PL190263B1 - Sondy dla docelowej sekwencji kwasu nukleinowego (TS) i ich zastosowania, sposób standardowej techniki syntezy peptydów, sposoby wykrywania TS w dsNA, sposoby wykrywania lub oznaczania ilościowo danego NA w próbce, sposób oznaczania ilości danego NAw próbce w czasie rzeczywistym, sposoby wykrywania TS w ssNA - Google Patents
Sondy dla docelowej sekwencji kwasu nukleinowego (TS) i ich zastosowania, sposób standardowej techniki syntezy peptydów, sposoby wykrywania TS w dsNA, sposoby wykrywania lub oznaczania ilościowo danego NA w próbce, sposób oznaczania ilości danego NAw próbce w czasie rzeczywistym, sposoby wykrywania TS w ssNAInfo
- Publication number
- PL190263B1 PL190263B1 PL97330201A PL33020197A PL190263B1 PL 190263 B1 PL190263 B1 PL 190263B1 PL 97330201 A PL97330201 A PL 97330201A PL 33020197 A PL33020197 A PL 33020197A PL 190263 B1 PL190263 B1 PL 190263B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- probe
- bases
- sre
- groups
- naa
- Prior art date
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 403
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 182
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 173
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 173
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 94
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims abstract description 37
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 37
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000008863 intramolecular interaction Effects 0.000 claims abstract description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 claims description 136
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 claims description 62
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 43
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 36
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical class CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 35
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims description 34
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 32
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 29
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 29
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 28
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 27
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 26
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 20
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- -1 cyanine compound Chemical class 0.000 claims description 19
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 13
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 claims description 13
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims description 12
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 12
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 claims description 12
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 11
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 claims description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 9
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 claims description 7
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 150000004713 phosphodiesters Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000006413 ring segment Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 4
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 claims description 3
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 claims description 3
- YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N sulfuryl dichloride Chemical compound ClS(Cl)(=O)=O YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000001183 hydrocarbyl group Chemical group 0.000 claims 3
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 claims 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims 1
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 10
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 33
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 31
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 26
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 21
- 238000003947 neutron activation analysis Methods 0.000 description 19
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 17
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 17
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 15
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 15
- QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M (4z)-1-(3-methylbutyl)-4-[[1-(3-methylbutyl)quinolin-1-ium-4-yl]methylidene]quinoline;iodide Chemical compound [I-].C12=CC=CC=C2N(CCC(C)C)C=CC1=CC1=CC=[N+](CCC(C)C)C2=CC=CC=C12 QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 11
- 238000013461 design Methods 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 8
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 7
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N pyrene Chemical compound C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical class CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N Quinoline Chemical compound N1=CC=CC2=CC=CC=C21 SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VTJUKNSKBAOEHE-UHFFFAOYSA-N calixarene Chemical compound COC(=O)COC1=C(CC=2C(=C(CC=3C(=C(C4)C=C(C=3)C(C)(C)C)OCC(=O)OC)C=C(C=2)C(C)(C)C)OCC(=O)OC)C=C(C(C)(C)C)C=C1CC1=C(OCC(=O)OC)C4=CC(C(C)(C)C)=C1 VTJUKNSKBAOEHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 4
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N dihydromaleimide Natural products O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 4
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N fluoranthrene Natural products C1=CC(C2=CC=CC=C22)=C3C2=CC=CC3=C1 GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 3
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 3
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 3
- ACOJCCLIDPZYJC-UHFFFAOYSA-M thiazole orange Chemical group CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1.C1=CC=C2C(C=C3N(C4=CC=CC=C4S3)C)=CC=[N+](C)C2=C1 ACOJCCLIDPZYJC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- DXYYSGDWQCSKKO-UHFFFAOYSA-N 2-methylbenzothiazole Chemical compound C1=CC=C2SC(C)=NC2=C1 DXYYSGDWQCSKKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FKNQCJSGGFJEIZ-UHFFFAOYSA-N 4-methylpyridine Chemical compound CC1=CC=NC=C1 FKNQCJSGGFJEIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- XPDWGBQVDMORPB-UHFFFAOYSA-N Fluoroform Chemical compound FC(F)F XPDWGBQVDMORPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N PicoGreen Chemical compound CN(C)CCCN(CCCN(C)C)C1=CC(=CC2=[N+](C3=CC=CC=C3S2)C)C2=CC=CC=C2N1C1=CC=CC=C1 ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- HOPRXXXSABQWAV-UHFFFAOYSA-N anhydrous collidine Natural products CC1=CC=NC(C)=C1C HOPRXXXSABQWAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 2
- 150000003857 carboxamides Chemical class 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- UTBIMNXEDGNJFE-UHFFFAOYSA-N collidine Natural products CC1=CC=C(C)C(C)=N1 UTBIMNXEDGNJFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000001046 green dye Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 2
- 150000002430 hydrocarbons Chemical group 0.000 description 2
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 2
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 description 2
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N phenobarbital Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 2
- GFYHSKONPJXCDE-UHFFFAOYSA-N sym-collidine Natural products CC1=CN=C(C)C(C)=C1 GFYHSKONPJXCDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N triethylammonium acetate Chemical compound CC(O)=O.CCN(CC)CC AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N triflic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C(F)(F)F ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000355 1,3-benzoxazolyl group Chemical group O1C(=NC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GYHJFWZSCIYJKD-UHFFFAOYSA-M 2,3-dimethyl-1,3-benzothiazol-3-ium;4-methylbenzenesulfonate Chemical compound C1=CC=C2[N+](C)=C(C)SC2=C1.CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1 GYHJFWZSCIYJKD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 description 1
- PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 2-(2-azaniumylethylamino)acetate Chemical group NCCNCC(O)=O PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTBVIMLZIRIFFR-UHFFFAOYSA-N 2-methylthio-1,3-benzothiazole Chemical compound C1=CC=C2SC(SC)=NC2=C1 UTBVIMLZIRIFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHXNZYCXMFBMHE-UHFFFAOYSA-N 3-bromopropanoic acid Chemical compound OC(=O)CCBr DHXNZYCXMFBMHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NVRVNSHHLPQGCU-UHFFFAOYSA-N 6-bromohexanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCBr NVRVNSHHLPQGCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- XTHFKEDIFFGKHM-UHFFFAOYSA-N Dimethoxyethane Chemical compound COCCOC XTHFKEDIFFGKHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010024229 Leprosy Diseases 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- JGRRWTHHRARIOU-UHFFFAOYSA-N OC(CCCCCN1C2=CC=CC=C2C=CC1)=O.Br Chemical compound OC(CCCCCN1C2=CC=CC=C2C=CC1)=O.Br JGRRWTHHRARIOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 239000012327 Ruthenium complex Substances 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001252 acrylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 description 1
- 125000004414 alkyl thio group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002152 alkylating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- ZSJHIZJESFFXAU-UHFFFAOYSA-N boric acid;phosphoric acid Chemical class OB(O)O.OP(O)(O)=O ZSJHIZJESFFXAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000004657 carbamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000002837 carbocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004181 carboxyalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000035606 childbirth Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 125000004663 dialkyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 125000000816 ethylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 239000000383 hazardous chemical Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002429 hydrazines Chemical class 0.000 description 1
- 150000002443 hydroxylamines Chemical class 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical group NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 1
- 150000002780 morpholines Chemical class 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 125000001820 oxy group Chemical group [*:1]O[*:2] 0.000 description 1
- 150000002926 oxygen Chemical class 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 150000008298 phosphoramidates Chemical class 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 125000003367 polycyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005581 pyrene group Chemical group 0.000 description 1
- UCFSULAKAYDAAE-UHFFFAOYSA-N quinolin-1-ium;iodide Chemical compound I.N1=CC=CC2=CC=CC=C21 UCFSULAKAYDAAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000012508 resin bead Substances 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003342 selenium Chemical class 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- JRPHGDYSKGJTKZ-UHFFFAOYSA-N selenophosphoric acid Chemical class OP(O)([SeH])=O JRPHGDYSKGJTKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- IIACRCGMVDHOTQ-UHFFFAOYSA-N sulfamic acid Chemical class NS(O)(=O)=O IIACRCGMVDHOTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NVBFHJWHLNUMCV-UHFFFAOYSA-N sulfamide Chemical class NS(N)(=O)=O NVBFHJWHLNUMCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003457 sulfones Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- ZKLKMWKSVPTJMS-UHFFFAOYSA-N tert-butyl 2-(2,4-dioxo-1H-pyrimidin-5-yl)acetate Chemical compound C(=O)(OC(C)(C)C)CC=1C(NC(NC=1)=O)=O ZKLKMWKSVPTJMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000004149 thio group Chemical group *S* 0.000 description 1
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 150000003672 ureas Chemical class 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
1. Sondy dla docelowej sekwencji kwasu nukleinowego (TS) i ich zastosowania, s posób standardowej techniki syntezy peptydów, sposoby wykrywania TS w dsNA, sposoby wykrywania lub oznaczania ilosciowo danego NA w próbce, sposób oznaczania ilosci danego NA w próbce w czasie rzeczywistym, sposoby wykrywania TS w ssNA znacznie zmienione, gdy wiaze sie z kwasem nukleinowym (NA), obejmujacym wymieniona sekwencje docelowa (TS), przy czym sonda przynajmniej w czesci bliskiej RG ma taka strukture, ze kazde wewnatrzczasteczkowe oddzialywanie miedzy SRE i RG, która wplywa na sygnal RG, jest stlumione lub ma taka sekwencje zasad przynajmniej na koncu bliskim RG, która minimalnie wplywa na wlasciwosci sygnalu RG. 2. Sonda wedlug zastrz. 1, znamienna tym, ze podczas wiazania z TS tworzy strukture, która zwieksza zmiane sygnalu powodowana przez wiazanie RG do NA. 3. Sonda wedlug zastrz. 1, znamienna tym, ze SRE, przynajmniej w czesci bliskiej RG, ma strukture odmienna od naturalnego kwasu nukleinowego. 4. Sonda wedlug zastrz. 1, znamienna tyiu, ze SRE jest wybrana sposród synte-- tycznego analogu kwasu deoksyrybonukleinowego (NAA), bialka lub peptydu rozpozna- jacego sekwencje, analogu kwasu deoksyrybonukleinowego polaczonego z bialkiem lub peptydem, i oligonukleotydu polaczonego z bialkiem lub peptydem.2 PL
Description
Przedmiotem wynalazku są sondy dla docelowej sekwencji kwasu nukleinowego (TS) i ich zastosowania, sposób standardowej techniki syntezy peptydów, sposoby wykrywania TS w dsNA, sposoby wykrywania lub oznaczania ilościowo danego NA w próbce, sposób oznaczania ilości danego NA w próbce w czasie rzeczywistym, sposoby wykrywania TS w ssNA.
W ogólności, ujawnienia zawarte w niniejszym opisie patentowym dotyczą sond do hybrydyzacji z kwasami nukleinowymi, które są stosowane w metodach identyfikacji specyficznych genów, odcinków genów, cząsteczek RNA i innych kwasów nukleinowych. Metody te są przede wszystkim stosowane klinicznie, na przykład do badania próbek tkanek, krwi i moczu, w technologii żywności, rolnictwie i badaniach biologicznych.
Tło opisu wynalazku
Sondy do hybrydyzacji do kwasów nukleinowych (NA), za pomocą których określamy zarówno kwasy deoksyrybonukleinowe (DNA) i rybonukleinowe (RNA), są stosowane do wykazywania obecności konkretnych sekwencji docelowych (TS) w złożonych mieszaninach. Tradycyjne metody hybrydyzacji, które po raz pierwszy opisali Gillespie i Spiegelman (J. Mol. Biol. 12, 829, 1956) stosują sondę opartą na oligodeoksyrybonukleotydzie wyposażoną w grupę reporterową(RG), która na ogół jest radioizotopem, a procedura obejmuje zazwyczaj następujące etapy: badany kwas nukleinowy unieruchomią się na papierze, szklanej kuleczce lub powierzchni tworzywa sztucznego, dodaje się nadmiar sondy komplementarnej do sekwencji docelowej, pozwala się sondzie na hybrydyzację, usuwa się niezhybrydyzowaną sondę; i wykrywa pozostałą sondę związaną z unieruchomioną sekwencją docelową.
Niezhybrydyzowaną sondę usuwa się za pomocą starannego płukania. Jest to zazwyczaj najbardziej czasochłonny i istotny etap w procedurze. Ponieważ właściwości niezhybrydyzowanej i zhybrydyzowanej sondy są nierozróżnialne, konieczne jest usuwanie w zasadzie całej
190 263 niezhybrydyzowanej sondy. Ponieważ zhybrydyzowana sonda jest tylko przyłączona przez interakcję z sekwencją docelową, będzie też częściowo usunięta przez płukanie podobnie jak i pewne hybrydy między TS i sondą, jeśli TS nie była dostatecznie unieruchomiona. Co więcej, część sondy może ulec przytwierdzeniu bezpośrednio do powierzchni powodując wystąpienie sygnału tła. W końcu, wymaganie, że niezhybrydyzowaną sonda musi być usunięta, czyni niemożliwą detekcję in vivo i w czasie rzeczywistym.
Opisano kilka metod wykazania hybrydyzacji bez konieczności usuwania niezhybrydyzowanej sondy, tak zwanych homogennych technik sondowania.
Bannwarth i wsp. (Helvetica Chimica Acta 71, 2085, 1.988) opracowali metodę z sondami złożonymi z oligodeoksyrybonukleotydu wyposażonego w kompleks rutenu, w której hybrydyzacja może być wykazana przez pomiar czasu trwania fluorescencji sondy. Choć strategia jest elegancka, jej zastosowanie jest ograniczone do wyspecjalizowanych laboratoriów o zaawansowanej aparaturze i może być tylko używana przez specjalnie wyszkolone osoby. Co więcej, zdolność metody do rozróżniania zhybrydyzowanej i niezhybrydyzowanej sondy nie jest zbyt dobra, szczególnie w próbkach biologicznych, które mogą zawierać składniki wpływające na czas trwania fluorescencji sondy.
Barton J. , (Patent USA nr 5 157 032) opisuje sondę złożoną z łańcucha DNA zmodyfikowanego kompleksem metal-ligand, którego intensywność fluorescencji wzrasta po hybrydyzacji. Te sondy uzyskują tylko niewielką fluorescencję po hybrydyzacji (opisano wydajność kwantową fluorescencji 0,007, Jenkins i Barton, J. Am. Chem. Soc., 114, 8736, 1992), co daje niską czułość. Co więcej, sondy są dwukationowe (ładunek +2), co prowadzi do znacznego niespecyficznego udziału w interakcji i w efekcie do zmniejszonej zdolności do rozróżniania różnych sekwencji.
Yamana i wsp. (Nuci. & Nuci. 11 (204), 383, 1992) opisują sondę złożoną z oiigonukleotydu modyfikowanego pirenem, który w optymalnych warunkach daje 20-krotne zwiększenie fluorescencji po hybrydyzacji. Metoda ta ma kilka wad.
Piren ma złożoną fotofizykę i jego właściwości absorpcyjne i fluorescencyjne zależą od jego najbliższego otoczenia, na przykład ma on dużą skłonność do tworzenia ekscymerów (J. Michl i Erie W. Thulstrup w Spectroscopy with polarized light, wyd. 1, VCH 1986, ISBN 0-89573-346-3). Co więcej, piren emituje światło ultrafioletowe (poniżej 450 nm), które nie jest widoczne gołym okiem. I w końcu, piren jest toksyczny (Yoshikawa i wsp., Vet. Hum. Toxicol. 29, 25, 1987).
Linn i wsp. (EP 0710 668 A2, US 5597696) i Ishiguro i wsp. (Nuci. Acids Res. 24, 4992, 1996) opisują takie sondy złożone z oligonukleotydu i niesymetrycznego barwnika cyjaninowego. Właściwości fluorescencyjne, takie jak polaryzacja fluorescencji, czas trwania fluorescencji i intensywność fluorescencji tych sond ulegają zmianie po hybrydyzacji. Te sondy mają kilka wad i ograniczeń. Pomiar polaryzacji fluorescencji i czasu trwania fluorescencji wymagają złożonej i kosztownej aparatury i muszą być przeprowadzone przez odpowiednio przeszkolone osoby. Zmiana w intensywności fluorescencji jest niewielka (opisano 4-krotną różnicę w warunkach optymalnych), co czyni sondowanie bardzo czułym na tło, szczególnie w warunkach, które wymagają nadmiaru sondy.
Heller i wsp. (EPA 070685) i Cardullo i wsp. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 87908794, 1988) opisują sondę opartą na równoczesnej hybrydyzacji dwóch sond opartych na DNA do blisko położonych sekwencji. Jedna sonda jest zmodyfikowana na 3' końcu łańcucha DNA za pomocą donorowego fluoroforu a druga sonda jest modyfikowana na 5' końcu za pomocą akceptorowego fluoroforu. Gdy są blisko siebie, energia fluorescencji jest przenoszona z fluoroforu donorowego do akceptorowego, co można wykryć. Fluorofory są daleko od siebie w roztworze, ale są umieszczane blisko siebie gdy sondy hybrydyzują do TS, przez wiązanie z 3' końcem jednej sondy koło 5' końca drugiej sondy. Strategia ta ma kilka wad. Jest konieczne rozróżnianie intensywności fluorescencji różnych długości fali, ponieważ hybrydyzacja nie daje znaczącej zmiany w całkowitej fluorescencji a tylko zmianę w długości fali fluorescencji. System ten nie jest odpowiedni do ilościowego określania TS ponieważ wydajność przeniesienia energii zależy od czynników takich jak odległość między fluoroforami i ich względna orientacja (Foerster, Ann. Phys. (Leipzig) 2:55-75, 1948), co może zależeć od sondowanej sekwencji. Strategia ta ma podstawowe problemy z fluorescencją tła, po10
190 263 nieważ światło stosowane do wzbudzania donora także w jakimś stopniu wzbudza akceptor dając niespecyficzny sygnał tła. W końcu wymaganie by dwie sondy wiązały się równocześnie z sekwencją docelową daje wolną kinetykę hybrydyzacji czyniąc technikę mniej odpowiednią dla detekcji w czasie rzeczywistym.
