CN100359000C - 木质素降解细菌的分离和适应性培养的方法 - Google Patents
木质素降解细菌的分离和适应性培养的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN100359000C CN100359000C CNB2003801102680A CN200380110268A CN100359000C CN 100359000 C CN100359000 C CN 100359000C CN B2003801102680 A CNB2003801102680 A CN B2003801102680A CN 200380110268 A CN200380110268 A CN 200380110268A CN 100359000 C CN100359000 C CN 100359000C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lignin
- mtcc
- bacterial
- xylogen
- consortium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 title claims abstract description 74
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 65
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 title claims abstract description 51
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 title claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 title abstract description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title abstract 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 73
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims description 31
- 230000008953 bacterial degradation Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001533 ligninolytic effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 41
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 35
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 35
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 25
- 108010054320 Lignin peroxidase Proteins 0.000 description 22
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 21
- OEGPRYNGFWGMMV-UHFFFAOYSA-N (3,4-dimethoxyphenyl)methanol Chemical compound COC1=CC=C(CO)C=C1OC OEGPRYNGFWGMMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 238000011160 research Methods 0.000 description 11
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 108010029541 Laccase Proteins 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- WJUFSDZVCOTFON-UHFFFAOYSA-N veratraldehyde Chemical compound COC1=CC=C(C=O)C=C1OC WJUFSDZVCOTFON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 7
- 241000256602 Isoptera Species 0.000 description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 6
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000222393 Phanerochaete chrysosporium Species 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 4
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 4
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 4
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 4
- 229920001131 Pulp (paper) Polymers 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 4
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 4
- 238000012549 training Methods 0.000 description 4
- 241001559589 Cullen Species 0.000 description 3
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 108010059896 Manganese peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 3
- 241001655322 Streptomycetales Species 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 3
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 239000002655 kraft paper Substances 0.000 description 3
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 3
- 241000186046 Actinomyces Species 0.000 description 2
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 2
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 2
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 2
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 2
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 2
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187362 Actinomadura Species 0.000 description 1
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 1
- 241000186073 Arthrobacter sp. Species 0.000 description 1
- 241000228232 Aspergillus tubingensis Species 0.000 description 1
- 241000857896 Bjerkandera sp. Species 0.000 description 1
- 108010031396 Catechol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000030523 Catechol oxidase Human genes 0.000 description 1
- 241001478240 Coccus Species 0.000 description 1
- 241001290175 Coriolopsis trogii Species 0.000 description 1
- 241001535083 Dialister Species 0.000 description 1
- 235000007810 Eryngium campestre Nutrition 0.000 description 1
- 240000005980 Eryngium maritimum Species 0.000 description 1
- 235000003933 Eryngium maritimum Nutrition 0.000 description 1
- 244000166124 Eucalyptus globulus Species 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 1
- 241000690372 Fusarium proliferatum Species 0.000 description 1
- 241000605909 Fusobacterium Species 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000191936 Micrococcus sp. Species 0.000 description 1
- 241000187708 Micromonospora Species 0.000 description 1
- KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N Peracetic acid Chemical compound CC(=O)OO KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000252132 Pleurotus eryngii Species 0.000 description 1
- 235000001681 Pleurotus eryngii Nutrition 0.000 description 1
- 241001503904 Sphaerimonospora mesophila Species 0.000 description 1
- 241000187219 Streptomyces badius Species 0.000 description 1
