CN100482796C - 在甲醇酵母PichiaPastoris中表达重组牛生长激素 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在甲醇酵母PichiaPastoris中表达重组牛生长激素。在近二十年的开发使用中，P.Pastoris已用于许多外源基因的表达，比其他真核表达系统相比具有快捷，方便和便宜的特点，而且通常能得到更高的表达量。本发明构建一种能够在胞内或胞外高效表达牛生长激素的酵母工程菌PichiaPastoris，可以作为饵料添加剂。
Description
本发明涉及在甲醇酵母Pichia Pastoris中表达重组牛生长激素(bovineGrowth Hormone，bGH)。二十世纪七十年代，菲利普石油公司就利用P.Pastoris在连续培养基上进行高密度发酵，每升细胞干重可达130mg蛋白的表达体系。在近二十年的开发使用中，P.Pastoris已用于许多外源基因的表达，比其他真核表达系统相比具有快捷，方便，和便宜的特点，而且通常能得到更高的表达量。P.pastoris酵母分泌型表达体系具有如下几个明显的优点：
(1)高表达量：在醇脱氢酶启动子的启动作用下，酵母细胞可高效启动其后目的基因的转录、表达。
(2)高稳定性：外援基因导入酵母后不是以自主复制的形式存在，而是整合人酵母的染色体上，因此表达菌株稳定。
(3)高分泌性：利用S.Cerevisiae的α-factor因子分泌和信号肽序列将外源蛋白分泌出胞外，产生极少量的酵母自身蛋白，使分泌的外源蛋白极易纯化。
(4)表达出有活性的蛋白，且有合适的糖基化或磷酸化修饰作用。
本发明构建一种能够在胞内或胞外高效表达牛生长激素的酵母工程菌Pichia Pastoris，可以作为饵料添加剂。
以下是具体方法的详细描述：
本发明通过PCR方法从牛脑cDNA中克隆了生长激素基因并插入pPIC9k质粒载体中，电击转化到甲醇营养型酵母GS115中，经不同浓度的G418筛选得到高拷贝插入的重组菌株，表型为His+Mut+。Western Blotting、SDS-PAGE电泳等实验证明表达产物存在于表达上清中，蛋白可以和生长激素多抗结合。在摇瓶表达培养基中以甲醇诱导外源基因的表达，表达上清经50kDa和3kDa超滤膜纯化后再经S-Sepharose Fast Flow及几步纯化后，得到蛋白重组牛生长激素。
一.材料
1.载体与菌株
DH5α菌株，
pPIC9K及P.pastoris蛋白表达系统美国Invitrogen公司。
2.试剂：
SCED：山梨醇1M，柠檬酸纳(pH7.5)10mM，EDTA 10mM，DTT 10mM
酵母氮源碱基(YNB) Difco Laborotories，
层析介质 Pharmacia公司。
玻璃奶(Glass Milk)DNA纯化试剂盒华绿渊公司
DNA分子量标准 Takara公司
蛋白分子量标准 Promega公司
限制性内切酶，DNA Ligase Britain Biolab公司
Taq-plusDNA聚合酶及PCR引物上海生物工程公司。
3.培养基：
酵母YPD培养基：酵母抽提物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％
酵母MGY培养基：甘油1％，酵母抽提物1％，蛋白胨2％，YNB1.34％，生
物素4×10-5％
酵母MM培养基：酵母氮源碱基1.34％，生物素4×10-5％，甲醇0.5％
酵母MD培养基：YNB 1.34％，生物素4×10-5％，葡萄糖2％
MM，MD及YPD固体培养基都加入1.5％琼脂
二.方法
(一)牛生长激素在甲醇酵母中的克隆
1.牛生长激素表达载体的构建
牛生长激素的基因序列为：
1 acggctcagg gtccgtgacg ctcaccagct atgatggctg caggcccccg gacctccctg
61 ctcctggctt tcgccctgct ctgcctgccc tggactcagg tggtgggcgc cttcccagcc
121 atgtccttgt ccggcctgtt tgccaacgct gtgctccggg ctcagcacct ccaccagctg
181 gctgctgaca ccttcaaaga gtttgagcgt acctacatcc ccgagggaca gagatactcc
241 atccagaaca cccaggttgc cttctgcttc tccgaaacca tcccggcccc cacgggcaag
301 aatgaggccc agcagaaatc agacttggag ctgcttcgca tctcactgct cctcatccag
361 tcgtggcttg ggcccctgca gtttctcagc agagtcttca ccaacagctt ggtgtttggc