Inną stosowaną technikę opartą na parze oligonukleotydow opisał Morrison (EPA 81300195.2, Patent US 4822733; Analyt. Biochem. 183, 231-244,1989; Biochem. 32, 3095-3104, 1993). Te oligonukleotydy są komplementarne do siebie a także do dwóch nici sekwencji docelowej. Oba mają fluorofor na 3' końcu i wygaszacz na 5' końcu. Gdy łączą się one ze sobą wygaszacze na 5' końcu są w bezpośredniej bliskości fluoroforów na 3' końcu gasząc ich fluorescencję. Jednak jeśli zamiast tego sonda zwiąże się z TS obserwuje się fluorescencję. Istnieją dwa przeciwne problemy projektowania związane z tą strategią: jest korzystne posiadanie wysokiego stężenia sondy aby uzyskać szybką kinetykę hybrydyzacji, ale równocześnie jest pożądane posiadanie niskiego stężenia sondy aby zminimalizować luminescencję tła z wolnych sond, które nie związały się ani z TS, ani z komplementarną sondą. Sondowanie przeprowadza się przez najpierw podgrzanie próbki aby rozdzielić nici obu cząsteczek sondy i dwuniciowego NA, a następnie temperatura jest obniżana aby pozwolić sondzie na hybrydyzację z TS. Niezhybrydyzowana sonda musi jednak napotkać sondę komplementarną, by ulec wygaszeniu, do tego momentu generuje taki sam sygnał jak sondy zhybrydyzowane do TS. Ponieważ sonda jest na ogół stosowana w dużym nadmiarze, może potrwać znaczną ilość czasu zanim tło spadnie do akceptowalnego poziomu, czyniąc tę strategię nieodpowiednią dla detekcji w czasie rzeczywistym. W końcu, sondy te można tylko stosować do dwuniciowych TS.
Tyagi, S. (PCT-Wo 953.339; Naturę Biotech. 14, 303-307, 1989) opisuje „molekularne latarnie”, które są oparte na sondzie z dwoma chromoforami, jeden na każdym końcu. Są one wybrane tak by jeden chromofor gasił fluorescencję drugiego gdy są blisko siebie. Sonda jest zaprojektowana tak, aby w roztworze tworzyła strukturę drugorzędową, która przybliża do siebie dwa końce sondy, co powoduje wygaszanie fluorescencji. To wymaganie strukturalne jest pierwszym ograniczeniem sondy, ponieważ musi ona zawierać sekwencje, które powodują konkretną strukturę drugorzędową. W konsekwencji sondy są także komplementarne do innych sekwencji oprócz tych, które mają zgodnie z planem rozpoznawać, tzn. sonda nigdy nie jest unikalna dla pojedynczego TS. Dalszą wadą jest, to że sondowanie jest ograniczone do wąskiego zakresu temperatur, ponieważ zarówno hybryda między sondą i TS i drugorzędowa struktura w wolnej sondzie muszą być stabilne. Na przykład temperatury, przy których TS nie hybrydyzuje do komplementarnego NA nie mogą być użyte. Co więcej, ruchy termiczne, które już są znaczące przy temperaturze pokojowej, zmniejszają wydajność wygaszania, co zmniejsza specyficzność reakcji sondowania.
Celem niniejszego wynalazku jest obejście ograniczeń omówionych powyżej w odniesieniu do metod tradycyjnych, a także ograniczeń obecnych metod homogennych oraz wyeliminowanie konieczności wstępnej obróbki próbek, takiej jak degradacja do małych fragmentów, wykrywanie sekwencji docelowych przez hybrydyzację z sondą, która generuje sygnał, ale która w stanie niezhybrydyzowanym generuje znacznie mniejszy, najlepiej pomijalny, sygnał, umożliwienie sondowania w homogennym roztworze, szybkie wykazanie hybrydyzacji, bez zwłoki, aby ilość NA można było określać ilościowo w czasie rzeczywistym, wykazywanie obecności konkretnych sekwencji NA w próbkach zawierających aktywne enzymy, takie jak nukleazy i proteazy, wykazywanie obecności konkretnej sekwencji NA in vivo, wykazywanie obecności konkretnej sekwencji NA przy zastosowaniu taniej aparatury, wykazywanie obecności dowolnej sekwencji w sposób wybiórczy, wykonywanie sondowania w dużym zakresie temperatur, eliminowaie zagrożeń związanych z zastosowaniem niebezpiecznych związków chemicznych, oraz umożliwienie wykorzystania sondy przez osoby bez wymogu specjalnego przeszkolenia iub doświadczenia.
Aby móc wykorzystać cały potencjał metod hybrydyzacji w diagnostyce i badaniach jest konieczne posiadanie techniki detekcji hybrydyzacji w roztworze z użyciem sond, które jako takie generują niskie lub pomijalne sygnały, ale które dają obserwowalną reakcję po hybrydyzacji do sekwencji docelowej. Jest też pożądane aby sonda mogła być stosowana in vivo bez wywierania szkodliwego wpływu na tkanki i komórki. Powinna też być możliwa detekcja w czasie rzeczywistym. Oczywiście powinno także być możliwe stosowanie sondy do trądy190 263 cyjnej hybrydyzacji. Jest także pożądane, aby sonda generowała sygnał widoczny gołym okiem. Przedstawione w niniejszym opisie rozwiązania według wynalazku spełniają te wymagania w sposób racjonalny.
Opis figur
Figura 1. Schemat rozwiązania według wynalazku. SRE - element rozpoznający sekwencję, który wiąże się specyficznie z sekwencją docelową (TS); RG - grupa reporterowa, która generuje sygnał przy hybrydyzacji; linker łączący SRE i RG.
Figura 2. Zwrotne wiązanie RG. Jeśli SRE jest zbyt podobny do naturalnych kwasów nukleinowych, RG może złożyć się zwrotnie oddziałując z nią tak, że jest generowany sygnał. Sonda jest „skrócona”.
Figura 3. Planowanie sond i strategia sondowania. A) Sonda oparta na NAA rozpoznająca ssTS. RG może wiązać się albo do dupleksu NAA/NA albo do obszaru ssNA obok TS. B) Sonda oparta na NAA rozpoznająca dsTS albo przez tworzenie tripleksu NAArdsNA z TS albo przez tworzenie tripleksu NAA2:NA przez usuniecie nici. C) Sonda oparta na peptydzie rozpoznająca ssTS. D) Sonda oparta na peptydzie rozpoznająca dsTS.
Figura 4. Porównanie interakcji związku, który ma odpowiednie właściwości do stosowania jako RG w sondzie, z NA i niektórymi NAA. Fluorescencja BO dodanego do jednoniciowych NAA, PNA, metylofosfonianów i fosforotionianów, i ssNA (w postaci DNA). Obserwuje się znacznie niższą fluorescencję dla nienaladowanych NAA, PNA i metylofosfonianów. NAA/NA miały ten sam skład zasad i ich stężenia wynosiły 0,1 mM.
Figura 5. Porównanie luminescencji uzyskanej przez niektóre asymetryczne barwniki cyjaninowe w obecności PNA. Barwnik TO w zasadzie wcale nie wykazuje luminescencji. Barwnik zieleń Pico od Molecular Probes Inc. (wzór strukturalny nie jest dostępny) ma niską iuminescencję, jak i barwnik BO. Barwnik zieleń oiigo, także od Molecular Probes Inc. (wzór strukturalny nie jest dostępny) ma najwyższą fluorescencję. Sekwencją PNA była (H)-TTCTTCTTTT-(NH2), a stężenia barwników wynosiły około 0,1 mM (stężenia zieleni pico i zieleni oligo są tylko przybliżone, ponieważ nie są podawane przez Molecular Probes Inc.).
Figura 6. Alternatywna strategia sondowania ssNA. Sonda NAA-RG i oligonukleotyd są równocześnie hybrydyzowane do blisko położonych części ssTS, i oligonukleotyd tworzy region dupleksowy, do którego może wiązać się RG.
Figura 7. Synteza TO-5-S.
Figura 8. Wzrost intensywności fluorescencji po hybrydyzacji do sondy zgodnie z projektem przedstawionym na Fig. 3A. Hybrydyzacja sondy PP10-CTT-TO do ssDNA. (a) Widma emisji fluorescencji i (b) intensywności fluorescencji wolnej sondy w obecności 5krotnego nadmiaru niekomplementamego ssDNA, i sonda w obecności TS.
Figura 9. Spektra absorpcji dla wolnej i zhybrydyzowanej sondy. Spektra absorpcji obszaru barwnika (400-600 nm) sondy PP10-CTT-TO wolnej i zhybrydyzowanej do TS. Po hybrydyzacji widmo barwnika przesuwa się w kierunku dłuższych fal i ogólna intensywność spada. Te zmiany można wykorzystać do śledzenia hybrydyzacji w homogennym roztworze.
Figura 10. Wzrost fluorescencji sondy po hybrydyzacji do TS zgodnie z projektem przedstawionym na Fig. 6.
Figura 11. Charakterystyka kompleksu zhybrydyzowanego zgodnie z projektem przedstawionym na Fig. 6. Górna ciągła linia (bez symboli); absorpcja w 260 nm jako funkcja temperatury. Linia przerywana z symbolami jest fluorescencją zhybrydyzowanej sondy. Kropkowana linia z symbolami to tło hybrydyzacji wolnej sondy. Ciągła linia bez symboli to stosunek między fluorescencją zhybrydyzowanej sondy i fluorescencją wolnej sondy (pokazane na skali po prawej).
Figura 12. Interakcja asymetrycznych barwników cyjaninowych z różnymi NA. U góry: logarytm stałej powinowactwa TO związanego z różnymi dwu- i jednoniciowymi NA jako funkcja mocy jonowej. Powinowactwo do polipirymidyn jest znacznie niższe niż do wszystkich innych polimerów. Dane pokazują, że powinowactwo barwnika do NA spada logarytmicznie z logarytmem mocy jonowej. U dołu: Tabela podsumowująca właściwości TO związanego z różnymi NA. Można wyobrazić sobie dwa sposoby wiązania: I. charakteryzujący się wysokim powinowactwem, wysoką fluorescencją i absorpcją przy dłuższej ługości fali, jest obserwowany
190 263 dla wszystkich dsNA i polipuryn i Π charakteryzujący się niskim powinowactwem, niską fluorescencją i absorpccąprzy krótszej długości fali obserwowany dla polipirymidyn.
Figura 13. Bezpośrednia obserwacja hybrydyzacji. Fotografia próbek zawierających sondę PP1O-CTT-TO w obecności niekomplementamych NS (z lewej) i TS zawierających NS. Próbki iluminowano od dołu stosując lampę generującą UV i fotografowano stosując zwykły aparat fotograficzny. Nie stosowano filtrów.
Figura 14. Synteza BO-2-O.
Figura 15. A) HPLC i B) widmo masowe sondy PP15-TGT-TO syntetyzowanej na fazie stałej.
Figura 16. Sondowanie zgodnie z projektem przedstawionym na Fig. 3D z użyciem sondy EcoRI. A: fluorescencją wolnej sondy (a), sonda w obecności dsNA zawierającego sekwencję rozpoznawaną przez EcoRI (b), sonda w obecności niekomplementamego dsNA, (c) Stosowane warunki: (a) 0,5 μΜ sonda; (b) 0,5 μΜ sonda i 0,5 μΜ cząsteczki dsDNA; (c) 0,5 μΜ sonda i 0,5 μΜ poli(dAdT):poli(dAdT). B: Fluorescencją tego samego barwnika nie związanego z SRE w obecności tych samych NA. Fluorescencją wolnego BO(a), BO w obecności dsNA (b) i BO w obecności poli (dAdT):poli (dAdT). Warunki: (a) 0,5 μΜ BO, (b) 0,5 μΜ BO i 0,5 μΜ dsDNA, (c) 0,5 μΜ sonda i 0,5 μΜ poli(dAdT):poli(dAdT).
Figura 17. Wpływ czynnika kompleksującego. Fluorescencją wolnej sondy PP15-GATBO w obecności różnych stężeń kaliksarenu. Fluorescencją tła zmniejsza się prawie 6-krotnie przy dodatku niewielkiej ilości kaliksarenu (0,25 g/l).
Figura 18. Porównanie sond opartych na NAA i NA. Fluorescencją wolnej sondy PNATO PP8-GCT-TO i sondy NA-TO PD8-GCT-TO i tych samych sond w obecności NA zawierającego TS w temperaturach 15, 20 i 25°C. Warunki doświadczalne - 20 ιηΜ bufor boranowy w pH 8,5 i 500 mM NaCl.
Figura 19. Wpływ końcowych zasad. Fluorescencją tła sond NAA-RG (u góry) i NARG (u dołu) mających na końcach różne zasady, do których jest przyłączony RG. Dane NAARG są średnimi z pomiarów uzyskanych dla sond opartych na PNA. Sondy w każdej kategorii miały różne sekwencje (z wyjątkiem dwóch ostatnich zasad), ładunek, linkera, RG (TO lub BO), a pomiarów dokonywano w różnych temperaturach, pH i mocy jonowej. Jednak w rozsądnym zakresie parametry te miały niewielki wpływ na sygnał tła w porównaniu z końcowymi zasadami. Sondy oparte na NAA zakończone ..CT-Rg i ..TT-RG miały najniższy sygnał tła. Sondy oparte na NA były identyczne z wyjątkiem dwóch ostatnich zasad (PD11-CXX-TO) i charakteryzowano je w tych samych warunkach (25°C, 10 bufor Tris, pH 7,5, 1 mkl EDTA, 10 my NaCl). Także tu ..CT-RG ma najniższe tło. Dane na dwóch wykresach nie są porównywalne, ze względu na inną skalę i inne stosowane warunki.
Figura 20. Strategia wyboru TS. Zasady na końcu najbliższym do RG w stanie zhybrydyzowanym powinny być komplementarne do tych, dla których RG ma najniższe powinowactwo i/lub z którymi RG uzyskuje najniższy sygnał (a), i powinny być bliskie miejsca (b), lub tworzyć z sondą miejsce (b'), które sięga do Rg w stanie zhybrydyzowanym, dla którego RG ma wysokie powinowactwo i z którym RG może dać intensywny sygnał po związaniu.
Figura 21. Przykłady sond wrażliwych na konkretną mutację. TS różnych długości i z różnym zachodzeniem na siebie mogą być zaprojektowane do wykrywania konkretnej mutacji. Przy wybieraniu TS należy rozważyć struktury sekwencji, z którymi RG może oddziaływać w a) wolnej sondzie, i b) w zhybrydyzowanym kompleksie. W ten sposób może być możliwe planowanie sondy tak, by uzyskać niską luminescencję tła, w połączeniu z największym sygnałem po hybrydyzacji.
Streszczenie niniejszego wynalazku .
Przedmiotem wynalazku jest sonda dla docelowej sekwencji kwasu nukleinowego (TS) zawierająca element rozpoznający sekwencję (SRE) kowalencyjnie połączony z grupą (grupami) reporterową. (reporterowymi) (RG), której właściwości sygnałowe są znacznie zmienione, gdy wiąże się z kwasem nukleinowym (NA), obejmującym wymienioną sekwencję docelową (TS), przy czym sonda przynajmniej w części bliskiej RG ma taką strukturę, że każde wewnątrzcząsteczkowe oddziaływanie między SRE i RG, która wpływa na sygnał RG, jest stłumione lub ma taką sekwencję zasad przynajmniej na końcu bliskim RG, która minimalnie wpływa na właściwości sygnału RG. Korzystnie sonda według wynalazku podczas wiązania
190 263 z TS tworzy strukturę, która zwiększa zmianę sygnału powodowaną przez wiązanie RG do NA. Również korzystnie SRE w sondzie według wynalazku, przynajmniej w części bliskiej RG, ma strukturę odmienną od naturalnego kwasu nukleinowego. W korzystnym wykonaniu SRE jest wybrana spośród syntetycznego analogu kwasu deoksyrybonukleinowego (NAA), białka lub peptydu rozpoznającego sekwencję, analogu kwasu deoksyrybonukleinowego połączonego z białkiem lub peptydem, i oligonukleotydu połączonego z białkiem lub peptydem. Korzystniej, w sondzie według wynalazku SRE jest NAA, który różni się od naturalnego kwasu nukleinowego NA tym, że ma zmieniony lub zastąpiony szkielet fosfodiestrowy, lub połączone z nim reszty cukrowe zmodyfikowane lub zastąpione, lub ma stereochemię odmienną od naturalnych NA. Najkorzystniej NAA ma obojętny ładunek wypadkowy, lub dodatni ładunek wypadkowy, który wynosi nie więcej niż jeden ładunek na zasadę, korzystnie nie więcej niż jeden ładunek na trzy zasady. Również w najkorzystniejszej postaci wykonania NAA jest peptydowym kwasem nukleinowym (PNA). Ponadto najkorzystniej RG stanowi związek z ładunkiem dodatnim.
Również w najkorzystniejszej postaci wykonania ponad 50% zasad NAA stanowią zasady pirymidynowe. W szczególności, zasada pirymidynowa jest przynajmniej w co drugiej pozycji. Również korzystnie zasady, na końcu których przyczepiony jest RG, są dwiema tyminami lub cytozyną i tyminą. Najkorzystniej, wszystkie zasady są zasadami pirymidynowymi.
W korzystnej postaci wykonania w sondzie według wynalazku SRE jest kwasem nukleinowym (NA) i jego zasada lub zasady, na końcu których przyczepiony jest RG, są takie, dla których RG ma najniższe powinowactwo i/lub takie, z którymi RG oddziałuje w sposób, który najmniej wpływa na jego właściwości sygnałowe.
W szczególności przedmiotem wynalazku jest sonda dla docelowej sekwencji kwasu nukleinowego (TS) zawierająca element rozpoznający sekwencję (SRE) kowalencyjnie połączony z grupą (grupami) reporterową (reporterowymi) (RG), której właściwości sygnałowe są znacznie zmienione, gdy wiąże się z kwasem nukleinowym (NA), obejmującym wymienioną sekwencję docelową (TS), przy czym sonda przynajmniej w części bliskiej RG ma taką strukturę, że każde wewnątrzcząsteczkowe oddziaływanie między SRE i RG, która wpływa na sygnał RG, jest stłumione lub ma taką sekwencję mieszanych zasad pirymidynowych przynajmniej na końcu bliskim RG, która minimalnie wpływa na właściwości sygnału RG.
Ponadto korzystnie w sondzie według wynalazku widoczną właściwością jest luminescencja. Również korzystnie intensywność sygnału RG wzrasta po wiązaniu TS. Korzystniej grupa reporterową jest związkiem zawierającym reszty aromatyczne, z których przynajmniej dwie są połączone wiązaniem kowalencyjnym, które jest sprzężone z układem aromatycznym.