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 description 1
- 241000948169 Streptomyces viridosporus Species 0.000 description 1
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- WFWLQNSHRPWKFK-UHFFFAOYSA-N Tegafur Chemical compound O=C1NC(=O)C(F)=CN1C1OCCC1 WFWLQNSHRPWKFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000203780 Thermobifida fusca Species 0.000 description 1
- 241000592342 Tracheophyta Species 0.000 description 1
- 229920002522 Wood fibre Polymers 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000078961 bacterium L35 Species 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- 238000004177 carbon cycle Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical group 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 239000000686 essence Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N glyoxylic acid Chemical compound OC(=O)C=O HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000011121 hardwood Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000010842 industrial wastewater Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 125000003473 lipid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 1
- 230000002371 mycocidal effect Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 125000000951 phenoxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(O*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000004537 pulping Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000000246 remedial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000003352 sequestering agent Substances 0.000 description 1
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 1
- 238000010563 solid-state fermentation Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 125000004646 sulfenyl group Chemical group S(*)* 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 235000014101 wine Nutrition 0.000 description 1
- 239000002025 wood fiber Substances 0.000 description 1
- 229920001221 xylan Polymers 0.000 description 1
- 150000004823 xylans Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P39/00—Processes involving microorganisms of different genera in the same process, simultaneously
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种采用木质素降解菌的聚生体来降解木质素的新方法。本发明也公开了从特定地点分离细菌并对木质素降解菌进行适应性培养的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种采用从特定地点分离出的木质素降解菌的设定聚生体降解木质素的新的需氧型生物方法。
背景技术
真菌
木质素是生物圈中最丰富的芳香族聚合物。在所有维管植物的细胞壁内都发现了与纤维素和半纤维素相结合存在的木质素。由于木质素相互之间的单元键是不可水解的，因此木质素难以发生化学降解或生物降解。在植物细胞壁内，木质素围绕在纤维素周围而形成基体，该基体本身是难降解的。木质素发生生物降解是造成木材在使用中发生多数天然破坏的原因，并且也可能在植物致病中起到了关键作用。另一方面，降解木质素的生物和它们的酶的潜在应用已经引起了关注，原因是它们可以为纸浆和纸工业提供环保技术。迄今为止，仅有少量的微生物群落能降解复合的木质素聚合物，最好的例子就是白色腐朽菌(white rot fungi)。关于生物降解木质素的多数研究都仅集中于一些真菌，如黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、Streptomycesviridosporus、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、硬毛栓菌(Trametes trogii)、层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)(Regaldo等，1997)等。(1)
在木材中引起白腐病的木腐担子菌类真菌是自然界中最有效的木质素降解物(Kirk and Farrell，1987；Eriksson等，1990)，且它们可能是木质素化组织的碳循环中的主要的天然试剂。尚未公开过其他微生物可作为纯培养物而有效地使木质素化的组织发生矿化(Kirk and Cullen，1998)。木腐担子菌类真菌在分类学上是一群异种高等真菌，其特征在于它们能利用一组细胞外的木质素降解酶来解聚和矿化木质素。在过去30年内，人们已经在有关生物技术应用，如生物制浆、生物漂白、纸浆厂派出污水、以及土壤生物补救技术方面对白色腐朽菌作用的木质素降解进行了深入细致的研究 (Akhtar等，1992，1998；Lamar等，1992；Messner和Srebotnik，1994)。
人们已经对黄孢原毛平革菌的木质素降解进行了酶学和生物分子学的研究(Gold和Alic，1993；Cullen，1997；Kirk和Cullen，1998)。
许多木质素降解所必需的酶在20世纪80年代初期以前都未得到鉴定，当时只有漆酶是已知的。由于在20世纪80年代初期发现了两种重要的过氧化物酶，即1983年发现的木质素过氧化物酶(LiPs)和1984年发现的锰过氧化酶(MnPs)(Kirk和Farrell，1987)，因而能从真菌中分离出一系列酶并对它们进行了详细的鉴定。
LiP(木质素过氧化物酶)被认为是白色腐朽菌作用的木质素生物降解中的一种关键酶。人们构建了对编码P.chrysosporium的主要木质素过氧化物酶(LiP)同功酶的基因特异性的DNA探针。这些探针用于研究LiP酶在规定的低氮介质中的瞬时表达(Boominathan等，1993)。
也发现通用的子囊菌——曲霉菌能快速转化较宽范围的木质素相关性芳香族化合物。曲霉菌已显示能大量产生高水平的半纤维素水解酶。(4)
Maria Teresa等已经说明了Bjerkandera sp.菌株BOS55是一种白色腐朽菌，它可漂白EDTA提取的桉树氧脱木素牛皮浆(UKP)而不需要锰。进一步地，在不存在锰的条件下，加入浓度为1-5mM的简单生理学有机酸(如羟基乙酸盐，乙醛酸盐，草酸盐以及其他)刺激了亮度增加，且纸浆去木质素作用是不加入酸的情况下的2-3倍。这一刺激归因于MnP和LiP的产量增加，以及藜芦基醇和草酸盐的生理学浓度增加。这些因素能显著提高超氧化物阴离子根的量，同时说明了引起更广泛的生物漂白的原因(5)。
迄今为止，所有的基础研究和应用研究工作都仅仅集中于真菌。在对生纸浆进行生物漂白的情况下，由于真菌的丝状体引起了空间位阻，使得利用真菌是不可行的。因此，鉴定出具有木质素氧化酶的细菌将具有重大意义。
细菌
细菌在木质素生物降解中的作用仍处于推测中。一些工作者已经证明了混合的(Sundman等，1968)或纯的细菌培养物(Sorensen，1962)能在作为碳源的木质素上生长。Pseudomonas spp.是Kawakami(1976)以及Odier和Monties(1977)要求保护的，其可以降解植物木质素。Odier和Montis也指出了几种其他的细菌菌株，这些细菌菌株可在7天时间内消耗掉50％以上处于含葡萄糖的矿物介质中的木质素。
采用几株诺卡氏菌(Nocardia)和假单胞菌(Pseudomonas spp.)以及一些从废木质素含量高的河水中分离出的未经鉴定的细菌，测定它们从特异性14C-标记的松柏醇(DHP)或玉米秆木质素的脱氢聚合物中释放14CO2的能力。然而，它们中仅有一部分能从标记的木质素中释放出大量的14CO2。所测试的Nocardia spp.比Pseudomonas spp.以及未经鉴定的细菌的活性更高。(6)
放射菌是在木质纤维素发生分解的土壤和堆肥中发现的丝状细菌。有几份报道所提供的证据表明属于链霉菌属的几个种能降解木质素。其他降解木质素的放射菌包括嗜中温高温单孢菌(Thermomonospora mesophila)，马杜拉放线菌(Actinomadura)和微单孢菌(Micromonospora)，链霉菌(Streptomyces)具有最高的降解木质素的能力。在多数研究中，在含有木质纤维素的培养物中产生了大量降解木质素的酶，这表明诱导机制是有效的。
在研究白蚁和它们的肠内微生物的共生关系时，Ajit Verma等(1994)断定白蚁土壤和白蚁内脏细菌两者在聚合物的解聚作用方面都起到了重要作用。内脏细菌能更有效地降解纤维素物质和半纤维素物质。从白蚁内脏的纯培养物中获得了水解纤维素和半纤维素的几种细菌分离物。其中的一些是节杆菌(Arthrobacter sp.)，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，梭杆菌(Clostridiumsp.)，微球菌(Micrococcus sp.)，链霉菌(Streptomycessp.)，粘质沙雷氏杆菌(Serratia marcescens)。从白蚁内脏中仅获得了一些分解木聚糖的细菌(Micrococcusluteuns，绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa))。白蚁引起的木质素降解中的问题让人迷惑，原因是大量白蚁内脏是厌氧的，而木质素降解的天然厌氧机制是未知的(7)。
