CN100464757C

CN100464757C - 一种以吸血水蛭为原料制备水蛭素的方法

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Publication number: CN100464757C
Application number: CNB2006100195310A
Authority: CN
Inventors: 周维海; 周维官
Original assignee: Individual
Current assignee: Zhou Weiguan
Priority date: 2006-06-29
Filing date: 2006-06-29
Publication date: 2009-03-04
Anticipated expiration: 2026-06-29
Also published as: CN1883510A

Abstract

本发明公开了一种以吸血水蛭为原料制备水蛭素的方法与应用，该制备方法的特征在于包括吸血水蛭制浆、配制悬浊液和干燥三个步骤，所得到的粉末，它保存了吸血水蛭最主要的有效活性成分——天然水蛭素。本发明具有工艺简单、生产成本较低、产品保存期长、并可采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测天然水蛭素含量，从而使质量稳定，产品疗效有保证等特点。水蛭素应用范围广泛，可通过常规的方法单独做成胶囊、软胶囊、颗粒剂、片剂使用，或与其它动、植物药制成复方制剂，用于防治脑中风、高血压、高脂血症、冠心病等心脑血管疾病。

Description

一种以吸血水蛭为原料制备水蛭素的方法

技术领域

本发明涉及一种从动物体中得到提取物的制备方法与应用，特别是以吸血水蛭为原料制备水蛭素的方法与应用。

背景技术

水蛭，俗称蚂蟥，是蛭纲动物的总称。它是我国传统名贵中药材，具有破血通经、消积散瘀、消肿解毒等功能，临床上用于治疗跌打损伤、目赤肿痛和防治脑中风、高血压、高脂血症、冠心病等心脑血管疾病。

世界上的水蛭有500多种，我国也有97种。

水蛭依其食性不同，可分为非吸血水蛭和吸血水蛭两大类：

非吸血水蛭：以螺类，如田螺、福寿螺等、河蚌等软体动物的汁液为食，主要分布于长江中下游沿岸的省区如湖北、江苏、浙江、上海等。常见的品种是宽体金线蛭Whitman pigra，隶属于无吻蛭目、黄蛭科、金线蛭属，由于其成年个体较大，易采集，因此它一直是中药材市场上的主流品种，目前在国内生产的中成药中，凡是含有水蛭成分的绝大多数都是以宽体金线蛭做为原料。

吸血水蛭：以吸吮人和脊椎动物，如牛、青蛙等的血液为生。常见的品种有：①菲牛蛭Hirudinaria manillensis，俗称金边蚂蟥，隶属于无吻蛭目、医蛭科、牛蛭属，主要分布于华南的广西、广东和海南等省区；②日本医蛭Hirudonipponia，隶属于无吻蛭目、医蛭科、医蛭属，它在我国分布较广，常见于四川、湖南和江苏等省区。吸血水蛭的个体较小，其成年个体重一般仅是宽体金线蛭的1/5～1/20。由于个体小、采集难、产量低的缘故，故到目前为止，中药材市场上很少见有吸血类水蛭饮片销售。国内仅有1～2家药厂以吸血水蛭为原料生产胶囊。

现代科学研究，如天然产物研究与开发，8(2)：54～56；中药材，21(12)：599～600；中医药学刊，23(4)：705～706；等等表明，水蛭的药理活性强弱取决于其体内活性成分的抗凝酶活性强度，也就是说水蛭的抗凝酶活性强，其药理活性就强，反之就弱。吸血水蛭的抗凝酶活性明显强于非吸血水蛭，而吸血水蛭的抗凝血酶活性成分主要是天然水蛭素Hirudin，非吸血水蛭的抗凝酶活性成分不含天然水蛭素，到目前为止，其活性成分尚未清楚。

众多研究，如水生生物学报，21(2)：169～173；中国新药杂志，6(3)：186～188；等等报道，天然水蛭素是迄今为止世界上所发现的最强的天然抗凝血酶物质，对人类心脑血管疾病尤其是脑血栓等血栓性疾病有特效，其防治效果是任何物质所不能比拟的。同时相关研究还表明，如生物化学杂志，11(3)：321～326；生物学通报，2003，38(3)：3～5；等等，水蛭素是由65～66氨基酸组成的低分子酸性多肽，分子量仅为7000，极易溶于水和生理盐水，异常稳定，单纯温度升高到100℃，不影响其活性。

对于吸血水蛭提取物，即水蛭素的制备方法，国内已有申请专利，如申请号为02116727.3的申请，它所采用的干燥方法是冷冻干燥，其设备昂贵，干燥成本高。

发明内容

本发明的目的是提供一种以吸血水蛭为原料制备水蛭素的方法，它能解决上述水蛭素提取存在的实际问题，具有很强的针对性。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种以吸血水蛭为原料制备水蛭素的方法，其特征在于该方法通过下述步骤制得：