Ponadto korzystnie grupa reporterową w sondzie według wynalazku jest związkiem, który wykazuje:
a) powinowactwo do ssNA i/lub dsNA w zakresie między 0,1 i 108M’’ (-l<łogK<8),
b) wydajność kwantową luminescencji w roztworze wodnym wynoszącą mniej niż 0,05, korzystnie mniej niż 0,01, i bardziej korzystnie mniej niż 0,001,
c) wydajność kwantową luminescencji po związaniu NA większą od 0,01, korzystnie większą od 0,1, i bardziej korzystnie większą od 0,25,
d) przynajmniej 5-krotne, korzystnie przynajmniej 50-krotne, i bardziej korzystnie przynajmniej 500-krotne zwiększenie wydajności kwantowej luminescencji po związaniu NA,
e) maksymalną molamą absorpcyjność co najmniej 1000 korzystnie co najmniej 10000 NPcm1 i bardziej korzystnie co najmniej 50000 M^cm'1.
Również korzystnie grupa reporterową w sondzie według wynalazku jest asymetrycznym związkiem cyjaninowym.
W korzystnej postaci wykonania asymetryczny związek cyjaninowy ma w swojej niezwiązanej formie jedną z następujących struktur chemicznych:
190 263
Ν—R2 \
R1 gdzie R1 oznacza wodór lub niesprzężoną z azotem grupę alkilową zawierającą co najwyżej 6 atomów węgla, która może być podstawiona polarnymi resztami wybranymi spośród grupy hydroksylowej, grup alkoksylowych, grupy karboksylowej i grup aminowych, X oznacza O, S, Se, NR5, gdzie R5 oznacza wodór lub grupę alkilową zawierającą co najwyżej 6 atomów węgla, lub CR6R7, gdzie R6 i r7 niezależnie oznaczają wodór lub grupę alkilową zawierającą co najwyżej 6 atomów węgla,
R2, R3 i R4, z których dwa lub trzy mogą być takie same, oznaczają wodór, małe grupy alkilowe, arylowe, lub parami, r2 i r4 lub R i R4 i w kombinacji z dwoma z atomów pierścienia, z którymi są związane, tworzą 5- lub 6-członowy pierścień aromatyczny, który może zawierać 0-2 heteroatomów takich jak O, S lub NR5, gdzie R5 ma znaczenie jak określone powyżej, n = 0, 1 lub 2,
Y oznaczaHC=CH, i obydwaA i B oznaczają 0 bib 1 ; uod wa.rdnkiern, kie jeśli A=R wówczas a=0, i vice versa,
R9 i Rw niezależnie oznaczają wodór lub niesprzężone z azotem grupy alkilowe, zawierające najwyżej 6 atomów węgla, które mogą być podstawione polarnymi resztami takimi jak grupy hydroksylowe, grupy alkoksylowe, grupy karboksylowe i grupy aminowe.
W następnej korzystnej postaci wykonania SRE i RG w sondzie według wynalazku są połączone za pomocą łańcucha węglowodorowego zawierającego jedną lub więcej z następujących grup:
a) sztywne grupy, takie jak z wiązaniami podwójnymi lub potrójnymi,
b) heteroatomy,
c) grupy polarne,
d) grupy naładowane lub mniwt λ rlirTrni nKlAtf\CP1 j W vujywuvi.
Korzystnie połączenie między SRE i RG ma przynajmniej jeden dodatni ładunek.
W najkorzystniejszej postaci wykonania SRE w sondzie według wynalazku jest NAA lub NA i ponad 50% jego zasad stanowią zasady pirymidynowe. Jeszcze korzystniej zasada pirymidynowa jest przynajmniej w co drugiej pozycji w SRE. Korzystnie w sondzie według wynalazku zasady, na końcu których przyczepiony jest RG, są dwiema tyminami lub cytozyną i tyminą. Również korzystnie wszystkie zasady są zasadami pirymidynowymi.
190 263
Również korzystnie sonda według wynalazku zawiera więcej niż jeden RG, które mogą być identyczne i których własności sygnałowe, pojedynczo lub w kombinacji, są zmienione.
Ponadto korzysntie sonda według wynalazku zawiera przynajmniej jeden RG, połączony z jednym lub więcej z poniższych: i) zasady nukleotydowe, ii) atomy szkieletu, iii) atomy cukru, i/lub atomy, z których składa się linker pomiędzy SRE i TS.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób standardowej techniki syntezy peptydów, w której przyłącza się związek o jednej z poniższych struktur chemicznych:
w których R 1 oznacza wodór lub niesprzężoną z azotem grupę alkilową zawierającą co najwyżej 6 atomów węgla, która może być podstawiona polarnymi resztami wybranymi spośród grup hydroksylowych, alkoksylowych, karboksylowych i aminowych,
X oznacza O, S, Se, NR5, gdzie R5 oznacza wodór lub grupę alkilową zawierającą co najwyżej 6 atomów węgla, lub CR6R7, gdzie R6 i R7, niezależnie oznaczają wodór lub grupę alkilową zawierającą co najwyżej 6 atomów węgla, r2, R3 i r4, z których dwa lub trzy mogą być takie same, oznaczają wodór, małe grupy alkilowe, reszty arylowe, lub parami, R2 i Rrnub R3 i R4 i w kombinacji z dwoma z atomów pierścienia, z którymi są związane, tworzą 5- lub 6-członowy pierścień aromatyczny, który może zawierać 0-2 heteroatomy takie jak O, S i NR5 ,gdzie Rs ma rnaczenie jiks określoncs powyżej, n = 0, 1 lub 2,
Y oznacza HC=CH, a obydwa A i B oznaczają 0 lub 1; pod warunkiem, że jeśli A=1 wówczas B=0, i vice versa,
R9 i R10 niezależnie oznaczają wodór lub niesprzężone z azotem grupy alkilowe zawierające co najwyżej 6 atomów węgla, które mogą być podstawione polarnymi resztami wybranymi spośród grup hydroksylowych, alkoksylowych, karboksylowych i aminowych.
i R1, R2, R3, R , R5, r6, R , R , r9 i r' oznaczają łańcuch węglowodorowy, który może być podstawiony resztami polarnymi i zawiera grupy sztywne, grupy naładowane lub grupy o dużej objętości, i jeden z nich obejmuje grupę izotiocyjaninową, grupę imidylową, chlorku sulfonylu lub karbonylową, która jest oddzielona od układu aromatycznego przynajmniej przez jeden węgiel o hybrydyzacji sp3, do grupy aminowej w SRE.
190 263
Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wykrywania sekwencji docelowej (TS) w dsNA, w którym TS wykrywa się z użyciem sondy według wynalazku bez uprzedniego rozdzielania nici dsNA.
Następnie przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania sekwencji docelowej w dsNA, w którym prowadzi się hybrydyzację sondy według wynalazku do jednej z nici dsNA w warunkach, w których dsNA jest niestabilny.
Przedmiotem według wynalazku jest również sposób wykrywania lub oznaczania ilościowo danego NA w próbce, która zawiera aktywne enzymy, w którym oznaczenie prowadzi się z użyciem sondy według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania ilości danego NA w czasie rzeczywistym, w próbce, która może zawierać enzymy modyfikujące NA, degradujące NA i syntetyzujące NA, w którym oznaczenie prowadzi się z użyciem sondy według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wykrywania TS w ssNA, w którym prowadzi się hybrydyzację sondy według wynalazku i oligomeru do blisko położonych części TS, tak że RG oddziałuje z regionem dupleksu tworzonego przez oligomer.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania lub oznaczania ilościowego NA w próbce, którym stosuje się sondę według wynalazku która jest unieruchomiona.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie sondy według wynalazku do zlokalizowania odcinka w chromosomie lub części chromosomu przez bezpośrednią obserwację hybrydy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Właściwości sondy według wynalazku umożliwiają jej zastosowanie do sondowania in vivo, zarówno w hodowanych komórkach jak i w całych organizmach, gdzie ma przewagę nad tradycyjnymi sondami opartymi na NA będąc oporną na trawienie przez enzymy. Ponadto może być ona wykorzystywana również do określenia, na przykład, ilości danego produktu PCR w złożonej mieszaninie, ilości danego RNA, np. w ekstraktach komórkowych lub względnego stężenia dwóch genów. To ostatnie z wyżej opisanych rozwiązań może być, na przykład, wykorzystane do śledzenia progresji nowotworów.
Fakt, że sonda według wynalazku generuje sygnał natychmiast po hybrydyzacji i może być stosowana do określenia ilości danego NA w czasie rzeczywistym umożliwia, na przykład, śledzenie reakcji PCR, transkrypcji in vitro itp. w czasie rzeczywistym. Rozwiązania według wynalazku umożliwiają również śledzenie zmian danego NA w komórkach w czasie rzeczywistym, na przykład śledzenie replikacji chromosomu lub plazmidu, lub produkcji danego RNA.
Rozwiązania według wynalazku mogą też być stosowane do wykrywania mutacji, przez skonstruowanie sond według wynalazku w taki sposób aby hybryWyzowały bardziej wydajnie do w pełni komplementarnej sekwencji niż do sekwencji różniących się jedną lub kilkoma zasadami.
Ponadto rozwiązania według wynalazku umożliwiają lokalizację poszczególnych sekwencji w chromosomach metodą „hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH). Sondy według wynalazku wykazują zaletę w stosunku do tradycyjnych sond FISH przez swoje zwiększenie fluorescencji po hybrydyzacji.
Aby uzyskać dostateczną intensywność sygnału może być konieczne zhybrydyzowanie kilku sond do sekwencji docelowej i/lub wyposażenie ich w znaczną ilość RG.
Rozwiązania według wynalazku mogą być na przykład stosowane do:
- identyfikacji czynników zakaźnych (wirusów, bakterii, pasożytów itp.) u pacjentów przez wykrywanie sekwencji specyficznych dla obcych organizmów, sprawdzenia czy dane osoby mają predyspozycję, lub mają zwiększone ryzyko, zapadnięcia na daną chorobę przez badanie ich materiału genetycznego,
- do diagnostyki prenatalnej, aby znaleźć wady genetyczne u zarodków i płodów i przewidywać komplikacje na przykład w związku z porodem,
- identyfikacji osoby na przykład w badaniach ojcostwa, kryminalistyce itp.,
- badania wyników w eksperymentach z technologii genu, takich jak klonowanie, transfekcje, „nokauty genów i tym podobnych.
190 263
Szczegółowy opis wynalazku
Rozwiązania według wynalazku umożliwiają w ogólności wykrywanie i ilościowe oznaczanie kwasów nukleinowych (NA) zawierających konkretną sekwencję docelową (TS). W przeciwieństwie do metod tradycyjnych, rozwiązania według wynalazku mogą być stosowane do homogennego sondowania tzn. obecność TS może być wykazana bez usuwania niezhybrydyzowanej sondy. W porównaniu z istniejącymi metodami sondowania homogennego rozwiązania według wynalazku mają przynajmniej jedną z następujących zalet: wyższą czułość, większą dokładność, i szybszą detekcję.
Niniejszy wynalazek dotyczy sondy złożonej z elementu rozpoznającego sekwencję (SRE) i grupy reporterowej (RG), które są połączone (Figura 1).
Uprzednie sondy oparte na koncepcji SRE-RG są obarczone problemami z wysokim sygnałem tła. Gdy RG jest fluoroforem, wolna sonda ma znaczną luminescencję tła i wzrost intensywności fluorescencji po hybrydyzacji do TS jest niewielki (mniej niż czterokrotny, EP 0710668 A2, Ishiguro i wsp., Nuci. Acids Res. 24, 4992, 1996). Duży sygnał tła jest przede wszystkim wynikiem zwijania się RG na SRE i interakcji między nimi (Figura 2). Powód, dla którego sondy ze stanu techniki są obciążone tym problemem, wynika z posiadania SRE opartego na NA, którego struktura sekwencji nie została zoptymalizowana aby zminimalizować sygnał z RG. Ponieważ RG jest cząsteczką, która ma powinowactwo do NA (musi je mieć, bo inaczej nie wiązałaby się z TS po hybrydyzacji) będzie mieć dużą tendencję do zwijania się i interakcji z SRE w każdej sondzie opartej na NA o ile nie wprowadzi się odpowiednich zabezpieczeń. To jest szczególnie istotny problem w sondach, w których RG jest kationem, jak we wszystkich dotychczas stosowanych tego typu sondach (EPO 710668; US 5157032; ishiguro i wsp., Nuci. Acids Res. 24, 4992, 1996), ponieważ RG jest przyciągany przez NA elektrostatycznie.
Powyższe problemy są wspólne dla wszystkich sond NA-RG niezależnie od ich właściwości sygnałowych. Może to być interakcja z promieniowaniem elektromagnetycznym, mierzona przez zmiany w absorpcji lub luminescencji (fluorescencji, fosforescencji), w stanie stacjonarnym lub rozdzielonym w czasie, lub zmiana w odpowiedzi na NMR, w potencjale redoks, przewodności, reaktywności itp. We wszystkich przypadkach sondy oparte na NA z niezoptymalizowanymi sekwencjami będą obarczone wiązaniem RG i będą wykazywać niepożądany sygnał tła.
W niniejszym opisie zostały opisane sondy SRE-RG, w których problem zwijania RG do SRE z jednoczesnym zwiększeniem sygnału tła jest zminimalizowany. Ponadto opisany został sposób w jaki sekwencja sondy i strategia sondowania mogą być zoptymalizowane aby poprawić zmianę w obserwowalnej właściwości sondy. Ostatecznie opisana została jedna z form sond SRE-RG, która także wykazuje silniejszy sygnał po związaniu TS niż odpowiadające sondy NA-RG.
Element rozpoznający sekwencję.
Sonda według wynalazku charakteryzuje się tym, że element SRE ma strukturę (albo chemiczną albo sekwencję albo obie), która minimalizuje interakcję z RG lub oddziałuje z RG w taki sposób, że występują minimalne zmiany w jej właściwościach sygnałowych. SRE jest albo NA, z konkretną zasadą lub zasadami na końcu, do których jest przyłączony RG, lub SRE jest chemicznie i/lub strukturalnie odmienny od NA. Może on być analogiem kwasu nukleinowego (NAA) (niniejszym odpowiadający analogowi oligonukleotydu), który jest odmienny od naturalnych NA, ale rozpoznaje je przez specyficzne parowanie między zasadami nukleotydowymi. SRE może też być peptydem, który wiąże się specyficznie do NA (Figura 3) i może być kombinacją peptydu i NAA, a w odpowiednim projekcie, może być kombinacją peptydu i NA. Może on też być organiczną syntetyczną cząsteczką, która wiąże się do sekwencji NA specyficznie.
W korzystnej postaci wynalazku SRE jest NAA. Jako NAA określamy liniowy polimer złożony z jednostek zawierających zasady nukleotydowe, ale różniący się od naturalnych NA przez modyfikacje lub zastąpienie szkieletu fosfodiestrowego, lub modyfikacje lub zastąpienie reszt cukrowych, lub odmienną stereochemią ale oddziaływujący specyficznie z NA przez tworzenie par zasad. NAA musi być dostatecznie odmienny od NA aby oddziaływać zasadniczo odmiennie z RG. Tak więc nie oczekuje się by pochodne NA (tzn. NA z jednym lub wię18
190 263 cej atomami wodoru zastąpionymi przez inne grupy) takie jak te, które mogą być zsyntetyzowane przez obecnie dostępne na rynku syntetyzery oligonukleotydów były dostatecznie odmienne.
Tak więc gdy cały SRE jest złożony z cegiełek NAA oczekuje się minimalnego wiązania zwrotnego. Jednak mieszany polimer NA/NAA zaprojektowany tak, by RG nie mógł się wygiąć aby wejść w interakcję z NA też będzie skuteczny. Na przykład elementy NAA mogą być strategicznie umieszczone, aby przeszkadzać wygięciu RG w mieszanym polimerze, który zawiera głównie elementy NA. W istocie jeden dobrze wybrany blok NAA może być wystarczający aby zapobiec wyginaniu RG jeśli będzie umieszczony na końcu kopolimeru NAA/NA. Poniżej, jako sondy oparte na NAA określamy także sondy z SRE opartym na mieszanych polimerach NAA-NA, które mają przynajmniej jeden element NAA, a RG jest połączony z elementem NAA.
Nie wszystkie elementy NAA w SRE muszą być identyczne. SRE może być też mieszanym polimerem NAA, NAA i NA i także pochodnych NAA (NAA z zastąpionym jednym lub kilkoma atomami wodoru).
Dostępnych jest wiele NAA, które mogą być stosowane, a nowe są szybko opracowywane ze względu na ich potencjalne zastosowania w niespokrewnionej dziedzinie terapii antysensownej i antygenowej (Nielsen, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24, 167, 1995; De Mesmaker i wsp., Current Opinion in Structural Biology 5, 343, 1995). Przykładami NAA są takie, które mają zmodyfikowane wiązania fosfodiestrowe (fosforotioniany, metylofosfoniany, boranofosforany, fosforoamidany, fosforoseleniany, fosforotriestry, itp.) lub takie, które mają nienaturalne reszty cukrowe (homo-DNA, o karbocyklicznym układzie pierścieniowym, bicyklo-DNA itp.), analogi fosfodiestrów (alkany, etery, tioetery, aminy, ketony, formacetale, tioformacetale, amidy, karbaminiany, moczniki, hydroksyloaminy, sulfamiany, sulfamidy, amidy glicynylowe, sulfony, itp.), takie, które mają całkowicie zastąpiony szkielet (bicykliczne analogi ryboacetalu, pochodne morfolinowe, peptydowe kwasy nukleinowe (PNA)), takie, które mająoligonukleotydy połączone 2',5' i takie, które mająa-nukleotydowe anomery.