Berrocal等(1997)已经表明了来自在固态发酵物中生长的链霉菌(streptomyces sp.)的无细胞滤液能溶解至多20％的[14C]木质素。发现细胞外过氧化物酶和酚氧化酶(漆酶)这两种酶的活性与木质素的溶解速率和矿化速率有关。(8)
往往与真菌有关的腐烂木材中所存在细菌已成为许多报道的主题。然而，细菌对降解木材成分的确切作用仍然是不清楚的。尽管营养物氮的可利用度抑制了合成的14C木质素在白腐真菌(Phanerochaete Chrysosporium)的作用下代谢成为CO2，但利用细菌Streptomyces badius来降解木质素时，最适宜采用大量的有机氮。(9)
表现出很强的漂白硬木牛皮浆能力的细菌分离物中(如在前处于审理中的专利申请中所报道)，只有少数细菌分离物具有降解木质素的能力。
酶是代谢的催化基础，因此不仅是生物学界、也是工艺设计者/工程师/化学工程师以及其他科学领域研究人员们在全世界范围的热切研究焦点。
由于酶在古时候就已经在许多制造工艺，如酒、奶酪、面包等的制造中发挥核心作用。20世纪后半叶，人们在基础研究和潜在工业应用的广泛领域中利用微生物、其代谢产物和酶的知识有了史无前例的增长。然而，仅在过去的20年内，微生物酶才在纸浆和纸工业中有商业化应用。(10)
酶在造纸业中的最普通应用是用于改进漂白。在1988年和1993年之间提交了至少15份涉及改进牛皮浆漂白的酶处理的专利或专利公开文献。
木质素，准确地应称为″天然塑料″，尽管它能抵抗微生物的攻击，但某些丝状真菌却能将其降解为CO2水平。截止1981年，人们还不是很清楚酶在木质素解聚中的作用。来自密歇根大学的Ming Tien等公开了降解木质素的酶。
在由真菌引起的木质素生物降解过程中起作用的主要酶是两种含有细胞外血红素的过氧化物酶：木质素过氧化物酶(LiP，EC 1.11.1.14)和锰过氧化物酶(MnP，EC：1.11.1.13)(Kirk等，1987)，Gold等(1989)；Hatakka(1994)。
LiP和MnP的主要区别在于被氧化的底物的性质。LiP能直接氧化非酚类或酚类木质素结构，从而分别生成芳基阳离子基团和苯氧基(Kirk，1987)。对于MnP，主要的还原底物是二价锰离子Mn2+。MnP在合适的螯合剂存在下的催化性循环产生了高活性的Mn3+螯合物，该螯合物能分别氧化各种酚类和以碳为中心的残基。(Wariishi等，1989；Hofrichter等，1998)。
通常，MnP不能氧化或解聚抵抗性更强的，构成了木材中约90％木质素的非酚类木质素结构。有趣的是，因为LiP和其它酶太大而不能渗透木制纤维素，对木质素的主要攻击似乎要求低分子量的试剂(Call等，1997)。由于这些矛盾，人们提出了通过小介质如thiyl或脂质基团的作用，使MnP分裂非酚类木质素结构的机制(Wariishi等，(1989)，Bao等，(1994))。
生长介质中的Mn(II)浓度在很大程度上影响了木质素过氧化物酶和漆酶的分泌方式。在以低Mn(II)浓度(2.4，μM)或高Mn(II)浓度(24和120μM)的胞外蛋白为对象的快速蛋白液相色谱曲线中未发现过氧化物酶。(16)
人们已经提出另一种酶——胞外酚氧化酶(漆酶)在木质素降解中的作用，且近来证明了漆酶可参与木质素降解。(Bourbonnais和Paice 1990；1992：Srinivasan等1995)。漆酶是一种含铜多酚氧化酶，已知漆酶能通过除去电子来催化许多无机和芳香族物质的氧化反应，该反应伴随着将O2还原为水。但是，尚未证明漆酶在生物漂白中的用途。
引用的参考文献
1.Etienne Odier和Isabelle Artaud，′Degradation of Lignin′.Prof.Dr.Annele Hatakka，′B iodegradation of Lignin′.
2.Frederick S.Archibald，′Lignin Peroxidase activity is not important inbiological bleaching and delignification of unbleached kraft pulp by Trametesversicolor′Appl.and Env.Microbiol.，Sept.1992 p.3101-3109.
3.Brian P.Roy和Frederick Archibald，′Effects of Kraft pulp and Lignin onTrametes versicolor carbon metabolism′，Appl.and Environmental Microbiol.，June 1993，P.1855-1863.
4.Daurte JC，Costa-Ferreira M；′Aspergilli and Lignocellulosics：Enzymology and biotechnological applications′，FEMS Microbiol.Rev.，Mar1994；13(2-3)：377-86.
5.Maria Teresa，Gumersindo Feijoo，tuned mester，Pablo Mayorga，Reyessierra-Alvarez and Jim A.Field.；′Role of Organic acids in the Manganeseindependent biobleaching system of Bjerkandera sp.Strain BOS55′，Appl.andEnv.Microbiol.，July 1998，p.2409-2417.
6.K.Haider，J，Trojanowski和V.Sundman，′Screening for Lignin degradingBacteria by means of[14C]labeled Lignin′Arch.Microbiol.119，103-106(1978).
7.Varma A.，Koll′s B.K.，Paul J.，Saxena S.，Koniig H；Lignocellulosedegradation by microorganisms from termite hills and termite guts：A survey onthe present state of art.FEMS Microbiology Reviews 15(1994)9-28.
8.M.M.Berrocal.J.Rodriguez.A.S.Ball，M.I.Perez-Lebric.M.E.Alias.′Solubilization and mineralization of[14C]lignocellulose from wheat straw byStreptomyces cyaneus CECT 3335 during growth in solid state fermentation′，Appl.Microbiol.Biotechnol(1997)48：379-384.
9.Ian D.Reid，′Effects of Nitrogen supplements on degradation of aspenwood Lignin and carbohydrate components by P.chrysosporium′，Appl.And Env.Micro，Mar 1983，p.830-837.
10.Q.K.Beg.M.Kapoor.L Mahajan.G.S.Hoondal，‘Microbial xylanasesand their industrial applications，A Review′，Appl.Microbiol.Biotech.(2001)56：326-328.
11.J.H.Clarke，K.Davidson，J.E.Rixon，J.R.Halstead，M.P.Fransen.H.J.Gilbert，G.P.Hazlewood.，′A comparison of enzyme aided bleaching of softwoodpaper pulp using combinations of xylanase，mannanase and 2-galactosidase.′Appl.Microbiol.Biotechnol.(2000)53：661-667.
12.Thomas W.Jeffries，′Enzymatic treatments of pulps：Opportunities for theEnzyme Industry in Pulp and Paper Manufacture′.
13.N.Gupta，R.M.Vohra和G.S.Hoondal.′A thermophillic extracellularxylanase from alkalophilic Bacillus sp.NG-27′，Biotechnology Letters，vol.14 No.11(Nov.1992)pp.1045-1046.
14.Michael J.Bailey，Peter Biely和Kaisa Poutanen，′Interlaboratory testingof methods forassay of xylanase activity′，Journal of Biotechnology，23(1992)257-270.
15.Toshiya susaki，TsutomuKajono，BoLi，HidehikoSugiyama，和HaruaTakatashi；′New pulp biobleaching system involving manganese peroxidaseimmobilized in a silicon support with controlled pore sizes′，Appl.and Env.Microbiol.May 2001，p2208-2212.
16.Tamara Vares，OutiNiemenmaa和Annele Hatakka，′Secretion ofLignolytic enzymes and mineralization of 14C-ring labeled synthetic Lignin bythree Phlebiatremellosa strains′，Appl.and Environmental Microbiol.Feb.1994569-573.
17.Ryuichiro Kondo，Koichi Harazono和Kokki Sakai；′Bleaching ofhardwood Kraft pulp with manganese peroxidase secreted from Phanerochaetesordida YK-624′.Appl.and Env.Microbiol.Dec.1994，p.4359-4363.
18.J.C.Rols，G.Goma，C.Fonade.′Biotechnology and the paper industry，Aerated lagoon for the wastewater treatment′.
19.J.Sealey和A.J.Ragauskas，′Residual Lignin studies oflaccase-delignified Kraft pulps′，Enz.And Micro Tech.23：422-426，1998.