421 acctcggacc gtgtctatga gaagctgaag gacctggagg aaggcatctt ggccctgatg
481 cgggagctgg aagatggcac cccccgggct gggcagatcc tcaagcagac ctatgacaaa
541 tttgacacaa acatgcgcag tgacgacgcg ctgctcaaga actacggtct gctctcctgc
601 ttccggaagg acctgcataa gaccgagacg tacctgaggg tcatgaagtg ccgccgcttc
661 ggggaggcca gctgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc
721 ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc
781 atcgca
合成的引物用无菌水稀释到5mM，在Taq-plus DNA聚合酶的作用下，以牛脑cDNA为模板进行PCR反应，经2％琼脂糖凝胶电泳检测反应产物条带。挑选一种阳性克隆产物，经EcoRI和XhoI双酶切后用玻璃奶在2％的琼脂糖凝胶上回收目的片段，然后连入EcoRI和XhoI双酶切的pPIC9K质粒，并转染感受态的大肠杆菌DH5α，氨苄平板挑取单克隆，用质粒pPIC9K上的测序引物进行扩增验证目的片段插入，然后进行基因测序进一步鉴定插入片段。用不含插入片段的载体质粒作为负对照。PCR反应条件如下：94℃，1min；56℃，1min；72℃，1min，30循环。构建方法如图1。
2.表达载体在酵母菌GS115中的整合：
2.1 酵母感受态细胞的制备：
1.在3ml YPD中培养酵母菌GS115种子液过夜。
2.在500ml锥形瓶中加入50mlYPD，接入0.1ml上述种子液，30℃培养至OD600约为1.3-1.5。
3.将培养液于4℃，1500g离心5min，去除上清，然后用50ml冰预冷的蒸馏水重悬细胞。
4.重复步骤3再次离心，细胞重悬于20ml冰预冷的蒸馏水，离心，细胞重悬于50ml冰预冷的1M山梨醇，再次离心，细胞重悬于0.2ml山梨醇，置于冰上，感受态细胞现用现制。
2.2 转化质粒的线性化
提取约20μg p PIC9K-牛生长激素质粒DNA，用SalI单酶切，电泳检测酶切完全后，用酚仿抽提，乙醇沉淀回收DNA，溶于10μl ddH2O中。
2.3 酵母感受态细胞的电击转化：
1.将0.1ml的感受态细胞与5-20μg的线性化DNA混合后转移至冰预冷的电击杯中。
2.用电击仪进行转化，转化条件如下：电压1500V，电容50μF，电阻：200Ω。在0.2cm的电击杯中，此条件下可达到每厘米7500V的电压，持续7-10mS。
3.电击后立即在杯中加入1ml冰预冷的1M山梨醇。将杯中的混合物转移至一无菌微量离心管中。在30℃温育1个小时，不要振动。
4.吸取200-500μl转化产物，涂在MD培养基，30℃保温2-3天后长出的菌落全部为His+重组子。
3.His+/Mut+表型菌及高拷贝插入菌株的筛选和鉴定：
3.1 His+/Mut+表型菌的筛选鉴定
由于His+重组子中会出现Mut+和Muts两种基因型，为了选择His+/Mut+表型菌，我们将第一步筛到的His+菌体同时点种到MM和MD平板上，根据Mut+和Muts两种表型在MM(碳源为甲醇)培养基上和MD(碳源为葡萄糖)培养基上的生长状态的差异，区分出Mut+和Muts。Mut+可以快速利用甲醇为C源，因而在MD和MM两种平板上的生长状况无差别；而Muts利用甲醇的速度远远低于利用葡萄糖的速度，因此生长一段时间后同一菌落在不同平板上的大小有明显差异，根据这种方法区分出His+Mut+和His+Muts转化子。挑取His+转化子同时接入MM及MD平板，30℃培养2-3天后，MD上出现菌落而MM上无菌落者或者较小菌落者为Muts型，否则为Mut+。
3.2 高拷贝插入菌株的筛选
从MM和MD培养基上筛选出的His+Mut+菌落约400-500株左右，挑取各个单菌落于含有0.5、1.0、2.0、3.0、4.0g/L G418的YPD平板上进行逐级筛选，3—5天可以在不同浓度的G418平板上长出菌落。
3.3转化子的PCR鉴定
挑取最高浓度G418平板上长出的单菌落，按如下方法提取酵母基因组DNA：
1.在10mLMD上28℃培养高浓度抗性菌至OD600＝5～10，1500g室温下离心5-10分钟.
2.用10mLH2O洗涤菌体后，室温下1500g再次离心5-10分钟.
3.重悬细胞于2mL新配置的SCED溶液，加入0.1mg溶菌酶，37℃放置50分钟.
4.加入2mL1％的SDS溶液，轻轻振匀，冰浴5分钟.
5.加入1.5mL5M KAc，4℃ 1000g离心5分钟.