Wspólne dla NAA jest to, że są one chemicznie, a więc także strukturalnie i elektrostatycznie (przynajmniej w rozkładzie ładunku) odmienne od NA, i mogą więc inaczej oddziaływać ze związkami interesującymi do stosowania jako RG. Jest to pokazane przykładowo na Figurze 4 ze związkiem BO. BO w zasadzie nie wykazuje sam luminescencji i staje się jasno luminescencyjny po związaniu z NA. Aby związek ten był użyteczny jako RG w sondzie SRE-RG nie powinien oddziaływać z SRE w sposób generujący luminescencję. Jak widać na Figurze 4 BO ma znacznie niższą luminescencję w obecności nienaładowanych NAA, PNA i metylofosfonianów. W obecności fosforotionianów ma mniej więcej taką samą luminescencję jak z ssNA. To ilustruje, że zastąpienie NA przez NAA w sondzie może zmniejszyć sygnał z Rg. Ale także ilustruje to, że dowolny NAA nie musi być odpowiedni. Dobór najlepszego NAA będzie zależeć od tego, jaka jest RG. Na przykład, jeśli RG jest kationem takim jak BO, oczekuje się, że najlepiej będą działać nienaładowane i kationowe NAA. Na ogół, ponieważ RG nie może mieć zbyt niskiego powinowactwa do NA (musi się wiązać po hybrydyzacji) zawsze można znaleźć NAA, dla którego RG ma niższe powinowactwo. Jeśli ten NAA jest stosowany jako SRE w sondzie, sonda będzie generować niższy sygnał tła niż odpowiednia sonda NA-RG.
Małe anionowe cząsteczki na ogół nie wiążą NA ze względu na odpychanie elektrostatyczne, podczas gdy dodatnio naładowane cząsteczki będą miały wysokie powinowactwo do NA. Tak więc większość cząsteczek interesujących jako RG jest kationowych, czasem obojętnych, i rzadko anionowych. NAA, które nie są naładowane, takie jak PNA, metylofosfoniany, pochodne morfolinowe, i niektóre analogi fosfodiestrowe są więc szczególnie interesujące do stosowania jako SRE w rozwiązaniach weług wynalazku, ponieważ nie przyciągają kationowych RG elektrostatycznie, i powinny wykazywać mniejszy stopień zwijania niż SRE oparte na NA. Interesujące są także NAA, które mają pewną ilość dodatnich ładunków, takich jak obojętne NAA, do których wprowadzono dodatnie ładunki, na przykład przez modyfikację niektórych reszt, lub przez dodanie dodatnio naładowanych podstawień. Interesujące są też kopolimery nienaładowanych i kationowych NAA. Oczywiście, dodatnie ładunki zmniejszą
190 263 specyficzność sondy, ze względu na niespecyficzne interakcje z NA. Tak więc ilość dodatnich ładunków w NAA nie powinna być zbyt wysoka.
Jednym z najlepiej scharakteryzowanych NAA jest PNA oparte na jednostkach N-(2-aminoetylo)glicynowych. Jest to pNa, który mamy na myśli wymieniając konkretny PNA. Jego kompleks z kwasami nukleinowymi jest bardzo odmienny od dsNA (Eriksson i Nielsen, Naturę Struct. Biol., 3, 410, 1996) podobnie jak dupleks PNA (H. Rasmussen i wsp., Naturę Struct. Biol. 4, 98-101, 1997). dsPNA tworzy zarówno prawo, jak i lewoskrętne helisy, podczas gdy PNA:DNA i dsDNA tworzą tylko prawoskrętne, dsPNA ma 18 par zasad na skręt, PNA:DNA 13, a dsDNA 10, tak więc skręcenie zasad w ds PNA wynosi 19,8°, w PNArDNA 28° i 34° w dsDNA. Tak więc oczekuje się, że związek, który oddziałuje w szczególny sposób z ssNA będzie oddziaływał całkiem odmiennie z ssPNA, i podobnie, związek, który oddziałuje w szczególny sposób z dsNA prawdopodobnie będzie inaczej reagował z hybrydą PNA:NA. Tak więc oczekuje się, że związek wybrany ze względu na wysokie powinowactwo do NA będzie miał niższe powinowactwo do PNA i także do większości innych NAA (Figura 4). Jeśli taki związek jest stosowany jako RG w sondzie, powinien wykazywać mniej wiązania zwrotnego, tak więc niższy sygnał tła, jeśli SRE sondy jest NAA zamiast NA.
NAA mają też inne zalety w porównaniu z NA, gdy są stosowane jako SRE w sondach. Ponieważ NAA są nienaturalne, są one oporne na enzymy, i sondy oparte na NAA mogą być stosowane w ekstraktach komórkowych i innych próbkach wykazujących aktywność enzymatyczną. Sondy oparte na NAA mogą także tworzyć bardziej stabilne hybrydy z TS niż sondy oparte na NA, co pozwala na sondowanie w wyższych temperaturach.
Stosując sondy oparte na NAA jest też możliwe uzyskanie wyższego sygnału po hybrydyzacji niż z sondami opartymi na NA. Po hybrydyzacji z ssTS, RG może związać się albo z obszarem ssNA obok TS albo z dwuniciowym obszarem wytworzonym między SRE i TS (Figura 3A). Jeśli SRE jest NAA, można udostępnić dsNA dla RG za pomocą podwójnej hybrydyzacji (Figura 6) . Tak więc z sondą opartą na NAA RG może zawsze wiązać się do tego samego typu struktury NA jak przy sondach opartych na NA. Jednak gdy stosuje się sondy oparte na NAA, RG może też się wiązać do hybrydy NAA/NA, która może mieć inną strukturę, w której RG daje intensywniejszy sygnał. Stwierdziliśmy, że ma to miejsce z PNA (Figura 18). Powód tego większego sygnału nie jest jasny, ale może być spowodowany przez to, że nienaładowany PNA tworzy bardziej sztywny dupleks z NA niż dsNA, co bardziej skutecznie ogranicza wewnętrzne ruchy w związanym RG i zwiększa jego sygnał fluorescencji. Jeśli ta hipoteza jest prawdziwa, można oczekiwać podobnego efektu dla wielu innych NAA.
W sondzie według wynalazku SRE może być białkiem lub peptydem. Są one również chemicznie bardzo odmienne od kwasów nukleinowych i mogą wiązać się z sekwencją NA specyficznie. Dziś znanych jest tylko kilka białek wiążących się specyficznie z sekwencjami kwasów nukleinowych, ale są opracowywane metody, aby projektować peptydy, które specyficznie rozpoznają TS (Choo i wsp., Naturę, 372, 642, 1994). Rg mogą łatwo być przyczepione do białek i peptydów (Przykład 10).
W innym wykonaniu w sondzie według wynalazku SRE jest NAA połączonym z peptydem, a RG jest połączona albo z peptydem albo z NAA. Z takim konstruktem można uzyskać zalety obu składników: zdolność do rozpoznawania dowolnej sekwencji przez NAA i minimalną interakcję RG z peptydem. Kombinacje peptydów i PNA są szczególnie interesujące, ponieważ mogą one być syntetyzowane za pomocą tej samej chemii w fazie stałej i mogą być łatwo sporządzone kopolimery w zasadzie każdego rodzaju. Na przykład za pomocą naładowanych aminokwasów można wprowadzić ładunki poprawiające rozpuszczalność i/lub do odpychania naładowanych RG (Przykład 2). .
W innym wykonaniu niniejszego wynalazku SRE jest konjugatem peptyd-NA z RG połączonym z peptydem. pepiyu musi oyć zaplanowany auy zahamować interakcję między Rg i na. Pojedynczy duży lub odpowiednio naładowany aminokwas (np. z takim samym ładunkiem jak RG) może być wystarczający, choć na ogół wymaganych będzie więcej aminokwasów.
Jeszcze w innym wykonaniu SRE jest kwasem nukleinowym, którego zasada lub zasady, na końcu których jest przyczepiony RG, są takie, do których RG ma najmniejsze powinowactwo i/lub oddziałuje w sposób, który minimalnie wpływa na jego właściwości sygnałowe.
190 263 (Grupa reporterowa
RG jest cząsteczką, która dostarcza łatwo wykrywalnego sygnału, gdy, połączona z SRE, wiąże się z TS. Ten sygnał powinien być znacząco większy niż dowolny sygnał od RG połączonej z SRE w nieobecności Ts. Ponieważ liczba strukturalnie różnych NAA jest bardzo duża, jest duża szansa znalezienia takiego, który nie oddziałuje, lub oddziałuje w sposób, który nie daje tej samej zmiany w obserwowalnej właściwości rG jak naturalne NA. W efekcie wszystkie związki, których obserwowalne właściwości są zmienione po wiązaniu do NA, mogą być stosowane jako RG w połączeniu z odpowiednim SRE w sondzie według niniejszego wynalazku. Wynalazek jest zilustrowany przez RG, których właściwości spektroskopowe są zmienione po wiązaniu do NA, co jest mierzone jako zmiana w całkowitej intensywności fluorescencji. W przykładach sygnał fluorescencji wzrasta po związaniu sondy. Nie jest to, oczywiście, ograniczenie niniejszego wynalazku. Sondy z RG, których zdolność sygnałowa maleje po wiązaniu TS także mogą być stosowane.
Związki do stosowania jako RG powinny mieć powinowactwo do NA, które jest wystarczające, aby wiązały się w stanie zhybrydyzowanym, ale nie za duże, ponieważ może to doprowadzić do niespecyficznej interakcji sondy z NA. Powinowactwo większości ligandów do NA zależy od składu jonowego i temperatury roztworu (Record i wsp., J. Mol. Biol. 107, 145, 1976) i może być modulowane, często w zakresie kilku rzędów wielkości (Figura 12). Aby być odpowiednim jako RG w rozwiązaniach według wynalazku związek powinien mieć powinowactwo do NA, które jest w zakresie między 0,1 i 108M’' (-1<logK<8) w 100 mM mocy jonowej w temperaturze pokojowej.
Ponieważ luminescencję można wykrywać z bardzo wysoka czułością, związki, które uzyskują wzrost fluorescencji po związaniu do NA są odpowiednie jako RG. Ich wydajność kwantowa luminescencji powinna zwiększyć się przynajmniej 10 razy po wiązaniu NA, korzystnie przynajmniej 50 razy i bardziej korzystnie przynajmniej 500 razy. Znanych jest wiele takich związków. Jednym ze związków z największym wzrostem jest oranż tiazolowy (ponad 5000 razy, Rye i wsp., Nuci. Acids Res. 11, 2803, 1992).
Związki powinny same w roztworze, tzn. w nieobecności NA, mieć bardzo niską luminescencję, ponieważ daje to wzrost sygnału tła. Kwantowa wydajność luminescencji wolnego związku powinna wynosić poniżej 0,05, korzystnie poniżej 0,01, i najkorzystnie poniżej 0,001.
Związki powinny absorbować światło wydajnie w obszarze UV/widzialne. Ich absorpcyjność molama w maksimum absorpcji powinna wynosić co najmniej 1000 M^cm4, korzystnie co najmniej 10000 M4cm4 i korzystniej co najmniej 50000 M4cm4.
Powyższe właściwości na ogół obserwuje się u związków mających pierścienie cykliczne lub policykliczne, z których przynajmniej dwa, a na ogół nie więcej niż 5, są aromatyczne i mogą być połączone. Pierścienie mogą być karbocykliczne lub heterocykliczne, zwykle z 1-2 atomami azotu. Inne powszechnie występujące heteroatomy w tych układach to tlen i siarka. Pierścienie mogą być podstawione między innymi grupami alkilowymi, zwykle z 1-4 atomami węgla, grupami oksy, takimi jak hydroksy, alkoksy i karboksyestry, zwykle z 1-4 atomami węgla, grupami aminowymi takimi jak mono- i dipodstawione grupy aminowe, zwykle monoi dialkiloamino, zwykle z 0-6 atomami węgla, tiogrupami, zwykle alkiltio z 1-4 atomami węgla, grupami cyjanowymi, nie-okso-grupami karbonylowymi, takimi jak grupy karboksylowe i ich pochodne, zwykle karboksyamidowe i karboksyalkilowe, zwykle z 1-7 atomami węgla, okso-karbonylowymi i acylowymi, zwykle z 1-4 atomami węgla, chlorowcami, zwykle z liczbą atomową 9-35 itp.
Bardziej interesujące są takie związki, które mają dwa układy aromatyczne połączone wiązaniem, zawierające na przykład grupy etylenowe, grupy fosforanowe, aminy, amidy, karbonyle i karboksyestry, to znaczy skoniugowane z układami aromatycznymi, a więc obdarzone pewną sztywnością. Te związki w stanie wolnym w roztworze na ogół mają niską luminescencję ze względu na rotację wokół tego wiązania, co prowadzi do nie-promieniującej deaktywacji ze stanu wzbudzonego. Uzyskują one wzmożoną fluorescencję, gdy są związane z kwasami nukleinowymi, na ogół przez interkalację lub wiązanie w małej bruździe, przez utrzymywanie ich w konformacji płaszczyzny w miejscu wiązania bez możliwości rotacji wokół skoniugowanego wiązania. Rotacja jest także ograniczona w lepkich roztworach, co
190 263 umożliwia zbadanie czy związek ma odpowiednie właściwości (Carlsson i wsp., J. Phys. Chem., 98, 10313, 1994) .
Jeszcze bardziej interesujące są asymetryczne barwniki cyjaninowe (F.M. bammer, w beterocyclic compounds, tom 18 „Cyanine dyes and related compounds” 1964, Wiley & Sons) takie jak opisane w opisach patentowych USA nr nr 4883867, 5312921, 53231130, 5401847, 5410030, 5436134, 5486616) i szczególnie te o strukturach pokazanych poniżej:
gdzie R1 oznacza wodór lub nie sprzęgniętą z azotem grupę alkilową zawierającą co najwyżej 6 atomów węgla, które mogą być podstawione polarnymi resztami takimi jak grupy hydroksylowe, grupy alkoksy, grupy karboksylowe i grupy aminowe. X oznacza O, S (lub Se), N-R5, gdzie r5 oznacza wodór lub małą grupę alkilową, lub CR6r7, gdzie r6 i r7 oznaczają wodór lub grupy alkilowe. Pierwszy układ pierścieniowy w tym przypadku stanowi benzoksazol, 0enaztiaaol, Oenaimidazol i indolina, odpowiednio. Drugim aromatycznym układem pierścieniowym może być pojedynczy lub podwójny pierścień aromatyczny, zazwyczaj chinolina lub pirydyna. Grupy boczne R2, R3 i r4 które mogą być takie same, oznaczają wodór, małe grupy alkilowe, arylowe, lub pary R2 i Rś lub r1 r4 i w kombinacji z dwoma z atomów pierścienia tworzą 5- lub 6-całonzwy pierścień aromatyczny który może zawierać 0-2 heteroatomów takich jak O, S i N-R8, gdzie R8 oznacza grupę alkilową. W wiązaniu metalowym, które łączy dwa układy aromatyczne n stanowi 0, 1 lub 2. Wpływa to na odległość i stopień koniugacji między układami pierścieni, a zatem i na długości fali absorpcji i emisji (Griffith w „Colom' and constitution of organie molecules”, Academic Press, 1976). Y oznacza bC=Cb i jego pozycja jest określona przez indeksy A i B, które stanowią 0 lub 1, jeśli A=0 wówczas a=1, i vice versa. Przy A=0 i B=1 mamy:
190 263
gdzie Ri, r2 i n mają znaczenia jak powyżej a R9 i Rw oznaczają nieskoniugowane grupy alkilowe przyłączone do azotu, które mogą być podstawione polarnymi resztami takimi jak grupy hydroksylowe, grupy alkoksylowe, grupy karboksylowe i grupy aminowe.
W niniejszym wynalazku mogą być także stosowane homo- i heterodimery barwników.
Te związki mogą być zsyntetyzowane za pomocą znanych metod (Sprague, US 2269234, 1942; Booker i wsp., Houbenweyl metoden der organiscnen chemie, tom V/qd, 1972; Lee i wsp., Cytometry 7, 508, 1986; Lee i Mize, EP 0410806, 1989). Znaczny wzrost ich luminescencji po związaniu kwasu nukleinowego jest dobrze znany (Lee i Chen, EP 0226272) i jest wykorzystywany do detekcji retikulocytów (Lee i Chen, patent USA nr 4883867), pasożytów w krwi (Lee i Mize, patent USA nr 4937198) , do zabarwiania kwasów nukleinowych w czasie elektroforezy (Quesada i in., Biotechniąues 10, 616, 1991; Mathies i Huang, Naturę 359, 167, 1992) i bardzo czułego wykrywanie kwasów nukleinowych w elektoporezie kapilarnej (Schwartz i Uhlfelder, Anal. Chem. 64, 1737, 1992). Podstawione polikationowymi łańcuchami (Glazer i Benson, patent USA nr 5312923; Yue i wsp., patent uSa nr 53231130) i jako homo- i heterodimery (Yue i Haugland, patent USA nr 5410030) związki te należą do najbardziej powszechnie stosowanych do barwienia kwasów nukleinowych.
Szczególnie interesujące pod kątem rozwiązań według wynalazku są nowe barwniki asymetryczne, które zostały poniżej opisane (Przykład 5) i mają pojedynczą grupę kwasu karboksylowego, która nie należy do układu skoniugowanego, i może być aktywowana przez związki sprzęgające znane w dziedzinie syntezy peptydów w fazie stałej. Takie barwniki mogą być połączone z lub włączone do peptydów i NAA opartych na peptydach takich jak PNA, za pomocą metod znanych w dziedzinie syntezy peptydów w fazie stałej jak opisano, na przykład, w Novabiochem 97/98 Catalogue and Peptide synthesis handbook.
Barwniki stosowane do zilustrowania niniejszego wynalazku są określane jako TO i BO, i mają wzory chemiczne:
TO
BO
190 263
Były one syntetyzowane z różnymi łańcuchami bocznymi (Przykład 1), aby pozwolić na przyczepienie przez syntezę chemiczną w fazie ciekłej (Przykład 3) albo stałej (Przykład 5) do różnych SRE.
Zauważamy, że ich tlenowe analogi (np. te same związki ale z tlenem na miejscu siarki) i najbardziej prawdopodobnie analogi selenowe mają bardzo podobne właściwości.
Powinowactwo i właściwości luminescencji asymetrycznych barwników cyjaninowych zależy od sekwencji zasad NA, z którym oddziałują (Figura 12). Wiążą się z bardzo wysokim powinowactwem z dsDNA, najbardziej prawdopodobnie przez interkalację (Jacobsen i wsp., Nucleic Acids Res. 23, 753, 1995; Hansen i wsp., Nuci. Acids Res., 24, 859, 1996). Wiążą się nieco słabiej (<10 razy) do jednoniciowych polipuryn, i znacznie słabiej (około 100-krotnie) do jednoniciowych polipirymidyn. Także właściwości fluorescencyjne barwników zależą od sekwencji zasad. Fluorescencja jest około 10 razy bardziej intensywna gdy są związane z dsDNA i polipurynami niż, gdy są związane z polipirymidynami. Występują też różnice we właściwościach absorpcji związanego barwnika. Jest jasne, że właściwości asymetrycznych barwników cyjaninowych związanych z NA zależą bardzo znacznie od zasady lub zasad, z którymi oddziałują.