发明目的
本发明的主要目的是为降解木质素而提供一种新型的木质素降解菌聚生体。
本发明的又一目的是提供一种采用上述定义的木质素降解菌来降解木质素的新型生物方法。
本发明的再一个目的是提供一种制备能降解木质素的木质素降解菌聚生体的方法。
发明概述
本发明提供了一种用于降解木质素的新型木质素降解菌聚生体，还提供了一种采用所述的木质素降解菌聚生体来降解木质素的生物方法。木质素降解菌是从锯屑连续长时间堆积的印度特定地点分离出的。培养所述的细菌来提高其降解木质素的能力，并最终制成聚生体来降解木质素。
发明详述
本发明涉及用于降解木质素的木质素降解菌的协同聚生体，所述的聚生体包括菌株CBTCC/52-03，CBTCC/53-03和CBTCC54-03的任意可能组合，这三种菌株保藏在印度昌迪加尔IMTECH的国际保藏中心，保藏号分别为MTCC 5094，MTCC 5095和MTCC 5098。
在本发明的一种实施方式中，聚生体包括菌株MTCC 5094，MTCC 5095和MTCC 5098。
在本发明的另一种实施方式中，聚生体包括菌株MTCC 5094，MTCC5095和MTCC 5098，其中每一种的含量都为20-40wt％。
在本发明的又一种实施方式中，聚生体包括比例相等的菌株MTCC 5094，MTCC 5095和MTCC 5098。
在本发明的又一种实施方式中，细菌是从锯屑和土壤的混合物中分离出的。
在本发明的又一种实施方式中，细菌是从印度Roorkhee的锯屑和土壤混合物中分离出的。
在本发明的又一种实施方式中，聚生体能降解至多0.8％的木质素。
在本发明的又一种实施方式中，MTCC 5094的性状是革兰氏阴性小杆菌。
在本发明的一种实施方式中，MTCC 5095的性状是革兰氏阴性球菌。
在本发明的又一种实施方式中，MTCC 5098的性状是革兰氏阴性长杆菌。
本发明设计的细菌分离物在基因组学与综合生物学研究所(IGIB)作为CBTCC保藏，对它们的鉴定正在进行中。
序号 培养物 保藏号
1. CBTCC/52-03 MTCC 5094
2. CBTCC/53-03 MTCC 5095
3. CBTCC/54-03 MTCC 5098
这些细菌分离物显示出能在规定的条件下降解木质素的重要能力。
本发明的细菌分离物是从印度Roorkee的木材工场分离出的，在此木材工场中锯屑连续堆积了10-12年。
本发明还提供了一种分离出能降解木质素的细菌分离物并培养该细菌分离物的方法，该方法包括：
a)在规定的条件下，采用土壤浸出液和特殊的诱导物对所述地点的细菌群进行富集；
b)采用不同的介质(0.3木质素+琼脂；土壤浸出液+琼脂；50％土壤浸出液+琼脂；0.3％木质素+50％土壤浸出液)从所述地点捕获最大量的细菌群；
c)在设定的介质、温度、pH、碳原等条件下培养从特定地点分离出的所述细菌；
d)将分离的细菌分离物接种到10ml 0.4％木质素中，检测它们降解木质素的能力；
e)采用公知的分光光度法测定木质素降解程度；
f)选择出能有效使木质素脱色的细菌分离物；
g)对所选细菌分离物进行适应较高浓度木质素的培养，观察它们的木质素降解活性的提高程度；
h)进一步选择并制成不同的细菌分离物，观察它们对降解木质素的协同作用；
i)在规定的条件下培养所述的细菌，以检测粗样品以及浓缩样品中的酶活性。在装有1000ml培养物的2升烧瓶中采用含有1.0％葡萄糖的MSM来生长培养物。培养烧瓶在30℃/120rpm下接种3天以实现旺盛生长；
j)在达到旺盛生长O.D.(1.00)之后，对得到的培养物进行离心处理；
k)收集上清液，采用硫酸铵进行浓缩，然后进行透析；
l)在310nm下采用分光光度法测定产物(藜芦基醛)的形成，分析粗样品和浓缩样品两者中的木质素过氧化物酶。
在本发明的一种实施方式中，细菌是从印度Roorkee的特殊锯屑地点分离出的。
在本发明的另一种实施方式中，对来自所述地点的土壤进行富集是这样进行的：取5g新鲜土壤放入装有100ml土壤浸出液、0.3％木质素、1mM藜芦基醇和50μl Candid B的500ml高压灭菌烧瓶中。富集烧瓶以120rpm的转速在30℃下保持96小时。
在本发明的另一种实施方式中，采用四类不同的介质(0.3木质素+琼脂；土壤浸出液+琼脂；50％土壤浸出液+琼脂；0.3％木质素+50％土壤浸出液)来捕获所述地点的最大细菌群。
在本发明的另一种实施方式中，在介质、温度、pH、碳原等的规定条件下培养分离出的细菌分离物。
在本发明的另一种实施方式中，通过在10ml 0.4％木质素中接种所有细菌分离物，从而检测它们降解木质素的能力。通过公知的分光光度法测定木质素的降解程度。
在本发明的另一种实施方式中，对一些选择出的细菌分离物进行适应较高浓度木质素的培养，观察它们的木质素降解活性的提高。将细菌接种到0.5％-1.0％的木质素中，并在30℃下保持3个月。采用公知的分光光度法测定木质素的降解程度。
在本发明的另一种实施方式中，进一步将筛选的细菌分离物被制成许多聚生体，观察它们对降解木质素的协同作用。
在本发明的另一种实施方式中，在2升装有1000ml培养物的烧瓶中，采用含有1.0％葡萄糖的MSM生长培养物来进行酶研究。培养烧瓶在30℃/120rpm的条件下接种3天，以实现旺盛生长。
在本发明的另一种实施方式中，对培养物进行离心处理，收集上清液，然后采用80％硫酸铵沉淀并进行透析。
在本发明的另一种实施方式中，通过在310nm下采用分光光度法测定产物(藜芦基醛)的形成，分析粗样品和浓缩样品两者中的木质素过氧化物酶。
本发明还提供了一种木质素的降解方法，该方法包括在25-35℃下，使含有菌株CBTCC/52-03，CBTCC/53-03和CBTCC54-03的细菌聚生体在含有木质素的溶液中接种1-5天，所述的菌株CBTCC/52-03，CBTCC/53-03和CBTCC54-03保藏在印度昌迪加尔IMTECH的国际保藏中心，保藏号分别为MTCC 5094，MTCC 5095和MTCC 5098。这些微生物也已经保藏在DeutscheSamlung von Mikroorganismen und Zelkulturen GmbH，保藏号为：
微生物 DSMZ ID 细菌
CBTCC/52-03-------- 03-498A 粘质沙雷氏杆菌(Serratia marcescens)
CBTCC/53-03-------- 03-499P 绿脓杆菌(seudomonas aeruginosa)
CBTCC/54-03-------- 03-504P 绿脓杆菌(seudomonas aeruginosa)
在本发明的一种实施方式中，细菌聚生体包括菌株MTCC 5094，MTCC5095和MTCC 5098的全细胞细菌分离物。
在本发明的另一种实施方式中，聚生体包括菌株MTCC 5094，MTCC5095和MTCC 5098。
在本发明的另一种实施方式中，聚生体包括菌株MTCC 5094，MTCC5095和MTCC 5098，其中每一种的浓度为20-40wt％。
在本发明的另一种实施方式中，聚生体包括等比例的菌株MTCC 5094，MTCC 5095和MTCC 5098。
在本发明的另一种实施方式中，细菌是从锯屑和土壤的混合物中分离出的。
在本发明的另一种实施方式中，细菌是从印度奈尼塔尔邦(Uttar pradesh)的Roorkhee的锯屑和土壤混合物中分离出的。
在本发明的另一种实施方式中，聚生体能降解至多0.8％的木质素。
为了分离木质素降解菌，进行适当的富集。为提高需要的细菌的产率，将来自所述地点的5g新鲜土壤接种到装有100ml土壤浸出液、0.3％木质素和50μl Candid B的500ml高压灭菌烧瓶(杀真菌的)中。在120rmp下使富集烧瓶在30℃下保持96小时。
为制备土壤浸出液，取1Kg土壤，使其在50℃下干燥2小时。将400g干燥后的土壤溶解在960ml单独的蒸馏水中，并在151bs下进行高压灭菌处理1小时。高压灭菌处理之后，将样品在5000rpm下离心处理10分钟。收集上清液(浸出液)，在进一步使用之前先储存在灭菌瓶中，用于制备富集烧瓶。
富集后的土壤样品在0.85％的盐水中连续稀释。从各个稀释液中分别取出100μl，在含有土壤浸出液，50％营养琼脂和0.2％木质素的培梯式培养皿上展开，以分离出木质素降解菌。如此获得的培养皿以倒转层位方式在30±2℃温育24-96小时。
根据菌落的形态和颜色选择出总共36个分离物，检测它们的木质素降解活性。挑选单独的分离菌落并将其划线到含有相同介质的新鲜培养皿上。重复上述步骤，直到获得纯的菌落。
