CN100398648C - 核酸分析的探针 - Google Patents

核酸分析的探针 Download PDF

Info

Publication number
CN100398648C
CN100398648C CNB971968721A CN97196872A CN100398648C CN 100398648 C CN100398648 C CN 100398648C CN B971968721 A CNB971968721 A CN B971968721A CN 97196872 A CN97196872 A CN 97196872A CN 100398648 C CN100398648 C CN 100398648C
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
nucleic acid
group
reporter group
combining
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB971968721A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1226928A (zh
Inventor
米凯尔·库比斯塔
尼克·斯范维克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
M. Kubista
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of CN1226928A publication Critical patent/CN1226928A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100398648C publication Critical patent/CN100398648C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
    • C07D417/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D487/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及检测具有特殊序列的核酸的探针。它由两个连接单元构成。一个单元与天然核酸化学不同，但有识别单链或双链DNA或RNA碱基或碱基对的特异序列能力。另一个单元是一种化合物，其可检测性质随结合核酸而改变。

Description

核酸分析的探针
本发明属于与核酸杂交的探针类。这种探针用于特异基因、基因片段、RNA分子和其它核酸的鉴定方法中。这些方法主要用于临床例如检测组织、血样和尿样，食品工程，农业和生物学研究。
发明背景
与核酸(NA)，我们指脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，杂交的探针用于确定复杂混合物中特异靶序列(TS)的存在。Gillespie和Spiegelman(J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，12，829，1956)首次描述了使用探针的传统的杂交方法，该探针基于装备有报告基团(RG)(通常为放射性同位素)的寡脱氧核糖核苷酸，并且该方法通常包括以下步骤：将待测核酸固定在纸上、玻璃珠或塑料表面；添加过量的与靶序列互补的探针；探针杂交；除去未杂交探针；检测保留的与固定靶序列结合的探针。
未杂交探针通过彻底清洗除去。这通常是这一程序最耗时间和最关键的步骤。因为未杂交探针和杂交探针的性质不可分辨，所以必须实质上除去所有未杂交探针。由于杂交探针只通过与靶序列的相互作用来连接，因此它们中的一些通过清洗将会被除去，同样在TS和探针之间TS未充分固定的一些杂交体通过清洗也会被除去。另外，一些探针可以直接粘附至表面而产生背景信号。最后，必须除去未杂交探针的要求使得体内检测和实时检测不可行。
曾报道过一些称为同源探针技术的方法不必除去未杂交探针即可确定杂交。
Bannwarth等(Helvetica Chimica Acta，71，2085，1988)研究了一种使用由装备有钌复合物的寡脱氧核苷酸构成的探针的方法，其中通过测定探针的荧光寿命确定杂交。虽然该方法很好，但它的应用限于装备精良的专业实验室并且仅能由受过专业训练的人使用。而且，该方法分辨杂交和未杂交探针的能力不是特别好，特别是在可能包含影响探针荧光寿命的成分的生物样品中更是如此。
Barton J.等(美国专利，5.157.032)描述了一种探针，该包括用金属-配体复合物修饰的DNA链，其荧光强度在杂交后增强。这些探针在杂交后仅获得中等强度的荧光(报道的荧光量为0.007，Jenkins和Barton，J.Am.Chem.Soc.(美国化学学会杂志)，114，8736，1992)，其灵敏度低。而且，该探针是二价阳离子(带+2价电荷)，导致形成显著的非特异相互作用，从而降低了分辨不同序列的能力。
Yamana等(Nucl.& Nucl.(核苷酸和核酸)，11(2-4)，383，1992)描述了一种由用芘修饰的寡核苷酸构成的探针，其在优化条件下杂交后荧光强度增加20倍。该方法有几个不利之处。芘具有复杂的光物理性质，其吸收性质和荧光性质依赖于其周围环境；例如，它有很高倾向形成受激准分子(MichlJ.和Erik W.Thulstrup in Spectroscopy with polarized light，第一版，VCH，1986，ISBN 0-89573-346-3)。而且，芘发射不能用肉眼看到的紫外光(450nm以下)。另外，芘还有毒(Yoshikawa等，Vet.Hum.Toxicol.29，25，1987)。
Linn等(EP 0710668A2，US 5597696)和Ishiguro等(Nucl.Acids Res.(核酸研究)，24，4992，1996)描述的探针包括寡核苷酸和不对称花青染料。这些探针的荧光性质例如荧光偏振性，荧光寿命和荧光强度在杂交后改变。这些探针有几个缺点和限制。荧光偏振性和荧光寿命的测定需要精密和昂贵的设备，且必须由具备专业训练的人操作。荧光强度的改变中等(据报道在优选条件下增加4倍)，使得探针对背景非常敏感，特别在需要过量探针的情况下。
Heller等(EPA 070685)和Cardullo等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国自然科学院进展)，85，8790-8794，1988)描述了一种探针，其基于两个DNA类探针与紧密靠近(close-lying)序列同时杂交。一个探针在DNA链的3’-末端修饰，具有给体荧光团，另一个探针在5’-末端修饰，具有受体荧光团。当它们接近时荧光能量由给体荧光团转移给受体荧光团，这可以检测出来。荧光团在溶液中离开很远，但是通过一个探针的3’-末端紧靠另一个探针的5’-末端结合而将探针与TS杂交时，促使这两个荧光团接近。该方法有几个不利。必须区别不同波长的荧光强度，因为杂交不会引起总荧光强度明显改变，而仅改变荧光波长。该系统不适于TS的定量测定，因为能量转移效率依赖以下因素，例如荧光团之间的距离和它们的相对取向(Forster，Ann.Phys.(Leipzig)(物理分析)，2：55-75，1948)，其也可能依赖于探针序列。该方法存在背景荧光有关的基本问题，因为用于激发给体的光某种程度也激发受体，导致非特异背景信号。最后，两个探针同时与靶序列结合的需要引起缓慢杂交动力学，使得该方法不适于实时检测。
Morrison(EPA 87300195.2；US.Pat.4822733；Analyt.Biochem.(生物化学分析)，183，231-244，1989；Biochem.(生物化学)，32，3095-3104，1993)描述了另一种基于一对寡核苷酸的方法。这些寡核苷酸彼此互补，也与靶序列的双链互补。两个寡核苷酸的3’-末端均有荧光团，5’-末端均有猝灭基团(quencher)。当这些寡核苷酸彼此成对时，5’-末端的猝灭基团立即与3’-末端的荧光团靠近，猝灭荧光团的荧光。然而，如果探针与TS结合就能观察到荧光。这一方法存在两个对立的设计问题：需要高的探针浓度以获得快速杂交动力学，但同时需要低的探针浓度以使游离探针的背景发光最小，已发现该游离探针既不与TS结合也不与互补探针结合。通过首先加热样品以分开探针分子和双链核苷酸的链，然后降低温度使探针与TS杂交而进行探测。然而，未杂交探针必须找到互补探针以实现猝灭，直到得到与TS杂交探针相同的信号。由于探针常过量使用，因此背景落入可接受水平之前要花费相当的时间，使得该方法不适于实时检测。最后，这些探针仅用于双链TS。
Tyagi S.(PCT-WO 9513399；Nature Biotech(自然生物工程)，14，303-307，1989)描述了具有两个发色团(每端各一个)的探针的分子信标(molecularbeacons)。选择这样两个发色团，使得当它们靠近时一个发色团能够猝灭另一个发色团的荧光。探针设计为在溶液中能形成二级结构，该结构使探针的两个末端靠近，引起荧光猝灭。这种结构的需要是该探针的第一个限制，因为它必须包含产生特定二级结构的序列。结果，探针除了与它们被设计去识别的那些序列互补，还要与其它序列互补，也就是说，探针对单个TS永远不是唯一的。其他不利是探测受限于狭窄的温度范围，因为探针与TS的杂交以及游离探针的二级结构都必须是稳定的。例如TS不与互补NA杂交的温度不能使用。而且，室温下已经明显的热运动降低了猝灭效能，故常须使用甚至更低的探测温度，这又降低了探针反应的特异性。
本发明的一个目的是克服上述传统方法以及目前同类方法的缺点。
本发明进一步的目的在于：
不需要预处理样品，例如降解成较小的片段；
探针与靶序列杂交产生信号测定靶序列，而未杂交状态产生的信号非常小，优选可忽略；
探测可以在均相溶液中进行；
可以迅速测定杂交，不需延迟；
NA的量可以实时定量测定；
可以确定含活性酶例如核酸酶和蛋白酶的样品中的特异NA序列；
可以确定体内特异NA的存在；
可以用便宜的设备确定特异NA的存在；
可以有选择地确定任意序列的存在；
可以在较宽的范围内探测；
使用本发明的人不需要接触有害化学品；
使用探针的人不需要特别训练或有特殊经验。
为在诊断和研究中充分利用杂交方法的所有潜力，必须有方法检测使用探针溶液中的杂交，该探针自身产生较低或可忽略的信号，但在与靶序列杂交后能产生可观察到的反应。探针也需要能体内使用而不会对组织和细胞产生有害作用。还需要实时检测。当然，也应该可以在传统杂交中使用该探针。还需要探针产生的信号可以由裸眼观察到。本发明在合理的程度上实现了这些需要。
附图说明
图1.本发明的图示。SRE：与靶序列(TS)特异结合的序列识别单元；RG：杂交后产生信号的报告基团；连接基：连接SRE和RG。
图2.RG的折回结合。如果SRE与天然核酸太相似，RG会折回与它相互作用从而产生信号。探针是“捷径(short cut)”。
图3.探针设计和探测方法。A)识别单链TS的NAA类探针。RG既可以与NAA/NA双链体(duplex)结合或可以与靠近TS的单链NA区结合。B)识别双链TS的NAA类探针，其通过与TS形成NAA：双链NA三链体，或通过经由链置换形成NAA2：NA三链体进行。C)识别单链TS的肽类探针。D)识别双链TS的肽类探针。
图4.在探针中具有合适性质用作RG的化合物与NA和一些NAA相互作用的比较。加入到单链NAA、PNA、甲基磷酸酯和硫代磷酸酯、以及单链NA(DNA型)中的BO的荧光。不带电的NAA、PNA和甲基磷酸酯观察到非常低的荧光。NAA/NA有相同的碱基组成，它们的浓度为0.1mM。
图5.在存在PNA时一些不对称花青染料的发光比较。染料TO基本上完全不发光。来自Molecular Probes Inc.(分子探针公司)的染料Picogreen(未提供结构分子式)和染料B同样具有低的发光。同样来自分子探针公司的染料Oligreen(未提供结构分子式)荧光最高。PNA序列为(H)-TTCTTCTTTT-(NH2)，染料浓度约为0.1mM(Oligreen和Picogreen的浓度仅是近似值，因为分子探针公司未提供它们的浓度)。
图6.用于探测单链NA的替代方法。NAA-RG探针和寡核苷酸同时杂交到单链TS的紧密靠近部分(close-lying parts)，寡核苷酸形成可以与其结合的双链体区域。
图7.TO-5-S的合成。
图8.按照图3A的设计的探针杂交后荧光强度的增加。探针PP10-CTT-TO与单链DNA的杂交。(a)荧光发射光谱，(b)游离探针，存在过量5倍的非互补单链DNA时的探针，和存在TS时的探针的荧光强度。
图9.游离的和杂交的探针的吸收光谱。游离探针和与TS杂交的探针PP10-CTT-TO的染料区的吸收光谱(400-600nm)。杂交后染料光谱向长波方向移动并且总强度降低。这些改变可以用于监测均相溶液中的杂交。
图10.按照图6的设计与TS杂交后探针荧光的增加。
图11.按照图6的设计的杂交复合物的表征。上部的实线(无标记)：260nm处的吸收值随温度的变化。有标记虚线(Dashed line)为杂交探针的荧光。有标记点线(Dotted line)为游离探针的背景荧光。有标记实线为杂交探针的荧光和游离探针的荧光的比值(由右边的刻度表示)。