Cząsteczki przyłączone do dsNA i dlatego też najprawdopodobniej do ssNA i NAA oddziałują głównie z 1-3 najbardziej na zewnątrz położonymi zasadami (Ciepek i wsp., J. Biomol. Struct. Dyn. 5, 361, 1987). Tak więc możliwe jest zminimalizowanie sygnału tła sond opartych na NA i NAA przez wybranie zasad najbliżej końca, do którego jest przyłączony RG. Zasasadami tymi powinny być te, dla których RG ma najmniejsze powinowactwo i/lub z którymi RG oddziałuje w sposób mający minimalny wpływ na jego właściwości sygnałowe.
Dla asymetrycznych barwników cyjaninowych uzyskiwana jest bardzo niska luminesccncja tła, gdy końcowymi zasadami SRE opartego na NA lub NAA są ..CT-RG lub TT-RG (Figura 19).
Sytuacja jest całkiem różna dla innych RG. Na przykład wiążący się w małej bruździe 4',6-diamidyno-2-fenyloindol (DAP1) ma znaczną luminescencję, gdy jest związany z obszarem przynajmniej trzech kolejnych par zasad A:T, ale znacznie niższą luminescencję w każdych innych sekwencjach (Jansen i wsp., J. Amer. Chem. Soc., 115, 10527, 1993). Sondy oparte na DAP1 jako SRE powinny być więc zaplanowane tak, aby nie miały kolejnych trzech par A:T dostępnych dla związanego barwnika.
Koniugacja SRE i RG
SRE i RG, aby mogły być połączone, muszą mieć odpowiednie reaktywne grupy. Możliwych jest wiele kombinacji. Tiole, takie jak cysteina, mogą być połączone z innymi tiolami i z grupami alkilującymi, takimi jak jodoacetamid, różne maleimidy, pochodne kwasu akrylowego itp. Grupy aminowe, takie jak końcowe grupy aminowe i w resztach aminokwasów zasadowych w peptydach i w PNA można poddać reakcji z izotiocyjanianami, imidoestrami i takimi sukcynoimidoestrami, ftallmidoestrami, sulfohalogenkamki, glioksalami, aldehydami i ketonami. Kwasy karboksylowe, takie jak końcowe grupy karboksylowe w peptydach i resztach kwaśnych aminokwasów, mogą być poddane reakcji z aminami, pochodnymi hydrazyny itp. Te reakcje sprzęgania są dobrze znane w dziedzinie, i są opisane na przykład w Novabiochem 97/98 Catalogue & Peptide synthesis handbook i w Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (wyd. 6, Molecular Probes, Inc., red. Richard Haugland).
Przy konstrukcji pochodnych barwnika jest ważne, by nie zmienić układu skoniugowanego, ponieważ może to zniszczyć jego właściwości spektroskopowe. To oznacza na ogół, że grupa reagująca powinna być oddzielona od układu aromatycznego przez przynajmniej jedno niesprzężone pojedyncze wiązanie. Dla powyższych związków cyjaninowych grupa reaktywna R może być umieszczona gdziekolwiek, o ile jest oddzielona od układu aromatycznego przez przynajmniej jeden węgiel o hybrydyzacji spJ Jest oczywiście także ważne, by pochodna RG nie miała grup bocznych ani innych podstawników, które interferują w reakcji sprzęgania.
Koniugacja SRE i RG jest zilustrowana przez dwa zupełnie odmienne podejścia; jedno jest oparte na chemii w roztworze, a drugie jest oparte na chemii w fazie stałej (Przykład 1).
Przykładem koniugacji w roztworze wodnym RG i SRE jest zastosowanie sukcynoimidyloestrów asymetrycznych barwników cyjaninowych i SRE z grupami aminowymi. W przy24
190 263 kładzie 4 sukcynoimidyloester TO (zsyntetyzowany w Przykładzie 3) jest związany z PNA, a w Przykładzie 10 sukcynoimidyloester bO jest przyłączony do białka. Podejście polegające na koniugacji w roztworze jest bardzo ogólne, i może być wykorzystane do przyłączenia zasadniczo każdego RG do dowolnego SRE przez stosowanie odpowiednich pochodnych.
Przykładem koniugacji w fazie stałej RG do SRE jest przyłączenie nowych pochodnych kwasów karboksylowych asymetrycznych barwników cyjaninowych, które opracowaliśmy (Przykład 5) do SRE z grupami aminowymi. W Przykładzie 6 pochodna kwasu karboksylowego TO jest przyłączona do immobilizowanego SRE typu PNA, a w przykładzie 7 inna pochodna kwasu karboksylowego TO jest przyłączona do immobilizowanego koniugatu SRElinker. Podejście polegające na koniugacji w fazie stałej jest szczególnie interesujące dla SRE typu peptydów i PNA, ponieważ barwniki mogą być przyłączone stosując tą samą procedurę jak dla reszt aminokwasowych i zasad PNA, i można zsyntetyzować całkowite sondy stosując handlowe syntetyzery peptydów·1.
Linker
Główną funkcją linkera jest utrzymywanie jednostek razem w sposób, który nie przeszkadza interakcji między RG i TS przy hybrydyzacji. Linker może być nieskomplikowany taki jak pojedyncze wiązanie chemiczne, ale może być też złożony i zawierać na przykład grupy funkcyjne. Może być też tak zaprojektowany, aby utrudniać interakcję między SRE i RG. Nasze wyniki oparte na modelowaniu, wykazują, że można to uzyskać przez stosowanie krótkich i/lub sztywnych linkerów i linkerów zawierających grupy o dużej objętości. Jeśli RG jest naładowany, podobne ładunki mogą być wprowadzone do linkera, aby hamować wiązanie zwotne.
Można skonstruować wiele linkerów przez połączenie SRE z odpowiednimi pochodnymi RG (Przykład 1). Bardziej złożone mogą być skonstruowane przez przyłączenie dodatkowych jednostek albo do SRE albo do RG przed ich połączeniem (Przykład 7).
Jest możliwe zmienianie powinowactwa sondy do NA przez zaprojektowanie linkera. Ujemne ładunki w linkerze zmniejszą powinowactwo do Na, podczas gdy dodatnie ładunki dadzą bardziej stabilne hybrydy. Te ostatnie są szczególnie interesujące, jeśli sondowanie ma być przeprowadzane w wyższej temperaturze. Do linkera można także wprowadzić grupy polarne, aby zwiększyć rozpuszczalność sondy. Jest też możliwa konstrukcja linkerów z kilkoma grupami funkcyjnymi, do których mogą być przyłączone RG. Taki linker może być rozgałęziony.
Linkery peptydowe są szczególnie interesujące w połączeniu z RG opartymi na asymetrycznych barwnikach cyjaninowych, ponieważ mają one bardzo niską luminescencję gdy są połączone z łańcuchami peptydowymi (Figura 16). Ponieważ PNA są syntetyzowane metodami chemii peptydów, mogą być łatwo przedłużane o aminokwasy na obu końcach. W istocie wiele PNA, które stosowaliśmy, ma jedną lub dwie lizyny przyłączone do przeciwnego końca RG, aby zwiększyć rozpuszczalność sondy (Przykład 2). Aminokwasy mogą być także wprowadzane między jednostki PN. Mogą być skonstruowane linkery peptydowe w zasadzie dowolnego rodzaju. Sztywne linkery mogą być zrobione w postaci α-helis, mogą być również wprowadzane ładunki, a także grupy funkcyjne. Oczywiście, inne grupy z bocznymi łańcuchami kwasów karboksylowymi mogą być też wprowadzane do linkerów za pomocą syntezy peptydów w fazie stałej (Przykład 7).
Linkery peptydowe mogą być także użyte do przyłączenia RG do SRE opartych na NA. Linker peptydowy, jeśli jest odpowiednio zaprojektowany, może przeszkadzać RG w interakcji z zasadami NA.
Strategie i projekty sondowania ssNA można sondować stosując sondę z SRE, który wiąże ssTS (Figura 3A i C). SRE jest na ogół NAA (Przykład 2), ale może być też peptydem, koniugatem peptyd-NAA, mieszanym polimerem nA-NAA lub koniugatem NA-peptyd. Wielkość TS może być różna, w zależności od systemu, który ma być sondowany. Na przykład przy określaniu ilościowym danego NA w próbce nie zawierającej - lub zawierającej mało - innych NA (np. takiej jak produkt reakcji PGR) sonda może być krótka - zaledwie 5-6 zasad, o ile tworzy stabilne hybrydy i wykazuje wystarczającą specyficzność sekwencji. Z drugiej strony, przy sondowaniu
190 263 na obecność konkretnego NA w próbce zawierającej nadmiar innych NA, takich jak obcy NA w stosunku do genomowego dNa, TS musi być dłuższe. Sondy rozpoznające 15-40 zasad będą działały w większości przypadków i długość 15-25 zasad prawdopodobnie jest wystarczająca dla większości ludzkich próbek.
Przy sondowaniu na obecność długiego fragmentu NA, takiego jak genom bakterii lub wirusa, lub na obecność plazmidu, konkretnej wstawki itp., sonda może być zaprojektowana w stosunku do wielu segmentów, które mogą być unikalne dla tego NA. Na przykład fragment NA o długości 500 zasad ma 500-20+1 =481 segmentów o długości 20 zasad, wszystkie unikalne dla tego NA. Z punktu widzenia specyficzności, sonda może być tak zaplanowana, aby rozpoznawać dowolny z tych segmentów. Przy stosowaniu sond opartych na NAA lub nA należy wybrać TS, który na końcu najbliższym RG w stanie zhybrydyzowanym ma zasadę lub zasady komplementarne do tych, do których RS ma najmniejsze powinowactwo i/lub w których obecność RG uzyskuje najniższy sygnał. Dla RG opartych na asymetrycznych barwnikach cyjaninowych takich jak TO i BO, TS powinien się kończyć ..AA lub ..Ga. Jest też zaletą, jeśli TS jest bliska miejsca, lub z sondą tworzy miejsce, które jest w pobliżu RG w stanie zhybryWyzowanymr dla którego RG ma wysokie powinowactwo, i gdy jest do niego związany uzyskuje intensywny sygnał (Figura 20). Podobna strategia może być użyta do optymalizacji odpowiedzi sygnału sondy, która jest wrażliwa na konkretną mutację (Figura 21).
dsNA można sondować w warunkach takich, jak na przykład wysoka temperatura i niska moc jonowa, gdy nici są rozdzielone, stosując sondę z SRE, który tworzy bardziej stabilne hybrydy z NA niż komplementarny NA. Takimi SRE jest na przykład wiele nienaładowanych i kationowych NAA.
Natywny dsNA może być sondowany za pomocą sondy z NAA, który tworzy specyficzne w stosunku do sekwencji tripleksy lub specyficzne w stosunku do sekwencji pętle D jak SRE, lub białko lub peptyd, który wiąże dsNA jako SRE (Przykład 10) lub koniugat białko/peptyd-NAA/NA.
ssNA może być sondowany także przez równoczesną hybrydyzację sondy według wynalazku (opartej na NAA, peptydzie/białku, koniugacie peptyd/NAA lub koniugacie peptydowym) i oligonukleoteWur które jest komplementarny do blisko położonych obszarów TS, tak że oligonukleotyd tworzy dupleks, do którego może wiązać się RG (Przykład 9).
dsDNA może być także sondowany z użyciem dówch komplementarnych sond, które rozpoznają dwie nici TS. To podejście przeciwdziała renaturacji i może generować wyższy sygnał.
Sondowanie można też przeprowadzać z sondą unieruchomioną na stałym nośniku, korzystnie za pomocą wiązania do SRE na przeciwnym końcu RG. Takie podejście można by łatwo zautomatyzować, i unieruchomione sondy mogą nawet być ponownie użyte.
Sondowanie może być też przeprowadzane z unieruchomionym NA próbki, jak w wielu konwencjonalnych podejściach. Sonda według wynalazku ma tę zaletę, że etap płukania w celu usunięcia niezhybrydyzowanej sondy jest mniej istotny.
Sondy mogą być konstruowane z dwoma RG, które mogą być różne, i których kombinowane obserwowalne właściwości zmieniają się po hybrydyzacji. Sondy mogą być zaprojektowane jako sondy oparte na NA z dwoma pirenami, które opisał Yamana (Nuci Acids. Res. 11 (2-44, 3 83, 1992) lub fluoro forem i wygrea/ziczzm. ikńry 'wygasa fflιofrsaencCn woNce sondy za pomocą interakcji międzecząateczkowych (Morrison, EPA 87300195.2) lub wewnątrzcząsteczkowych (Tyagi, WO 9513399). Sondy według wynalazku mają zaletę tworzenia bardziej stabilnych kompleksów (pozwalając na sondowanie w temperaturach powyżej temperatury topnienia dsNA) i są oporne na nukleazy. Szczególnie interesujące są sondy, w których jeden RG jest fluoroforem, który uzyskuje duży wzrost fluorescencj i po wiązaniu z NA, takim jak asymetryczne barwniki cyjaninowe, a drugi jest wygaszaczem. W takim projekcie wygaszacz wygasza ewentualną resztkową fluorescencję wolnej sondy, co dodatkowo polepsza fluorescencję po hybrydyzacji.
Sondowanie można też przeprowadzać w obecności trzeciego składnika, który obniża resztkową fluorescencję wolnej sondy.
Trzecim składnikiem może być wygaszacz, tzn. cząsteczka, która wygasza fluorescencję RG w wolnej sondzie. Wygaszacz może być wolny w roztworze lub też przyłączony do SRE,
190 263 jak opisano powyżej, lub może być przyłączony do innego NA lub NAA, który jest komplementarny do części SRE. Ten wygaszacz NA/NAA ma wiązać się z wolną sondą w sposób, który wprowadza wygaszacz w pobliże RG. Jeśli komplementarność jest tylko częściowa, sonda będzie miała wyższe powinowactwo w stosunku do TS, i będzie dysocjować od wygaszacza NA/NAA jeśli TS jest obecna. Trzeci składnik może także być czynnikiem, który się wiąże z RG i trzyma go z dala od wiązanej zwrotnie pozycji w SRE. Jest prawdopodobne, że różne czynniki będą najlepiej działały z różnymi RG. Na przykład kaliksaren ma duże powinowactwo w stosunku do TO, i może być stosowane do zmniejszania tła luminescencji sond SRE-TO (Przykład 12).
Sondy według niniejszego wynalazku mogą być stosowane do równoczesnego wykrywania i oznaczania ilościowego obecności kilku różnych NA w próbce przez konstruowanie ich z RG wykazującymi roaróżnialne reakcje spektralne. Mogą, na przykład, emitować światło o różnej długości fali.
Niniejszy wynalazek może być też stosowany do lokalizacji sekwencji w chromosomach za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISb). Sondy według wynalazku mają zaletę w stosunku do sond konwencjonalnych, że sygnał na poziomie tła z nieahyOrydyaowanych sond jest znacznie niższy. Szczególnie interesujące są sondy wyposażone w kilka RG, na przykład przyłączonych do rozgałęzionych linkerów, i do innych składników SRE takich jak szkielet, reszty cukrów i zasady nukleotydów NAA.
Wykrywanie hybrydyzacji
Wiązanie sondy do TS może być monitorowane za pomocą dowolnej obserwowanej właściwości sondy, która jest zmieniona po związaniu. Ponieważ intensywność fluorescencji może być mierzona z bardzo dużą czułością za pomocą stosunkowo taniej aparatury, detekcja fluorescencji na ogół jest metodą z wyboru. Jednak można także śledzić zmiany w innych obserwowalnych właściwościach. Mogą być mierzone także zmiany w czasie trwania fluorescencji i polaryzacji fluorescencji jak i zmiany w absorpcji (Figura 9), odpowiedzi NMR, przewodności itp. ’
Porównanie sond opartych na NAA-RG z powszechnie stosowanymi sondami opartymi na NA-RG
Zalety sond według wynalazku najlepiej można zrozumieć przez porównanie jednej z sond NAA-RG według wynalazku z sondą NA-RG o tej samej sekwencji i tym samym RG. Należy zauważyć, że w ten sposób porównujemy tylko właściwości strukturalne, a nie związane z sekwencją. Dla porównania stosujemy PNA jako NAA, a TO jako RG. Oznacza to, że sondy NA-RG są w zasadzie identycznie z tymi, które opisali Linn i wsp. (EP 0710 668 A2, US 5597696) i bardzo podobne do opisanych przez Ishiguro i wsp. (Nucleic Acids Res. 24, 4992, 1996), przypominając, że barwnik żółcień oksaaolzwα, YO, stosowana przez drugą grupę, jest we wszystkich istotnych aspektach najbardziej zbliżony do oranżu tiazolowego.
Z przykładu 14 wynika, że ° Oparte na PAA sondy mają niższy sygnał tła niż sondy oparte na NA.
• Sondy oparte pa PeifA dajA ινν^ζ,ν sygnałyiż sondy oparte paNA gdy sądSybrydsOrt wane do TS.
° Wzrost odpowiedzi sygnału jest znacznie większy z sondami opartymi na PNA niż z opartymi na NA.
W dodatku sondy oparte na PNA mają następujące zalety w porównaniu z sondami opartymi na NA:
= Sondy oparte na PNA mogą być używane przy wyższych temperaturach niż oparte na NA, ponieważ tworzą one bardziej stabilne kompleksy z TS. Na przykład sonda PP*-GCT-TO daje d 1z-ν t r nn»sóżr + j ΓίΎΛΑ ems rp+ es t^iU /'PrłruOŚO/P 1 i W e WAtai fn 5amrrprstnrTp nrlnnwif^dniA
AAIUOI OjrgllCAlL* 11UVVVI V» 1 w/ x >» ivvv<ivj ~ v sonda oparta na NA nie tworzyłaby dupleksu.
• Sondy oparte na PNA mogą być używane przy zasadniczo dowolnej mocy jonowej, podczas gdy sondowanie za pomocą sond NA jest bardzo wrażliwe na moc jonową. Porównanie w przykładzie 14 prowadzono w 500 mM NaCl, aby stabilizować sondę NA-RG związaną z TS.
° Sondy PNA są oporne na nukleazy.
190 263 ° PNA, ale nie NA, mogą w niektórych warunkach wnikać w dsDNA i tworzyć tripleksy z jedną z nici DNA przez tworzenie pętli D (Nielson i wsp., Science 254, 1497, 1991).
Przykłady
Przykład 1. Zsyntetyzowane RG
| Barwnik | R. | Do przyłączenia poprzez | Stosowane w sondach |
| TO-1-0 | -(CH2),COOH | Faza stała | - |
| TO-2-O | -(CH2)2-COOH | Faza stała | PP16-GTC-TOb, PP16-GTC-TOc |
| TO-5-O | -(CH2)j-COOH | Faza stała | PP11-TT-TO, PP8-GCT-TO, PP5-GCT-TO, PP15-TGT-T0, PP16-GTC-TOa |
| TO-10-0 | -(CH2)io-COOH | Faza stała | - |
| TO-l-S | -(CH2)1-CO-O-C4O2NH4 | Roztwór | |
| T0-2-S | (CH2)2-CO-O-C4O2NH4 | Roztwór | |
| TO-5-S | -(CH2)5-CO-O-C4O2NH4 | Roztwór | PPIO-CTT-TO, PD8-GCT-TO, PDIO-CTT-TO |
| BO-1-0 | -(CH2),-COOH | Faza stała | - |
| BO-2-O | -(CH2)2-COOH | Faza stała. | - |
| BO-10-0 | -(CH2),o-COOH | Faza stała | PP15-TGT-B0 |
| BO-l-S | -(CH2),-CO-O-C4O2NH4 | Roztwór | - |
| BO-2-S | -(CH2)2-CO-O-C4O2NH4 | Roztwór | - |
| BO-IO-S | -(CH2),0-CO-O-C4O2NH4 | Roztwór | PPIO-CTT-BO, PP15-GAT-BO, EcoRI |
Ri oznacza łańcuch boczny zawierający grupę reaktywną, za pomocą której RG jest przyczepiony do SRE.
Przykład 2. Zsyntetyzowane sondy
| Kod | SRE | RG | Linker | Sekwencja |
| Sondy oparte na NAA1 | ||||
| PPIO-CTT-TO | PNA | TO | -(CH2)5-CO-NH-(CH2)S-CO- | (H)-TTCTTCTTTT-(NH2) |
| PPIO-CTT-BO | PNA | BO | -(CH2)10-CO-NH-(CH2)5-CO- | (H)-TTCTTCTTTT-(NH2) |
| PP11-TT-TO | PNA | TO | -(CH2)5-CO- | (H)-TTCTCGTCGAT-Lys-(NH2) |
| PP8-GCT-TO | PNA | TO | -(CH2)5-CO- | (H)-TCGTCGAT-Lys+-(NH2) |
| PP5-GCT-TO | PNA | TO | -(CH2)5-CO- | (H)-TCGAT-Lys+-(NH2) |
| PP15-TGT-TO | PNA | TO | -(CH2)5-CO- | (H)-TGTACGTCACAACTA-Lys+-Lys+-(NH2) |
| PP15-TGT-BO | PNA | BO | -(c.h2)10-co- | (H)-TGTACGTCACAACTA-Lys+-Lys+-(NH2) |
| PP16-GTC-T0a | PNA | TO | -(CH2)s-CO- | (H)-CTGTACGICACAACTA-Lys*-Lys‘-(NH2) |
| PP16-GTC-T0b | PNA | TO | -(CH2)2-CO- | (H)-CTGTACGTCACAACTA-Lys+-Lys-(NH2) |
| PP16-GTC-7Oc | PNA | TO | -(CH2)2-C4N2H2-CH2-CO'2 | (H)-CTGTACGTCACAACTA-Lys+-LysXNH2) |
| PP15-GAT-BO | PNA | BO | -(CH2),o-CO- | (H)-TAGTTGTGACGTACA-(NH2) |
190 263
c.d. przykładu 2
| Sondy oparte na peptydach | ||||
| EcoRJ | Peptyd | BO | -(CH2)h-CO- | Sekwencja aminokwasów EcoRI |
| Sondy oparte na NA2 | ||||
| PD8-GCT-TO | DNA | TO | -(CH2)5-CO-NH-(CH2)5-CO- | (5 ')TCGTCGAT(3') |
| PDIO-CTT-TO | DNA | TO | -(CH2)5-CO-NH-(CH2)5-CO- | (5 ')TTCTTCTTTT(3') |
| PD11-CTT-TO | DNA | TO | -(CH2)5-CO-NH-(CH2)s-CO- | (5 ')TTCTCGTCGAT(3') |
| PD11-CAT-TO | DNA | TO | -(CH2)5-CO-NH-(CH2)5-CO- | (5')TACTCGTCGAT(3') |
| PD11-CTC-TO | DNA | TO | -(CH2)5-CO-NH-(CH2)5-CO- | (5 ')CTCTCGTCGAT(3') |
| PD11-CCT-TO | DNA | TO | -(CH2)5-CO-NH-(CH2)5-CO- | (5 ')CTCTCGTCGAT(3') |
(H) oznacza wolną grupę aminową a (NH2) oznacza końcowy karboksamid.
2 Sztywny linker 3 Oligodeoksyrybonukleotydy z linkerami aminowymi nabyto od Scandinavian Gene Synthesis. Przyłączono sukcynyloimidoester TO i sondę oczyszczono za pomocą tej samej procedury jak sondę opartą na PNA w Przykładzie 4, poza tym, że TPA zastąpiono 0,1 M. TEAA (octan trietyloaminy) pH 7,0.
Przykład 3. Synteza sukcynyloimidoestru oranżu tiazolowego (TO-5-S)
Syntezę przeprowadzono w czterech etapach.
p-toluenosulfonian N-metylo-2-metylobenzotiazoliowy (1, Figura 7). p-toluenometylosulfonian (3,5 g, 18,8 mola) dodano powoli do 2,1 g (14,0 mola)
2-metylobenzotiazolu w etanolu (10 ml). Mieszaninę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez trzy godziny, a następnie mieszano w temperaturze pokojowej przez 15 godzin. Odparowano rozpuszczalnik i produkt rekrystalizowano w metanolu/acetonie.
Wydajność: 4,2 g, 12,6 mmola, 91%.
Bromek N-(karboksypentylo)chinoliny (II, Figura 7)
Do 30 ml acetonitrylu dodano chinolinę (5,2 g, 40 mmoli) i kwas 6-bromo-heksanowy (7,8 g, 40 mmoli). Mieszaninę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną w atmosferze azotu przez trzy godziny, a następnie mieszano przez 15 godzin w temperaturze pokojowej. Dodano 50 ml acetonu i roztwór mieszano jeszcze przez godzinę. Biały osad odsączono, przepłukano acetonem (2x10 ml) i wysuszono.
Wydajność: 8,4 g, 65%.
Jodek N-karboksypentenylo-4- [(3 -metylo-2(3 H)-benzotiazolilideno)metylo)chinoliny (III, Figura 7) HI zsyntetyzowano przez kondensację (ogrzewanie do wrzenia pod chłodnica zwrotną przez 45 minut) I (1,6 g, 5 mmoli) i II (4,8 g, 15 momoli) w obecności KOH (0,8 g, 15 mmoli) w etanolu (20 ml). Po schłodzeniu do temperatury pokojowej produkt strącano 30% KI (wodnym) (20 ml). Osad sączono, płukano acetonem i rekrystalizowano w metanolu.
Wydajność: 1,0 g, 2 mmole, 40%. N-sukcynyloimidyloester związku ΠΙ (TO-5-S) (Figura 7).
III (0,5 g,l rrnnol) i modrohsysukcynimcy (0,11, 1 nunol) rozpu rzzzonz w 25 ml 2suche) dimetoksyetanu. Do zimnego roztworu dodano dicyklzheksylokarbodiimid (0,23 g, 1,1 mmola). Roztwór mieszano w 0°C przez 20 godzin i usunięto mocznik przez sączenie. Przesącz zatężono i próbkę rekrystalizzwa2z w metanolu.
Wydajność: 0,4 g, 0,65 mmola, 65%.
Przykład 4. Synteza w roztworze sondy PNA (PPIO-CTT-TO) i jej charakterystyka nmoli PNA wyposażonego w grupę aminową o sekwencji 'TTTTCTTCTT-CO-(CH2)5-NH2' rozpuszczono w 10 μί H2O i 31 μί 500 mM buforu Na3BO3 i dodano 10 μl dioksanu. Reakcje rozpoczynano przez dodanie 140 nmtdi TO-5-S (w DMSO) w dwóch próbkach po 2 μl (miedzy dwiema porcjami mieszano 5 minut), a następnie mieszaninę reakcyjną umieszczono w 37° C na 4 godziny. Po schłodzeniu do 25°C dodano 10 μΐ acetonitrylu. Produkt oczyszczono za pomocą HPLC stosując kolumnę z odwróconymi fazami C-18 (Waters, symetria C18 3,9 x 150 mm) w układzie gradientu (LKB 2249) z monito190 263 rowaniem absorpcji przy 260 nm (LKB 2151). Stosowany gradient był mieszaniną acetonitrylu i wody z 0,01-O,1% obj/obj kwasu trifluorooctowego. Przepływ był 1 ml/min a gradient 95-60% H2 O, 20 min., 60-O% H2 O, 5 min. Dobrze oddzielono sondę i nadmiar TO-5-S. Frakcje zawierające sondę zamrażano w ciekłym azocie i liofilizowano przez 15 minut, aby usunąć rozpuszczalnik i kwas trifluorooctowy. Uzyskano luźny czerwonawy materiał, który rozpuszczono w wodzie dejonizowanej. Sondę hybrydyzowano do TS, co spowodowało dużą zmianę w absorpcji RG pokazując jej interakcję (Fig. 9).
Przykład 5. Synteza BO-2-O (Rt=CH2CH2COOH)
Syntezę przeprowadzono w trzech etapach p-toluenometylosulfonian (35 g, 18,8 mmola) i 2-metylotiobenzotiazol (2,5 g, 14,0 mmol) ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez pięć godzin. Produkt (I) krystalizowano w metanolu/acetonie (Figura 14a).
Wydajność: 4,8 g, 13,1 mmola, 94%
4-pikolinę (3,7 g, 40 mmoli) i kwas 3-bromopropionowy (6,1 g, 40 mmoli) ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 5 godzin. Produkt (Ii) rekrystalizowano w metanolu/acetonie (Figura 14b).
Wydajność: 6,9 g, 28 mmoli, 70%
Jodek N-karboksyetylo-4-[(3-metylo-2(3H)-benzotiazolilideno)-metylopirydyniowy syntetyzowano przez kondensację (przez noc w temperaturze pokojowej) I (1,8 g, 5 mmol) i II (1,2 g, 5 mmoli) w obecności Et3N (2,0 g, 20 mmol) w CH2CI2 (10 ml). Produkt strącano 30% KI (aq) (15 ml), sączono i rekrystalizowano w metanolu/wodzie.
Wydajność: 0,70 g, 2,1 mmola, 43%
Przykład 6. Synteza w fazie stałej, odszczepienie i oczyszczanie sondy PP15-TGT-TO mg żywicy z poziomem podstawienia PNA 0,15 mmola/g spęczniano w DCM przez noc. Sekwencja pNA była następująca Re-Lys-Lys-ATCAACACTGCATG-NH-Boc, gdzie Re oznacza żywicę, a Boc oznacza t-butyloksykarbonylową grupę ochronną dla N-końca. Syntezę w fazie stałej przeprowadzono na lejku szklanym z ssaniem wodnym i mieszaniem azotem. Stosowano porcje roztworów płuczących i odczynników po 1ml a dla reakcji sprzęgania 0,3 ml. Boc usunięto przez dodanie 5% m-krezolu w kwasie trifluorooctowym (TFA) i mieszanie przez 4 minuty. Procedurę przeprowadzono trzy razy, a następnie żywicę przepłukano trzema porcjami DCM:DMF (1:1), a następnie dwiema porcjami pirydyny. Wolne grupy aminowe wykrywano testem Kaisera. Monomer PNA Boc-tymine (9,8 mg, 18 x 10'6 mmola) rozpuszczono w 0,3 ml heksafluorofosforanu 2-(1H-benzotriazolo-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametylouroniowego (HBTU, 0,15 mM, 18x10- moli) w DMF. Po około 1 minucie dodawano diizopropyloetylaminę, DIEA (6,3 μΐ, 3,4 x 10’6mmol) i mieszaninę przenoszono na żywicę i prowadzono reakcję sprzęgania przez 30 minut. Test Kaisera nie wykazał wolnych grup aminowych pod koniec reakcji. Nieprzereagowany monomer odsączano i żywicę płukano dwukrotnie DMF. Zablokowanie pozostałych grup aminowych przeprowadzono bezwodnikiem octowym i kolidyną w DMF (1:1:8) przez dwie minuty. Żywicę następnie płukano trzy’ razy DMF i mieszano z 5% piperydyną w DMF przez cztery minuty. W końcu żywicę płukano trzy razy DCM:DMF (1:1) i trzy razy DCM.
Następnie sprzęgnięto T0-5-O (R1=CH2CH2CH2CH2CH2COOH, 9,6 mg, 18x10’ mola) z Re-Lys-Ly:s-.^’r'C.AACACTGCATGT-NH-Boc tak samo jak tyminę, z tym, że reakcję sprzęgania prowadzono przez 45 minut. Kuleczki żywicy zmieniły barwę na czerwoną w czasie reakcji, a test Kaisera nie wykazał wolnych grup aminowych.
Suchą żywicę umieszczono w probówce Eppendorfa do sączenia i płukano 0,25 ml TFA. Lys-Lys-ATCAACACTGCATGT-TO odszczepiono z żywicy i odblokowano przez dodanie kwasu trifluorometylosulfonowego (TFMSA):TFA:m-krezol:tioanizol (2,6:1 :l:0,25ml) przez jedną godzinę. Mieszaninę następnie oddzielono od żywicy przez wirowanie przy 6000 obr/min i przeniesiono do probówki. Odszczepienie powtórzono jeden raz i żywicę na końcu płukano TFA (0,25 1). Połowę rozpuszczalnika odparowano z połączonych odszczepionych frakcji za pomocą strumienia azotu. Następnie dodano zimny eter dietylowy (5 ml) do probówki i strącono białe kryształy. Probówkę wirowano przy 6000 obr/min i usunięto nadsącz. Sondę (PP15-TGT-TO) przepłukano czterema porcjami eteru i w końcu rozpuszczono w 0,2 ml wody. Po dodaniu wody sonda zrobiła się czerwona.
190 263
Sondę oczyszczono za pomocą HPLC z odwróconymi fazami, jak opisano w Przykładzie 4, i scharakteryzowano za pomocą MALDI-TOF MS (Figura 15).
Przykład 7. Synteza w fazie stałej, odszczepienie i oczyszczanie sondy PP16-GTC-10c (sonda ze sztywnym linkerem) mg żywicy z poziomem podstawienia PNA 0,15 mmola/g spęczniano w THF przez trzy godziny. Sekwencja PNA była następująca Re-Lys-Lys-ATCAACACTGCATGT-NH-Boc, do której najpierw przyłączono cytozynę jak opisano w Przykładzie 6. W następnym etapie przyłączono sztywny linker w następujący sposób.
N-karboksymetylopiperazynę chronioną przez Boc (3,3 mg, 13,5xwSnola) rozpuszczono w DMF (0,5 ml) i HBTU (5,1 mg, 13,5xS0'8 mol) i DlEA (4,8 pl, 2,75xS03mol). Mieszaninę następnie dodano do sekwencji z odblokowanym końcem aminowym. Sprzęganie prowadzono przez 30 minut, po czym nie wykryto wolnych grup aminowych testem Kaisera. Nieprzereagowany monomer odsączono i żywicę przepłukano dwukrotnie DMF. Zablokowanie pozostałych grup aminowych przeprowadzono bezwodnikiem octowym i kolidyną w DMF (1:1:8) przez dwie minuty. Żywicę następnie płukano trzy razy DMF i mieszano z 5% piperydyną w DMF przez cztery minuty. W końcu żywicę płukano trzy razy DCM:DMF (1:1) i trzy razy DCM. Usunięto Boc ze sztywnego linkera jak opisano w Przykładzie 6 i test Kaisera wykrył obecność drugorzędowej aminy. T0-2-O (Ri=CH2CH2COOH, 6,6 mg, ' 3,5x10-’ mol) rozpuszczono w DMF (0,5 ml) i dodano HBTU (5,1 mg, 13,5x10-6 mol) i DIeA (4,8 pl, 2,75 x'0'5 mol). Mieszaninę następnie dodano do żywicy. Sprzęganie prowadzono przez 45 minut, po czym żywica zrobiła się czerwona. Blokowanie i płukanie przeprowadzono jak w Przykładzie 6. Sondę następnie od-szczepiono i odblokowano jak w Przykładzie 6.
Sondę (PP16-GTC-Toc) oczyszczono za pomocą HPLC z odwróconymi fazami, jak opisano w Przykładzie 4, i scharakteryzowano za pomocą MALDI-TOF MS.
Przykład 8. Sondowanie ssDNA sondą PPIO-CTT-TO stosując schemat przedstawiony na Figurze 3 A.
Najpierw zmierzono fluorescencję tła sondy PP1-CTT-TO. Następnie dodano nadmiaru niekomplementamego ssDNA (5TGCTTGA^TTCGCTTC-3'), co nie wpłynęło na luminescencję. Następnie dodano ssDNA zawierającego TS (5'AGCGGTCGACAGAAGAAGAAAA-3'). To spowodowało natychmiastowy wzrost luminescencji (Figura 8). Próbki zawierały 1,4 pM. sondę, 5 mM bufor boranowy (pH 8,5) i 50 mM NaCl. Temperatura sodowania wynosiła 50°C.
Przykład 9. Sondowanie ssDNA sondą PPIO-CTT-TO według schematu przedstawionego na Figurze 6.
Do próbki zawierającej sondę PPIO-CTT-TO i oligomer 5'GTCGACCGCT-3', które są komplementarne do blisko położonych części ssDNA dodano ssDNA o sekwencji 5'AGCGGTCGACAGAAGAAGAAAA-3'. Spowodowało to 45-krotny wzrost fluoresecencji (Figura '0). Eksperyment przeprowadzono w 50°C w 5 mM buforze boranowym (pH 8,5) przy mocy jonowej 500 mM.
Mieszanina sondująca jest dodatkowo scharakteryzowana na Fig. 11. Absorpcja w 260 nm, mierzona jako funkcja temperatury, wykazuje, że oligomer dysocjuje w około 65°C, co jest wyrażane w pierwszym punkcie przegięcia, a sonda oparta na PNA w około 85°, co jest odbite w drugim punkcie przegięcia. Ta różnica jest odbiciem wyższej stabilności hybryd PNA:NA w porównaniu z dsNA.
Fluorescencja sondy zarówno wolnej jak i zhybrydyzowanej spada z temperaturą. W przypadku sondy wolnej, jest to prawdopodobnie wynikiem zmniejszonego stopnia wiązania zwrotnego w wyższej temperaturze, podczas gdy w przypadku drugiej wynika to ze zwięklAb^tn/ci foeo/lu Hun 1 ρίτςΐρ Wc n 1*107X17^3 na ąy2'UWl*łaU—p 2lp<cAiC7Oz-u vii nun.iuuvj i ινιιιιινωι^ vxi »» * «χ *.5 ----1-------ność RG a wiec i niższą fluorescencję. Zwiększenie fluorescencji po hybrydyzacji jest stosunkiem pomiędzy tymi sygnałami, i jest maksymalne przy około 62°C.
Fluorescencja zhybrydyzowanej sondy spada do poziomu tła przy około 75°C, co jest poniżej temperatury topnienia dupleksu PNA:NA, ale w temperaturze, gdzie w zasadzie nie jest wiązany żaden oligomer. To popiera hipotezę, że barwnik w stanie zhybrydyzowanym jest związany do obszaru dupleksu NA:NA (Przykład 6).
190 263
Przykład 10. Konstrukcja sondy białko-RG
Skonstruowano sondę enzymu restrykcyjnego EcoRI, który specyficznie rozpoznaje sekwencję 5'-GAATTC-373'-CTTAGG-5' w dsNA i BO. 200 nmoli sukcynyloimidoestru BO, rozpuszczonego w DMSO, dodano do 100 nmoli EcoRI (Life Technology) w 1 ml 20 ϋΜ buforu fosforanowego w pH 8,0. Roztwór BO dodawano powoli z mieszaniem aby uniknąć denaturacji białka przez DMSO. Mieszaniπę następnie mieszano w ciemności przez 15 godzin w 4°C i na końcu oddzielono sondę od wolnego barwnika stosując mikrokoncentrator 10 K w 4°C. Na Figurze 16 przedstawiono widma fluorescencji wolnej sondy EcoRI, sondy w obecności dsDNA zawierającego miejsce rozpoznawane przez EcoRI, i dsDNA pozbawionego tego miejsca, tu polimeru DNA poli(dAdT): poli(dAdT). Widać, że sonda EcoRI specyficznie rozpoznaje dsDNA zawierający TS. Jako odnośnik pokazano widma fluorescencji wolnego barwnika w obecności tego samego DNA.
Przykład 11. Wzmocnienie fluorescencji sond SRE-RG
| Kod | Warunki | Sposób | Wzrost flurescencji po hybrydyzacji |
| Sondy oparte na NAA | 6 | ||
| PPIO-CTT-TO | 5 ωΜ bufor boranowy pH 8,5, 500ηMNaCl, 50°C | 3A | 45 |
| PPIO-CTT-TO | 5 mH bufor boranowy pH 8,5, 500 ml NaCl, 50°C | 3A | 20 |
| PPIO-CTT-TO | 5 mM bufor boranowy pH 8,5, 500 ml NaCl, 50°C | 3A | 20 |
| PPIO-CTT-BO | 10 mKl bufor boranowy pH 8,5, 25°C | 3A | g |
| PPIO-CTT-BO | 10 mM bufor boranowy pH 8,5, 45°C | 3A | 9 |
| PP5-GCT-TO | 10 bufor boranowy pH 8,5, 20°C | 3A | 20 |
| PP11-TT-TO | 10 mM bufor boranowy pH 8,5, 45°C | 3A | 10 |
| PP8-GCT-TO | 10 mW bufor boranowy pH 8,5,45°C | 3A | 35 |
| PP8-GCT-TO | 10 βΜ bufor boranowy pH 8,5, 500ml NaCl, 20°C | 3A | 30 |
| PP8-GCT-TO | 10 ωΜ bufor fosforanowy, pH 7,5, 25°C | 3A | 27 |
| Sondy oparte na białkach | |||
| EcoRI | 10 ωΜ bufor fosforanowy, pH 7,5, 25°C | 3B | 50 |
Przykład 12. Określenie wydajności kwantowych
Wydajność kwantową fluorescencji wolnej i zhybrydyzowa-nej sondy PP8-GCT-TO określono względem fluoresceiny. PP8-GCT-TO rozpuszczono w 10 mM buforze fosforanowym pH 7,5 w stężeniu sondy 0,8 μ Μ. Pomiarów absorpcji dokonano stosując Varian Cary 4 a fluorescencji na spex fluorog tl2. Wszystkie pomiary przeprowadzono stosując tę samą komórkę 1 cm. Próbki wzbudzano przy 470 nm i widma zapisywano między 480 i 700 nm, zbierając pięć punktów na nm. Wydajności kwantowe flurescencji (Of) oznaczano względem dianionu fluresceiny w 0,1 Μ NaOH (zakładając wydajność kwantową 0,93). Wydajności kwantowe wyliczono z:
— 00 (1)
190 263 gdzie F(v) jest intensywnością emisji przy długości v, a jest absorpcją przy długości fali wzbudzenia. Hybrydyzacje przeprowadzono z ssDNA 5'- ATC GAĆ GAG AGA aTa TCA w stosunkach 1:1.
Wyniki podsumowano poniżej.
| Próbka | Φρ | Φρ^Φρ (F)* |
| Wolna PP8-GCT-TO w 25°C | 0,0066 | - |
| PP8-GCT-TO zmieszana z równą ilością komplementarnego ssDNA, 2S°C | 0,1600 | 24 |
| Próbka powyżej podgrzana do 80°C na 5 min, a następnie doprowadzona do 25°C | 0,1800 | 27 |
* Wzrost wydajności kwantowej po hybrydyzacji. Należy zauważyć, że wzrost w wydajności kwantowej nie jest koniecznie identyczny ze wzrostem fluorescencji wynikającej z różnic w absorpcji między sondą wolną i zhebredyzowaną.
Przykład 13. Zmniejszenie sygnału tła.
Sygnał tła fluorescencji z sondy PP15-GAT-BO jest zmniejszony po dodaniu kaliksarenu (Figura 17), który prawdopodobnie chroni RG przez SRE. Stężenie sondy PP15-GAT-BO wynosiło 1 pM, temperatura wynosiła 15°C. Stosowano 10 mM bufor Tris, pH 7,5.
Przykład 14. Porównanie sond NAA-RG i NA-RG
Zsyntetyzowano sondy PNA-TO (PP8-GCT-TO) i NA-TO (PD8-GCT-TO) z tymi samymi sekwencjami i porównywalnymi linkerami. Mierzono fluorescencję wolnych sond i sond zhebrydyzowanych do Na zawierających TS w trzech temperaturach (Figura 18). We wszystkich przypadkach fluorcsccncja wolnej sondy opartej na PNA była niższa niż sondy opartej na NA, a fluorescencją zhybryWyzowanej sondy opartej na PNA była wyższa niż zhybrydyzowanej sondy opartej na NA.
Przykład 15. Detekcja wzrokowa.
Bezpośrednia obserwacja hybrydyzacji między sondą i TS. Figura 13 przedstawia dwie probówki polipropylenowe podświetlone z dołu lampą UV o szerokim zakresie i sfotografowane z boku (stosując film ASA 200 bez filtrów). Obie probówki zawierają 30 μΐ próby i 3,5 x 10'w mola sondy. Lewa próba zawiera także 5-krotny nadmiar niekomplementarnego NA, podczas gdy prawa świecąca próba zawiera komplementarny NA. Stosowano te same oligomery jak w Przykładzie 12. Warunki - bufor boranowy 10 mM, pH 8,5, bez soli, 30°C.
FIGURA 2
190 263
FIGURA 3
190 263
log[BO]
FIGURA 4
Intensywność fluorescencji
| —□— | Zieleń oligo |
| -Q- | Zieleń pico |
| -Δ- | BO |
| —v— | TO |
o—
log[C] —t~ —i -4
FIGURA 5
190 263
+ oligomer ν.ντ......\ —-μ
SSNA
TS część 1 TS część 2
FIGURA 6
190 263
FIGURA 7
190 263
. Sonda + Sonda +
Wolna so a njckomplementaniy komplementarny DNA DNA
FIGURA 8
FIGURA 9
190 263
długość fali (nm) :§>
FIGURA 10
FIGURA 11
190 263
| Typ kompleksu | Wydajność kwantowa | log(K) | cmax | szczyt abs. | Sposób wiązania |
| ( at 25’C1 | (at lOOtnM) | (W* cm·') | (nm) | ||
| wolny TO | <1x10·* | - | 55000 | 500.6 | I |
| TO-ctDNA | 0.11 | 5.3 | 49500 | 509.4 | 1 |
| TO-polł (dA-dT)) | 0.07 | 5.5 | 60500 | 509.4 | 1 |
| TO-pol/(dG-dC)j | 0.11 | 5.5 | 69200 | 510.6 | 1 |
| TO-poli(dA) | 0.00 | 4.8 | 52900 | 506.6 | 1 |
| TO-poIi(dG) | 0.39 | 4.8 | - | - | KU) |
| TO-polt(dC) | 0.009 | 3.4 | 37900 | 475.6 | 11 |
| TO-poK(dT) | 0.01 | 2.3 | 68000 | 476.0 | 11 |
FIGURA 12
190 263
FIGURA 13
FIGURA 14
190 263
Masa/Lodunek
FIGURA 15
<t>)
_]-- . ,1 __I-- , , I.,
450 500 550 600 długość fali (nm)
FIGURA 16
190 263
FIGURA 17
Temperatura (°C)
Fluorescencja
| & | i | CO H | |||
| *7 | T | + | + | + | |
| O | u | < | 1 | 1 | |
| 5Γ | CU | u | U | u | |
| Ci | Q | Q | |||
| Cu | fl. | Cu |
| CO H | co | CO H | |||
| ć | t | 1 | + | + | + |
| U | u | ||||
| A_ | CL | a. | | | 1 | |
| CL | C- | Cu | U Cu | £ | y |
| a. | CL | c. |
FIGURA 18
190 263
FIGURA 19
Badany NA m~mm n 11 ιιιτιπτγτπ limu 11111 im i u 11 LLUJII U.UUILLIIIIJ llllltl llllllllllllll
SRE rozpoznające różne TS o długości 7
Ul 1.11,1 tJJIJJJ limu umil
FIGURA 20
190 263
Mutacja, która ma być wykryta
ΠΤΤΤΤΤΊΤΠ
LLLUB
LLIŁUJ
UHLU
3’
SRE wrażliwe na mutacji
LLUHLLS N Uli UH
FIGURA 21
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 6,00 zł.
Claims (79)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sondy dla docelowej sekwencji kwasu nukleinowego (TS) i ich zastosowania, sposób standardowej techniki syntezy peptydów, sposoby wykrywania TS w dsNA, sposoby wykrywania lub oznaczania ilościowo danego NA w próbce, sposób oznaczania ilości danego NA w próbce w czasie rzeczywistym, sposoby wykrywania TS w ssNA znacznie zmienione, gdy wiąże się z kwasem nukleinowym (NA), obejmującym wymienioną sekwencję docelową (TS), przy czym sonda przynajmniej w części bliskiej RG ma taką strukturę, że każde wewnątrzcząsteczkowe oddziaływanie między SRE i RG, która wpływa na sygnał RG, jest stłumione lub ma taką sekwencję zasad przynajmniej na końcu bliskim RG, która minimalnie wpływa na właściwości sygnału RG.
- 2. Sonda według zastrz. 1, znamienna tym, że podczas wiązania z TS tworzy strukturę, która zwiększa zmianę sygnału powodowaną przez wiązanie RG do NA.
- 3. Sonda według zastrz. 1, znamienna tym, że SRE, przynajmniej w części bliskiej RG, ma strukturę odmienną od naturalnego kwasu nukleinowego.
- 4. Sonda według zastrz. 1, znamienna tym, że SRE jest wybrana spośród syntetycznego analogu kwasu deoksyrybonukleinowego (NAA), białka lub peptydu rozpoznającego sekwencję, analogu kwasu deoksyrybonukleinowego połączonego z białkiem lub peptydem, i oligonukleotydu połączonego z białkiem lub peptydem.
- 5. Sonda według zastrz. 4, znamienna tym, że SRE jest NAA, który różni się od naturalnego kwasu nukleinowego NA tym, że ma zmieniony lub zastąpiony szkielet fosfodiestrowy, lub połączone z nim reszty cukrowe zmodyfikowane lub zastąpione, lub ma stereochemię odmienną od naturalnych NA.
- 6. Sonda według zastrz. 5, znamienna tym, że NAA ma obojętny ładunek wypadkowy, lub dodatni ładunek wypadkowy, który wynosi nie więcej niż jeden ładunek na zasadę, korzystnie nie więcej niż jeden ładunek na trzy zasady.
- 7. Sonda według zastrz. 5 albo 6, znamienna tym, że NAA jest peptydowym kwasem nukleinowym (PNA).
- 8. Sonda według zastrz. 6, znamienna tym, że RG stanowi związek z ładunkiem dodatnim.
- 9. Sonda według zastrz. 8, znamienna tym, że ponad 50% zasad NAA stanowią zasady pirymidynowe.
- 10. Sonda według zastrz. 9, znamienna tym, że zasada pirymidynowa jest przynajmniej w co drugiej pozycji.
- 11. Sonda według zastrz. 9, znamienna tym, że zasady, na końcu których przyczepiony jest RG, są dwiema tyminami lub cytozyną i tyminą.
- 12. Sonda według zastrz. 9, znamienna tym, że wszystkie zasady są zasadami pirymij_____ uynu w jim.
- 13. Sonda według zastrz. 1, znamienna tym, że SRE jest kwasem nukleinowym (NA) i jego zasada lub zasady, na końcu których przyczepiony jest RG, są takie, dla których RG ma najniższe powinowactwo i/lub takie, z którymi RG oddziałuje w sposób, który najmniej wpływa na jego właściwości sygnałowe.
- 14. Sonda według zastrz. 1, znamienna tym, że widoczną właściwością jest luminescencja.190 263
- 15. Sonda według zastrz. 1, znamienna tym, że intensywność sygnału RG wzrasta po wiązaniu TS.
- 16. Sonda według zastrz. 15, znamienna tym, że grupa reporterowa jest związkiem zawierającym reszty aromatyczne, z których przynajmniej dwie są połączone wiązaniem kowalencyjnym, które jest sprzężone z układem aromatycznym.
- 17. Sonda według zastrz. 1, znamienna tym, że grupa reporterowa jest związkiem, który wykazuje:a) powinowactwo do ssNA i/lub dsNA w zakresie między 0,1 i 108M'* (-1<logK<8),b) wydajność kwantową luminescencji w roztworze wodnym wynoszącą mniej niż 0,05, korzystnie mniej niż 0,01, i bardziej korzystnie mniej niż 0,001,c) wydajność kwantową luminescencji po związaniu NA większą od 0,01, korzystnie większą od 0,1, i bardziej korzystnie większą od 0,25,d) przynajmniej 5-krotne, korzystnie przynajmniej 50-krotne, i bardziej korzystnie przynajmniej 500-krotne zwiększenie wydajności kwantowej luminescencji po związaniu NA,e) maksymalną molamą. absorpcyjność co najmniej 1000 M^cm'1, korzystnie co najmniej 10000 i bardziej korzystnie co najmniej 50000 M^cm1.
- 18. Sonda według zastrz. 1, znamienna tym, że grupa reporterowa jest asymetrycznym związkiem cyjaninowym.
- 19. Sonda według zastrz. 18, znamienna tym, że SRE jest NAA lub NA i ponad 50% jego zasad stanowią zasady pirymidynowe.
- 20. Sonda według zastrz. 19, znamienna tym, że zasada pirymidynowa jest przynajmniej w co drugiej pozycji.
- 21. Sonda według zastrz. 19, znamienna tym, że zasady, na końcu których przyczepiony jest RG, są dwiema tyminami lub cytozyną i tyminą.
- 22. Sonda według zastrz. 19, znamienna tym, że wszystkie zasady są zasadami pirymidynowymi.
- 23. Sonda według zastrz. 18, znamienna tym, że asymetryczny związek cyjaninowy ma w swojej niezwiązanej formie jedną z następujących struktur chemicznych:R3 kio♦ Y—NKLK2R10-R10 // N + \KI gdzie R1 oznacza wodór lub niesprzężoną z azotem grupę alkilową zawierającą co najwyżej 6 atomów węgla, która może być podstawiona polarnymi resztami wybranymi spośród grupy hydroksylowej, grup alkoksylowych, grupy karboksylowej i grup aminowych, X oznacza O, S, Se, NR5, gdzie R5 oznacza wodór lub grupę alkilową zawieraj ącą co najwyżej 6 atomów węgla, lub CR5R7, gdzie R6 i R7 niezależnie oznaczają wodór lub grupę alkilową za4190 263 wierającą co najwyżej 6 atomów węgla, R2, R3 i R4, z których dwa lub trzy mogą być takie same, oznaczają wodór, małe grupy alkilowe, arylowe, lub parami, r2 i R4 lub R3 i R4 i w kombinacji z dwoma z atomów pierścienia, z którymi są związane, tworzą 5- lub 6- członowy pierścień aromatyczny, który może zawierać 0-2 heteroatomów takich jak O, S lub NR , gdzie R ma znaczenie jak określone powyżej, n = 0, 1 lub 2, Y oznacza HC=CH, i obydwa A i B oznaczająO lub 1; pod warunkiem, że jeśli A=1 wówczas B=0, i vice versa,R i R niezależnie oznaczają wodór lub niesprzężone z azotem grupy alkilowe, zawierające najwyżej 6 atomów węgla, które mogą być podstawione polarnymi resztami takimi jak grupy hydroksylowe, grupy alkoksylowe, grupy karboksylowe i grupy aminowe.
- 24. Sonda według zastrz. 23, znamienna tym, że SRE jest NAA lub NA i ponad 50% jego zasad stanowią zasady pirymidynowe.