为检测分离的细菌的木质素降解活性，将10ml 0.4％木质素装入30ml试管中，分别接种所有的细菌分离物。3天之后，不同的细菌分离物表现出对木质素具有不同的脱色程度。采用公知的分光光度法测定木质素的降解程度。
根据木质素的脱色程度，在36个分离物中总共选择出15个细菌分离物进行进一步的研究。为提高选择出的细菌分离物的木质素降解活性，进行适应较高浓度木质素的培养。所有的15个分离物在10ml 0.5％-1.00％的木质素中接种。所有试管都在30℃下保持3个月。进行长时间的培养之后，选择8个细菌分离物进行进一步的研究。选择出的分离物能使至多0.7％的木质素脱色。
采用公知的分光光度法测定木质素降解程度。为观察这些细菌分离物的协同作用，设计了许多聚生体并测试它们降解木质素的能力。发现包括被称为MTCC 5094，MTCC 5095和MTCC5098的三种细菌的聚生体能降解至多0.8％的木质素。
为找到木质素在酶水平上的降解机制，进行木质素过氧化物酶(一种用于木质素降解的重要酶)的酶分析试验。将所有3种细菌在含有1％葡萄糖的1升最小量盐介质(MSM)中接种。为引入木质素降解酶，向培养物中加入1mM藜芦基醇。所有的培养物在振荡条件下(100-120rpm)于30-35℃下温育3天。
观察到旺盛生长之后，所有培养物在4℃下以10,000rpm离心分离，收集上清液以检测酶活性。
为浓缩细胞外酶，采用100％饱和硫酸铵溶液进行80％硫酸铵沉淀，然后进行后续的透析。
既对不含细胞的粗提取物，也对浓缩的样品进行木质素过氧化物酶的酶分析试验。为进行酶分析试验，向酒石酸(pH 3)缓冲液中加入10mM藜芦基醇，5mM H2O2和400μl酶溶液。在310nm下监测产物(藜芦基醛)的形成。木质素过氧化物酶催化藜芦基醇被H2O2氧化成藜芦基醛的反应。藜芦基醇在310nm处无吸收，但藜芦基醛具有强吸收(摩尔消光系数＝9300M-1cm-1)。所有三种细菌分离物都显示出不同程度的木质素降解活性。
本发明还参照附随的实施例展开进一步描述，但实施例是以阐述的方式给出，因此不应被曲解为以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
在对木质素降解菌的努力探索中，进行了战略性的分离，以从特定地点捕获最大量的木质素降解菌。
分离点是位于印度Roorkee的一个工场，锯屑在这里连续堆积了10-12年。
为分离出木质素降解菌，进行适当的富集。为提高所需细菌的产率，使5g来自所述地点的新鲜土壤接种到装有100ml土壤浸出液、0.3％木质素和50μl Candid B的500ml高压灭菌烧瓶中。富集烧瓶在120rpm下于300℃保持96小时。
为制备土壤浸出液，取1Kg土壤，使其在500℃下干燥2小时。将400g干燥后的土壤溶解在960ml单独的蒸馏水中，并在151bs下高压灭菌1小时。进行高压灭菌之后，样品在5000rpm下离心10分钟。收集上清液，将其储存在灭菌瓶中，用于制备富集烧瓶和进一步使用。
富集的样品在0.85％盐水中进行连续稀释。从各个稀释液中取出100μl，在含有土壤浸出液、50％营养琼脂和0.2％木质素的培梯式培养皿上展开，以分离出木质素降解菌。如此获得的培养皿以倒转层位方式在30±2℃温育24-96小时。
根据菌落的形态和颜色选择出总共36个分离物，检测它们的木质素降解活性。挑选单独的分离菌落并将其划线到含有相同介质的新鲜培养皿上。重复上述步骤，直到获得纯的菌落。
实施例2
为分离出木质素降解菌，进行适当的富集。为提高所需细菌的产率，将5g来自所述地点的新鲜土壤接种到装有100ml土壤浸出液、0.3％木质素和50μl Candid B的500ml高压灭菌烧瓶中。富集烧瓶在120rpm下于300℃保持96小时。
为制备土壤浸出液，取1Kg土壤，使其在500℃下干燥2小时。将400g干燥后的土壤溶解在960ml单独的蒸馏水中，并在151bs下高压灭菌1小时。进行高压灭菌之后，样品在5000rpm下离心10分钟。收集上清液，将其储存在灭菌瓶中，用于制备富集烧瓶和进一步使用。
富集的样品在0.85％盐水中进行连续稀释。从各个稀释液中取出100μl，在含有土壤浸出液、50％营养琼脂和0.2％木质素的培梯式培养皿上展开。如此获得的培养皿以倒转层位方式在30±2℃温育24-96小时。
根据菌落的形态和颜色选择出总共36个分离物，检测它们的木质素降解活性。挑选单独的分离菌落并将其划线到含有相同介质的新鲜培养皿上。重复上述步骤，直到获得纯的菌落。
为检测分离的细菌的木质素降解活性，将10ml 0.4％木质素装入30ml试管中，分别接种所有的细菌分离物。3天之后，不同的细菌分离物表现出对木质素具有不同的脱色程度。采用公知的分光光度法测定木质素的降解程度。
表1.以木质素(0.4％)作为唯一碳源的细菌降解
| 分离物编号 | 木质素百分比 | 脱色程度 |
| L1 | 0.4％ | 5％ |
| L2 | 0.4％ | 10％ |
| L3 | 0.4％ | 4％ |
| L4 | 0.4％ | 29％ |
| L5 | 0.4％ | 36％ |
| L6 | 0.4％ | 9％ |
| L7 | 0.4％ | 4％ |
| L8 | 0.4％ | 31％ |
| L9 | 0.4％ | 20％ |
| L10 | 0.4％ | 35％ |
| L11 | 0.4％ | 40％ |
| L12 | 0.4％ | 5％ |
| L13 | 0.4％ | 32％ |
| L14 | 0.4％ | 14％ |
| L15 | 0.4％ | 12％ |
| L16 | 0.4％ | 5％ |
| L17 | 0.4％ | 6％ |
| L18 | 0.4％ | 23％ |
| L19 | 0.4％ | 9％ |
| L20 | 0.4％ | 38％ |
| L21 | 0.4％ | 12％ |
| L22 | 0.4％ | 30％ |
| L23 | 0.4％ | 25％ |
| L24 | 0.4％ | 6％ |
| L25 | 0.4％ | 14％ |
| L26 | 0.4％ | 4％ |
| L27 | 0.4％ | 42％ |
| L28 | 0.4％ | 29％ |
| L29 | 0.4％ | 33％ |
| L30 | 0.4％ | 11％ |
| L31 | 0.4％ | 13％ |
| L32 | 0.4％ | 15％ |
| L33 | 0.4％ | 7％ |
| L34 | 0.4％ | 11％ |
| L35 | 0.4％ | 34％ |
| L36 | 0.4％ | 36％ |
实施例3
为从特定地点分离出木质素降解菌，进行适当的富集。为提高所需细菌的产率，将5g来自所述地点的新鲜土壤接种到装有100ml土壤浸出液、0.3％木质素和50μl Candid B的500ml高压灭菌烧瓶中。富集烧瓶在120rpm下于300℃保持96小时。
为制备土壤浸出液，取1Kg土壤，使其在500℃下干燥2小时。将400g干燥后的土壤溶解在960ml单独的蒸馏水中，并在151bs下高压灭菌1小时。进行高压灭菌之后，样品在5000rpm下离心10分钟。收集上清液，将其储存在灭菌瓶中，用于制备富集烧瓶和进一步使用。
富集的样品在0.85％盐水中进行连续稀释。从各个稀释液中取出100μl，在含有土壤浸出液、50％营养琼脂和0.2％木质素的培梯式培养皿上展开。如此获得的培养皿以倒转层位方式在30±2℃温育24-96小时。
根据菌落的形态和颜色选择出总共36个分离物，检测它们的木质素降解活性。挑选单独的分离菌落并将其划线到含有相同介质的新鲜培养皿上。重复上述步骤，直到获得纯的菌落。
为检测分离的细菌的木质素降解活性，将10ml 0.4％木质素装入30ml试管中，分别接种所有的细菌分离物。3天之后，不同的细菌分离物表现出对木质素具有不同的脱色程度。采用公知的分光光度法测定木质素的降解程度。
根据木质素的脱色程度，从36个中选出总共15个细菌分离物，即L4，L5，L8，L10，L11，L13，L18，L20，L20，L22，L23，L27，L28，L29，L35和L36进行进一步研究。为提高选择出的细菌分离物的木质素降解活性，对它们进行适应较高浓度木质素的培养。所有的15个分离物在10ml 0.5％-1.00％的木质素中接种。所有试管都在30℃下保持3个月。进行长时间的适应性培养之后，选择8个细菌分离物，即L4，L5，L10，L13，L28，L29，L35和L36进行进一步的研究。采用公知的分光光度法测定木质素降解程度，选择出的分离物能使至多0.7％的木质素脱色(表2)。