图12.不对称花青染料与各种NAs的相互作用。上部：与各种双链和单链NA结合的TO的亲合力常数的对数值随离子强度的变化。对聚嘧啶的亲和力明显低于对其它所有聚合物的亲和力。数据显示染料对NA的亲和力随离子强度对数值变化呈对数减小。下部：归纳与各种NA结合的TO的性质的表。可以认为有两种结合方式。I：特征为对所有双链NA和聚嘌呤观察到有高度亲合力、高荧光和长波吸收。II：特征为对聚嘧啶观察到有低亲和力、低荧光和短波吸收。
图13.杂交的直接观察。包含探针PP10-CTT-TO的样品的照片，其中存在非互补NS(左)和包含TS的NS。样品用紫外发生灯从下照射，用标准相机拍照，未使用滤波器。
图14.BO-2-O的合成。
图15.固相合成的探针PP15-TGT-TO的A)高效液相谱图，B)质谱图。
图16.按照图3D所示的设计使用探针EcoRId探测。A：游离探针的荧光(a)，存在包含EcoRI识别序列的双链NA时探针的荧光(b)，存在非互补双链NA时探针的荧光(c)，使用的条件：(a)0.5μM探针；(b)0.5μM探针和0.5μM双链DNA分子；(c)0.5μM探针和0.5μM聚(dAdT)：聚(dAdT)。B：存在相同NA时不与SRE结合的相同染料的荧光。游离BO的荧光(a)，存在双链NA时BO的荧光(b)，存在聚(dAdT)：聚(dAdT)时BO的荧光(c)。条件：a)0.5μM BO；(b)0.5μM BO和0.5μM双链DNA；(c)0.5μM探针和0.5μM聚(dAdT)：聚(dAdT)。
图17.配位剂的作用。存在各种浓度杯芳烃(calilixarene)时游离探针PP15-GAT-BO的荧光。在添加中等浓度(0.25g/L)杯芳烃时背景荧光几乎降低6倍。
图18.NAA类探针和NA类探针的比较。游离PNA-TO探针PP8-GCT-TO和NA-TO探针PD8-GCT-TO的荧光，以及温度为15、20和25℃，存在包含TS的NA时，相同探针的荧光。实验条件为20mM，pH 8.5的硼酸盐缓冲液和500mM氯化钠。
图19最末端碱基的影响。在其与RG连接的末端具有不同碱基的NAA-RG探针(上)和NA-RG探针(下)的背景荧光。NAA-RG数据是PNA类探针获得的测量平均值。每一类型的探针有不同的序列(除了最后两个碱基)、电荷、连接基、RG(TO或BO)，且在不同温度、pH和离子强度下进行测定。然而，在适当的范围内，这些参数对背景信号的影响与最末端碱基对背景信号的影响相比小得多。末端为..CT-RG和..TT-RG的NAA探针的背景信号最小。测试的NA类探针是相同的，除了最后两个碱基(PD11-CXX-TO)，并且在相同条件下(25℃，10mM Tris缓冲液，pH 7.5，1mM EDTA，10mM氯化钠)进行表征。在这种情况中也是..CT-RT的背景信号最低。这两张图的数据无可比性，因为具有不同的比例并且使用了不同的条件。
图20选择TS的方法。末端最靠近RG的碱基在杂交状态应该与RG对其亲和力最低的那些碱基和/或使RG与其一起产生最低信号的那些碱基互补(a)，并且它应该靠近位点(b)，或与探针产生在杂交状态时靠近RG的位点(b’)，RG对它具有高亲和力，RG和它一起在结合时产生强烈的信号。
图21对特异突变敏感的探针的实例。可以设计为对特异突变敏感的各种长度和不同变化的重叠的TS。选择TS时，应该考虑在(a)游离探针中和(b)在杂交复合物中RG可以与之相互作用的序列结构。这种方式可以设计出产生低背景发光并且在杂交后产生最大信号的探针。
发明概述
本发明涉及一种探针，该探针由通过连接基连接的序列识别单元(SRE)和报告基团(RG)组成(图1)。RG是一种化合物，特征为与核酸(NA)结合时具有可观察的性质改变。例如，它游离在溶液中时的发光最小，当与NA结合时产生强烈发光。SRE是一种序列与特异NA结合的分子，且特征为具有使其与RG的相互作用最小化的结构，或具有与RG以影响RG信号特征最小的方式相互作用的结构。它可以是NA，其与RG附着的末端的碱基为对RG有最低亲和力的碱基，或以最小影响RG信号特征的方式与RG相互作用的碱基。SRE也可以在结构上与NA不同。它可以是具有修饰或替换的骨架的寡脱氧核酸类似物(NAA)，非天然糖部分，不同的构型和/或不同的立体化学。它也可以是与特异于核酸的序列结合的肽或蛋白质。最重要的是当RG与SRE连接时，彼此的相互作用和杂交后RG与靶序列的相互作用实质上不同。
本发明的探针在与TS结合时显示可观察到的性质(也称为信号特性)的不同并能用于均相分析，即不必除去未杂交探针即可检测特异NA的存在。本发明的探针还可用于使探针固定(例如，通过束缚在表面固定)的分析，本发明的探针具有清洗除去未杂交探针的步骤不再重要的优点。
本发明的探针可以识别单链(ss)NA和双链(ds)NA的TS。
本发明的探针与ssNA形成的复合物比与dsNA形成的复合物更稳定，且所述探针也可以在使dsNA链分开的温度用于探测dsNA。
本发明的探针具有用于培养细胞以及整个有机体的体内进行探测的潜能，这是比传统的抗酶NA类探针具有优势。
本发明的探针产生与TS的数量成比例的信号，并且可以用于定量样品中特异NA的数量。它可以用于确定，例如，复杂混合物中特异PCR产物的数量。它也可以确定特异RNA的数量，例如细胞提取物中的RNA数量，或两种基因的相对浓度。后者还可以用于，例如，跟踪癌症的发展。
本发明杂交后立即产生信号并可以实时确定特异NA的数量。这就可能实时跟踪例如PCR反应，体外转录等。它也应该可以实时监测，例如细胞内特异NA的数量变化，以跟踪染色体或质粒复制，或特异RNA的产生。
本发明也能用于监测突变。可以构建对完全互补序列比对一个或一些碱基改变的序列杂交更有效的探针。
本发明已推测可以用于通过荧光原位杂交(FISH)技术定位染色体中的特异序列。同样本发明的探针比传统的FISH探针的有利之处在于杂交后荧光增强。为获得足够强度的信号，可能需要几个探针与靶序列杂交和/或将它们与许多RG组装。
本发明可以用于，例如
通过检测对外源有机体的特异序列鉴定患者的感染原(病毒、细菌、寄生虫等)，
通过检测个体的遗传物质鉴定该个体是否有易患疾病的倾向或增加患病的风险，
用于孕期诊断，发现胚胎期和胎儿成长期的遗传缺陷，并预告例如与分娩有关的并发症，
个体鉴定例如亲源检测，法医检测等，
检测基因工程实验结果，例如克隆、转染、基因剔除等。
发明详述和其优选实施例
如标题所示，本发明涉及用于鉴定和定量包含特异靶序列(TS)的核酸(NA)的探针。与传统方法相比，本发明可以用于均相探测，即不必除去未杂交探针即可检测TS的存在。与已知的均相探针方法相比，本发明至少有下述之一的优点：高灵敏度、高准确性、和快速检测。
本发明是由相连的序列识别单元(SRE)和报告基团(RG)构成的探针(图1)。
以前基于SRE-RG理念的探针存在高背景信号的问题。当RG为荧光原(fluorefore)，游离探针具有显著的背景发光，且与TS杂交后荧光强度增加中等(不到4倍，EP0710668A2；Ishiguro等，Nucl.Acids Res.24，4992，1996)。强的背景信号主要由于RG折回到SRE并与之相互作用引起的(图2)。以前探针存在这种问题的原因在于它们具有基于NA的SRE，其序列结构未经优化以最小化来自RG的信号。由于RG是对NA有亲合性的分子(必须如此，否则它不会杂交后与TS结合)，故在任何NA类探针中RG有很大倾向折回与SRE相互作用，除非采取预防措施。对RG为阳离子的探针，这是一个特别重要的问题，事实上所有以前这类探针均如此(EP0710668；US 5157032；Ishiguro等，Nucl.Acids Res.24，4992，1996)，因为RG与NA静电相吸。
上述问题对所有NA-RG探针普遍存在，无论它们的荧光性质如何。当通过稳定状态或时间分辨方式(time resolved fashion)中的吸收或发光(荧光、磷光)变化，或NMR响应、氧化还原电位，电导率、反应性等的变化测量时，它可能是电磁辐射的相互作用。在所有情况下，基于具有未优化序列的NA探针都遭遇RG的折回结合，并具有不必要的背景信号。
本发明描述了SRE-RG探针，其RG折回至SRE产生背景信号的问题被最小化了。本发明也描述了如何优化探针序列和探测方法以改进探针可观察的性质的变化。最后，还描述了一种与TS结合时显示比相应的NA-RG探针信号更强的SRE-RG探针。
序列识别单元
本发明探针特征为，SRE单元具有能最小化与RG的相互作用的结构，或者与RG相互作用后使RG信号特征变化的最小结构(化学结构或序列结构或两者共有)。SRE可以为在与RG附着的末端有特异碱基的NA，或者SRE与NA化学和/或结构不同。它可以是一种与天然NA不同的核酸类似物(NAA)(此处与寡核苷酸类似物等同)，但通过核苷酸碱基间专属配对识别它们。它也可以是与特异于NA；s的序列结合的肽(图3)，它可以是肽和NAA的组合，在合适设计中，它也可以是肽和NA的组合。它还可以是与NA序列特异结合的有机合成分子。
在优选的实施方案中，SRE是NAA。对NAA，我们指线型聚合物，其由含核苷酸碱基的单元构成，但由于具有修饰或替换的磷酸二酯骨架、或者具有修饰或替换的糖配基、或者具有不同立体化学而与天然NA不同，但是通过形成碱基对与NA序列特异性相互作用。NAA必须与NA足够不同以至它与RG发生本质上不同的相互作用。因此，NA衍生物(即一个或几个氢原子由其他基团取代后得到的NA)，例如目前可以用市售寡核苷酸合成器合成的那些，预计达不到足够的不同。
当SRE完全由NAA构成单元(building block)构成，可以期望最小化折回结合。然而设计出的RG不能折回与NA段(step)相互作用的NA/NAA混合聚合物也会有效。例如，在主要包含NA段的混合聚合物中可以有策略地安排NAA段以阻断RG折回。事实上，如果NAA安置在NAA/NA共聚物的末端，一个合适选择的NAA段可以充分阻断RG的折回。以下的NAA类探针我们也指具有基于混合聚合物的SRE的探针，该混合聚合物具有至少一个NAA段，且RG与NAA段连接。
所有SRE中的NAA段必须不一样。SRE也可以是NAA、NAA和NA的混合聚合物、以及也可以是NAA衍生物(NAA的一个或几个氢原子被取代)的混合聚合物。
现有许多可以使用的NAA，由于它们在反义治疗和反基因(antigene)治疗的非相关领域具有潜在的应用，新型NAA正快速得到发展(Nielsen，Annu.Rev.Biophys.Biophys.Biomol.Struct.(生物物理与生物分子结构年度综述)，24，167，1995；De Mesmaeker等，Current Opinion in Structural Biology(结构生物学新观点)，5，343，1995)。NAA的实例是具有修饰的磷酸二酯键(硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、硼酸磷酸酯(branophosphate)、氨基磷酸酯、硒基磷酸酯(phosphoroselenoate)、磷酸三酯等)的那些，具有非天然糖部分(均-DNA、带有碳环环系统的那些、二环-DNA等)的那些，磷酸二酯类似物(烷烃、醚类、硫醚、胺类、酮类、甲基乙缩醛、硫甲基乙缩醛、酰胺、氨基甲酸酯、脲、羟胺、氨基磺酸酯、硫酰胺、甘氨酰胺、砜等)，具有完全替换骨架(二环核糖乙缩醛类似物、吗啉衍生物、肽核酸(PNA))的那些，具有2’，5’连接的寡核苷酸的那些，和具有α-核苷酸异头物的那些。
通常NAA在化学上与NA不同，从而结构和静电引力(至少电荷分布)与NA不同，因此可能与感兴趣的用作RG的化合物不同地作用。图4中以化合物BO为例。BO自身基本上不发光，与NA结合时变得强烈发光。在SRE-RG探针中有用的RG应不与SRE以产生发光的方式相互作用。如图4中看到的，在存在不带电的NAA、PNA和甲基磷酸盐时BO具有明显较低的发光。存在硫代磷酸酯时它具有与单链NA大致相同的发光。这说明在探针中用NAA取代NA可以减小来自RG的信号。但也说明不是任何NAA都可以。最有效的NAA还依赖RG是什么。例如，如果RG是阳离子，例如BO，不带电的和阳离子的NAA预计最为有效。通常，由于RG不能对NA亲和力太低(它必须在杂交时结合)，总有RG对其亲和力较低的NAA。如果NAA用作探针的SRE，该探针将产生比相应NA-RG探针低的背景信号。
由于静电斥力，阴离子小分子通常不与NA结合，而带正电的分子对NA有较强的亲和力。因此用作RG的感兴趣的大多数分子是阳离子，偶尔为电中性，很少为阴离子。因此不带电的NAA，例如PNA、甲基磷酸酯、吗啉衍生物、和一些磷酸二酯类似物用作本发明的SRE引起特别关注，因为它们不会静电吸引阳离子RG，并应该显示比基于NA的SRE更小的折回结合。带一些正电荷的NAA也受到关注，例如通过一些残基修饰，或通过添加带正电的取代基引入正电荷的中性NAA。不带电的NAA和阳离子NAA的共聚物也是感兴趣的。当然，由于它们与NA的非特异静电相互作用，正电荷将减小探针的特异性。因此NAA中正电荷的数目不应太高。