6.上清加入2倍体积的无水乙醇，室温下1000g离心15分钟.
7.用70％乙醇洗涤一次后再次离心，沉淀37℃烘干后溶于200μl TE待用.
以提取的各基因组DNA为模板，用AOX1 5’和3’引物进行PCR反应，鉴定阳性重组子，用含插入基因的重组质粒作为正对照。PCR反应条件如下：94℃，1min；55℃，1min；72℃，2.5min，30个循环。用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
(二)重组蛋白的表达与纯化：
1 重组蛋白的摇瓶发酵表达及表达条件的摸索
挑取转化子单菌落，接入3ml MGY，28℃振荡培养后将菌液接入MGY培养基中，培养到菌体OD600＝2～6，1500g离心去上清，沉淀转移到100mL表达培养基MM上，1-2h后用甲醇进行诱导表达，在表达过程中每隔24h补加一次甲醇。定时取出培养液，离心取上清，紫外检测蛋白含量，以空白发酵液为对照，用SDS-PAGE分析表达量的大小。为提高重组牛生长激素在毕赤酵母中的表达量，研究了转化子生长的培养条件，包括不同碳源对转化子生长的影响和接种量、甲醇浓度、pH值、摇瓶转速及不同诱导时间对牛生长激素表达的影响。
1.1 碳源对转化子生长的影响
将5mL菌液接入100mL分别以2％葡萄糖，2％甘油，2％甲醇，2％乙醇为碳源的基础生长培养基上，定时取样，监测各种培养基中菌体密度OD600达到5.0的时间。
1.2 接种量对牛生长激素表达的影响
菌体密度OD600达到5.0后，分别将50mL，100mL，200mL，300mL培养基生长的菌体离心，接种到100mL含有0.5％甲醇，pH6.0的诱导培养基上，每隔24h补加一次初始浓度的甲醇，培养48h后收获发酵液，检测菌体生长密度及上清中蛋白总含量，进行SDS-PAGE电泳，紫外薄层扫描检测上清蛋白表达量。
1.3 甲醇浓度对牛生长激素表达的影响
将生长培养基的菌体等量接入含有甲醇百分比浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0的诱导培养基上进行培养，24h后补加相同浓度的甲醇，诱导48b后收获发酵液，按上述方法进行检测。
1.4 pH对牛生长激素分泌的影响
以100mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4为缓冲液，将生长培养基的菌体等量接入pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的诱导培养基，诱导48h，按上述方法进行检测。
1.5 摇瓶转速对牛生长激素表达的影响
分别在80、120、160、200、240r/min不同转速下诱导培养48h，按上述方法进行检测。
1.6 诱导时间对牛生长激素表达的影响
将生长培养基的转化子离心后菌体接入诱导培养基，连续诱导表达64h。
每隔6h取样一次，测定菌体密度和蛋白量。
2.重组蛋白的SDS-PAGE电泳和Western免疫印迹
取500μL发酵液上清，经15％三氯乙酸(TCA)-20℃沉淀1h以上，12,000r/min，离心10min，小心吸出上清，加入1ml丙酮，轻摇后，12,000r/min离心5min，小心吸出上清。沉淀于37℃烘干后溶于30μL体系中进行15％的SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，以紫外薄层扫描直接分析目的条带在总蛋白中的含量。用兔抗牛生长激素的多抗对表达产物进行Western Blotting鉴定，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG。
3.表达产物的分离纯化
表达上清经50kD和3kD超滤膜超滤后调节电导率7ms，pH至3.7后上样到S-Sepharose Fast Flow柱上(2.0cm×20cm)，以0.02mol/L的甲酸缓冲液(pH3.7)平衡后，用含有0～1mol/L NaCl的平衡缓冲液进行梯度洗脱。收集目的峰浓缩后用G25纯化后真空冷冻收集目的蛋白。纯化流程如图2所示。
Claims (1)
1.一种在甲醇酵母Pichia Pastoris中表达重组牛生长激素的方法，该方法包括以下步骤：
(1)通过PCR方法从牛脑cDNA中克隆了生长激素基因；
(2)将牛生长激素基因克隆到pPIC9k质粒载体中；
(3)将克隆有牛生长激素基因的pPIC9k载体电击转化到甲醇营养型酵母GS115中；
(4)经不同浓度的G418筛选得到高拷贝插入的重组菌株，表型为His+Mut+；
(5)用Western Blotting和SDS-PAGE电泳实验证明表达产物存在于表达上清中，表达产物蛋白可以和生长激素多抗结合；
(6)在摇瓶表达培养基中以甲醇诱导外源基因的表达，表达上清经50kDa和3kDa超滤膜纯化后再经S-Sepharose Fast Flow及Sephadex-G25纯化后，得到重组牛生长激素。
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