1、取吸血水蛭活体或冷冻结冰保存的吸血水蛭尸体，按其重量计算，加入生理盐水或饮用水1～10倍，在胶体磨里反复匀浆2～6次，制得到吸血水蛭浆液。

2、用60～150目筛网将吸血水蛭浆液进行过滤，除去滤渣后得到吸血水蛭滤液。

3、在吸血水蛭滤液中加入辅料，其用量：按重量份比为：吸血水蛭滤液50～90份，淀粉，如木薯淀粉、玉米淀粉等10～50份，水溶性填充剂，如乳糖、蔗糖、甘露醇、麦芽糊精等0～5份。

4、按上述配比，将淀粉和/或水溶性填充剂放入吸血水蛭滤液中，搅拌均匀后即得到悬浊液。

5、将上述吸血水蛭悬浊液置于喷雾干燥机内进行喷雾干燥，其条件是进口温度165～195℃，出口温度68～85℃，制得干燥粉末。

6、上述制得的粉末，其主要活性成分是水蛭素，可采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测其天然水蛭素的含量，一般是每克干粉含天然水蛭素60～4000ATU。

本发明的另一个目的是提供具有抗凝血酶活性的水蛭素的应用。

所述的水蛭素，可通过常规的方法，单独做成胶囊、软胶囊、颗粒剂、片剂使用，或与其它动、植物药(或它们的提取物)配成复方制剂，均可用于防治脑中风、高血压、高脂血症、冠心病等心脑血管疾病。

本发明水蛭素的制备方法，其优点在于能最大限度地提取水蛭体内的主要有效活性成分，工艺简单、生产成本较低、产品保存期长、并可采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测其活性成分含量，从而使质量稳定，且携带和服用方便，可为制药提供安全、优质的原料，在临床应用中，根据不同的需要，可以将本发明制成具有针对性的药物。

水蛭素质量控制技术：吸血水蛭中主要活性成分是水蛭素，用Markwardt凝血酶直接滴定法可检测其含量。其原理是：水蛭素能与凝血酶特异性结合，使凝血酶失活，其结合比例为1:1，水蛭素的计量单位为国际单位，以ATU表示，凝血酶活性的国际单位为NIH，即1个ATU等于中和1个NIH凝血酶的水蛭素量。

水蛭素含量检测方法：

取本品粉末约1g，精密称定，精密加入0.9％氯化钠溶液5ml，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清夜100μl，置试管(10mm×100ml)中，加入0.5％(牛)纤维蛋白原(以凝固物计)的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(取0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液25ml与0.1mol/L盐酸溶液约40ml，加水至100ml，调节pH值至7.4)200μl，摇匀，置水浴(37℃±0.5℃)中缓缓滴加每1ml(中)含40U(单位)的凝血酶溶液(每分钟5μl，边滴加边轻轻摇匀)至凝固，记录消耗凝血酶溶液的体积，按下式计算：

U＝C₁V₁/C₂V₂W

式中：U---每1g含凝血酶活性单位，即水蛭素含量，U/g；

C₁---凝血酶溶液的浓度，μ/ml；

C₂---供试品溶液的浓度，g/ml；

V₁---消耗凝血酶溶液的体积，μl；

V₂---供试品溶液的加入量，μl；

W---取样量。

上述水蛭素含量检测方法亦适用于：以吸血水蛭为主要原料所制成的各种制剂的质量监测。

具体实施例

实施例一：

取菲牛蛭活体10千克，用干净水冲洗干净后，加入生理盐水100千克，在胶体磨里反复匀浆3次后得到菲牛蛭浆液；用80目筛网将菲牛蛭浆液进行过滤，除去滤渣后得到菲牛蛭滤液104.3千克，因菲牛蛭活体内尚有一些未消化的血液及其本身的蛋白质；在上述滤液中分别加入普通木薯淀粉95千克、乳糖5千克，搅拌均匀后即得到悬浊液204.3千克；将上述悬浊液置于喷雾干燥机内进行喷雾干燥，其条件为进口温度175℃，出口温度78℃，共得到干燥粉末101.5千克，因菲牛蛭活体内尚有一些未消化的血液及其本身的蛋白质；经采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测上述粉末中天然水蛭素的含量为61ATU/克。

实施例二：

取冷冻结冰保存的日本医蛭尸体30千克，待其溶解后加入饮用水210千克，在胶体磨里反复匀浆4次后得到日本医蛭浆液；用60目筛网将日本医蛭浆液进行过滤，除去滤渣后得到日本医蛭滤液221.7千克，因日本医蛭尸体内尚有一些未消化的血液；在上述滤液中加入玉米淀粉50千克，搅拌均匀后即得到悬浊液271.7千克；将上述悬浊液置于喷雾干燥机内进行喷雾干燥，其条件为进口温度185℃，出口温度81℃，共得到干燥粉末52.9千克，因日本医蛭尸体内尚有一些未消化的血液及其本身的蛋白质；经采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测上述粉末中天然水蛭素的含量为436ATU/克。

实施例三：

取冷冻结冰保存的菲牛蛭尸体20千克，待其溶解后加入生理盐水20千克，在胶体磨里反复匀浆5次后得到菲牛蛭浆液；用100目筛网将菲牛蛭浆液进行过滤，除去滤渣后得到菲牛蛭滤液26.6千克，因菲牛蛭尸体内尚有一些未消化的血液；在上述滤液中分别加入普通木薯淀粉3千克、甘露醇0.4千克，搅拌均匀后即得到悬浊液30千克；将上述悬浊液置于喷雾干燥机内进行喷雾干燥，其条件为进口温度168℃，出口温度68℃，共得到干燥粉末4.2千克，因菲牛蛭尸体内尚有一些未消化的血液及其本身的蛋白质；经采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测干燥粉中天然水蛭素的含量为3809.5ATU/克。

实施例四：

取冷冻结冰保存的菲牛蛭尸体50千克，待其溶解后加入饮用水150千克，在胶体磨里反复匀浆3次后得到菲牛蛭浆液；用70目筛网将菲牛蛭浆液进行过滤，除去滤渣后得到菲牛蛭滤液164.3千克，因菲牛蛭尸体内尚有一些未消化的血液；在上述滤液中分别加入普通木薯淀粉40千克、麦芽糊精10千克，搅拌均匀后即得到悬浊液214.3千克；将上述悬浊液置于喷雾干燥机内进行喷雾干燥，其条件为进口温度178℃，出口温度75℃，共得到干燥粉末54.2千克，因菲牛蛭尸体内尚有一些未消化的血液及其本身的蛋白质；经采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测干燥粉中天然水蛭素的含量为599.6ATU/克。

实施例五：

取实施例一所得的粉末100克(其天然水蛭素含量为61ATU/克)，按常规方法制成胶囊，0.3克/粒(水蛭素含量为18.3ATU/粒)。日服2～3次，每次2～4粒，可防治高脂血症、高血粘等疾病。

临床试验结果：治疗高脂血症108例，有效77例，显效25例，无效6例，总有效率94.4％。

实施例六：

取实施例三所得的粉末30克(其水蛭素含量为3809.5ATU/克)，药用淀粉870克，两者混合、拌匀，按常规直接压片法制片，0.3克/片(水蛭素含量为38.1ATU/片)。日服2～3次，每次2～4片，对治疗经闭、脑中风的后遗症如半身不遂、肢体麻木等有显著的效果。

临床试验结果：吕××，女，44岁，广西经济管理干部学院教师，2004年5月以来，经期异常，时间长短不一，有时提前，有时推迟，月经量减少，每月的月经量仅是原来正常时的1/5～1/10，经多次服用调经胶囊和中药单方，效果不佳。2005年12月15日开始服用实施例五的片剂，每天2次，每次4片，服用30天，其间的月经量明显增多，整个经期的月经量达到200毫升，比未服用前的50毫升增加了四倍，继续服用60天后，整个经期的月经量达到了400毫升，已恢复到原来的正常水平。在这以后停止服用，到2006年5月31日经期和月经量都很正常。

Claims

1、一种以吸血水蛭为原料制备水蛭素的方法，其特征在于该方法包括下述步骤：

①制浆：在常温下，将吸血水蛭活体或尸体加入生理盐水或饮用水，粉碎并用胶体磨制成吸血水蛭浆，经过滤取吸血水蛭滤液，所述的生理盐水或饮用水为吸血水蛭重量的1—10倍；

②配制悬浊液：在吸血水蛭滤液中加入辅料制成吸血水蛭悬浊液；所述的辅料是淀粉和水溶性填充剂，其用量按重量份比为：吸血水蛭滤液50—90份，淀粉10—50份，水溶性填充剂0—5份，所述水溶性填充剂的是乳糖、蔗糖、甘露醇或麦芽糊精；

③干燥：采用喷雾干燥法将吸血水蛭悬浊液进行喷雾干燥，得到粉末成品，所述的喷雾干燥条件是：进口温度165—195℃，出口温度68—85℃。