性质最优的NAA之一是基于N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元的PNA。这就是在说到特异PNA时，我们想到的是PNA。它与核酸的复合物与双链NA非常不同(Eriksson和Nielsen，Nature Struct.Biol.(天然生物学结构)，3，410，1996)，PNA双链体也是如此(H.Rasmussen等，天然生物学结构，4，98-101，1997)。双链PNA形成右手螺旋和左手螺旋，而PNA∶DNA和双链DNA仅形成右手螺旋，双链PNA的每个回转(turn)有18个碱基对，PNA∶DNA具有13个碱基对而双链DNA具有10个碱基对，双链PNA的碱基扭曲为19.8°，PNA∶DNA的为28°，双链DNA的为34°。因此，与单链NA以特别方式相互作用的化合物预计与单链PNA的作用方式显著不同，同样，与双链NA以特别方式相互作用的化合物与PNA∶NA杂交物作用也不同。因此，选择的对NA具有高亲和力的化合物，期望对PNA有低亲和力，此种情况也适用于大多数其它NAA(图4)。如果化合物用作探针的RG，它应该显示低的折回结合(back binding)，因此，如果探针的SRE是NAA而不是NA，则显示较低的背景信号。
当NAA用作探针的SRE时，还有其它优于NA的地方。因为NAA是非天然的，故它们对酶有抗性，因此NAA探针可以用于细胞提取物和其它具有酶活性的样品。NAA类探针还可以与TS形成比NA类探针更稳定的杂交体，允许在较高温度下探测。
NAA类探针杂交后也可以获得比NA类探针更高的信号。与单链TS杂交后RG可以和靠近TS的单链NA区结合，或可以与SRE和TS之间形成的双链区结合(图3A)。如果SRE为NAA，双链NA可以通过双重杂交提供给RG(图6)。因此，NAA类探针中RG通常可以和与NA类探针类型相同的NA-结构结合。然而，使用NAA类探针时，RG也可以与NAA/NA杂交体结合，这可能具有不同的结构，其中RG获得更强的信号。我们已经发现PNA即为此种情况(图18)。产生更强信号的原因尚不清楚，但可能是由于不带电的PNA与NA形成比双链NA更刚性的双链体引起的，该双链体更有效地限制了结合的RG的内部运动，从而增强了荧光信号。如果这种假设是正确的，许多其它NAA预计有相似的作用。
本发明的另一个实施方案中，SRE为蛋白质或肽。它们在化学上也与核酸非常不同，可以与NA序列特异结合。目前仅知道一些序列特异核酸结合蛋白质，但是已经发展了一些方法来设计专属识别TS的肽(Choo等，Nuture(自然)，372，642，1994)。RG可以容易地附着于蛋白质和多肽。(实施例10)。
本发明的又一个实施方案中SRE是结合肽的NAA，RG或者与肽或者与NAA连接。这种结构有两个优点：通过NAA识别任意序列的能力和RG与肽的最小的相互作用。肽和PNA的结合引起特别关注，因为可以通过相同的固相化学合成和基本上可以容易地合成任意一种共聚物。例如，为促进溶解性和/或排斥带电RG，可以使用带电氨基酸引入电荷(实施例2)。
本发明的再一个实施方案中，SRE为肽-NA缀合物(conjugate)，而RG附着到所述肽上。所述肽必须设计为阻止RG与NA的相互作用。单一大体积的或带合适电荷(即与RG同样的电荷)的氨基酸可能足够，但通常需要较多的氨基酸残基。
另一个实施方案中，SRE为NA，在其被RG附着的末端的碱基是那些对RG具有最低亲和力和/或以最小影响RG信号特征的方式相互作用的碱基。
报告基团
RG是当与SRE连接并与TS结合时发送容易检测信号的分子。这个信号应比无TS存在时与SRE连接的RG的任何信号明显强烈。因为结构不同的NAA数量非常大，就有很多机会寻找到一个不会相互作用，或以不像天然NA一样引起RG可观察特征改变的方式相互作用的NAA。因此，与NA结合时可观察性质改变的所有化合物都可以用作RG，并在本发明的探针中与合适SRE结合。本发明通过与NA结合时光谱性质改变的RG进行说明，测量该光谱性质的改变为总荧光强度的改变。在一些例子中，探针结合时荧光信号增强。当然，这不是对本发明的限制。也可以使用带有与TS结合时信号性质减弱的RG的探针。
用作RG的化合物应该对NA有足够亲和力，以使得它们在杂交状态结合，但该亲和力不能太高，因为它可能导致探针与NA的非特异相互作用。大多数配体对NA的亲和力依赖于离子组成和溶液温度(Record等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，107，145，1976)，并可以被调整到中等，常常超过几个数量级(图12)。为了适合用作本发明的RG，在室温和100mM离子强度下该化合物对NA的亲和力应该在0.1到108M-1(-1＜logK＜8)之间。
因为发光检测灵敏度很高，故与NA结合后荧光增加的化合物适于用作RG。与NA结合后发光量子产率应增加至少10倍，优选至少在50倍，更优选至少500倍。已经知道了许多这种化合物。有最大荧光增加的化合物之一是噻唑橙(thiazole orange)(超过5000倍，Rye等，Nucl.Acids Res.11，2801，1992)。
化合物在溶液中应该为游离的，即不存在NAs时有非常低的发光，否则会增加背景信号。游离化合物的发光量子产率应少于0.05，优选少于0.01，更优选少于0.001。
化合物应在UV/VIS区有效吸光。最大吸收时的摩尔吸光系数应至少为1000M-1cm-1，优选至少为10,000M-1cm-1，更优选至少为50,000M-1cm-1。
包括环或多环结构的化合物通常观察到上述性质，其中至少两个且通常不超过5个为芳香环，并且可以被连接。环可以是碳环或具有1-2个N原子的杂环。这些系统中的其它常见杂原子为氧和硫。环可以用其它基团取代包括：通常有1-4个碳原子的烷基，通常有1-4个碳原子的含氧基团如羟基、烷氧基和羧酯基，通常有0-6个碳原子的氨基基团如单取代和双取代的氨基基团(通常为单烷基氨基和双烷基氨基)，含硫基团，通常有1-4个碳原子的烷硫基，氰基，通常有1-7个碳原子的非氧代羰基(non-oxo-carbonylgroup)例如羧基及其衍生物(通常为羧酰胺和羧烷基)，通常有1-4个碳原子的氧羰基和酰基，通常原子数为9-35的卤素等。
更感兴趣的化合物是那些包含由一个键连接的两个芳族系统，包含与芳族系统缀合的例如乙烯基、磷酸基、氨基、酰胺、羰基和羧酸酯，从而具有一定刚性的化合物。这些化合物游离在溶液中通常有较低的发光，围绕该键旋转导致激发态无辐射失活。当与核酸结合(通常通过插入或通过结合于小沟(minor groove))时，由于在结合位点被固定在不能围绕连接键转动的平面构型中，它们获得增强的荧光。粘性溶液也限制转动，使得具有合适性质的化合物可以检测。(Carlsson等，J.Phys.Chem.(物理化学杂志)，98，10313，1994)。
更为感兴趣的是不对称花青染料(F.M.Hamer，Heterocyclic Compounds(杂环化合物)，18卷，‘花青染料和相关化合物’，1964，Wiley和Sons)，例如US4883867；US5312921；US5321130；US5401847；US5410030；US5436134；US5486616所描述的那样，特别是具有下列结构的那些：
Figure C9719687200211
其中R1为氢或至多6个碳原子的与氮原子非共轭的烷基，其可以由极性残基例如羟基、烷氧基、羰基和氨基取代。X为氧、硫(或硒)、N-R5(其中R5是氢或低级烷基)，或CR6R7(其中R6和R7是氢或烷基)。这些例子中第一个环系统分别为苯并噁唑、苯并噻唑、苯并咪唑和二氢吲哚。另一个芳族系统可以是单芳环或双芳环，通常为喹啉或吡啶。侧基R2、R3和R4，可以相同，为氢、低级烷基、芳基(aryles)，或者R2和R4或R3和R4成对地与两个环原子结合构成5元或6元芳环，所述芳环可以包含0-2个杂原子例如氧、硫和N-R8，其中R8为烷基。连接两个芳族系统的次甲基键的n为0、1、或2。这会影响环系统之间的共轭距离和程度，因此也影响了吸收波长和发射波长(Griffith，‘Colour and constitution of organic molecules(有机分子的颜色和组成)’，Academic press，1976)。Y为HC＝CH，其位置由指数A和B给出，A和B为0或1，如果A＝0则B＝1，反之亦然。当A＝0和B＝1时，我们指：
Figure C9719687200221
当A＝1以及B＝0时，我们指：
Figure C9719687200222
和
Figure C9719687200223
和
Figure C9719687200224
其中R1，R2和n同上所述，R9和R10为与氮原子非共轭连接的烷基，其可以由极性残基例如羟基、烷氧基、羧基和氨基取代。
染料的均或杂二聚体也可以用于本发明。
用已建立的方法可以合成这些化合物(Sprague，US2268234，1942；Brooker等，Houbenweyl methoden der organischen chemie，band V/1d，1972；Lee等，Cytometry(血细胞记数)，7，508，1986；Lee和Mize，EP0410806，1989)。它们在与核酸结合后发光的大幅度增强是公知的(Lee和Chen，EP 0226272)，并用于检测网状细胞(Lee和Chen，US专利4883867)，用于检测血液中的寄生虫(Lee和Mize，US专利4937198)，用于电泳中核酸染色(Quesada等，生物技术，10，616，1991；Methies和Huang，自然，359，167，1992)和用于毛细管电泳中核酸的超灵敏感检测(Schwartz和Uhlfelder，Anal.Chem.(分析化学)，64，1737，1992)。这些用聚阳离子链取代的化合物(Glazer和Benson，US专利5312921；Yue等，US专利5321130)，作为杂或均二聚体的这些化合物(Yue和Haugland，US专利5410030)是核酸染色的最常用染料。
本发明特别感兴趣的是我们发明(实施例5)的不对称染料，它有一个不是共轭体系部分的羧酸基，可以由固相多肽合成领域公知的偶联剂激活。这种
Figure C9719687200231
Novabiochem 97/98Catal8类目和肽合成手册)’例如PNA。
下的化学结构：
它们已经被合成，带有通过液相(实施例3)或固相(实施例5)化学方法与各种SRE附着的各种侧链(实施例1)。
我们注意到它们的氧类似物(即除了氧原子代替硫原子其余均一样的化合物)，最有可能还有具有非常类似的性质的硒类似物。
不对称花青染料的亲和力和发光特征依赖于与它们相互作用的NA的碱基序列(图12)。它们以非常高的亲和力与双链DNA结合，更可能是通过插入(Jacobsen等，Nucl.Acids Res.23，753，1995；Hansen等，Nucl.AcidsRes.24，859，1996)。它们与单链聚嘌呤结合较差(＜10倍)，对单链聚嘧啶结合力更差(约100倍)。染料的荧光特征还依赖于碱基序列。当它们与双链DNA和聚嘌呤结合时比它们与聚嘧啶结合时荧光约增强10倍。也观察到结合染料吸收性质的差异。很明显结合于NA的不对称花青染料的性质很大程度依赖于与它们相互作用的碱基。
连接于双链NA的分子，因此也最有可能与单链NA和NAA结合的分子，主要与1-3个最外的碱基相互作用(Ciepek等，J.Biomol.Struct.Dyn.(生物分子结构动力学杂志)，5，361，1987)。因此可以通过选择最靠近其与RG附着的末端的碱基可以最小化NA类探针和NAA类探针的背景信号。这些碱基那些RG对其具有最小亲和力和/或RG与其以最小影响RG信号性质的方式相互作用的碱基。
当基于NA或NAA的SRE的末端碱基为..CT-RG或..TT-RG(图19)时，对于不对称花青染料可以获得非常低的背景发光。
其它RG的情况非常不同。例如，小沟粘合剂(minor groove binder)4’-6，二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)与至少三个连续A:T碱基对区域结合时有强烈发光，但与任何其它序列结合时发光明显较低(Jansen等，J.Amer.Chem.Soc.(美国化学协会杂志)，115，10527，1993)。因此，基于DAPI作SRE的探针应设计为不含有容易和染料结合的一连串三个A:T碱基对。
SRE和RG的结合
SRE和RG的连接必须有合适的反应基团。许多组合都是可行的。巯基(thiol)，例如半胱氨酸中的巯基，可以连接于其它巯基和烷基化基团，例如碘代乙酰胺，各种顺丁烯二酰亚胺，丙烯酸衍生物等。氨基，例如肽中和PNA中的氨基末端和碱性氨基酸残基，可以和异硫氰酸酯、酰亚胺酯(例如琥珀酰亚胺酯和邻苯二甲酰亚胺酯)、和磺酰卤、乙二醛、醛和酮反应。羧酸，例如肽和酸性氨基酸残基中的羧基末端，可以和胺，肼衍生物等反应。这些偶联反应本领域已经熟知，并被描述在，例如，新生物化学97/98目录和肽合成手册和Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals(荧光探针和化合物研究手册)(第六版，分子探针公司，Richard Haugland编辑)。
构建染料衍生物时重要的是共轭系统不被影响，因为这可能破坏它的光谱特征。通常这意味着反应基团应该被至少一个非共轭单键与芳族系统隔开。对上述花青化合物，反应基团可以安排在任何有R基团处，只要它被至少一个sp3-杂化碳与芳族系统隔开。当然，RG衍生物不具有干扰偶联反应的侧链或其它取代基也很重要。
SRE和RG的结合通过两种不同的方法说明；其一基于溶液化学，其二基于固相化学(实施例1)。
RG和SRE在水溶液中的结合用不对称花青染料的琥珀酰亚胺酯和有氨基基团的SRE作例子。实施例4中，TO的琥珀酰亚胺酯(实施例3中合成)附着于PNA，实施例10中BO的琥珀酰亚胺酯附着于蛋白质。溶液方法非常普通，并且通过使用合适的衍生物可以基本上用于任何RG对任何SRE的附着。