表2对选择出的木质素降解菌进行适应较高浓度木质素的驯化
| 分离物编号 | 木质素脱色的百分比 | |||||
| 0.5％ | 0.6％ | 0.7％ | 0.8％ | 0.9％ | 1.0％ | |
| L4 | 30％ | 25％ | 11％ | 0.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| L5 | 40％ | 30％ | 12％ | 1.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| L8 | 34％ | 22％ | 10％ | 0.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| L10 | 33％ | 27％ | 12％ | 0.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| L11 | 37％ | 27％ | 10％ | 0.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| L13 | 30％ | 23％ | 14％ | 1.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| L18 | 20％ | 15％ | 8％ | 0.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| L20 | 33％ | 20％ | 7％ | 0.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| L22 | 25％ | 15％ | 3％ | 0.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| L23 | 24％ | 14％ | 2％ | 0.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| L27 | 40％ | 19％ | 11％ | 0.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| L28 | 26％ | 20％ | 15％ | 2.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| L29 | 35％ | 30％ | 12％ | 0.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| L35 | 40％ | 30％ | 20％ | 3.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| L36 | 39％ | 22％ | 14％ | 1％ | 0.0％ | 0.0％ |
实施例4
为观察培养的细菌的协同作用，设计了许多聚生体并测试它们降解木质素的能力。取三种细菌分离物而设计出聚生体。所有的聚生体都从能降解至多0.7％的木质素的8种细菌分离物，即L4，L5，L10，L13，L28，L29，L35和L36中制备。测试这些聚生体在协同方式下的木质素降解活性。
为了从用于生物降解研究的聚生体中制造接种体，将来自三种不同细菌的琼脂平板的环分别接种到含有1％葡萄糖的10ml MSM中。培养物在以100-120rpm振荡的培养摇瓶中于30℃下温育16-24小时。温育之后，在650nm下测定光学密度。通过稀释或浓缩细菌悬浮液，将培养物的光学密度保持为1.00。将所有3种培养物等比例混合，制得接种体。采用不同聚生体的接种体接种不同浓度的木质素(0.7％，0.8％，0.9％，1.0％)。所有的试管都在30℃下温育3天。采用公知的分光光度法测定木质素的降解程度。最后，选择出L35，L36和L13作为有效的木质素降解物，它们能降解至多0.8％的木质素。
表3木质素降解菌对木质素降解的协同作用
| 聚生体编号 | 木质素的脱色百分比 | |||
| 0.7％ | 0.8％ | 0.9％ | 1.0％ | |
| 1 | 13％ | 6.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| 2 | 12％ | 5.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| 3 | 18％ | 12.0％ | 2.0％ | 0.0％ |
| 4 | 12％ | 11.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| 5 | 14％ | 10.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| 6 | 16％ | 12.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| 7 | 20％ | 15.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| 8 | 17％ | 15.0％ | 3.0％ | 0.0％ |
| 9 | 13％ | 15.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| 10 | 12％ | 13.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| 11 | 11％ | 6.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| 12 | 15％ | 2.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| 13 | 22％ | 8.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| 14 | 20％ | 10.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| 15 | 15％ | 11.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| 16 | 29％ | 40％ | 8.0％ | 1.0％ |
| 17 | 12％ | 14.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| 18 | 15％ | 12.0％ | 0.0％ | 0.0％ |
| 19 | 22％ | 18.0％ | 1.0％ | 0.0％ |
| 20 | 23％ | 10％ | 0.0％ | 0.0％ |
实施例5
为找到木质素在酶水平上的降解机制，进行木质素过氧化物酶(一种用于木质素降解的重要酶)的酶分析试验。将能降解至多0.8％的聚生体16(表3)的所有3种细菌L35，L36和L13分别接种到含有1％葡萄糖的1升最小量盐介质(MSM)中。为引入木质素降解酶，向培养物中加入1mM藜芦基醇。所有的培养物在振荡条件下(100-120rpm)于30-35℃下温育3天。观察到旺盛生长之后，所有培养物在4℃下以10,000rpm离心分离，收集上清液以检测酶活性。为浓缩胞外酶，采用100％饱和硫酸铵溶液进行80％硫酸铵沉淀，然后进行后续的透析。
既对不含细胞的粗提取物，也对浓缩的样品进行木质素过氧化物酶的酶分析试验。为进行酶分析试验，向酒石酸(pH3)缓冲液中加入10mM藜芦基醇、5mM H2O2和400μl酶溶液。在310nm下监测产物(藜芦基醛)的形成。木质素过氧化物酶催化藜芦基醇被H2O2氧化成藜芦基醛的反应。藜芦基醇在310nm处无吸收，但藜芦基醛具有强吸收(摩尔消光系数＝9300M-1cm-1)。所有三种细菌分离物都显示出不同程度的木质素降解活性(表4)。
表4
| 序号 | 分离物编号 | 在310nm下的吸收 | |||
| 24小时 | 72小时 | ||||
| 开始 | 最终 | 开始 | 最终 | ||