- 25. Sonda według zastrz. 24, znamienna tym, że zasada pirymidynowa jest przynajmniej w co drugiej pozycji.
- 26. Sonda według zastrz. 24, znamienna tym, że zasady, na końcu których przyczepiony jest RG, są dwiema tyminami lub cytozyną i tyminą.
- 27. Sonda według zastrz. 24, znamienna tym, że wszystkie zasady są zasadami pirymidynowymi.
- 28. Sonda według zastrz. 1, znamienna tym, że SRE i RG są połączone za pomocą łańcucha węglowodorowego zawierającego jedną lub więcej z następujących grup:a) sztywne grupy, takie jak z wiązaniami podwójnymi lub potrójnymi,b) heteroatomyc) grupy polarned) grupy naładowane lube) grupy o dużej objętości.
- 29. Sonda według zastrz. 28, znamienna tym, że SRE jest NAA lub NA i ponad 50% jego zasad stanowią zasady pirymidynowe.
- 30. Sonda według zastrz. 29, znamienna tym, że zasada pirymidynowa jest przynajmniej w co drugiej pozycji.
- 31. Sonda według zastrz. 29, znamienna tym, że zasady, na końcu których przyczepiony jest RG, są dwiema tyminami lub cytozyną i tyminą.
- 32. Sonda według zastrz. 29, znamienna tym, że wszystkie zasady są zasadami pirymidynowymi.
- 33. Sonda według zastrz. 1, znamienna tym, że połączenie między SRE i RG ma przynajmniej jeden dodatni ładunek.
- 34. Sonda według zastrz. 33, znamienna tym, że SRE jest NAA lub NA i ponad 50% jego zasad stanowią zasady pirymidynowe.
- 35. Sonda według zastrz. 34, znamienna tym, że zasada pirymidynowa jest przynajmniej w co drugiej pozycji.
- 36. Sonda według zastrz. 34, znamienna tym, że zasady, na końcu których przyczepiony jest RG, są dwiema tyminami lub cytozyną i tyminą.
- 37. Sonda według zastrz. 34, znamienna tym, że wszystkie zasady są zasadami pirymidynowymi.
- 38. Sonda według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera więcej niż jeden RG, które mogą być identyczne i których własności sygnałowe, pojedynczo lub w kombinacji, są zmienione.
- 39. Sonda według zastrz. 1 albo 38, znamienna tym, że zawiera przynajmniej jeden RG, połączony z jednym lub więcej z poniższych:i) zasady nukleotydowe ii) atomy szkieletu nij aium^ wnusiu i/lub atomy, z których składa się linker pomiędzy SRE i TS .
- 40. Sonda dla docelowej sekwencji kwasu nukleinowego (TS) zawierająca element rozpoznający sekwencję (SRE) kowalencyjnie połączony z grupą (grupami) reporterową (reporterowymi) (RG), której właściwości sygnałowe są znacznie zmienione, gdy wiąże się z kwasem nukleinowym (NA), obejmującym wymienioną sekwencję docelową (TS), przy czym sonda przynajmniej w części bliskiej Rg ma taką strukturę, że każde wewnątrzcząsteczkowe oddzia190 263 ływanie między SRE i RG, która wpływa na sygnał RG, jest stłumione lub ma taką sekwencję mieszanych zasad pirymidynowych przynajmniej na końcu bliskim RG, która minimalnie wpływa na właściwości sygnału RG.
- 41. Sonda według zastrz. 40, znamienna tym, że widoczną właściwością jest luminescencja.
- 42. Sonda według zastrz. 40, znamienna tym, że intensywność sygnału RG wzrasta po wiązaniu TS.
- 43. Sonda według zastrz. 42, znamienna tym, że grupa reporterowa jest związkiem zawierającym reszty aromatyczne, z których przynajmniej dwie są połączone wiązaniem kowalencyjnym, które jest sprzężone z układem aromatycznym.
- 44. Sonda według zastrz. 40, znamienna tym, że grupa reporterowa jest związkiem, który wykazuje:a) powinowactwo do ssNA i/lub dsNA w zakresie między 0,1 i 108M’’ (-1<logK<8),b) wydajność kwantową luminescencji w roztworze wodnym wynoszącą mniej niż 0,05, korzystnie mniej niż 0,01, i bardziej korzystnie mniej niż 0,001,c) wydajność kwantową luminescencji po związaniu NA większą od 0,01, korzystnie większą od 0,1, i bardziej korzystnie większą od 0,25,d) przynajmniej 5-krotne, korzystnie przynajmniej 50-krotne, i bardziej korzystnie przynajmniej 500-krotne zwiększenie wydajności kwantowej luminescencji po związaniu NA,e) maksymalną molarną absorpcyjność co najmniej 1000 MI'1 cm'1, korzystnie co najmniej 10000 M’'cm'1 i bardziej korzystnie co najmniej 50000 M'lcm'l.
- 45. Sonda według zastrz. 40, znamienna tym, że grupa reporterowa jest asymetrycznym związkiem cyjaninowym.
- 46. Sonda według zastrz. 45, znamienna tym, że SRE jest NAA lub NA i ponad 50% jego zasad stanowią zasady pirymidynowe.
- 47. Sonda według zastrz. 46, znamienna tym, że zasada pirymidynowa jest przynajmniej w co drugiej pozycji.
- 48. Sonda według zastrz. 46, znamienna tym, że zasady, na końcu których przyczepiony jest RG, są dwiema tyminami lub cytozyną i tyminą.
- 49. Sonda według zastrz. 46, znamienna tym, że wszystkie zasady są zasadami pirymidynowymi.
- 50. Sonda według zastrz. 45, znamienna tym, że asymetryczny związek cyjaninowy ma w swojej niezwiązanej formie jedną z następujących struktur chemicznych:190 263 gdzie R oznacza wodór lub niesprzężoną z azotem grupę alkilową zawierającą co najwyżej 6 atomów węgla, która może być podstawiona polarnymi resztami wybranymi spośród grupy hydroksylowej, grup alkoksylowych, grupy karboksylowej i grup aminowych, X oznacza O, S, Se, NR , gdzie R oznacza wodór lub grupę alkilową zawierającą co najwyżej 6 atomów węgla, lub CR6R7, gdzie R6 i R7 niezależnie oznaczają wodór lub grupę alkilową zawierającą co najwyżej 6 atomów węgla, R2, R3 i R4, z których dwa lub trzy mogą być takie same, oznaczają wodór, małe grupy alkilowe, arylowe, lub parami, R2 i R4 lub R3 i R4 i w kombinacji z dwoma z atomów pierścienia, z którymi są związane, tworzą 5- lub 6-członowy pierścień aromatyczny, który może zawierać 0-2 heteroatomów takich jak O, S lub NR5, gdzie R5 ma znaczenie jak określone powyżej, n = 0, 1 lub 2,Y oznacza HC=CH, i obydwa A i B oznaczają 0 lub 1; pod warunkiem, że jeśli A = 1, wówczas B = 0, i vice versa,R9 i R10 niezależnie oznaczają wodór lub niesprzężone z azotem grupy alkilowe, zawierające najwyżej 6 atomów węgla, które mogą być podstawione polarnymi resztami takimi jak grupy hydroksylowe, grupy alkoksylowe, grupy karboksylowe i grupy aminowe.
- 51. Sonda według zastrz. 50, znamienna tym, że SRE jest NAA lub NA i ponad 50% jego zasad stanowią zasady pirymidynowe.
- 52. Sonda według zastrz. 51, znamienna tym, że zasada pirymidynowa jest przynajmniej w co drugiej pozycji.
- 53. Sonda według zastrz. 51, znamienna tym, że zasady, na końcu których przyczepiony jest RG, są dwiema tyminami lub cytozynąi tyminą.
- 54. Sonda według zastrz. 51, znamienna tym, że wszystkie zasady są zasadami pirymidynowymi.
- 55. Sonda według zastrz. 40, znamienna tym, że SRE i RG są połączone za pomocą łańcucha węglowodorowego zawierającego jedną lub więcej z następujących grup:a) sztywne grupy, takie jak z wiązaniami podwójnymi łub potrójnymi,b) heteroatomyc) grupy polarned) grupy naładowane lube) grupy o dużej objętości.
- 56. Sonda według zastrz. 55, znamienna tym, że SRE jest NAA lub NA i ponad 50% jego zasad stanowią zasady pirymidynowe.
- 57. Sonda według zastrz. 56, znamienna tym, że zasada pirymidynowa jest przynajmniej w co drugiej pozycji.
- 58. Sonda według zastrz. 56, znamienna tym, że zasady, na końcu których przyczepiony jest RG, są dwiema tyminami lub cytozynąi tyminą.
- 59. Sonda według zastrz. 56, znamienna tym, że wszystkie zasady są zasadami pirymidynowymi.
- 60. Sonda według zastrz. 40, znamienna tym, że połączenie między SRE i RG ma przynajmniej jeden dodatni ładunek.
- 61. Sonda według zastrz. 60, znamienna tym, że SRE jest NAA lub NA i ponad 50% jego zasad stanowią zasady pirymidynowe.
- 62. Sonda według zastrz. 61, znamienna tym, że zasada pirymidynowa jest przynajmniej w co drugiej pozycji.
- 63. Sonda według z zastrz. 61, znamienna tym, że zasady, na końcu których przyczepiony jest RG, są dwiema tyminami lub cytozynąi tyminą.
- 64. Sonda według z zastrz. 61, znamienna tym, że wszystkie zasady są zasadami pirymidynowymi .
- 65. Sonda według zastrz. 40, znamienna tym, że zawiera więcej niż jeden RG, które mogą być identyczne i których własności sygnałowe, pojedynczo lub w kombinacji, są zmienione.
- 66. Sonda według zastrz. 40 albo 65, znamienna tym, że zawiera przynajmniej jeden RG, połączony z jednym lub więcej z poniższych:i) zasady nukleotydowe ii) atomy szkieletu190 263 iii) atomy cukru i/lub atomy, z których składa się linker pomiędzy SRE i TS.
- 67. SposóS staóbasdowajtochniki syntezyneptydów,znamieirny tym, że przyłąprzi się związek o jednej z poniższych struktur chemicznych:RIOWU=-2 w których R1 oznacza wodór lub niesprzężoną. z azotem grupę alkilową zawierającą co najwyżej 6 atomów węgla, która może być podstawiona polarnymi resztami wybranymi spośród grup hydroksylowych, alkoksylowech, karboksylowych i aminowych, X oznacza O, S, Se, NR5, gdzie R5 oznacza wodór lub grupę alkilową zawierającą co najwyżej 6 atomów węgla, lub CRĆR7, gdzie R6 i R7, niezależnie oznaczają wodór lub grupę alkilową zawierającą co najwyżej 6 atomów węgla, r2, R3 i R4, z których dwa lub trzy mogą być takie same, oznaczają wodór, małe grupy alkilowe, reszty arylowe, lub parami, R2 i R4 lub r3 i r4 i w kombinacji z dwoma z atomów pierścienia, z którymi są związane, tworzą 5- lub 6-członowy pierścień aromatyczny, który może zawierać 0-2 heteroatomy takie jak O, S i NR5, gdzie R4 ma znaczenie jak określone powyżej, n = 0, 1 lub 2,Y oznacza HC=CH, a obydwa A i B oznaczają 0 lub 1; pod warunkiem, że jeśli A=1 wówczas B=0, i vice versa,R9 i R10 niezależnie oznaczają wodór lub niesprzężone z azotem grupy alkilowe zawierające co najwyżej 6 atomów węgla, które mogą być podstawione polarnymi resztami wybranymi spośród grup hydroksylowych, alkoksylowych, karboksylowych i aminowych, iRi, R2, r3, r4, r5, r2, r7, r8, r9 i r‘0 oznaczają łańcuch węglowodorowy, który może być podstawiony resztami polarnymi i zawiera grupy sztywne, grupy naładowane lub grupy o dużej objętości, i jeden z nich obejmuje grupę izotiocyjaninową grupę imidylową chlorku sulfonylu lub karbonylową, która jest oddzielona od układu aromatycznego przynajmniej przez jeden węgiel o hybrydyzacji sp3, do grupy aminowej w SRE.
- 68. Sposób wykrywania sekwencji docelowej (TS) w dsNA, znamienny tym, że TS wykrywa się z użyciem sondy określonej w zastrz. 1 bez uprzedniego rozdzielania nici dsNA.
- 69. Sposób wykrywania sekwencji docelowej (TS) w dsNA, znamienny tym, że TS wykrywa się z użyciem sondy określonej w zastrz. 40 bez uprzedniego rozdzielania nici dsNA.190 263
- 70. Sposób wykrywania sekwencji docelowej w dsNA, znamienny tym, że prowadzi się hybrydyzację sondy określonej w zastrz. 1 do jednej z nici dsNA w warunkach, w których dsNA jest niestabilny.
- 71. Sposób wykrywania sekwencji docelowej w dsNA, znamienny tym, że prowadzi się hybrydyzację sondy określonej w zastrz. 40 do jednej z nici dsNA w warunkach, w których dsNA jest niestabilny.
- 72. Sposób wykrywania lub oznaczania ilościowo danego NA w próbce, która zawiera aktywne enzymy, znamienny tym, że oznaczenie prowadzi się z użyciem sondy określonej w zastrz. 5.
- 73. Sposób oznaczania ilości danego NA w czasie rzeczywistym, w próbce, która może zawierać enzymy modyfikujące NA, degradujące NA i syntetyzujące NA, znamienny tym, że oznaczenie prowadzi się z użyciem sondy określonej w z zastrz. 5.
- 74. Sposób wykrywania TS w ssNA, znamienny tym, że prowadzi się hybrydyzację sondy określonej w zastrz. 1 i oligomeru do blisko położonych części TS, tak że RG oddziałuje z regionem dupleksu tworzonego przez oligomer.
- 75. Sposób wykrywania TS w ssNA, znamienny tym, że prowadzi się hybrydyzację sondy określonej w zastrz. 40 i oligomeru do blisko położonych części TS, tak że RG oddziałuje z regionem dupleksu tworzonego przez oligomer.
- 76. Sposób wykrywania lub oznaczania ilościowego NA w próbce, znamienny tym, że stosuje się sondę określoną w zastrz. 1, którąjest unieruchomiona.
- 77. Sposób wykrywania lub oznaczania ilościowego NA w próbce, znamienny tym, że stosuje się sondę określoną w zastrz. 40, którąjest unieruchomiona.
- 78. Zastosowanie sondy określonej w z zastrz. 1 do zlokalizowania odcinka w chromosomie lub części chromosomu przez bezpośrednią obserwację hybrydy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
- 79. Zastosowanie sondy określonej w z zastrz. 40 do zlokalizowania odcinka w chromosomie lub części chromosomu przez bezpośrednią obserwację hybrydy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9602183A SE506700C2 (sv) | 1996-05-31 | 1996-05-31 | Sond och förfaranden för analys av nukleinsyra |
| PCT/SE1997/000953 WO1997045539A1 (en) | 1996-05-31 | 1997-05-30 | Probe for analysis of nucleic acids |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL330201A1 PL330201A1 (en) | 1999-04-26 |
| PL190263B1 true PL190263B1 (pl) | 2005-11-30 |
Family
ID=35788253
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL97330201A PL190263B1 (pl) | 1996-05-31 | 1997-05-30 | Sondy dla docelowej sekwencji kwasu nukleinowego (TS) i ich zastosowania, sposób standardowej techniki syntezy peptydów, sposoby wykrywania TS w dsNA, sposoby wykrywania lub oznaczania ilościowo danego NA w próbce, sposób oznaczania ilości danego NAw próbce w czasie rzeczywistym, sposoby wykrywania TS w ssNA |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL190263B1 (pl) |
-
1997
- 1997-05-30 PL PL97330201A patent/PL190263B1/pl not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL330201A1 (en) | 1999-04-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2256545C (en) | Probe for analysis of nucleic acids | |
| US6225052B1 (en) | Method for determining a nucleic acid | |
| Hüsken et al. | “Four-potential” ferrocene labeling of PNA oligomers via click chemistry | |
| JP2002501102A (ja) | 非対称シアニン色素クエンチャー | |
| WO2003091455A1 (en) | Compositions and methods related to two-arm nucleic acid probes | |
| JP2003532745A (ja) | エネルギー伝達アッセイ法および試薬 | |
| EP2780480B1 (en) | Gamma-pna miniprobes for fluorescent labeling | |
| Lartia et al. | New cyanine–oligonucleotide conjugates: relationships between chemical structures and properties | |
| US20190002491A1 (en) | Fluorescent dyes and methods of use thereof | |
| EP0968309B1 (en) | Method for determining a nucleic acid | |
| JPWO1996025518A1 (ja) | 核酸分析用プローブおよび検出方法 | |
| PL190263B1 (pl) | Sondy dla docelowej sekwencji kwasu nukleinowego (TS) i ich zastosowania, sposób standardowej techniki syntezy peptydów, sposoby wykrywania TS w dsNA, sposoby wykrywania lub oznaczania ilościowo danego NA w próbce, sposób oznaczania ilości danego NAw próbce w czasie rzeczywistym, sposoby wykrywania TS w ssNA | |
| WO2006084067A2 (en) | Dark quenchers, probes and other conjugates incorporating the same, their use | |
| WO2001002558A1 (en) | Probe for analysis of nucleic acids | |
| Rozovsky et al. | Bifunctional reactive pentamethine cyanine dyes for biomedical applications | |
| AU768137B2 (en) | Probe for analysis of nucleic acids | |
| US20100105028A1 (en) | Probe for detecting nucleic acids | |
| HK1056743A (en) | 4-[(3-methyl-2(3h)-benzothiazolyliden)methylene]-quinoline and -pyridine derivatives as reporter groups in probes for analysis of nucleic acids | |
| CA2451442A1 (en) | Fluorescent dyes for probes for analysis of nucleic acids | |
| Nozeret et al. | Synthesis of mouse centromere-targeted polyamides and physico-chemical studies of their interaction with the target double-stranded DNA | |
| WO1996025518A1 (en) | Probe for use in nucleic acid analysis and detecting method | |
| Homer | Strategies to Improve the Brightness of Nucleic Acid Hybridization Probes for mRNA Detection in Live T Cells | |
| EP0815259B1 (en) | Modulation of the binding properties of nucleic acid binding partners | |
| Gupta et al. | Gamma-FIT-PNAs as sensitive RNA probes | |
| Rastede | The Design, Synthesis and Characterization of Bright Fluorescent Probes for Biomolecule Detection |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20090530 |