RG和SRE的固相结合用我们研究出的不对称花青染料的新型羧酸衍生物(实施例5)附着于有氨基基团的SRE作例子。实施例6中TO的羧酸衍生物被附着于这类PNA的固定的SRE，实施例7中不同的TO的羧酸衍生物被附着于固定的SRE连接基缀合物。固相方法尤其对这类肽和PNA的SRE感兴趣，因为染料可以通过与氨基酸残基和PNA碱基同样的程序附着，可以用市售的肽合成器合成完全的探针。
连接基
连接基的主要功能是保持单元以不会阻碍杂交后RG和TS之间的相互作用的方式结合在一起。连接基可以简单，例如化学单键，但是也可以复杂，包含例如官能团。它也可以设计来阻碍SRE和RG之间的相互作用。我们基于模型研究的结果显示这可以通过使用短的和/或刚性的连接基，和含大基团的连接基实现。如果RG带电，可以将同种电荷引入连接基以便抑制折回结合。
许多连接基可以通过将SRE与合适的RG衍生物连接而构建(实施例1)。连接它们之前，用附加单元附着于SRE或RG可以构建更复杂的连接基(实施例7)。
可以通过设计连接基适度调整探针对NA的亲和力。连接基中的负电荷会降低对NA的亲和力，而正电荷会产生更稳定的杂交体。如果在较高温度下进行探测，则后者更为感兴趣。也可以将极性基团引入连接基以增加探针的溶解性。也可以构建具有几个RG附着于其上的反应基团的连接基。这种连接基也可以有分支。
肽连接基在与基于不对称花青染料的RG连接中引起特别关注，因为当附着于肽链时它们有非常低的发光(图16)。因为PNA由肽化学合成，它能容易地通过任一端的氨基酸进行扩展。事实上，我们使用的许多PNA具有一个或两个赖氨酸附着于RG的相反末端以增加探针的溶解性(实施例2)。氨基酸还可以引入PNA单元之间。基本上任何种类的肽连接基都可以被构建。刚性连接基可以做成α-螺旋形式，可以引入电荷，和也可以具有官能度。当然，具有羧酸侧链的其它基团也可以通过固相多肽合成而插入连接基(实施例7)。
肽连接基也可以用于将RG附着于基于NA的SRE。如果设计适当，肽连接基可以阻碍RG与NA-碱基的相互作用。
探测方法和设计方案
单链NA可以使用具有结合单链TS的SRE的探针进行探测(图3A和C)。SRE通常为NAA(实施例2)，但也可以为肽、肽-NAA缀合物、NA-NAA混合聚合物、或设计的NA-肽缀合体。TS的大小可以改变，依赖于被探测的系统。例如，为确定不含或仅含一些其它NA的样品(即，例如PCR反应产物)中特异NA的数量，探针可以短至5-6个碱基，条件是形成稳定的杂交体和具有足够的序列特异性。另一方面，当在含过量其它NA，例如存在抗基因组DNA的外源NA的样品中探测特异NA的存在时，TS必须较长。识别15-40个碱基的探针在大多数情况下都有效，15-20个碱基的长度对大多数人类样品都可能有效。
当探测长链NA片段(例如细菌或病毒基因组)的存在，或探测质粒，特别是插入物的存在时，可以针对所有可能对该NA特异(unique)的大量片段设计探针。例如，500个碱基长的NA片段具有500-20+1＝481个，片段为20个碱基长度，其中所有片段可能对该NA都是特异的。从特异性的观点，探针可以设计为识别任何这些片段。当使用NAA和NA类探针时，应该选择杂交状态末端最靠近RG的TS，该TS的一个或多个碱基和那些RG对其有最低亲和力和/或在其存在下RG获得最低信号的碱基互补。对基于不对称花青染料的RG，例如TO和BO，TS应该以..AA或..GA结尾。如果TS靠近在杂交状态接近RG的位点，或者和探针产生在杂交状态接近RG的位点，也是有利的，RG对该位点有高的亲和力，与它结合时获得强信号(图20)。同样的方法可以用于优化对特异突变敏感的探针的信号响应(图21)。
双链NA可以在一定条件下探测，例如高温和低离子强度，此条件下它的链可以分开，使用具有SRE的探针，其与NA比其与互补NA形成更稳定的杂交体。这种SRE为，例如，一些不带电荷和阳离子NAA。
天然双链NA可以用带NAA的探针探测，该NAA形成序列特异三链体或序列特异D-环作为SRE，或者与双链NA结合的蛋白质或肽作为SRE(实施例10)，或者蛋白质/肽-NAA/NA缀合物。
单链NA也可以通过本发明的探针(基于NAA、肽/蛋白质、肽-NAA缀合物或肽-缀合物)和与TS紧密靠近区(close lying region)互补的寡核苷酸同时杂交而进行探测，从而寡核苷酸形成RG可与其结合的双链体(实施例9)。
双链DNA也可以用识别TS的两条链的两个互补探针探测。这一方法阻碍了复性(renaturation)，并会产生较大的信号响应。
也可以在探针固定于固体支持物时探测，优选地通过在RG相反端和SRE连接进行固定。这一方法易于自动化，并且固定的探针甚至可以再生。
也可以使用探测NA固定的样品，像许多传统方法那样。本发明的探针具有除去非杂交探针的清洗步骤不再关键的优点。
探针可以用两个可以是不同的RG构建，它们结合的可观察性质在杂交后改变。探针可以设计为有两个芘的NA类探针，如Yamana描述的那样(Nucl.Acids Res.11(2-4)，383，1992)，或者具有一个荧光团和一个猝灭剂，通过分子内(Morrison，EPA 87300195.2)或分子间(Tyagi，WO 9513399)的相互作用猝灭荧光。本发明的探针具有形成更稳定的复合物(允许在双链NA解链温度以上进行探测)和抗核酸酶的优点。特别感兴趣的探针是一个RG为与NA结合时荧光大幅度增加的荧光基团，例如不对称花青染料，另一个RG为猝灭剂。这种设计中，猝灭剂会猝灭游离探针的任何残存荧光，进一步促进了杂交后荧光增强。
也可以在减小游离探针残存荧光的第三种成分存在下进行探测。该第三种成分可以是猝灭剂，即，猝灭游离探针RG荧光的分子。猝灭剂可以游离在溶液中，也可以如上所述附着于SRE，或者它也可以附着于与部分SRE互补的另一个NA或NAA。该NA/NAA-猝灭剂与游离探针的结合方式应使猝灭剂靠近RG。如果仅部分互补，探针将对TS有较高的亲和力，TS存在时探针将与NA/NAA-猝灭剂分解(dissociate)。第三种成分也可以为与RG结合并将其与SRE的折回结合位点隔断的试剂。不同的试剂可能用不同的RG最为有效。例如，杯芳烃对TO有很高亲和力，可以用于减小SRE-TO探针的背景发光(实施例12)。
通过将它们与具有可分辨光谱响应的RG构建，本发明还可以用于同步检测和定量一样品中几种不同NA的存在。例如，它们可以发射不同波长的光。
本发明还可以通过荧光原位杂交(FISH)用于定位染色体中的序列。本发明的探针优于传统探针之处在于来自非杂交探针的背景信号显著较低。特别关注的是配备有多个RG的探针，例如，附着于分支连接基的RG，和附着于其它SRE成分，例如，NAA的主链、糖部分和核苷酸碱基的RG。
杂交的检测
探针与TS的结合可以用结合时改变的、探针的任何可观察的性质监测。由于荧光强度可以用相对便宜的设备以高灵敏度测量，因此通常选择的方法是荧光检测。然而，也可以监测其它可观察性质的改变。荧光寿命的改变、荧光偏振性的改变，以及吸收、NMR响应、导电率等的改变也可以被测量。
NAA-RG类探针与普通的NA-RG类探针的比较
本发明的探针与普通探针比较具有的优点是通过将本发明的一个NAA-RG探针与具有相同序列和相同RG的NA-RG探针比较得到最好证明。应注意用这种方法我们仅比较与序列无关的结构特征。为了比较，我们用PNA作为NAA，TO作为RG。这意味着NA-RG探针基本上与Linn等描述的那些探针一致(EP 0710668A2；US 5597696)，与Ishiguro等描述的那些探针非常相似(Nucl.Acids Res.24，4992，1996)，后者使用的染料噁唑黄，YO在所有基本方面与噻唑橙最多相当。
从下面的实施例14得到：
·PNA类探针比NA类探针的背景信号低。
·PNA类探针与TS杂交时比NA类探针获得更高的信号。
·PNA类探针比NA类探针的信号响应增强明显更大。
另外，PNA类探针比NA类探针有下列优势：
·PNA类探针可以比NA类探针在更高温度下使用，因为它们与TS形成更稳定的复合物。例如，PP8-GCT-TO探针甚至在45℃下信号增加35倍(实施例11)，该温度下相应的NA类探针不会形成双链体。
·PNA类探针基本上可以用于任何离子强度，而NA类探针的探测对离子强度非常敏感。事实上，实施例14的对比是在500mM NaCl条件下进行，以便稳定与TS结合的NA-RG探针。
·PNA-探针抗核酸酶。
·PNA，而不是NA可以在一定条件下插入双链DNA，与DNA的一条链通过D-环构型形成三链体(Nielsen等，科学，254，1497，1991)。
实施例
实施例1.RG的合成。
  染料   R<sub>1</sub>   附着方式   探针中的应用
  TO-1-O   --(CH<sub>2</sub>)<sub>1</sub>-COOH   固相   -
  TO-2-O   --(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>-COOH   固相   PP16-GTC-Tob，PP16-GTC-TOc
  TO-5-O   --(CH<sub>2</sub>)<sub>5</sub>-COOH   固相   PP11-TT-TO，PP8-GCT-TO，PP5-GCT-TO，PP15-TGT-TO，PP16-GTC-TOa
  TO-10-O   --(CH<sub>2</sub>)<sub>10</sub>-COOH   固相   -
  TO-1-S   --(CH<sub>2</sub>)<sub>1</sub>-CO-O-C<sub>4</sub>O<sub>2</sub>NH<sub>4</sub>   溶液   -
  TO-2-S   --(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>-CO-O-C<sub>4</sub>O<sub>2</sub>NH<sub>4</sub>   溶液   -
  TO-5-S   --(CH<sub>2</sub>)<sub>5</sub>-CO-O-C<sub>4</sub>O<sub>2</sub>NH<sub>4</sub>   溶液   PP10-CTT-TO，PD8-GCT-TO，PD10-CTT-TO
  BO-1-O   --(CH<sub>2</sub>)<sub>1</sub>-COOH   固相   -
  BO-2-O   --(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>-COOH   固相   -
  BO-10-O   --(CH<sub>2</sub>)<sub>10</sub>-COOH   固相   PP15-TGT-BO
  BO-1-S   --(CH<sub>2</sub>)<sub>1</sub>-CO-O-C<sub>4</sub>O<sub>2</sub>NH<sub>4</sub>   溶液   -
  BO-2-S   --(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>-CO-O-C<sub>4</sub>O<sub>2</sub>NH<sub>4</sub>   溶液   -
  BO-10-S   --(CH<sub>2</sub>)<sub>10</sub>-CO-O-C<sub>4</sub>O<sub>2</sub>NH<sub>4</sub>   溶液   PP10-CTT-BO，PP15-GAT-BO，EcoRI
R1是包含反应基团的侧链，通过该反应基团RG附着于SRE
实施例2.合成的探针。
Figure C9719687200291
Figure C9719687200311
1(H)代表游离氨基和(NH2)代表末端的羧酰胺。
2刚性连接基。
3从Scandinavian Gene Sythesis购买的带有氨基连接基的寡脱氧核苷酸。TO的琥珀酰亚胺酯附着其上，探针用实施例4中的PNA类探针一样的程序纯化，除了TFA用0.1M的TEAA(乙酸三乙基铵)代替，pH 7.0。
实施例3.噻唑橙的琥珀酰亚胺酯(TO-5-S)的合成
合成包括四步。
N-甲基-2-甲基苯并噻唑鎓对-甲苯磺酸盐(I，图7)
对甲苯甲磺酸盐(3.5g，18.8mole)缓慢地加入在乙醇(10ml)中的2.1g(14.0mole)2-甲基苯并噻唑。混合物回流三小时，然后室温搅拌15小时。蒸发溶剂，产物在甲醇/丙酮中重结晶。
产率：4.2g，12.6mmol，91％。
N-(羧戊基)喹啉溴化物(II，图7)
将喹啉(5.2g，40mmol)和6-溴-正己酸(6-bromo-hexanicacid)(7.8g，40mmol)加入30ml乙腈中。混合物在氮气流下回流三小时，然后室温搅拌15小时。加入50ml丙酮并进一步搅拌溶液1小时。过滤收集白色沉淀，用丙酮(2*10ml)洗涤并干燥。
产率：8.4g，26mmol，65％。
N-羧戊基-4-[(3-甲基-2(3H)-苯并噻唑亚基)甲基]-喹啉碘化物(III，图7)
通过在KOH(0.8g，15mmol)III存在下于乙醇(20ml)中缩合(回流45分钟)I(1.6g，5mmol)和II(4.8g，15mmol)而合成III。冷却至室温后用30％KI(水溶液)沉淀出产物。过滤沉淀物，用丙酮洗涤，并在甲醇中重结晶。
产率：1.0g，2mmol，40％。
III的N-羟基琥珀酰亚胺酯(TO-5-S)(图7)
III(0.5g，1mmol)和羟基琥珀酰亚胺酯(0.11g，1mmol)溶解于25ml(无水)二甲氧乙烷(dimetoxyethane)。二环己基碳二亚胺(0.23g，1.1mmol)加入该冷溶液。溶液在0℃搅拌20小时，过滤除去脲。滤液浓缩样品在甲醇中重结晶。
产率：0.4g，0.65mmol，65％。
实施例4.PNA探针(PP10-CTT-TO)的溶液合成及其表征
38nmol连接有氨基基团的PNA(序列‘TTTTCTTCTT-CO-(CH2)5-NH2’)溶解于10μl H2O和31μl 500mM的Na3BO3缓冲液，并加入10μl二噁烷。加入两等份2μl的140nmol TO-5-S(在DMSO中)开始反应(中间搅拌5分钟)，之后反应混合物在37℃放置4小时。冷却至25℃后加入10μl的乙腈。产物用HPLC纯化，使用反相C-18柱(Waters，对称C183.9×150mm)，梯度体系(LKB2249)，在260nm监测吸收(LKB2151)。使用的梯度是含有0.01-0.1％v/v三氟乙酸的乙腈和水的混合物。流速为1ml/min，梯度为95-60％H2O，20min，60-0％H2O，5min。探针和过量TO-5-S被很好地分离。含探针的级分用液氮凝固，冷冻干燥15小时以除去溶剂和三氟乙酸。得到的疏松的类红色物质溶解于去离子水。将探针与TS杂交，导致显示其相互作用的RG的吸收大幅度改变(图9)。
实施例5.BO-2-O(R1＝CH2CH2COOH)的合成
合成包括以下三步：
对甲苯甲磺酸盐(35g，18.8mmol)和2-甲基硫代苯并噻唑(2.5g，14.0mmol)回流5小时.产物(I)在甲醇/丙酮中重结晶(图14a)。
产率：4.8g，13.1mmol，94％。
4-甲基吡啶(3.7g，40mmol)和3-溴丙酸(6.1g，40mmol)回流5小时。产物(II)在甲醇/丙酮中重结晶(图14b)。
产率：6.9g，28mmol，70％。
通过在Et3N(2.0g，20mmol)存在下于CH2Cl2(10ml)中缩合(室温过夜)I(1.8g，5mmol)和II(1.2g，5mmol)而合成N-羧乙基-4-[(3-甲基-2(3H)-苯并噻唑亚基)甲基]吡啶碘化物。用30％的KI(aq)(15ml)沉淀产物，过滤，并在甲醇/水中重结晶。
产率：0.70g，2.1mmol，43％。
实施例6.探针PP15-TGT-TO的固相合成、切割(cleavage)和纯化。
将PNA取代浓度为0.15mmol/g的20mg树脂溶涨于DCM中过夜。PNA序列为Re-Lys-Lys-ATCAACACTGCATG-NH-Boc，其中‘Re’为树脂，Boc为氨基末端保护基团叔丁氧基羧酸基。固相合成在配备有抽水装置(water suction)和氮气搅拌的玻璃漏斗中进行。清洗和反应物溶液部分为1ml，偶联步骤中为0.3ml。通过加入含5％m-甲酚的三氟乙酸(TFA)并搅拌4分钟除去Boc。该程序进行三次，之后树脂用三份DCM∶DMF(1∶1)洗涤，再用吡啶洗两次。游离氨基用Kaiser检测法检测。PNA单体Boc-胸腺嘧啶(9.8mg，18*10-6mol)溶解于0.3ml含2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，0.15mM，18*10-6mol)的DFM中。约一分钟后加入二异丙基乙胺，DIEA(6.3μl，3.4*10-5mol)，将混合物转移至树脂，并使偶联反应进行30分钟。反应结束时Kaiser检测法检测无游离氨基。未反应单体过滤除去，树脂用DMF清洗两次。用DMF中的乙酐和colidin(1∶1∶8)将任何保留的氨基进行封端两分钟。然后用DMF清洗树脂三次，加入含5％哌啶的DMF搅拌四分钟。最后树脂用DCM∶DMF(1∶1)清洗三次，并用DCM清洗三次。
然后用和胸腺嘧啶一样的方法将TO-5-O(R1＝CH2CH2CH2CH2CH2COOH，9.6mg，18*10-6mol)偶联于Re-Lys-Lys-ATCAACACTGCATGT-NH-Boc，不同的是偶联反应进行45分钟。反应过程中树脂珠变红，Kaiser检测法检测显示无游离氨基。
将干燥树脂置于Eppendorf过滤管，用TFA(0.25ml)洗涤。Lys-Lys-ATCAACACTGCATGT-TO从树脂上切割下来，加入三氟甲磺酸(TFMSA)∶TFA∶m-甲酚∶苯硫基甲烷(2∶6∶1∶1，0.25ml)脱保护一小时。然后通过离心分离(6000rpm)从树脂上除去混合物并转移到检测管。重复切割一次，最后用TFA(0.25ml)清洗树脂。用氮气流蒸发除去合并的切割部分的一半溶剂。然后，冰冷的二乙醚(5ml)加入检测管，沉淀得到白色结晶。试管在6000rpm离心，除去上清液。探针(PP15-TGT-TO)用四份乙醚清洗，最后溶解于0.2ml水中。加水后探针变红。
如实施例4所述用反相HPLC纯化探针，并通过MALDI-TOF MS表征(图15)。
实施例7.固相合成、切割和纯化探针PP16-GTC-10C(带刚性连接基的探针)。
将PNA取代浓度为0.15mmol/g的20mg树脂在THF中溶涨三小时，然后用DCM清洗。PNA序列为Re-Lys-ATCAACACTGCATGT-NH-Boc，首先如实施例6所述将胞嘧啶偶合其上，接着如下述偶合刚性连接基。
将Boc-保护的N-羧甲基哌嗪(3.3mg 13.5×10-6mol)溶解于DMF(0.5ml)中，然后加入HBTU(5.1mg，13.5×10-6mol)和DIEA(4.8μl，2.75×10-5mol)。然后将混合物加入氨基末端脱保护的序列。偶联进行30min，之后Kaiser检测法检测无游离氨基。过滤除去未反应单体，并用DMF洗涤树脂两次。使用在DMF中的乙酸酐和colidin(1∶1∶8)对任何保留的氨基进行封端处理两分钟。用DMF洗涤树脂三次，然后和含5％哌啶的DMF一起搅拌四分钟。树脂最后用DCM∶DMF(1∶1)洗涤三次及用DCM洗涤三次。如实施例6所述从刚性连接基中除去Boc，Kaiser检测法检测到仲胺的存在。TO-2-O(R1＝CH2CH2COOH，6.6mg，13.5×10-6mol)溶解于DMF(0.5ml)中并加入HBTU(5.1mg，13.5×10-6mol)和DIEA(4.8μl，2.75×10-5mol)。然后将混合物加入树脂。偶联反应进行45min，树脂变红。如实施例6所述进行封端和洗涤。然后如实施例6所述对探针进行切割和脱保护。
探针(PP16-GTC-Toc)如实施例4所述用反相HPLC纯化，通过MALDI-TOF MS表征。
实施例8.用图3A所示方案通过探针PP10-CTT-TO探测单链DNA。
首先测定探针PP10-CTT-TO的背景发光。然后加入过量不影响发光的非互补单链DNA(5’-TCCTTCATTCGCTTC-3’)，然后加入包含TS(5’-AGCGGTCGACAGAAGAAGAAAA-3’)的单链DNA。这导致发光即刻增强(图8)。样品包含1.4μM的探针，5mM硼酸盐缓冲液(pH8.5)和50mMNaCl。探测温度为50℃。
实施例9.用图6所示方案通过探针PP10-CTT-TO探测单链DNA。
具有序列5’-AGCGGTCGACAGAAGAAGAAAA-3’的单链DNA加入到含探针PP10-CTT-TO和与单链DNA的两个紧密靠近部分互补的寡聚物5’-GTCGACCGCT-3’的样品中。这导致荧光增强45倍(图10)。实验在50℃，5mM硼酸盐缓冲液(pH8.5)，离子强度为500mM的条件下进行。
图11进一步表征该探测的混合物。测量260nm时吸收随温度的变化，表明在约65℃时寡聚物分解，这由第一个转折点反映，PNA类探针在约85℃分解，这由第二个转折点反映。这种不同反映PNA∶NA杂交体比双链NA稳定性较高。
游离探针和杂交探针的荧光都随温度降低。前者可能由于高温下残基折回结合程度减小，而后者由于NA双链体中碱基的热振动增强，引起RG的内部灵活性增加，从而具有较低的荧光。杂交后荧光增强用这些信号的比例表示，最大值在约62℃处。
杂交探针的荧光在约75℃时落入背景水平，该温度低于PNA∶NA双链体的熔化温度，但处于基本上无寡聚物结合的温度。这支持了在杂交状态染料与NA∶NA双链体区结合的假设(实施例6)。
实施例10.蛋白质-RG探针的构建。
探针用限制性酶EcoRI构建，其特异识别双链NA中的序列5’-GAATTC-3’/3’-CTTAAG-5’，和BO。将溶解于DMSO的200nmol BO琥珀酰亚胺酯加到1ml含100nmol EcoRI(来自Life Technology(生命工程公司))的20mM磷酸缓冲液(pH8.0)中。搅拌下逐渐加入BO溶液以避免蛋白质被DMSO变性。将混合物在4℃于暗处搅拌15小时，最后在4℃用10K的微浓缩器从游离染料中分离探针。图16显示了游离EcoRI探针、存在含EcoRI识别位点的双链DNA的探针、和缺乏该位点的双链DNA的荧光光谱，此处DNA聚合物为聚(dAdT)∶聚(dAdT)。可以看到EcoRI探针特异识别含TS的双链DNA。作为参考还显示了存在相同DNA时游离染料的荧光光谱。
实施例11.SRE-RG探针的荧光增强。
  代码   条件   模式   杂交后荧光增加
  NAA类探针
  PP10-CTT-TO   5mM硼酸缓冲液pH8.5，500mM NaCl，50℃   6   45
  PP10-CTT-TO   5mM硼酸缓冲液pH8.5，500mM NaCl，50℃   3A   20
  PP10-CTT-TO   5mM硼酸缓冲液pH8.5，500mM NaCl，50℃   3A   20
  PP10-CTT-BO   10mM硼酸缓冲液pH8.5，25℃   3A   8
  PP10-CTT-BO   10mM硼酸缓冲液pH8.5，45℃   3A   9
  PP5-GCT-TO   10mM硼酸缓冲液pH8.5，20℃   3A   20
  PP11-TT-TO   10mM硼酸缓冲液pH8.5，45℃   3A   10
  PP8-GCT-TO   10mM硼酸缓冲液pH8.5，45℃   3A   35
  PP8-GCT-TO   20mM硼酸缓冲液，500mM NaCl，pH8.5，20℃   3A   30
  PP8-GCT-TO   10mM磷酸缓冲液pH7.5，25℃   3A   27
  蛋白质类探针
  EcoRI   10mM磷酸缓冲液pH7.5，25℃   3D   50
实施例12.量子产率的确定。
游离或杂交探针PP8-GCT-TO相对于荧光素的荧光量子产率。将PP8-GCT-TO溶解于10mM磷酸缓冲液(pH7.5)，探针浓度为0.8μM。在Varian Cary 4上测定吸收度，在spex fluorolog t2上测定荧光。所有测定都用相同的1cm的比色皿进行。在470nm激发样品，记录480-700nm之间的光谱，每nm记录五个数据点。确定相对二价阴离子荧光素的0.1M NaOH溶液(假定量子产率为0.93)的荧光产量(ΦF)。量子产率用以下公式计算：
&Phi; F = &Integral; - &infin; &infin; F s ( &upsi; ) d&upsi; &Integral; - &infin; &infin; F f ( &upsi; ) d&upsi; &CenterDot; 0.93 A f &lambda; ex A s &lambda; ex - - - ( 1 )
其中F(v)为波长v时的荧光发射强度，Aλex为激发波长的吸收。用单链DNA 5’-ATC GAC GAG AGA ATA TCA以1∶1的比率杂交。结果概述如下。
  样品   Φ<sub>F</sub>   Φ<sub>F</sub>(H)/Φ<sub>F</sub>(F)<sup>*</sup>
  在25℃，游离的PP8-GCT-TO   0.0066
  在25℃，PP8-GCT-TO和等量互补单链DNA混合   0.16   24
  上述样品加热至80℃5分钟，然后冷却至25℃   0.18   27
*杂交后荧光量子产率增加。注意量子产率的增加不一对与荧光强度的增加相同，因为游离探针和杂交探针的吸收不同。
实施例13.背景信号的减弱。
探针PP15-GAT-BO的背景荧光信号在加入杯芳烃后减小(图17)，杯芳烃很可能使RG与SRE分离。探针PP15-GAT-BO的浓度为1μM，温度为15℃，使用10mM Tris缓冲液(pH7.5)。
实施例14.NAA-RG与NA-RG探针的比较。
探针PNA-TO(PP8-GCT-TO)和探针NA-TO(PP8-GCT-TO)用相同的序列和可比较的连接基合成。测定了三种温度下游离探针和与含TS的NA杂交探针的荧光(图18)。所有情况中，游离PNA类探针的荧光低于NA类探针的荧光，杂交PNA类探针的荧光高于杂交NA类探针的荧光。
实施例15.目测检测。
直接观察探针和TS之间的杂交。图13显示了两根聚丙烯管用宽通带紫外灯照射，并从侧面照相(用ASA 200胶片，无滤波器)。两根管均含3μ1样品和3.5×10-10mol探针。左边的样品还包含过量5倍的非互补NA，而右边的发光样品包含互补NA。使用与实施例12相同的寡聚物。条件为10mM硼酸盐缓冲液(pH8.5)，不含盐，温度30℃。

Claims (38)

1.靶核酸序列的探针，包括与报告基团共价结合的序列识别单元，当报告基团与核酸结合时，所述报告基团的信号性质显著改变，其中所述探针
i)至少在其最靠近报告基团的部分有使序列识别单元和报告基团之间的任何分子内相互作用被抑制、或使所述分子内相互作用对所说报告基团信号性质具有最小影响的结构，和/或
ii)通过与靶核酸序列结合，产生一种结构，该结构增加由报告基团与核酸结合所导致的信号改变，
所述序列识别单元包含：
(a)核酸，
(b)核酸类似物，其与天然核酸的不同在于，具有修饰或替换的磷酸二酯骨架，或者修饰或替换的糖部分，或者具有与天然核酸不同的立体化学结构，
(c)序列识别肽，
(d)肽和核酸类似物的组合，或
(e)肽和核酸的组合。
2.按照权利要求1的探针，其与靶核酸序列结合后，形成的结构增强由于报告基团与核酸结合而产生的信号变化。
3.按照权利要求1的探针，其中序列识别单元至少在其最靠近报告基团的部分具有与天然核酸不同的结构。
4.按照权利要求1的探针，其中序列识别单元为核酸，其在报告基团附着末端的碱基，为报告基团对其有最低亲和力和/或报告基团与其相互作用最小影响报告基团的信号性质的方式进行。
5.按照权利要求1的探针，其中核酸类似物为电中性或净正电荷，其中每个碱基不超过一个电荷。
6.按照权利要求1的探针，其中核酸类似物为电中性或净正电荷，其中每三个碱基不超过一个电荷。
7.按照权利要求5的探针，其中核酸类似物为肽核酸。
8.按照权利要求6的探针，其中核酸类似物为肽核酸。
9.按照权利要求1的探针，其中可观察的信号性质是发光。
10.按照权利要求1的探针，其中与靶核酸序列结合后报告基团信号强度增加。
11.按照权利要求5的探针，其中报告基团为化合物，其具有以下特征：
a)对单链核酸和/或双链核酸的亲和力为0.1到108M-1之间；
b)水溶液中的发光量子产率低于0.05，
c)与核酸结合时发光量子产率大于0.01，
d)与核酸结合时发光量子产率增加至少5倍，
e)最大摩尔吸收量为至少1000M-1cm-1。
12.按照权利要求11的探针，其中水溶液中的发光量子产率低于0.01，或者与核酸结合时的发光量子产率大于0.1，或与核酸结合时的发光量子产率增加至少50倍，或最大摩尔吸收量为至少10000M-1cm-1。
13.按照权利要求12的探针，其中水溶液中的发光量子产率低于0.001，或与核酸结合时的发光量子产率大于0.25，或与核酸结合时的发光量子产率增加至少500倍，或最大摩尔吸收量为至少50000M-1cm-1。
14.按照权利要求6的探针，其中报告基团为化合物，其具有：
a)对单链核酸和/或双链核酸的亲和力为0.1到108M-1之间；
b)水溶液中的发光量子产率低于0.05，
c)与核酸结合时的发光量子产率大于0.01，
d)与核酸结合时的发光量子产率增加至少5倍，
e)最大摩尔吸收量为至少1000M-1cm-1。
15.按照权利要求14的探针，其中水溶液中的发光量子产率低于0.01，或与核酸结合时的发光量子产率大于0.1，或与核酸结合时的发光量子产率增加至少50倍，或最大摩尔吸收量为至少10000M-1cm-1。
16.按照权利要求15的探针，其中水溶液中的发光量子产率低于0.001，或与核酸结合时的发光量子产率大于0.25，或与核酸结合时的发光量子产率增加至少500倍，或最大摩尔吸收量为至少50000M-1cm-1。
17.按照权利要求9的探针，其中报告基团为包含芳香部分的化合物，其中至少两个芳香部分通过与芳族系统共轭的共价键相连。
18.按照权利要求9的探针，其中报告基团为不对称花青化合物。
19.按照权利要求18的探针，其中不对称花青化合物的未结合形式具有下列化学结构之一：
Figure C971968720004C1
Figure C971968720004C2
其中R1为氢或为至多6个碳原子的与氮原子不共轭的烷基，所述烷基任选用选自羟基、烷氧基、羧基和氨基的极性基团取代，
其中X为O、S、Se、N-R5、或CR6R7，其中R5为氢或至多6个碳原子的烷基，R6和R7独立地为氢或至多6个碳原子的烷基，
其中R2、R3和R4两两相同或三个都相同，为氢、低级烷基、芳基，或者R2和R4或R3和R4成对地与两个环原子结合构成5或6元芳环，所述芳环任选包含0-2个杂原子，
其中n＝0，1或2，
其中Y为HC＝CH，A和B为0或1：当A＝0时B＝1，当A＝1时B＝0，
其中R9和R10独立地为氢，或为至多6个碳原子的与氮原子不共轭的烷基，所述烷基任选用选自羟基、烷氧基、羧基和氨基的极性基团取代。
20.权利要求19的探针，其中的杂原子为O、S或N-R8，其中R8为氢或至多6个碳原子的烷基。
21.按照权利要求5的探针，其中报告基团为带正电的化合物。
22.按照权利要求1-21之一的探针，其中序列识别单元和报告基团由含下述一个或多个基团的烃链连接：
a)刚性基团，
b)杂原子，
c)极性基团，
d)带电基团，和
e)体积大的基团。
23.权利要求22的探针，其中刚性基团为双键或三键。
24.按照权利要求1-16之一的探针，其中序列识别单元和报告基团之间的连接基有至少一个正电荷。
25.按照权利要求1-16之一的探针，其中序列识别单元为核酸类似物或核酸，其碱基超过50％为嘧啶类。
26.按照权利要求1的探针，其中在被报告基团附着的末端的碱基为两个胸腺嘧啶，或为胞嘧啶和胸腺嘧啶。
27.按照权利要求25的探针，其中所有碱基为嘧啶。
28.通过标准的肽合成法将具有下述之一化学结构的化合物与序列识别单元中的氨基连接的方法：
Figure C971968720005C1
Figure C971968720005C2
Figure C971968720005C3
其中R1为氢或为至多6个碳原子的与氮原子不共轭的烷基，所述烷基任选用选自羟基、烷氧基、羧基和氨基的极性基团取代，
其中X为O、S、Se、N-R5、或CR6R7，其中R5为氢或至多6个碳原子的烷基，其中R6和R7独立地为氢或至多6个碳原子的烷基，
其中R2、R3和R4两两相同或三个都相同，为氢、低级烷基、芳基、或者R2和R4或R3和R4成对地与两个环原子结合构成5或6元芳环，所述芳环任选包含0-2个杂原子，
其中n＝0，1或2，
其中Y为HC＝CH，A和B为0或1：当A＝0时B＝1，当A＝1时B＝0，
其中R9和R10，独立地为氢，或为与氮原子不共轭的至多6个碳原子的烷基，所述烷基任选用选自羟基、烷氧基、羧基和氨基的极性基团取代，和
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R9和R10为烃链，任选被极性残基取代、并包含刚性基团、带电荷基团、或体积大的基团，且其中之一还含有被至少一个SP3杂化碳造成与芳族系统隔开的异硫氰酸根、酰亚氨基、磺酰氯基或羰基。
29.权利要求28的方法，其中的杂原子为O、S或N-R8，其中R8为氢或至多6个碳原子的烷基，且任选被极性残基取代、并包含刚性基团、带电荷基团、或体积大的基团，且其中之一还含有被至少一个SP3杂化碳造成与芳族系统隔开的异硫氰酸根、酰亚氨基、磺酰氯基或羰基。
30.检测双链核酸中的靶核酸序列的方法，其在不预先分开链的情况下，用权利要求1-27之一的探针进行检测。
31.检测双链核酸中的靶核酸序列的方法，其在该双链核酸不稳定的条件下，使其中的一条链与权利要求1-27之一的探针杂交。
32.用权利要求5-8之一的探针检测或定量含活性酶的样品中特异核酸的方法。
33.用权利要求5-8之一的探针实时定量测定可能含核酸修饰酶、核酸降解酶和核酸合成酶的样品中特定核酸量的方法。
34.检测单链核酸中的靶核酸序列的方法，其使权利要求1-27之一的探针和一种寡聚体与所述靶核酸序列的紧密靠近部分杂交，以致报告基团与由所述寡聚体形成的双链体区相互作用。
35.用权利要求1-27之一的探针检测或定量核酸的方法，其中所述探针是被固定的探针。
36.按照权利要求1的探针，包含不止一个报告基团，所述报告基团任选彼此相同，其单独的或结合的信号性质被改变。
37.按照权利要求1或权利要求36的探针，包含至少一个与下列一或多种基团连接的报告基团，：
i)核苷酸碱基，
ii)骨架原子，
iii)糖分子和/或包含连接基的原子。
38.权利要求1-27，36和37之一的探针定位染色体中的节段或部分的用途，其通过荧光显微镜检直接观察杂交体来定位。
CNB971968721A 1996-05-31 1997-05-30 核酸分析的探针 Expired - Fee Related CN100398648C (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9602183-7 1996-05-31
SE96021837 1996-05-31
SE9602183A SE506700C2 (sv) 1996-05-31 1996-05-31 Sond och förfaranden för analys av nukleinsyra

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1226928A CN1226928A (zh) 1999-08-25
CN100398648C true CN100398648C (zh) 2008-07-02

Family

ID=20402854

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB971968721A Expired - Fee Related CN100398648C (zh) 1996-05-31 1997-05-30 核酸分析的探针

Country Status (12)

Country Link
US (1) US6329144B1 (zh)
EP (2) EP0918852A1 (zh)
JP (2) JP2000511057A (zh)
CN (1) CN100398648C (zh)
AU (1) AU3112997A (zh)
BR (1) BR9709495A (zh)
CA (1) CA2256545C (zh)
NZ (1) NZ333473A (zh)
PL (1) PL188875B1 (zh)
RU (1) RU2223966C2 (zh)
SE (1) SE506700C2 (zh)
WO (1) WO1997045539A1 (zh)

Families Citing this family (143)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5658751A (en) * 1993-04-13 1997-08-19 Molecular Probes, Inc. Substituted unsymmetrical cyanine dyes with selected permeability
US6485901B1 (en) 1997-10-27 2002-11-26 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to linear beacons
US6080868A (en) 1998-01-23 2000-06-27 The Perkin-Elmer Corporation Nitro-substituted non-fluorescent asymmetric cyanine dye compounds
GB9812768D0 (en) 1998-06-13 1998-08-12 Zeneca Ltd Methods
US6441152B1 (en) 1998-12-08 2002-08-27 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions for the identification of nucleic acids electrostatically bound to matrices
US6403313B1 (en) * 1999-12-21 2002-06-11 Ingeneus Corporation Fluorescent intensity assay for duplex and triplex nucleic acid hybridization solution utilizing fluorescent intercalators
US6858390B2 (en) 1998-12-31 2005-02-22 Ingeneus Corporation Aptamers containing sequences of nucleic acid or nucleic acid analogues bound homologously, or in novel complexes
US6656692B2 (en) 1999-12-21 2003-12-02 Ingeneus Corporation Parallel or antiparallel, homologous or complementary binding of nucleic acids or analogues thereof to form duplex, triplex or quadruplex complexes
US6420115B1 (en) 1999-12-21 2002-07-16 Ingeneus Corporation Cation mediated triplex hybridization assay
US6900300B1 (en) 2000-09-19 2005-05-31 Ingeneus Corporation Quadruplex DNA and duplex probe systems
US6432642B1 (en) 1999-01-15 2002-08-13 Pe Corporation (Ny) Binary probe and clamp composition and methods for a target hybridization detection
SE9902565D0 (sv) * 1999-07-05 1999-07-05 Jonas Karlsson Probe for analysis of nucleic acids
US6472153B1 (en) * 1999-10-26 2002-10-29 Epoch Biosciences, Inc. Hybridization-triggered fluorescent detection of nucleic acids
US6927027B2 (en) 1999-12-21 2005-08-09 Ingeneus Corporation Nucleic acid multiplex formation
US6911536B1 (en) 1999-12-21 2005-06-28 Ingeneus Corporation Triplex and quadruplex catalytic hybridization
US6924108B2 (en) 1999-12-21 2005-08-02 Ingeneus Corporation Nucleic acid binding enhancement by conjugation with nucleotides, nucleosides, bases and/or their analogues
US7052844B2 (en) 1999-12-21 2006-05-30 Ingeneus, Inc. Purification of DS-DNA using heteropolymeric capture probes and a triplex, quadruplex or homologous duplex binding mechanism
US7309569B2 (en) 1999-12-21 2007-12-18 Ingeneus, Inc. Parallel or antiparallel, homologous or complementary binding of nucleic acids or analogues thereof to form duplex, triplex or quadruplex complexes
US7220541B2 (en) 2000-01-24 2007-05-22 Ingeneus, Inc. Homogeneous assay of biopolymer binding by means of multiple measurements under varied conditions
US6613524B1 (en) 2000-01-24 2003-09-02 Ingeneus Corporation Amperometric affinity assay and electrically stimulated complexes of nucleic acids
US6982147B2 (en) 2000-01-24 2006-01-03 Ingeneus Corporation Apparatus for assaying biopolymer binding by means of multiple measurements under varied conditions
US7998673B2 (en) 2000-03-29 2011-08-16 Lgc Limited Hybridisation beacon and method of rapid sequence detection and discrimination
PT1715063E (pt) * 2000-03-29 2011-04-28 Lgc Ltd Farol de hibridização e método para a detecção e discriminação rápida de sequência
US7019129B1 (en) 2000-05-09 2006-03-28 Biosearch Technologies, Inc. Dark quenchers for donor-acceptor energy transfer
US6887664B2 (en) 2000-06-06 2005-05-03 Applera Corporation Asynchronous primed PCR
SE519172C2 (sv) * 2000-06-07 2003-01-21 Lightup Technologies Ab Fastfas syntes av cyaninfärgämnen
EP1349958B1 (en) 2000-09-26 2009-06-03 Boston Probes, Inc. Probes, probe sets, methods and kits pertaining to the detection, identification and/or enumeration of bacteria
EP1748078B1 (en) 2001-03-09 2011-01-19 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions of combination oligomers
JP2004537053A (ja) 2001-07-25 2004-12-09 アプレラ コーポレイション 電気泳動検出システムにおける時間遅延積分
US20030087309A1 (en) * 2001-08-27 2003-05-08 Shiping Chen Desktop drug screening system
WO2003042697A1 (en) * 2001-11-14 2003-05-22 Genospectra, Inc. Biochemical analysis system with combinatorial chemistry applications
EP1448800A4 (en) 2001-11-21 2007-05-16 Applera Corp DIGITAL ASSAY
AU2003280470A1 (en) * 2002-07-01 2004-01-19 Guava Technologies, Inc. Fluorescent dyes, energy transfer couples and methods
EP2161276A3 (en) 2002-09-08 2010-05-26 Applera Corporation Methods, compositions and libraries pertaining PNA dimer and PNA oligomer systhesis
US7927840B2 (en) 2006-09-11 2011-04-19 Gen Probe Incorporated Method for detecting West Nile Virus nucleic acids in the 3′ non-coding region
CA2868618C (en) * 2002-10-16 2017-05-23 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting west nile virus
EP1594984A2 (en) * 2003-02-18 2005-11-16 Applera Corporation Compositions and methods for multiplex analysis of polynucleotides
EP1601955B1 (en) 2003-03-07 2013-01-09 Luxcel Biosciences Limited An oxygen sensitive probe and method for measuring oxygen uptake
US8372648B2 (en) 2003-04-16 2013-02-12 APDN (B.V.I.), Inc. Optical reporter compositions
US8415164B2 (en) 2003-04-16 2013-04-09 Apdn (B.V.I.) Inc. System and method for secure document printing and detection
US8420400B2 (en) 2003-04-16 2013-04-16 APDN (B.V.I.), Inc. System and method for authenticating tablets
US8426216B2 (en) 2003-04-16 2013-04-23 APDN (B.V.I.), Inc. Methods for authenticating articles with optical reporters
US8415165B2 (en) 2003-04-16 2013-04-09 APDN (B.V.I.), Inc. System and method for authenticating sports identification goods
US8124333B2 (en) 2003-04-16 2012-02-28 APDN, Inc. Methods for covalent linking of optical reporters
US7504495B2 (en) 2003-11-20 2009-03-17 Exiqon A/S Quencher compositions comprising anthraquinone moieties
US7776529B2 (en) 2003-12-05 2010-08-17 Life Technologies Corporation Methine-substituted cyanine dye compounds
EP1720944B1 (en) 2003-12-05 2013-07-17 Life Technologies Corporation Cyanine dye compounds
WO2006001835A2 (en) 2003-12-30 2006-01-05 The Regents Of The University Of California Aromatic triamide-lanthanide complexes
US7705150B2 (en) 2004-02-04 2010-04-27 Biosearch Technologies, Inc. Cyanine dyes
EP1716252A1 (en) * 2004-02-19 2006-11-02 University College Cork-National University of Ireland, Cork Detection of biologically active compounds
EP1771563A2 (en) 2004-05-28 2007-04-11 Ambion, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS INVOLVING MicroRNA
US7910753B2 (en) * 2004-09-10 2011-03-22 Anaspec Incorporated Cyanine dyes and their applications as luminescence quenching compounds
ES2534304T3 (es) 2004-11-12 2015-04-21 Asuragen, Inc. Procedimientos y composiciones que implican miARN y moléculas inhibidoras de miARN
DE102004063339A1 (de) * 2004-12-23 2006-07-06 Bayer Technology Services Gmbh Sonde zum Nachweis von Nukleinsäuren
EP2813581B1 (en) 2005-01-06 2018-06-27 Applied Biosystems, LLC Use of polypeptides having nucleic acid binding activity in methods for fast nucleic acid amplification
RU2400538C2 (ru) 2005-03-05 2010-09-27 Сиджен, Инк. Олигонуклеотид с двойственной специфичностью и способы, в которых он используется
WO2006095941A1 (en) 2005-03-05 2006-09-14 Seegene, Inc. Processes using dual specificity oligonucleotide and dual specificity oligonucleotide
JP5306811B2 (ja) 2005-05-11 2013-10-02 ライフ テクノロジーズ コーポレーション ２本鎖ｄｎａへの高い選択性を有する蛍光化学物質及びそれらの使用
AU2006252346B2 (en) 2005-06-02 2012-06-28 Advandx, Inc. Peptide nucleic acid probes for analysis of microorganisms
US20070059713A1 (en) 2005-09-09 2007-03-15 Lee Jun E SSB-DNA polymerase fusion proteins
EP1994182B1 (en) 2006-03-15 2019-05-29 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Degenerate nucleobase analogs
RU2394915C2 (ru) * 2006-03-24 2010-07-20 Александр Борисович Четверин Бесконтактные способы обнаружения молекулярных колоний, наборы реагентов и устройство для их осуществления
US10741034B2 (en) 2006-05-19 2020-08-11 Apdn (B.V.I.) Inc. Security system and method of marking an inventory item and/or person in the vicinity
US9790538B2 (en) 2013-03-07 2017-10-17 Apdn (B.V.I.) Inc. Alkaline activation for immobilization of DNA taggants
US20140106357A1 (en) 2012-10-16 2014-04-17 Applied Dna Sciences, Inc. Security system and method of marking an inventory item and/or person in the vicinity
EP2029781A4 (en) 2006-05-26 2010-06-30 Althea Technologies Inc BIOCHEMICAL ANALYSIS OF PARTITIONED CELLS
AU2007272604B2 (en) 2006-07-10 2013-08-01 The Regents Of The University Of California Luminescent 1-hydroxy-2-pyridinone chelates of lanthanides
CA2660800C (en) 2006-08-15 2016-03-01 The Regents Of The University Of California Luminescent macrocyclic lanthanide complexes
EP2114905B1 (en) 2007-01-25 2015-04-15 Lumiphore, Inc. Multi-color time resolved fluorophores based on macrocyclic lanthanide complexes
US20080274458A1 (en) * 2007-05-01 2008-11-06 Latham Gary J Nucleic acid quantitation methods
WO2009036332A1 (en) 2007-09-14 2009-03-19 Asuragen, Inc. Micrornas differentially expressed in cervical cancer and uses thereof
EP2436780B1 (en) * 2007-10-02 2016-06-08 Thermo Fisher Scientific Inc. Monomethine dyes
US20090131279A1 (en) * 2007-11-15 2009-05-21 Sigma Aldrich Company Nucleic acid fluorescent stains
US20100041045A1 (en) * 2007-11-15 2010-02-18 Sigma-Aldrich Co. Nucleic acid fluorescent stains
WO2009070805A2 (en) * 2007-12-01 2009-06-04 Asuragen, Inc. Mir-124 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
SI2757091T1 (en) 2008-04-01 2018-01-31 Biosearch Technologies, Inc. Stabilized nucleic acid black gas-fluorofor probe
EP2990487A1 (en) 2008-05-08 2016-03-02 Asuragen, INC. Compositions and methods related to mirna modulation of neovascularization or angiogenesis
US8940485B2 (en) 2008-11-12 2015-01-27 Apdn (B.V.I.) Inc. Methods for genotyping mature cotton fibers and textiles
US8669079B2 (en) 2008-11-12 2014-03-11 Cara Therapeutics, Inc. Methods for genetic analysis of textiles made of Gossypium barbadense and Gossypium hirsutum cotton
US7943320B2 (en) * 2008-12-30 2011-05-17 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Unsymmetrical cyanine dyes for high resolution nucleic acid melting analysis
EP2256215A1 (en) 2009-04-30 2010-12-01 Steffen Mergemeier Assay system using a nuclease activity of a nucleic acid polymerase
EP3597657B1 (en) 2009-05-21 2021-09-01 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Universal tags with non-natural nucleobases
CA2762986C (en) 2009-05-22 2018-03-06 Asuragen, Inc. Mirna biomarkers of prostate disease
EP2816038B8 (en) 2009-08-24 2019-12-25 Lumiphore, Inc. Hopo chelators
WO2011025919A1 (en) 2009-08-28 2011-03-03 Asuragen, Inc. Mirna biomarkers of lung disease
WO2011027966A2 (en) 2009-09-03 2011-03-10 Seegene, Inc. Td probe and its uses
CN103282517B (zh) 2010-10-29 2018-11-13 奥斯瑞根公司 用于分析重复序列的mPCR方法
AU2012212105A1 (en) 2011-02-03 2013-09-12 Mirna Therapeutics, Inc. Synthetic mimics of miR-124
CA2840196C (en) 2011-06-27 2022-09-20 Eisai R&D Management Co., Ltd. Microrna biomarkers indicative of alzheimer's disease
WO2013009070A2 (ko) * 2011-07-12 2013-01-17 주식회사 파나진 평행 결합 구조의 이중 혼성화 pna 프로브 시스템
WO2013040251A2 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Asurgen, Inc. Methods and compositions involving mir-135b for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease
CN102408741B (zh) * 2011-09-15 2014-04-23 中山大学 一种染料及其制备方法与在检测特殊dna二级结构中的应用
US9926592B2 (en) * 2011-11-14 2018-03-27 Carnegie Mellon University Gamma-PNA miniprobes for fluorescent labeling
WO2013112458A1 (en) 2012-01-24 2013-08-01 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Novel chrebp isoforms and methods using the same
EP2850086B1 (en) 2012-05-18 2023-07-05 Pacific Biosciences Of California, Inc. Heteroarylcyanine dyes
US9297032B2 (en) 2012-10-10 2016-03-29 Apdn (B.V.I.) Inc. Use of perturbants to facilitate incorporation and recovery of taggants from polymerized coatings
US9266370B2 (en) 2012-10-10 2016-02-23 Apdn (B.V.I) Inc. DNA marking of previously undistinguished items for traceability
WO2014093291A1 (en) 2012-12-10 2014-06-19 Advandx, Inc. Use of probes for mass spectrometric identification of microorganisms or cells and associated conditions of interest
US9963740B2 (en) 2013-03-07 2018-05-08 APDN (B.V.I.), Inc. Method and device for marking articles
US11453652B2 (en) 2013-03-15 2022-09-27 Lumiphore, Inc. Di-macrocycles
EP3567123B1 (en) 2013-05-20 2021-11-10 BioVentures, LLC Gep5 model for multiple myeloma
US9904734B2 (en) 2013-10-07 2018-02-27 Apdn (B.V.I.) Inc. Multimode image and spectral reader
EP3425066A1 (en) 2014-01-05 2019-01-09 Biomirna Holdings Ltd. Lung cancer determinations using mirna
WO2015120382A1 (en) 2014-02-07 2015-08-13 The Johns Hopkins University Predicting response to epigenetic drug therapy
US10745825B2 (en) 2014-03-18 2020-08-18 Apdn (B.V.I.) Inc. Encrypted optical markers for security applications
ES2978925T3 (es) 2014-03-18 2024-09-23 Apdn B V I Inc Marcadores ópticos cifrados para aplicaciones de seguridad
ES2707062T3 (es) 2014-05-09 2019-04-02 Biosearch Tech Inc Extintores cósmicos
CN107109474B (zh) 2014-08-19 2021-03-19 豪夫迈·罗氏有限公司 用于核酸检测的方法和组合物
WO2016094330A2 (en) 2014-12-08 2016-06-16 20/20 Genesystems, Inc Methods and machine learning systems for predicting the liklihood or risk of having cancer
WO2016092045A1 (en) 2014-12-11 2016-06-16 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and kits for predicting medically refractory acute severe colitis
US10760182B2 (en) 2014-12-16 2020-09-01 Apdn (B.V.I.) Inc. Method and device for marking fibrous materials
BR112017022117A2 (pt) 2015-04-15 2018-07-10 Biosearch Technologies, Inc. “sondas duplas supressoras”
CA2983819A1 (en) 2015-04-24 2016-10-27 Atila Biosystems Incorporated Amplification with primers of limited nucleotide composition
EP3292214A1 (en) 2015-05-04 2018-03-14 Academisch Medisch Centrum Method of quantifying mirnas using normalization
US10174363B2 (en) 2015-05-20 2019-01-08 Quantum-Si Incorporated Methods for nucleic acid sequencing
KR20180008779A (ko) * 2015-05-20 2018-01-24 퀀텀-에스아이 인코포레이티드 시간 분해된 발광을 사용하여 핵산의 서열을 결정하는 방법
CA2992616C (en) 2015-07-23 2023-01-03 Asuragen, Inc. Methods, compositions, kits, and uses for analysis of nucleic acids comprising repeating a/t-rich segments
US10519605B2 (en) 2016-04-11 2019-12-31 APDN (B.V.I.), Inc. Method of marking cellulosic products
CA3031994A1 (en) 2016-07-29 2018-02-01 Juno Therapeutics, Inc. Methods for assessing the presence or absence of replication competent virus
WO2018045162A1 (en) 2016-09-01 2018-03-08 Biogen Ma Inc. Biomarkers predictive of primary progressive multiple sclerosis and uses thereof
US10995371B2 (en) 2016-10-13 2021-05-04 Apdn (B.V.I.) Inc. Composition and method of DNA marking elastomeric material
US10920274B2 (en) 2017-02-21 2021-02-16 Apdn (B.V.I.) Inc. Nucleic acid coated submicron particles for authentication
JP2020526194A (ja) 2017-06-29 2020-08-31 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 免疫療法薬と関連する毒性を評価するためのマウスモデル
WO2019027850A1 (en) 2017-07-29 2019-02-07 Juno Therapeutics, Inc. CELL EXPANSION REAGENTS EXPRESSING RECOMBINANT RECEPTORS
MA50057A (fr) 2017-09-01 2020-07-08 Juno Therapeutics Inc Expression génique et évaluation d'un risque de développement d'une toxicité suite à une thérapie cellulaire
MX2020004239A (es) 2017-11-01 2020-09-09 Juno Therapeutics Inc Proceso para producir una composicion de celulas t.
CN111918972A (zh) 2018-01-31 2020-11-10 朱诺治疗学股份有限公司 评估存在或不存在有复制能力的病毒的方法和试剂
EP3877054B1 (en) 2018-11-06 2023-11-01 Juno Therapeutics, Inc. Process for producing genetically engineered t cells
EP3719144A1 (en) 2019-04-05 2020-10-07 Fundación para la Investigación Biomédica del Hospital Universitario de la Paz (FIBHULP) Mir-151a-3p as an universal endogenous control for exosome cargo normalization
CN114302736A (zh) 2019-04-17 2022-04-08 高山免疫科学股份有限公司 变体icos配体(icosl)融合蛋白的方法和用途
SG11202113356XA (en) 2019-06-12 2021-12-30 Juno Therapeutics Inc Combination therapy of a cell-mediated cytotoxic therapy and an inhibitor of a prosurvival bcl2 family protein
US20220267857A1 (en) 2019-07-19 2022-08-25 Fundación Para La Investigación Biomédikca Del Hospital Universitario La Paz (Fibhulp) Method for determining the response to treatment of a patient affected by non-small cell lung carcinoma (nsclc)
JP2022545467A (ja) 2019-08-22 2022-10-27 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｔ細胞療法とｚｅｓｔｅホモログ２エンハンサー（ＥＺＨ２）阻害剤との併用療法および関連方法
WO2021140173A1 (en) 2020-01-10 2021-07-15 Biouniversa S.R.L. Methods and uses for treating fibrotic solid tumors with bags inhibitors
WO2021146349A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Aspen Neuroscience, Inc. Method of differentiating neural cells and related compositions and methods of use
EP4150057A2 (en) 2020-05-13 2023-03-22 Juno Therapeutics, Inc. Process for producing donor-batched cells expressing a recombinant receptor
CN116234558A (zh) 2020-06-26 2023-06-06 朱诺治疗学有限公司 条件性地表达重组受体的工程化t细胞、相关多核苷酸和方法
WO2022099658A1 (zh) * 2020-11-13 2022-05-19 大连理工大学 菁类化合物、含菁类化合物的染料以及菁类化合物的应用
WO2022099659A1 (zh) * 2020-11-13 2022-05-19 大连理工大学 白细胞分类试剂、红细胞分析试剂、试剂盒以及分析方法
WO2023004371A1 (en) 2021-07-21 2023-01-26 Aspen Neuroscience, Inc. Methods of differentiating neural cells and predicting engraftment thereof and related compositions
KR20230055951A (ko) 2021-10-15 2023-04-26 아주대학교산학협력단 miR-625-3p의 건선 중증도 진단용 바이오마커로서의 용도
WO2023201361A1 (en) 2022-04-15 2023-10-19 Aspen Neuroscience, Inc. Methods of classifying the differentiation state of cells and related compositions of differentiated cells
WO2023230581A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Celgene Corporation Methods of manufacturing t cell therapies