| 1 | L35 | 0 | 0 | 1.352 | 1.491 |
| 2 | L36 | 0 | 0 | 1.265 | 1.438 |
| 3 | L13 | 0 | 0 | 1.426 | 1.537 |
优点
细菌引起的木质素降解对纸浆和纸工业废水的生物修复技术有重大意义。
木质素的细菌降解使人们对工业木质素废物转化为有用商品有了新的理解。
Claims (7)
1.一种用于降解木质素的木质素降解细菌的协同聚生体，所述的聚生体包括任意组合的菌株CBTCC/52-03，CBTCC/53-03和CBTCC54-03，这三种菌株保藏于印度昌迪加尔IMTECH的国际保藏中心，保藏号分别为MTCC5094，MTCC 5095和MTCC 5098。
2.如权利要求1所述的协同细菌聚生体，其中，所述聚生体包括每一种的含量均为20-40wt％的菌株MTCC 5094，MTCC 5095和MTCC5098。
3.如权利要求1所述的协同细菌聚生体，其中，所述聚生体包括等比例的菌株MTCC 5094，MTCC 5095和MTCC5098。
4.一种降解木质素的方法，该方法包括：
将包括菌株CBTCC/52-03，CBTCC/53-03和CBTCC54-03的细菌聚生体接种到含有木质素的溶液中，在25-35℃下培养1-5天，以上三种菌株保藏于印度昌迪加尔IMTECH的国际保藏中心，保藏号分别为MTCC 5094，MTCC5095和MTCC5098。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述细菌聚生体包括菌株MTCC5094，MTCC 5095和MTCC 5098的全细胞细菌分离物。
6.如权利要求4所述的方法，其中，所述聚生体包括每一种的含量均为20-40wt％的菌株MTCC 5094，MTCC 5095和MTCC5098。
7.如权利要求4所述的方法，其中，所述聚生体包括等比例的菌株MTCC5094，MTCC 5095和MTCC5098。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US10/393,368 US7022511B2 (en) | 2002-03-21 | 2003-03-21 | Process for the isolation and acclimatization of bacteria for lignin degradation |
| US10/393,368 | 2003-03-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1764717A CN1764717A (zh) | 2006-04-26 |
| CN100359000C true CN100359000C (zh) | 2008-01-02 |
Family
ID=33029698
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2003801102680A Expired - Fee Related CN100359000C (zh) | 2003-03-21 | 2003-11-07 | 木质素降解细菌的分离和适应性培养的方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7022511B2 (zh) |
| CN (1) | CN100359000C (zh) |
| AU (1) | AU2003280039A1 (zh) |
| BR (1) | BR0318200A (zh) |
| FI (1) | FI120771B (zh) |
| SE (1) | SE529680C2 (zh) |
| WO (1) | WO2004083409A1 (zh) |
| ZA (1) | ZA200507593B (zh) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7018510B2 (en) * | 2002-03-21 | 2006-03-28 | Council Of Scientific And Industrial Research | Process for bio-bleaching of Kraft pulp using bacterial consortia |
| CN105503292A (zh) * | 2016-01-21 | 2016-04-20 | 北京健源泽农科技有限公司 | 一种植物有机栽培基质的制备方法 |
| CN107129974B (zh) * | 2017-04-05 | 2021-07-20 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 降解非酚型木质素的方法 |
| CN108728103A (zh) * | 2018-04-17 | 2018-11-02 | 仁维国际股份有限公司 | 土壤生物素的提取方法 |
| CN109135754A (zh) * | 2018-09-04 | 2019-01-04 | 孙爱友 | 一种针对农用土壤的微生物原位培养方法 |
| CN110721996B (zh) * | 2019-10-29 | 2022-02-01 | 广州国苑规划设计有限公司 | 一种用于污染土壤植物的修复方法 |
| CN112251377B (zh) * | 2020-10-22 | 2022-10-25 | 江苏进化树生物科技有限公司 | 一种短芽孢杆菌、菌剂及其应用 |
| CN112593437A (zh) * | 2020-12-23 | 2021-04-02 | 合肥工业大学 | 一种木质素的生物降解方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5342765A (en) * | 1991-08-01 | 1994-08-30 | Occidental Chemical Corporation | Method of producing extracellular products from aerobic microorganisms |
| US5545544A (en) * | 1988-11-23 | 1996-08-13 | Sandoz Ltd. | Process for treatment of waste stream using Scytinostroma galactinum fungus ATCC 20966 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1456396A (en) * | 1973-10-17 | 1976-11-24 | Univ Louisiana State | Comestible protein from cellulose |
-
2003
- 2003-03-21 US US10/393,368 patent/US7022511B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-07 AU AU2003280039A patent/AU2003280039A1/en not_active Abandoned
- 2003-11-07 CN CNB2003801102680A patent/CN100359000C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-11-07 BR BRPI0318200-2A patent/BR0318200A/pt not_active Application Discontinuation
- 2003-11-07 WO PCT/IB2003/005026 patent/WO2004083409A1/en not_active Application Discontinuation
-
2005
- 2005-09-20 ZA ZA2005/07593A patent/ZA200507593B/en unknown
- 2005-09-21 SE SE0502078A patent/SE529680C2/sv unknown
