔下に腹部正中切開を行い、盲腸結紮後、１９ゲージ針にて穿刺する盲腸結紮穿孔法を行った。結紮３時間に後、実施例４と同様にして１ｍＬ／分の速度で、４５分間体外循環を施行し、表７の結果を得た。表中の比較例６は０．２ｇの吸着材１を充填したカラムを用いて同様に評価したものであり、また、比較例７は０．４ｇのナイロン編み地を充填したカラムを用いて同様に評価したものである。
【００５４】
【表７】
表７から、ラット体重当たりの吸着材の量（表面積）が少なかったり、比較例７のように、ただのナイロンの編み地のようなものでは、十分な表面積のものを充填しても、治療効果が出ないことがわかる。
【００５６】
【発明の効果】
本発明によれば、ＳＩＲＳやＡＲＤＳおよび敗血症などの急性炎症症候群や疎血再環流障害の治療具として好適な炎症性疾患治療用カラム、特に体外循環用カラムを提供することができる。
Claims (8)
- 血液中の白血球活性化物質と炎症性白血球の双方を同時に吸着する吸着材が、被治療動物の体重１ｋｇ当たり、表面積が４６０〜８４０ｃｍ2の量で充填され、
前記吸着材は、水不溶性担体にアミノ基を有する環状ペプチド残基を固定化したものである、虚血再還流障害治療用カラム。 - 該白血球活性化物質が、細菌毒素である請求項１記載の虚血再還流障害治療用カラム。
- 該細菌毒素が、エンドトキシンである請求項２記載の虚血再還流障害治療用カラム。
- 該炎症性白血球が顆粒球である請求項１〜３のいずれか一項記載の虚血再還流障害治療用カラム。
- 該環状ペプチド残基が、ポリミキシン、コリスチン、または、グラミシジンＳまたはそれらの誘導体であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項記載の虚血再還流障害治療用カラム。
- 該水不溶性担体が、アミン結合性基を有するポリ（ビニル芳香族化合物）である請求項１〜５のいずれか一項記載の虚血再還流障害治療用カラム。
- 該水不溶性担体が、ポリイミド系重合体である請求項１〜５のいずれか一項記載の虚血再還流障害治療用カラム。
- 該吸着材の形状が、膜、繊維、中空糸、粒状物またはこれらを用いた組み立て品であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項記載の虚血再還流障害治療用カラム。
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