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0710668A2 (en) * 1994-07-18 1996-05-08 Becton, Dickinson and Company Covalent attachment of thiazole orange to oligonucleotides for use in nucleic acid detection

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5570834A (en) * 1978-11-21 1980-05-28 Oriental Shashin Kogyo Kk Silver halide photographic emulsion for helium-neon laser light exposure
US4883867A (en) 1985-11-01 1989-11-28 Becton, Dickinson And Company Detection of reticulocytes, RNA or DNA
US5627027A (en) * 1986-04-18 1997-05-06 Carnegie Mellon University Cyanine dyes as labeling reagents for detection of biological and other materials by luminescence methods
US5569587A (en) * 1986-04-18 1996-10-29 Carnegie Mellon University Method for labeling and detecting materials employing luminescent arysulfonate cyanine dyes
US5268486A (en) * 1986-04-18 1993-12-07 Carnegie-Mellon Unversity Method for labeling and detecting materials employing arylsulfonate cyanine dyes
US4937198A (en) * 1989-07-28 1990-06-26 Becton, Dickinson And Company Novel fluorescent dye
DE69132765T2 (de) * 1990-12-24 2002-02-21 Enzo Diagnostics, Inc. Verfahren zum Nachweis eines Zielpolynukleotids in einer Probe unter Verwendung eines Reagenz, das den Hintergrund verringert, und eine dieses Reagenz enthaltende Zusammensetzung und Kit.
DK51092D0 (da) 1991-05-24 1992-04-15 Ole Buchardt Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf
US5321130A (en) 1992-02-10 1994-06-14 Molecular Probes, Inc. Unsymmetrical cyanine dyes with a cationic side chain
JPH05287209A (ja) * 1992-04-09 1993-11-02 Hitachi Chem Co Ltd 蛍光標識用色素、蛍光標識用色素で標識された生物由来物質、及びそれらを含有する試薬
US5410030A (en) 1993-04-05 1995-04-25 Molecular Probes, Inc. Dimers of unsymmetrical cyanine dyes containing pyridinium moieties
US5658751A (en) 1993-04-13 1997-08-19 Molecular Probes, Inc. Substituted unsymmetrical cyanine dyes with selected permeability
US5534416A (en) 1993-04-13 1996-07-09 Molecular Probes, Inc. Fluorescent viability assay using cyclic-substituted unsymmetrical cyanine dyes
US5436134A (en) * 1993-04-13 1995-07-25 Molecular Probes, Inc. Cyclic-substituted unsymmetrical cyanine dyes
WO1995001341A1 (en) * 1993-06-30 1995-01-12 Abbott Laboratories Intercalators having affinity for dna and methods of use
CA2148140C (en) * 1994-04-29 2010-08-10 John W. Sutherland Homogeneous method for assay of double-stranded nucleic acids using fluorescent dyes and kit useful therein
US5453505A (en) * 1994-06-30 1995-09-26 Biometric Imaging, Inc. N-heteroaromatic ion and iminium ion substituted cyanine dyes for use as fluorescence labels
ES2181799T3 (es) * 1994-10-06 2003-03-01 Isis Pharmaceuticals Inc Conjugados de acidos peptido nucleicos.
JP3189000B2 (ja) 1994-12-01 2001-07-16 東ソー株式会社 特定核酸配列の検出方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0710668A2 (en) * 1994-07-18 1996-05-08 Becton, Dickinson and Company Covalent attachment of thiazole orange to oligonucleotides for use in nucleic acid detection

Also Published As

Publication number Publication date
CA2256545C (en) 2006-10-31
AU3112997A (en) 1998-01-05
EP1357185A1 (en) 2003-10-29
BR9709495A (pt) 1999-08-10
RU2223966C2 (ru) 2004-02-20
CN1226928A (zh) 1999-08-25
EP0918852A1 (en) 1999-06-02
WO1997045539A1 (en) 1997-12-04
JP2005047901A (ja) 2005-02-24
SE9602183D0 (sv) 1996-05-31
PL188875B1 (pl) 2005-05-31
JP2000511057A (ja) 2000-08-29
SE506700C2 (sv) 1998-02-02
CA2256545A1 (en) 1997-12-04
SE9602183L (sv) 1997-12-01
NZ333473A (en) 1999-10-28
US6329144B1 (en) 2001-12-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100398648C (zh) 核酸分析的探针
US7667024B2 (en) Oligonucleotides labeled with a plurality of fluorophores
US7081336B2 (en) Dual resonance energy transfer nucleic acid probes
US9261460B2 (en) Real-time nucleic acid detection processes and compositions
WO1999061665A2 (en) Solution hybridization of nucleic acids with antisense probes having modified backbones
AU7288296A (en) Sulfo benz{e}indocyanine fluorescent dyes
JP3495752B2 (ja) 生標的個体の検出方法およびプローブ
Astakhova et al. Perylene attached to 2′-amino-LNA: synthesis, incorporation into oligonucleotides, and remarkable fluorescence properties in vitro and in cell culture
CN101631796B (zh) 具有由单核苷或单核苷酸衍生的结构的化合物、核酸、标记物以及核酸检测方法和试剂盒
ES2306265T3 (es) Sonda para la deteccion de acidos nucleicos.
US20190048401A1 (en) Optimized real-time nucleic acid detection processes
WO2001002558A1 (en) Probe for analysis of nucleic acids
US20120016128A1 (en) Rhodamine lactone phosphoramidites and polymers
AU768137B2 (en) Probe for analysis of nucleic acids
Swenson et al. Forced Intercalation Peptide Nucleic Acid Probes for the Detection of an Adenosine-to-Inosine Modification
CA2451442A1 (en) Fluorescent dyes for probes for analysis of nucleic acids
PL190263B1 (pl) Sondy dla docelowej sekwencji kwasu nukleinowego (TS) i ich zastosowania, sposób standardowej techniki syntezy peptydów, sposoby wykrywania TS w dsNA, sposoby wykrywania lub oznaczania ilościowo danego NA w próbce, sposób oznaczania ilości danego NAw próbce w czasie rzeczywistym, sposoby wykrywania TS w ssNA
US20130040859A1 (en) Spectrally-resolved chemiluminescent probes for sensitive multiplex molecular quantification
Rastede The Design, Synthesis and Characterization of Bright Fluorescent Probes for Biomolecule Detection
US20130130402A1 (en) Fluorescent compounds, compositions, and methods for using the compounds and compositions
JP2004117217A (ja) ｐＨ指示薬、およびそれを用いたｐＨ測定方法。
JPH10337199A (ja) 核酸染色剤、それを用いた二本鎖核酸の検出方法及び標的核酸の検出試薬
JPH11290098A (ja) 核酸染色剤、それを用いた二本鎖核酸の検出方法及び標的核酸の検出試薬

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C53 Correction of patent of invention or patent application
COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: M. KUBISTA TO: FUSIKAPATENGTEWASITESIWEILIGE CO., LTD.

CP03 Change of name, title or address

Address after: Gothenburg

Applicant after: Foss Kappa Ten Te Chwast J Velli G Co.

Address before: Luc, Sweden

Applicant before: M. Kubista

ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: LAITEEPU SCIENCE & TECHNOLOGY Y CO.,LTD.

Free format text: FORMER OWNER: FUSIKAPATENGTEWASITESIWEILIGE CO., LTD.

Effective date: 20021024

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20021024

Address after: Hu Dinge, Sweden

Applicant after: M. Kubista

Address before: Gothenburg

Applicant before: Foss Kappa Ten Te Chwast J Velli G Co.

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20080702