- 2005-09-21 FI FI20050943A patent/FI120771B/fi active IP Right Grant
-
2006
- 2006-02-17 US US11/276,219 patent/US20060121592A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5545544A (en) * | 1988-11-23 | 1996-08-13 | Sandoz Ltd. | Process for treatment of waste stream using Scytinostroma galactinum fungus ATCC 20966 |
| US5342765A (en) * | 1991-08-01 | 1994-08-30 | Occidental Chemical Corporation | Method of producing extracellular products from aerobic microorganisms |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Biological colour removal of pulp and paper mill wastewaters.. Bajpai-P, et al.Journal of Biotechnology,Vol.33 No.3. 1994 * |
| 木质素生物降解及其应用研究进展. 陈立祥等.中南林学院学报，第23卷第1期. 2003 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SE0502078L (sv) | 2005-11-07 |
| FI20050943A (fi) | 2005-11-18 |
| SE529680C2 (sv) | 2007-10-23 |
| FI20050943A0 (fi) | 2005-09-21 |
| FI120771B (fi) | 2010-02-26 |
| AU2003280039A1 (en) | 2004-10-11 |
| CN1764717A (zh) | 2006-04-26 |
| US20040048355A1 (en) | 2004-03-11 |
| US20060121592A1 (en) | 2006-06-08 |
| US7022511B2 (en) | 2006-04-04 |
| WO2004083409A1 (en) | 2004-09-30 |
| BR0318200A (pt) | 2006-03-21 |
| ZA200507593B (en) | 2006-12-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI120771B (fi) | Menetelmä bakteereiden eristämiseksi ja akklimatisoimiseksi ligniinin hajottamiseksi | |
| CN106957807B (zh) | 一种地衣芽孢杆菌菌株ta65及其在促进堆肥腐熟中的应用 | |
| CN107058177A (zh) | 一种热反硝化地芽孢杆菌菌株tb62及其在促进堆肥腐熟中的应用 | |
| CN108504599A (zh) | 粘质沙雷氏菌菌株及其生产木质素降解酶和降解木质素中的应用 | |
| CN106978367A (zh) | 一种脲芽孢杆菌菌株tb42及其在促进堆肥腐熟中的应用 | |
| Böhmer et al. | Solid‐state fermentation of lignocellulotic materials for the production of enzymes by the white‐rot fungus Trametes hirsuta in a modular bioreactor | |
| US6953685B2 (en) | Process for removing dye from dye containing water or soil using white rot-lignin-modifying fungus flavadon flavus | |
| US7736879B2 (en) | Process for bio-bleaching of kraft pulp using bacterial consortia | |
| Korsa et al. | Harnessing the potential use of cellulolytic Klebsiella oxytoca (M21WG) and Klebsiella sp.(Z6WG) isolated from the guts of termites (Isoptera) | |
| CN107475150A (zh) | 一种造纸工业废水脱色的复合菌群及其制备方法 | |
| CN114736817B (zh) | 一种防治植物真菌病害的链霉菌、菌剂及其应用和防治植物真菌病害的方法 | |
| JP7307519B2 (ja) | 複合発酵培養液の製造方法 | |
| Ayşegül et al. | Isolation of lignin-degrading bacteria from different sources and testing of their ligninolytic activities | |
| JP3425453B2 (ja) | パルプ漂白微生物及びそれを用いたパルプの漂白方法 | |
| Wahyudi et al. | Potency of fibrolytic bacteria isolated from Indonesian sheep’s colon as inoculum for biogas and methane production | |
| Tampoebolon et al. | Isolation and lignocellulolytic activities of fiber-digesting bacteria from digestive tract of termite (Cryptothermes sp.) | |
| JP2005304424A (ja) | 白色腐朽菌用培地及び白色腐朽菌の培養方法 | |
| Ahlawat et al. | Dye decolorization potential of spent substrates from Agaricus bisporus and Pleurotus sp. –a laboratory study | |
| Korsa et al. | Harnessing the potential use of cellulolytic Klebsiella oxytoca (M | |
| Mandryk et al. | Sludge and lignin as growth media for the production of antimicrobial substances by selected microorganisms | |
| CN109679930A (zh) | 一种生产亚硝酸盐还原酶的发酵方法 | |
| JPH11299480A (ja) | 分解菌並びに該分解菌を利用した有機性廃棄物の分解方法及び装置 | |
| Sharma | Hardik Pathak Anima Sharma | |
| JP2006197898A (ja) | アルカリ性放線菌の分離方法及びアルカリ性放線菌 | |
| Malherbe | Biological Sulphate reduction using lignocellulose hydrolysis by-products produced by fungal hydrolysis of cenchrus ciliaris cv. Molopo (Buffelsgrass) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20080102 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |