FI120771B - Menetelmä bakteereiden eristämiseksi ja akklimatisoimiseksi ligniinin hajottamiseksi - Google Patents

Description

Menetelmä bakteereiden eristämiseksi ja akklimatisoimiseksi ligniinin hajot tamiseksi - Förfarande för isoleringen och acklimatiseringen av bakterier för att nedbryta lignin

Keksinnön ala 5 Oheinen keksintö koskee uudenlaista aerobista biologista menetelmää ligniinin hajottamiseksi määrätystä paikasta eristetyn, määritetyn lignolyyttisen bakteerikon-sortion avulla.

Tekniikan tason kuvaus

Sienet 10 Ligniini on biosfäärissä runsaimpana esiintyvä aromaattinen polymeeri. Sitä on kaikkien putkilokasvien soluseinämissä selluloosaan ja hemiselluloosaan assosioituneena. Koska ligniinin yksiköidenväliset sidokset eivät ole hydrolysoituvia, ligniinin hajottaminen on vaikeaa niin kemiallisesti kuin biologisestikin. Ligniini ympäröi selluloosaa kasvin soluseinämässä muodostaen matriisin, joka sinällään vastustaa 15 hajoamista. Suuri osa käytössä olevan puun luonnollisesta tuhoutumisesta johtuu ligniinin biologisesta hajoamisesta, ja sillä saattaa olla tärkeä merkitys kasvin pa- 1« · : V togeneesissä. Toisaalta ligniiniä hajottavia organismeja ja niiden entsyymejä hyö- dyntävien mahdollisten sovellusten houkuttelevuus on lisääntynyt, koska ne voivat :T: tuottaa ympäristöystävällisiä menetelmiä sellu- ja paperiteollisuudelle. Tällä hetkel- 20 lä vain muutama organismiryhmä pystyy hajottamaan komplekseja ligniinipoly- ·· : ;·; meerejä, ja parhaana esimerkkinä näistä ovat valkolahosienet. Suurin osa ligniinin .···. biohajoamista käsittelevästä kirjallisuudesta on keskittynyt vain muutamiin sieniin, kuten Phanerochaete chrysosporium, Streptomyces viridosporus, Pleurotus eryn- . ^ gii, Trametes trogii, Fusarium proliferatum (Regaldo et ai., 1997) jne. (1) • · · • * · · • · · 25 Puuta lahottavat basidiomycetous-sienet, jotka aiheuttavat valkolahoa puuhun, ·:··· ovat tehokkaimpia luonnossa esiintyviä ligniinin hajottajia (Kirk and Farrell, 1987; ·:··· Eriksson et ai., 1990), ja ne ovat kenties tärkeimpiä luonnonaineita puuksi muuttu- .·. neiden kudosten hiilen kierrättämisessä. Minkään muun mikro-organismin ei ole • · · ’·'·* puhdasviljelyssä esitetty mineralisoivan puuksi muuttuneita kudoksia yhtä tehok- * * 30 kaasti (Kirk and Cullen, 1998). Nämä kuuluvat taksonomisesti heterogeenisten korkeampien sienten ryhmään, joille on tunnusomaista niiden ainutlaatuinen kyky depoiymeroida ja mineraloida ligniiniä solunulkoisten lignolyyttisten entsyymien 2 avulla. Valkolahosienten aikaansaamaa ligniinin hajoamista on tutkittu runsaasti viimeisten 30 vuoden aikana liittyen bioteknisiin sovelluksiin, kuten biokuidutuk-seen, biovalkaisuun, sellutehtaiden jätevesien käsittelyyn ja maaperän biologiseen ennallistamiseen (Akhtar et ai., 1992, 1998; Lamar et ai., 1992; Messner and Sre-5 botnik, 1994).

Ligniinin hajoamisen entsymologiaa ja molekyylibiologiaa on tutkittu pääasiassa Phanerochaete chrysosporiumista (Gold and Alic, 1993; Cullen, 1997; Kirk and Cullen, 1998). Monia ligniinin hajoamisessa tarvittavia entsyymejä ei oltu karakterisoitu ennen 1980-luvun alkupuolta, jolloin tunnettiin käytännössä vain lakkaasi. 10 Sen jälkeen kun 1980-luvun alkupuolella löydettiin kaksi tärkeää peroksidaasia, nimittäin ligniiniperoksidaasit (UP) vuonna 1983 ja mangaaniperoksidaasit (MnP) vuonna 1984 (Kirk and Farrell, 1987), joukko entsyymejä on eristetty sienistä ja karakterisoitu yksityiskohtaisesti.

LiP:n (ligniiniperoksidaasin) uskotaan olevan yksi tärkeimmistä entsyymeistä val-15 kolahosienten aikaansaamassa ligniinin biohajoamisessa. Valmistettiin erityisesti tärkeimpiä ligniiniperoksidaaseja (LiP), P. chrysosporoiumin isotsyymejä koodaa-ville geeneille tarkoitettuja DNA-antureita. Näiden antureiden avulla tutkittiin LiP-entsyymien ajallista esiintymistä määritetyllä vähätyppisellä alustalla. (Boominat-han et ai. 1993).

• · · • · • · ·*· 20 Runsaslukuiseen ascomycetes-lajiin kuuluvien Aspergillus-sienten on myös todet- ··· f:*. tu muuttavan nopeasti monenlaisia ligniininsukuisia aromaattisia yhdisteitä. Niiden ,···. on osoitettu tuottavan erittäin runsaasti hemiselluloosaentsyymejä. (4) ·♦·* • · • · · ·“.* Maria Teresa et ai. on osoittanut, että Bjerkandera sp. kanta BOS55 on Valkola- * · *-·* hosieni, joka pystyy valkaisemaan EDTA-hapolla eukalyptusmassaa ja hapella de- 25 lignifioitua kraft-massaa (UKP=valkaisematon kraft-massa) ilman mangaania. Li-: säksi mangaania sisältämättömissä olosuhteissa, lisättäessä 1-5 mM yksinkertai- ··* siä fysiologisia orgaanisia happoja (esim. glykolaattia, glyoksylaattia, oksalaattia ja muita), kiilto lisääntyi ja massan delignifioituminen oli 2-3-kertaista verrattuna tu-loksiin, joissa ei käytetty happoja. Tämän paranemisen katsottiin olevan MnP:n ja • · . 30 LiP:n lisääntyneen tuotannon sekä veratryylialkoholin ja oksalaatin suurempien fy- · ' siologisten pitoisuuksien vaikutusta. Nämä tekijät edistivät superoksidianioniradi-kaalien huomattavasti parantunutta tuotantoa, mikä on mahdollisesti vaikuttanut biovalkaisun lisääntyneeseen käyttöön. (5) 3 Tähän mennessä kaikki perus- ja soveltava tutkimus on keskittynyt vain sieniin. Raakamassan biovalkaisussa sienten käyttö ei ole mahdollista sienirihmojen aiheuttamien rakenteellisten esteiden vuoksi. Sen vuoksi ligniiniä hapettavia entsyymejä sisältävien bakteerien tunnistaminen olisi erittäin tärkeää.

5 Bakteerit

Bakteereiden rooli ligniinin biohajoamisessa on edelleen otaksuman tasolla. Jotkut tutkijat ovat osoittaneet, että joko bakteerien sekaviljelmä (Sundman et ai., 1968) tai puhdasviljelmä (Sorensen, 1962) voi kasvaa ligniinissä hiililähteenä. Kawakami (1976) ja Odier ja Monties (1977) ovat väittäneet, että Pseudomonas spp. hajottaa 10 kasvien ligniinejä. Odier ja Montis ovat osoittaneet myös useita muita bakteerikantoja, jotka voivat seitsemän päivän aikana käyttää yli 50 % mineraaliainetta sisältävässä glukoosissa olevasta ligniinistä.

Useista kantoihin Nocardia ja Pseudomonas spp. kuuluvista sekä joistakin tunnistamattomista bakteereista, jotka eristettiin runsaasti jäteligniiniä sisältävästä järvi-15 vedestä, tutkittiin niiden kyky vapauttaa 14C02:sta erityisesti 14C-nimetystä konife-ryylialkoholin (DHP) tai vilja-auman ligniinien dehydropolymeeristä. Kuitenkin vain jotkut näistä pystyivät vapauttamaan merkittäviä määriä 14C02ista nimetystä ligniinistä. Tutkittu Nocardia spp. oli aktiivisempi kuin Pseudomonas spp. ja tunnista- i ’ · *: mattomat bakteerit. (6) • · • · · !*:·. 20 Actinomycetesit ovat rihmabakteereita, joita esiintyy maassa ja komposteissa, jos- « · · 'I.., sa lignoselluloosa hajoaa. Lukuisissa raporteissa todistetaan, että monet Strepto- myces-sukuun kuuluvat lajit pystyvät hajottamaan ligniiniä. Muita ligniiniä hajotta- • · · *"/ via Actinomycetes-bakteereita ovat Thermomonospora mesophila, Actinomadura, *···* Micromonospora, ja Streptomyces-suvun lajeilla on paras ligniinin hajottamiskyky.

25 Useimmissa tutkimuksissa ligniiniä hajottava entsyymi tuotettiin korkeammilla ta- • « · soilla lignoselluloosaa sisältävillä alustoilla, mikä viittaa siihen, että käytössä on ol-iut induktiomekanismi.

··» • ’ . Tutkiessaan termiittien ja niiden suolistomikrobien symbioottista suhdetta Ajit Ver- ma et al.(1994) on tullut siihen johtopäätökseen, että sekä termiitin maa- että suo-: V: 30 listobakteerit ovat tärkeitä tekijöitä polymeerin depolymeroinnissa. Suolistobakteeri··: rit pystyvät hajottamaan selluloosa- ja hemiselluloosamateriaaleja tehokkaammin.

Useita selluloosaa ja hemiselluloosaa hydrolysoivia bakteeri-isolaatteja on saatu puhdasviljelyssä termiitin suolistosta. Näitä ovat mm. Arthrobactersp., Bacillus ce- 4 reus, Clostridium sp., Micrococcus sp., Streptomyces sp., Serratia marcescens. Vain joitakin ksylaania hajottavia bakteereita on saatu termiitin suolistosta (Micrococcus luteuns, Pseudomonas aeruginosa). Kysymys ligniinin hajoamisesta termiittien vaikutuksesta on kiehtova, koska suuri osa termiitin suolistosta on anaero-5 bista, eikä luonnollisia anaerobisia ligniinin hajotusmenetelmiä vielä tunneta.(7)

Berrocal et ai. (1997) on osoittanut, että kiinteän olomuodon käymisessä kasvaneet streptomyces sp. -bakteerin soluvapaat suodokset pystyivät solubiloimaan jopa 20 % [14C]-ligniinistä. Kahden entsyymin, solunulkoisen peroksidaasin ja fe-nolioksidaasin (lakkaasin) toiminnan havaittiin korreloivan ligniinin sekä solubiloin-10 ti- että mineralointimäärien suhteen.(8)

Lukuisissa raporteissa on käsitelty lahopuussa usein sienten kanssa esiintyviä bakteereita. Niiden täsmällistä roolia puun osien hajoamisessa ei kuitenkaan ole vielä selvitetty. Vaikka ravintotypen esiintyminen tukahduttaa synteettisen 14C-ligniinin aineenvaihdunnan CC^iksi Phanerochaete Chrysosporiumin vaikutukses-15 ta, orgaanisen typen suuret pitoisuudet olivat optimaalisia Streptomyces badius -bakteerin aikaansaamalle ligniinin hajoamiselle. (9)

Vain muutamilla bakteeri-isolaateilla, joilla on havaittu olevan merkittävä lehtipuu- kraft-massan valkaisukyky erään aikaisemman vireillä olevan patenttihakemuksen ·*·*: mukaisesti, on esiintynyt ligniinin hajotuskykyä.

* · ·«· ]···. 20 Entsyymit ovat aineenvaihdunnan katalyyttisiä kulmakiviä, ja ne ovat sinällään in- « « · 'λ., tensiivisen maailmanlaajuisen tutkimuksen kohteina, ei ainoastaan biologian alalla, /**.* vaan myös prosessisuunnittelijoiden/prosessi-insinöörien, kemian insinöörien ja * ♦ * muilla tieteenaloilla toimivien tutkijoiden keskuudessa. Ammoisista ajoista lähtien • · ’·♦·* entsyymeillä on ollut keskeinen tehtävä monissa valmistusprosesseissa, kuten vii- 25 nin, juuston, leivän jne. valmistuksessa. 20. vuosisadan jälkimmäisellä puoliskolla • · i tietämyksemme mikro-organismien käytöstä, niiden aineenvaihdunnan tuotteista ja entsyymeistä lisääntyi ennätysmäisesti laajalla perustutkimuksen alalla ja näiden mahdollisten teollisten sovellusten alueella. Mikrobiaalisia entsyymejä on kuitenkin • · >(><: käytetty kaupallisesti sellu- ja paperiteollisuudessa vasta viimeisten kahden vuosi- 30 kymmenen aikana. (10) • · • · · • · · • · ·:··: Yleisin entsyymien käyttökohde paperiteollisuudessa on valkaisun parantaminen.

Vuosien 1988 ja 1993 välillä julkaistiin ainakin 15 patenttia tai patenttijulkaisua, 5 jotka koskivat kraft-massojen valkaisun parantamiseen tähtääviä entsymaattisia käsittelyjä.

Vaikka ligniini, joka tunnetaan paikkansapitävästi nimellä "luonnonmuovi", pystyykin vastustamaan mikrobihyökkäyksiä, tietyt rihmasienet pystyvät hajottamaan sen 5 C02:n tasolle. Ennen vuotta 1981 ei edes tiedetty, liittyikö ligniinin depolymerointiin entsyymejä. Michiganin yliopistossa toimivat tutkijat Ming Tien et ai. ovat löytäneet ligniiniä hajottavia entsyymejä.

Tärkeimmät sienten vaikutuksesta tapahtuvaan ligniinin biohajoamiseen liittyvät entsyymit ovat kaksi solunulkoista heemiä sisältävää peroksidaasia: ligniini-10 peroksidaasi (UP, EC 1.11.1.14) ja mangaani-peroksidaasit (MnP, EC: 1.11.1.13) (Kirk et ai., 1987), Gold et ai. (1989); Hatakka (1994). Tärkein ero LiP:n ja MnP:n välillä on hapettuvan substraatin luonne. LiP pystyy hapettamaan ei-fenolisia tai fenolisia ligniinirakenteita suoraan tuottaen ensimmäisessä tapauksessa aryyli-kationi-radikaaleja ja jälkimmäisessä tapauksessa fenoksiradikaaleja. (Kirk, 1987). 15 MnP:n ensisijainen pelkistävä substraatti on kaksivalenssinen mangaani-ioni Mn2+. MnP:n katalyyttisessä syklissä syntyy sopivien kelaattien yhteydessä erittäin reaktiivisia Mn3+-kelaattikomplekseja, jotka pystyvät hapettamaan vastaavasti erilaisia fenoleja ja hiilikeskeisiä radikaaleja. (Wariishi et ai., 1989; Hofrichter et ai., 1998).

{V. Yleensä MnP ei pysty hapettamaan tai depolymeroimaan heikommin hajoavia ei- • · 20 fenolisia ligniinirakenteita, jotka muodostavat noin 90 % puun sisältämästä ligniini·. nistä. Mielenkiintoista on, että ligniiniin kohdistuva ensisijainen hyökkäys näyttää i t · 'I.., vaativan molekyylipainoltaan pieniä aineita, koska UP ja muut entsyymit ovat liian suuria läpäistäkseen lignoselluloosan. (Call et ai., 1997). Näiden poikkeamien • · · vuoksi on esitetty, että on olemassa mekanismeja, jotka mahdollistavat MnP:n tart- • · *»··* 25 tumisen ei-fenolisiin ligniinirakenteisiin pienten välittäjäaineiden, kuten tiyyli- tai li- pidiradikaalien, vaikutuksesta. (Wariishi et ai., (1989), Bao et ai., (1994)).

• · ♦ ♦ * • « · «·· ♦

Kasvualustan Μη (II) -pitoisuus vaikuttaa voimakkaasti ligniiniperoksidaasin ja lak-kaasin erittymismuotoihin. Mn-peroksidaasia ei löydetty solunulkoisten proteiinien φ « < nopean nestekromatografian profiileista alhaisissa (2,4 μΜ) eikä korkeissa (24 ja 30 120 pM) Μη (II) -pitoisuuksissa .(16) • · • · * • * · * ♦ ·:··: Ligniinin hajoamiseen on esitetty osallistuvan vielä yhden entsyymin, solunulkois ten fenolioksidaasien (lakkaasien), ja äskettäin on osoitettu, että lakkaasi voi olla mukana ligniinin hajoamisessa. (Bourbonnais and Paice 1990; 1992: Srinivasan et 6 ai. 1995). Lakkaasi on polyfenolioksidaasia sisältävä kuparin laji, jonka tiedetään toimivan katalysaattorina monien epäorgaanisten ja aromaattisten aineiden hapettumisessa elektronien poistamisen avulla, jolloin 02 pelkistyy vedeksi. Sen sovel-luskelpoisuus biovalkaisussa on kuitenkin vielä todistettava.

5 Viitteet 1. Etienne Odier and Isabelle Artaud 'Degradation of Lignin'. Prof. Dr. Annele Hatakka, 'Biodegradation of Lignin'.

2. Frederick S. Archibald, 'Lignin Peroxidase activity is not important in biological bleaching and delignification of unbleached kraft pulp by Trametes versi- 10 color' Appi. and Env. Microbiol., Syyskuu 1992, sivut 3101-3109.

3. Brian P. Roy and Frederick Archibald, 'Effects of Kraft pulp and lignin on Trametes versicolor carbon metabolism', Appi. and Environmental Microbiol., Kesäkuu 1993, sivut 1855-1863.

4. Daurte J C, Costa-Ferreira M; 'Aspergilli and Lignocellulosics: Enzymology 15 and biotechnological applications', FEMS Microbiol. Rev., 13. maaliskuuta, 1994;(2-3):377-86.

»I · * · · • * * ,j, 5. Maria Teresa, Gumersindo Feijoo, tuned mester, Pablo Mayorga, Reyes si- [lllm erra-Alvarez and Jim A. Field.; 'Role of Organic acids in the Manganese inde- *:!,* pendent biobleaching system of Bjerkandera sp. Strain BOS55', Appi. and Env.

\···’ 20 Microbiol., Heinäkuu 1998, sivut 2409-2417.

• · · • » · ··· · ··· 6. K. Haider, J, Trojanowski, and V. Sundman, 'Screening for lignin degrading Bacteria by means of [14C] labeled lignin' Arch. Microbiol. 119, 103-106 (1978).

• · ♦ · · • · · .**·. 7. Varma A., Koll's B. K., Paul J., Saxena S., Koniig H; Lignocellulose degra- ", dation by microorganisms from termite hills and termite guts: A survey on the pre- * ] 25 sent state of art. FEMS Microbiology Reviews 15 (1994) 9-28.

• · ;y; 8. M. M. Berrocal. J. Rodriguez. A. S. Ball, M. I. Perez-Lebric. M. E. Alias.

....: 'Solubilization and mineralization of [14C] lignocellulose from wheat straw by Strep- tomyces cyaneus CECT 3335 during growth in solid state fermentation', Appi. Microbiol. Biotechnol (1997) 48:379-384.

7 9. Ian D. Reid, 'Effects of Nitrogen supplements on degradation of aspen wood lignin and carbohydrate components by P. chrysosporium', Appi. And Env. Micro, Maaliskuu 1983, sivut 830-837.

10. Q. K. Beg .M. Kapoor. L. Mahajan. G. S. Hoondal, Microbial xylanases and 5 their industrial applications, A Review', Appi. Microbiol. Biotech. (2001) 56:326- 328.

11. J. H. Clarke, K. Davidson, J. E. Rixon, J. R. Halstead, M. P. Fransen. H. J. Gilbert, G. P. Hazlewood., Ά comparison of enzyme aided bleaching of softwood paper pulp using combinations of xylanase, mannanase and 2-galactosidase.' 10 Appi. Microbiol. Biotechnol. (2000) 53: 661-667.

12. Thomas W. Jeffries, 'Enzymatic treatments of pulps: Opportunities for the Enzyme Industry in Pulp and Paper Manufacture'.

13. N. Gupta, R. M. Vohra and G. S. Hoondal. Ά thermophillic extracellular xylanase from alkalophilic Bacillus sp. NG-27', Biotechnology Letters, vol. 14 nro 11 15 (Marraskuu 1992), sivut 1045-1046.

14. Michael J. Bailey, Peter Biely and Kaisa Poutanen, 'Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity', Journal of Biotechnology, 23 (1992) ! .:. 257-270.

• M·· M» t · « *;!/ 15. Toshiya susaki, Tsutomu Kajono, BoLi, Hidehiko Sugiyama, and Harua Ta- • · ]··;* 20 katashi; 'New pulp biobleaching system involving manganese peroxidase immobi- :.: : lized in a silicon support with controlled pore sizes', Appi. and Env. Microbiol. Tou- J kokuu 2001, s. 2208-2212.

: 16. Tamara Vares, Outi Niemenmaa and Annele Hatakka, 'Secretion of ··· ·

Lignolytic enzymes and mineralization of 14C-ring labeled synthetic lignin by three * , 25 Phlebia tremellosa strains', Appi. and Environmental Microbiol. Helmikuu 1994 569-573.

* * 17. Ryuichiro Kondo, Koichi Harazono, and Kokki Sakai; 'Bleaching of hard- • · ,...: wood Kraft pulp with Manganese Peroxidase secreted from Phanerochaete sor- dida YK-624'. Appi. and Env. Microbiol. Joulukuu 1994, s. 4359-4363.

8 18. C. Rols, G. Goma, C. Fonade. 'Biotechnology and the paper industry, Aerated lagoon for the wastewater treatment'.

19. J. Sealey and A. J. Ragauskas, 'Residual lignin studies of laccase-delignified Kraft pulps', Enz. And Micro Tech. 23: 422-426,1998.

5 Keksinnön tavoitteet

Oheisen keksinnön päätavoitteena on tuottaa uudenlainen lignolyyttinen bakteeri-konsortio ligniinin hajottamiseksi.

Toinen oheisen keksinnön tavoite on tuottaa uudenlainen biologinen prosessi ligniinin hajottamiseksi edellä määritetyn lignolyyttisen bakteerikonsortion avulla.

10 Vielä eräs keksinnön tavoite on tuottaa lignolyyttisen bakteerikonsortion valmistusmenetelmä, joka pystyy hajottamaan ligniiniä.

Keksinnön yhteenveto

Oheinen keksintö tuottaa uudenlaisen lignolyyttisten bakteereiden konsortion ligniinin hajottamiseksi sekä biologisen prosessin ligniinin hajottamiseksi tämän lig-15 nolyyttisen bakteerikonsortion avulla. Lignolyyttisiä bakteereita eristettiin tietystä ' .j. Intiassa sijaitsevasta paikasta, johon kerääntyi jatkuvasti sahanpuruja pitkän ajan kuluessa. Nämä bakteerit akklimatisoitiin niiden ligniinin hajotuskyvyn parantami- *:!.* seksi ja lopuksi ne formuloitiin konsortioksi ligniinin hajottamiseksi.

• · • » • · · • : Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus • · · • · • ♦ «· 20 Oheinen keksintö koskee synergistä lignolyyttisten bakteerien konsortiota ligniinin hajottamiseksi, joka konsortio sisältää bakteerikannat CBTCC/52-03, CBTCC/53- φ .*··. 03 ja CBTCC54-03 missä tahansa mahdollisissa yhdistelmissä, ja joita bakteeri-

kantoja säilytetään kansainvälisessä säilytyspaikassa (IMTECH) Intian Chandiga-* rissa, ja jonka kirjausnumerot ovat vastaavasti MTCC 5094, MTCC 5095 ja MTCC

25 5098.

• · • ♦ * • · ·

Eräässä oheisen keksinnön sovellusmuodossa konsortio sisältää bakteerikannat ** MTCC 5094, MTCC 5095 ja MTCC 5098.

9

Eräässä toisessa oheisen keksinnön sovellusmuodossa konsortio sisältää bakteerikannat MTCC 5094, MTCC 5095 ja MTCC 5098, joista kukin on painoltaan 20-40 %.

Edelleen eräässä oheisen keksinnön sovellusmuodossa konsortio sisältää osuu-5 deltaan samankokoiset bakteerikannat MTCC 5094, MTCC 5095 ja MTCC 5098.

Edelleen eräässä oheisen keksinnön sovellusmuodossa bakteerit on eristetty sahanpurujen ja maan seoksesta.

Vielä eräässä oheisen keksinnön sovellusmuodossa bakteerit on eristetty Intian Roorkeesta peräisin olevasta sahanpurujen ja maan seoksesta.

10 Eräässä oheisen keksinnön sovellusmuodossa konsortion ligniinin hajoaminen on enintään 0,8 %.

Eräässä toisessa oheisen keksinnön sovellusmuodossa MTCC 5094:n ominaisuudet ovat seuraavat: gram-negatiivinen, muoto - pienet sauvabakteerit.

Eräässä oheisen keksinnön sovellusmuodossa MTCC 5095:n ominaisuudet ovat 15 seuraavat: gram-negatiivinen, muoto - pallobakteerit.

·· · • · t • · ' Eräässä toisessa oheisen keksinnön sovellusmuodossa MTCC 5098:n ominaisuu- * det ovat seuraavat: gram-negatiivinen, muoto - pitkät sauvabakteerit.

• · · ··# • · ]*·;* Oheiseen keksintöön liittyviä bakteeri-isolaatteja säilytetään laitoksessa nimeltä : Institute of Genomics and Integrative Biology (IGIB) CBTCC:nä, ja niiden tunnis-

• M

20 taminen on parhaillaan käynnissä.

:T: Sarjan nro Viljelmä Kirjausnro .**·. 1. CBTCC/52-03 MTCC 5094 • · 2. CBTCC/53-03 MTCC 5095 : 3. CBTCC/54-03 MTCC 5098 • · · • · • · • · · • ·*. 25 Nämä bakteeri-isolaatit osoittavat merkittävää ligniinin hajotuskykyä määritetyissä !\ * olosuhteissa.

• ·· • · 10

Oheisessa keksinnössä käytetyt bakteeri-isolaatit on eristetty Intian Roorkeessa sijaitsevasta puutyöverstaasta, johon on kerääntynyt sahanpuruja jatkuvasti 10-12 vuoden aikana.

Lisäksi keksintö tuottaa ligniinin hajotuskykyisten bakteeri-isolaattien eristämis- ja 5 akklimatisointimenetelmän, joka sisältää seuraavat vaiheet: a) mainitun paikan bakteerikasvuston rikastaminen maauutteen ja erityisten kiihdy-tinten avulla määritetyissä olosuhteissa; b) mahdollisimman suuren bakteerikasvuston eristäminen mainitusta paikasta erilaisten aineiden avulla (0,3 ligniini+agar; maauute+agar; 50 % maauute+agar; 0,3 10 % ligniini+50 % maauute); c) tietystä paikasta eristettyjen bakteerien viljely määritetyissä olosuhteissa, kuten kasvualusta, lämpötila, pH, hiililähde jne.; d) eristettyjen bakteeri-isolaattien ligniinin hajotuskyvyn tarkistaminen istuttamalla ne 10 millilitraan 0,4-prosenttista ligniiniä; 15 e) ligniinin hajoaminen mitattiin tunnetulla spektrofotometrimenetelmällä; • · · • · · : ·' f) niiden bakteeri-isolaattien valitseminen, jotka pystyvät tehokkaasti poistamaan ···: ligniinin väriä; ··«

• * I

• ♦ * • g) valituksi tulleiden bakteeri-isolaattien akklimatisointi ligniinin pitoisuuden lisää-! miseksi niiden lignolyyttisen toiminnan paranemisen toteamiseksi; ··· i ··· • · • · 20 h) toisen valittujen luettelon laadinta ja erilaisten bakteeri-isolaattien formulointi ; niiden ligniinin hajoamiseen kohdistuvan synergisen vaikutuksen toteamiseksi; * · · («t · • M • * *·;** i) mainittujen bakteerien viljely määritetyissä olosuhteissa entsyymitoiminnan to- ·:·*: teamiseksi raa'asta sekä rikastetusta näytteestä. Viljelmä kasvatettiin 1,0 % glu- ·:*·: koosia sisältävässä MSM:ssä kahden litran pullossa, jossa oli 1000 ml viljelmää.

25 Viljelmäpulloa pidettiin lämpökaapissa (30 °C/120 r/min) kolmen vuorokauden ajan **'**. runsaan kasvun aikaansaamiseksi; • · 11 j) tuloksena olevan viljelmän erottaminen sentrifugilla runsaan ulkohalkaisijan kasvun tapahduttua (1,00); k) supernatantin kerääminen ja rikastaminen ammoniumsulfaattisaostuksen avulla ja sitä seuraavalla dialyysillä; 5 I) ligniiniperoksidaasin analysointi kummastakin näytteestä, sekä raa'asta että vä-kevöidystä, mittaamalla tuotteen (veratryldehydi) muodostuminen spektrofotomet-rin avulla 310 nm:ssä.

Eräässä oheisen keksinnön sovellusmuodossa bakteerit on eristetty tietystä Intian Roorkeessa sijaitsevasta sahanpuruja sisältävästä paikasta.

10 Eräässä toisessa oheisen keksinnön sovellusmuodossa mainitusta paikasta otetun maa-aineksen rikastaminen suoritetaan ottamalla 5 g tuoretta maa-ainesta 500 ml:n autoklaavipulloon, joka sisältää 100 ml maauutetta, 0,3 % ligniiniä, 1 mM ve-ratryylialkoholia ja 50 ui Candid B:tä. Rikastuspulloa pidetään 30 °C:n lämpötilassa 96 tunnin ajan kierrosluvulla 120 r/min.

15 Eräässä toisessa oheisen keksinnön sovellusmuodossa käytetään neljää erilaista ainetta (0,3 ligniini+agar; maauute+agar; 50 % maauute+agar; 0,3 % ligniini+50 % maauute) mahdollisimman suuren bakteerikasvuston eristämiseksi mainitusta pai- : l kasta.

»«· ···* ··« V : Eräässä toisessa oheisen keksinnön sovellusmuodossa eristettyjä bakteeri- ··« 20 isolaatteja viljellään määritetyissä olosuhteissa, kuten kasvualusta, lämpötila, pH, hiililähde jne.

• · · Φ 9 • · ···

Eräässä toisessa oheisen keksinnön sovellusmuodossa kaikista bakteeri- : .·. isolaateista testataan niiden ligniinin hajotuskyky istuttamalla ne 10 millilitraan 0,4- *,···*. prosenttista ligniiniä. Ligniinin hajoaminen mitattiin tunnetulla spektrofotometrime- **.* 25 netelmällä.

* ·

Eräässä toisessa oheisen keksinnön sovellusmuodossa jotkut valitut bakteeri- .·*·. isolaatit akklimatisoidaan suuremman ligniinipitoisuuden aikaansaamiseksi niiden • * * lignolyyttisen kyvyn paranemisen toteamiseksi. Bakteerit istutetaan 0,5-1,0-prosenttiseen ligniiniin ja niitä pidetään 30 °C:ssa kolmen kuudauden ajan. 30 Ligniinin hajoaminen mitattiin tunnetulla spektrofotometrimenetelmällä.

12

Eräässä toisessa oheisen keksinnön sovellusmuodossa muodostetaan lisää valituksi tulleita bakteeri-isolaatteja useassa konsortiossa niiden ligniinin hajoamiseen kohdistuvan synergisen vaikutuksen toteamiseksi.

Eräässä toisessa oheisen keksinnön sovellusmuodossa viljelmä kasvatetaan 5 1,0 % glukoosia sisältävässä MSM:ssä kahden litran pullossa, jossa on 1000 ml viljelmää, entsyymitutkimusta varten. Viljelmäpulloja pidetään lämpökaapissa (30 °C/120 r/min) kolmen vuorokauden ajan runsaan kasvun aikaansaamiseksi.

Eräässä toisessa oheisen keksinnön sovellusmuodossa viljelmät erotetaan sentri-fugilla ja supernatantti kerätään 80-prosenttisen ammoniumsulfaattisaostuksen ja 10 dialyysin avulla.

Eräässä toisessa oheisen keksinnön sovellusmuodossa ligniiniperoksidaasi analysoidaan kummastakin näytteestä, sekä raa'asta että väkevöidystä, mittaamalla tuotteen (veratryldehydi) muodostuminen spektrofotometrin avulla 310 nm:ssä.

Oheinen keksintö tuottaa lisäksi ligniinin hajotusmenetelmän, johon sisältyy bak-15 teerikannat CBTCC/52-03, CBTCC/53-03 ja CBTCC54-03 sisältävän bakteerikon-sortion istuttaminen ligniiniä sisältävään liuokseen 1-5 vuorokauden ajaksi lämpötilassa 25-35 °C; bakteerikantoja säilytetään kansainvälisessä säilytyspaikassa :v< (IMTECH) Intian Chandigarissa ja niiden kirjausnumerot ovat MTCC 5094, MTCC

: ;* 5095 ja MTCC 5098. Tällaiset organismit on talletettu myös yhtiön Deutsche • · 20 Samlung von Mikroorganismen und Zelkulturen GmbH kokoelmaan seuraavilla kir- '·* : jausnumeroilla: **· · • * • · ·

Organismi DSMZID Bakteerit :***: CBTCC/52-03------- 03-498A Serratia marcescens ··· CBTCC/53-03...... 03-499 Pseudomonas aeruginosa : .·. 25 CBTCC/54-03------ 03-504 Pseudomonas aeruginosa ··· · ··· • · • ♦ *t* Eräässä oheisen keksinnön sovellusmuodossa bakteerikonsortio sisältää baktee- rikantojen MTCC 5094, MTCC 5095 ja MTCC 5098 kokosolu-bakteeri-isolaatit.

• · . v. Eräässä toisessa oheisen keksinnön sovellusmuodossa konsortio sisältää baktee- rikannat MTCC 5094, MTCC 5095 ja MTCC 5098.

• * 13

Edelleen eräässä toisessa oheisen keksinnön sovellusmuodossa konsortio sisältää bakteerikannat MTCC 5094, MTCC 5095 ja MTCC 5098, joista kukin on painoltaan 20-40 %.

Vielä eräässä toisessa oheisen keksinnön sovellusmuodossa konsortio sisältää 5 osuudeltaan samankokoiset bakteerikannat MTCC 5094, MTCC 5095 ja MTCC 5098.

Eräässä oheisen keksinnön toisessa sovellusmuodossa bakteerit on eristetty sahanpurujen ja maan seoksesta.

Eräässä toisessa oheisen keksinnön sovellusmuodossa bakteerit on eristetty Inti-10 an Uttar Pradeshista, Roorkeesta peräisin olevasta sahanpurujen ja maan seoksesta.

Eräässä toisessa oheisen keksinnön sovellusmuodossa konsortion ligniinin hajoaminen on enintään 0,8 %.

Lignolyyttisten bakteerien eristämiseksi suoritettiin asianmukainen rikastus. Halut- 15 tujen bakteerien tuoton parantamiseksi 5 g mainitusta paikasta peräisin olevaa tuoretta maa-ainesta istutettiin 500 ml:n autoklaavipulloon, joka sisälsi ml maa- , uutetta, 0,3 % ligniiniä ja 50 ui Candid B:tä (sienenestoaine). Rikastuspulloa pidet- • » · : ·* tiin 30 °C:n lämpötilassa 96 tunnin ajan kierrosluvulla 120 r/min.

• k· ···· ·*· V : Maauutteen valmistusta varten otettiin 1 kg maata ja sitä kuivatettiin 50 °C:ssa 20 kahden tunnin ajan. 400 g kuivattua maa-ainesta liuotettiin 960 millilitraan kerran : tislattua vettä ja autoklaavattiin 6804 grammassa (15 Ibs) tunnin ajan. Autoklaava- ·***» uksen jälkeen näytettä erotettiin sentrifugilla kierrosluvulla 5000 r/min 10 minuutin

• M

ajan. Supernatantti (uute) kerättiin ja säilöttiin steriiliin pulloon rikastuspullon val- • ,·. mistusta ja tulevaa käyttöä varten.

• · · «♦« · »·· • * **:** 25 Rikastetut maanäytteet laimennettiin sarjana 0,85-prosenttiseen suolaliuokseen.

"*" 100 ui jokaisesta vastaavasta laimenteesta levitettiin maauutetta, 50 % ravin- *:**: neagaria ja 0,2 % ligniiniä sisältäviin petrimaljoihin lignolyyttisten bakteerien eris- ,v, tämistä varten. Tällä tavoin saatuja levyjä kasvatettiin lämpötilassa 30+2 °C 24-96 *m\ tunnin ajan ylösalaisin käännettynä.

• · 14

Pesäkkeen morfologian ja värin perusteella valittiin yhteensä 36 isolaattia niiden lignolyyttisen toiminnan tarkistamista varten. Yksittäiset eristetyt pesäkkeet erotettiin ja pyyhkäistiin samaa ainetta sisältäville tuoreille levyille. Edellä kuvattua vaihetta toistettiin, kunnes saatiin puhdaspesäkkeitä.

5 Eristettyjen bakteerien lignolyyttisen toiminnan tarkistamiseksi 10 ml 0,4-prosenttista ligniiniä otettiin 30 ml:n koeputkiin ja kaikki bakteeri-isolaatit istutettiin yksitellen. Kolmen vuorokauden kuluttua eri bakteeri-isolaatit osoittivat eriasteista ligniinin värinpoistoa. Ligniinin hajoaminen mitattiin tunnetulla spektrofoto-metrimenetelmällä.

10 Ligniinin värinpoiston perusteella jatkotutkimusta varten valittiin yhteensä 15 bak-teeri-isolaattia 36 isolaatista. Valittujen bakteeri-isolaattien lignolyyttisen toiminnan parantamiseksi suoritettiin akklimatisointi ligniinin pitoisuuden lisäämiseksi. Kaikki 15 isolaattia istutettiin 10 millilitraan ligniiniä pitoisuusalueella 0,5-1,00 %. Kaikkia putkia pidettiin 30 °C:n lämpötilassa kolmen kuukauden ajan. Pitkän akklima-15 toisoinnin jälkeen jatkotutkimusta varten valittiin kahdeksan bakteeri-isolaattia. Valitut isolaatit pystyivät poistamaan ligniinin väriä aina 0,7 %:iin saakka. Ligniinin hajoaminen mitattiin tunnetulla spektrofotometrimenetelmällä.

Näiden bakteeri-isolaattien synergisen vaikutuksen toteamiseksi useita yhtymiä suunniteltiin ja testattiin niiden ligniinin hajotuskyky. Yhden kolmesta tunnuksilla 20 MTCC 5094, MTCC 5095 ja MTCC 5098 nimetyn bakteerin sisältävän konsortion todettiin pystyvän hajottamaan ligniiniä aina 0,8 %:iin saakka.

• * * »·· • ·

Ligniinin hajoamismekanismin selvittämiseksi entsyymitasolla suoritettiin entsyy- • · * :;j(: mianalyysi ligniiniperoksidaasille, ligniinin hajoamisen tärkeimmälle entsyymille.

*···: Kaikki kolme bakteeria istutettiin yhteen litraan minimaalisuola-ainetta (MSM), joka 25 sisälsi 1 % glukoosia. Lignolyyttisten entsyymien indusoimiseksi viljelmiin lisättiin 1 • · ·.: · mM veratryylialkoholia. Kaikkia viljelmiä kasvatettiin 30-35 °C:n lämpötilassa kol- :[[\* men vuorokauden ajan ravisteluolosuhteissa (100-120 r/min). Voimakkaan bak- teerikasvun toteamisen jälkeen kaikki viljelmät erotettiin sentrifugilla kierrosnopeu- • ♦ t . della 10 000 r/min 4 °C:n lämpötilassa. Supernatantti kerättiin entsyymitoiminnan 30 toteamiseksi.

• · · • · · * · ·:·*: Solunulkoisten entsyymien konsentroitumista varten suoritettiin 80-prosenttinen ammoniumsulfaattisaostus käyttäen 100-prosenttista kyllästettyä ammoniumsul-faattiliuosta ja suorittaen sen jälkeen dialyysi.

15

Ligniiniperoksidaasin entsyymianalyysi suoritettiin sekä raa'alle soluvapaalle uutteelle että väkevöidylle näytteelle. Entsyymianalyysiä varten 10 mM veratryylialko-holia, 5 mM H2C>2:sta ja 400 pl entsyymiliuosta lisättiin viinihappo (pH 3) -puskuriliuokseen. Tuotteen (veratryldehydi) muodostumista valvottiin 310 nm:ssä. 5 Ligniiniperoksidaasi katalysoi veratryylialkoholin hapettumisen H202:n vaikutuksesta veratryldehydiksi. Veratryalkoholilla ei ole lainkaan absorbanssia 310 nm:ssä, kun taas veratryldehydi absorboi voimakkaasti (moolinen absorptiokerroin=9300 M-1 cm-1). Kaikilla kolmella bakteeri-isolaatilla oli erilainen lignolyyttisen toiminnan aste.

10 Oheista keksintöä kuvataan edelleen viitaten oheisiin esimerkkeihin, jotka on annettu havainnollistamistarkoituksessa, ja täten niiden ei tule katsoa rajoittavan millään tavalla oheisen keksinnön alaa.

Esimerkki 1

Pyrittäessä tutkimaan lignolyyttisiä bakteereita suoritettiin strateginen eristäminen 15 mahdollisimman suuren lignolyyttisen bakteerikasvuston eristämiseksi tietystä paikasta.

Eristämiskohde oli Intian Roorkeessa sijaitseva verstas, jossa sahanpurua oli ke- **·*; rääntynyt jatkuvasti 10-12 vuoden kuluessa.

» · • · ·

Lignolyyttisten bakteerien eristämiseksi suoritettiin asianmukainen rikastus. Halut-20 tujen bakteerien tuoton parantamiseksi 5 g mainitusta paikasta peräisin olevaa /·;' tuoretta maa-ainesta istutettiin 500 ml:n autoklaavipulloon, joka sisälsi 100 ml ••j · maauutetta, 0,3 % ligniiniä ja 50 ui Candid B:tä. Rikastuspulloa pidettiin 30 °C:n lämpötilassa 96 tunnin ajan kierrosluvulla 120 r/min.

M aa uutteen valmistusta varten otettiin 1 kg maata ja sitä kuivatettiin 50 °C:ssa 25 kahden tunnin ajan. 400 g kuivattua maa-ainesta liuotettiin 960 millilitraan kerran tislattua vettä ja autoklaavattiin 6804 grammassa (15 Ibs) tunnin ajan. Autoklaava-\ uksen jälkeen näytettä erotettiin sentrifugilla kierrosluvulla 5000 r/min 10 minuutin ajan. Supernatantti (uute) kerättiin ja säilöttiin steriiliin pulloon rikastuspullon val-mistusta ja tulevaa käyttöä varten.

• ♦ 30 Rikastetut maanäytteet laimennettiin sarjana 0,85-prosenttiseen suolaliuokseen. 100 ui jokaisesta vastaavasta laimenteesta levitettiin maauutetta, 50 % ravintoaga- 16 ria ja 0,2 % ligniiniä sisältäviin petrimaljoihin lignolyyttisten bakteerien eristämistä varten. Tällä tavoin saatuja levyjä pidettiin lämpökaapissa 30+2 °C:n lämpötilassa 24-96 tunnin ajan ylösalaisin käännettynä.

Pesäkkeen morfologian ja värin perusteella valittiin yhteensä 36 isolaattia niiden 5 lignolyyttisen toiminnan tarkistamista varten. Yksittäiset eristetyt pesäkkeet erotettiin ja pyyhkäistiin samaa ainetta sisältäville tuoreille levyille. Edellä kuvattua vaihetta toistettiin, kunnes saatiin puhdaspesäkkeitä.

Esimerkki 2

Lignolyyttisten bakteerien eristämiseksi suoritettiin asianmukainen rikastus. Halut-10 tujen bakteerien tuoton parantamiseksi 5 g mainitusta paikasta peräisin olevaa tuoretta maa-ainesta istutettiin 500 ml:n autoklaavipulloon, joka sisälsi 100 ml maauutetta, 0,3 % ligniiniä ja 50 ui Candid B:tä. Rikastuspulloa pidettiin 30 °C:n lämpötilassa 96 tunnin ajan kierrosluvulla 120 r/min.

Maauutteen valmistusta varten otettiin 1 kg maata ja sitä kuivatettiin 50 °C:ssa 15 kahden tunnin ajan. 400 g kuivattua maa-ainesta liuotettiin 960 millilitraan kerran tislattua vettä ja autoklaavattiin 6804 grammassa (15 Ibs) tunnin ajan. Autoklaava-uksen jälkeen näytettä erotettiin sentrifugilla kierrosluvulla 5000 r/min 10 minuutin ajan. Supernatantti (uute) kerättiin ja säilöttiin steriiliin pulloon rikastuspullon val-mistusta ja tulevaa käyttöä varten.

···· ··· • · · *:!.* 20 Rikastetut maanäytteet laimennettiin Saijana 0,85-prosenttiseen suolaliuokseen.

• · ]·”* 100 ui jokaisesta vastaavasta laimenteesta levitettiin maauutetta, 50 % ravintoaga- · ria ja 0,2 % ligniiniä sisältäviin petrimaljoihin lignolyyttisten bakteerien eristämistä • · · varten. Tällä tavoin saatuja levyjä pidettiin lämpökaapissa 30+2 °C:n lämpötilassa 24-96 tunnin ajan ylösalaisin käännettynä.

• · φ · · • · · ··· 25 Pesäkkeen morfologian ja värin perusteella valittiin yhteensä 36 isolaattia niiden ·** lignolyyttisen toiminnan tarkistamista varten. Yksittäiset eristetyt pesäkkeet erotet-’ tiin ja pyyhkäistiin samaa ainetta sisältäville tuoreille levyille. Edellä kuvattua vai- *( * hetta toistettiin, kunnes saatiin puhdaspesäkkeitä.

• · * · φ • # · • ·

Eristettyjen bakteerien lignolyyttisen toiminnan tarkistamiseksi 10 ml 30 0,4-prosenttista ligniiniä otettiin 30 ml:n koeputkiin ja kaikki bakteeri-isolaatit istutettiin yksitellen. Kolmen vuorokauden kuluttua eri bakteeri-isolaatit osoittivat erias- 17 teista ligniinin värinpoistoa. Ligniinin hajoaminen mitattiin tunnetulla spektrofoto-metrimenetelmällä.

Taulukko 1. Bakteriaalinen ligniinin hajoaminen (0,4 %) ainoana hiililähteenä

Isolaatin nro_Ligniiniprosentti_Värinpoisto_ LI_0,4 %_5_%_ L2_0,4 %_10%_ L3_0,4 %_4%_ L4_0,4 %_29%_ L5_0,4 %_36%_ L6_0,4 %_9_%_ L7_0,4 %_4_%_ L8_0,4 %_31 %_ L9_0,4 %_20%_ L10_0,4 %_35%_ LII_0,4 %_40%_ L12_0,4 %_5%_ L13_0,4 %_32%_ L14_0,4 %_14%_ L15_0,4 %_12%_ ^ .:. L16_0,4 %_5%_ :*j*: L17_0,4 %_j3%_ .***: L18_0,4 %_23%_ L19_0,4 %_9% _ L20_0,4 %_38% L21_0,4 %_12%_ : .·. L22 0,4 % 30 % ♦ · · " "1·1 li····"”' - · — — ’ " — L23_0,4 % _25%_ **’ L24_0,4 %_ 6%_ L25_0,4 %_14%_ L26_0,4 %_4%_ :V: L27_0,4 %_42%_ *:·*: L28_0,4 %_ 29%_ L29_0,4 %_33%_ L30 0,4 % 111 % 18 L31_0,4 %_13%_ L32_0,4 %_15%_ L33_0,4 %_7_%_ L34_0,4 %_11 %_ L35_0,4 %_34%_ L36 0,4 % 36 %

Esimerkki 3

Tietystä paikasta olevien lignolyyttisten bakteerien eristämiseksi suoritettiin asianmukainen rikastus. Haluttujen bakteerien tuoton parantamiseksi 5 g mainitusta 5 paikasta peräisin olevaa tuoretta maa-ainesta istutettiin 500 ml:n autoklaavipul-loon, joka sisälsi 100 ml maauutetta, 0,3 % ligniiniä ja 50 ui Candid B:tä. Rikastus-pulloa pidettiin 30 °C:n lämpötilassa 96 tunnin ajan kierrosluvulla 120 r/min.

Maauutteen valmistusta varten otettiin 1 kg maata ja sitä kuivatettiin 50 °C:ssa kahden tunnin ajan. 400 g kuivattua maa-ainesta liuotettiin 960 millilitraan kerran 10 tislattua vettä ja autoklaavattiin 6804 grammassa (15 Ibs) tunnin ajan. Autoklaava-uksen jälkeen näytettä erotettiin sentrifugilla kierrosluvulla 5000 r/min 10 minuutin ajan. Supernatantti (uute) kerättiin ja säilöttiin steriiliin pulloon rikastuspullon vai- • · * t\m mistusta ja tulevaa käyttöä varten.

• · · · ·** • · φ

Rikastetut maanäytteet laimennettiin sarjana 0,85-prosenttiseen suolaliuokseen.

*·..* 15 100 ui jokaisesta vastaavasta laimenteesta levitettiin maauutetta, 50 % ravintoaga- • · : ria ja 0,2 % ligniiniä sisältäviin petrimaljoihin lignolyyttisten bakteerien eristämistä varten. Tällä tavoin saatuja levyjä pidettiin lämpökaapissa 30+2 °C:n lämpötilassa 24-96 tunnin ajan ylösalaisin käännettynä.

• ·

• · I

• · · • » · · .···. Pesäkkeen morfologian ja värin perusteella valittiin yhteensä 36 isolaattia niiden 20 lignolyyttisen toiminnan tarkistamista varten. Yksittäiset eristetyt pesäkkeet erotet- * * tiin ja pyyhkäistiin samaa ainetta sisältäville tuoreille levyille. Edellä kuvattua vai- hetta toistettiin, kunnes saatiin puhdaspesäkkeitä.

• * * * · · • · ·

Eristettyjen bakteerien lignolyyttisen toiminnan tarkistamiseksi 10 ml 0,4- * · prosenttista ligniiniä otettiin 30 ml:n koeputkiin ja kaikki bakteeri-isolaatit istutettiin 19 yksitellen. Kolmen vuorokauden kuluttua eri bakteeri-isolaatit osoittivat eriasteista ligniinin värinpoistoa.

Ligniinin värinpoiston perusteella jatkotutkimusta varten 36 bakteeri-isolaatista valittiin yhteensä 15, nimittäin L4, L5, L8, L10, L11, L13, L18, L20, L20, L22, L23, 5 L27, L28, L29, L35 ja L36. Valittujen bakteeri-isolaattien lignolyyttisen toiminnan parantamiseksi suoritettiin akklimatisointi ligniinin pitoisuuden lisäämiseksi. Kaikki 15 isolaattia istutettiin 10 millilitraan ligniiniä pitoisuusalueella 0,5-1,00 %. Kaikkia putkia pidettiin 30 °C:n lämpötilassa kolmen kuukauden ajan. Pitkän akklimatisoin-nin jälkeen jatkotutkimusta varten valittiin kahdeksan bakteeri-isolaattia, nimittäin 10 L4, L5, L10, L13, L28, L29, L35 ja L36. Ligniinin hajoaminen mitattiin tunnetulla spektrofotometrimenetelmällä. Valitut isolaatit olivat pystyneet poistamaan ligniinin väriä aina 0,7 %:iin saakka. (Taulukko 2)

Taulukko 2. Valittujen lignolyyttisten bakteerien akklimatisointi suurempaan ligniinipitoisuuteen

Isolaatin Ligniinin värinpoistoprosentti nr0 0,5% 0,6% 0,7% 0,8% 0,9% 1,0% L4_30% 25% 11% 0,0%_0,0 % 0,0 % L5_40% 30% 12% 1,0%_0,0 % 0,0 % L8_34% 22% 10% 0,0%_0,0 % 0,0 % L10 33% 27% 12% 0,0% 0,0% 0,0% • · · ........—..... ' —"*— ' 1 —- ί“·: L11 37% 27% 10% 0,0%_0,0 % 0,0 % :V* L13 30% 23% 14% 1,0%_0,0 % 0,0 % I***! L18 20% 15% 8% 0,0%_0,0 % 0,0 % L20 33 % 20 % 7 % 0,0 %_0,0 % 0,0 % : ... L22 25% 15% 3% 0,0%_0,0 % 0,0 % ::ί.: L23 24 % 14 % 2 % 0,0 %_0,0 % 0,0% **·*.* L27 40% 19% 11% 0,0%_0,0 % 0,0 % L28 26% 20% 15% 2,0%_0,0 % 0,0 % L29 35% 30% 12% 0,0%_0,0 % 0,0 % L35 40 % 30 % 20 % 3,0 % 0,0 % 0,0 % • * ------------------- -------...... ^^ .........

·:*·· L36 39 % 22 % 14 % |l%_0,0 % 0,0 % 15 20

Esimerkki 4

Akklimatisoitujen bakteereiden synergisen vaikutuksen toteamiseksi laadittiin useita yhtymiä ja testattiin niiden ligniinin hajotuskyky. Konsortiot laadittiin yhdistämällä kolme bakteeri-isolaattia. Kaikki konsortiot tehtiin 8 bakteeri-isolaatista, nimittäin 5 L4, L5, L10, L13, L28, L29, L35 ja L36, jotka ovat pystyneet hajottamaan ligniinin aina 0,7 %:iin saakka. Näistä yhtymistä testattiin niiden lignolyyttinen toiminta sy-nergisellä menetelmällä.

Siirrosteen tekemiseksi biohajoamistutkimusta varten kolmen erilaisen bakteerin agarlevystä otettu silmukka istutettiin yksitellen 10 millilitraan MSM:ää, joka sisälsi 10 1 %:n glukoosia. Viljelmiä kasvatettiin 30 °C:n lämpötilassa 16-24 tunnin ajan ra vistavassa kasvatuskaapissa kierrosluvulla 100-120 r/min. Kasvatuksen jälkeen mitattiin optinen tiheys 650 nm:ssä. Viljelmän optinen tiheys asetettiin arvoon 1.00 joko laimentamalla tai väkevöimällä bakteerisuspensiota. Kaikki kolme viljelmää sekoitettiin yhteen samassa suhteessa siirrosteen tekemiseksi. Eri ligniinipitoi-15 suuksia (0,7 %, 0,8 %, 0,9 %, 1,0 %) istutettiin eri yhtymien siirrosteella. Kaikkia putkia kasvatettiin lämpökaapissa 3 vuorokauden ajan lämpötilassa 30 °C. Ligniinin hajoaminen mitattiin tunnetulla spektrofotometrimenetelmällä. Lopuksi valittiin bakteeri-isolaatit L35, L36 ja L13 sisältävä tehokas ligniinin hajottajakonsortio, joka pystyi hajottamaan ligniiniä aina 0,8 %:iin saakka.

·« · • · • · • * 20 Taulukko 3. Lignolyyttisten bakteerien synerginen vaikutus ligniinin ha-joamiseen.

* · I

• ·# | 1 I ‘ ............ " " 111 *...: Konsortion nro Ligniinin värinpoistoprosentti __ : _0,7 %_0,8 %_0,9 %_1,0%_ O J_13%_6,0 %_0,0 %_0,0 %_ 2 12%_5,0 %_0,0 %_0,0 %_ 3 _18%_12,0% 2,0%_0,0 %_ O 4_12%_11,0% 0,0%_0,0 %_ 5 _14%_10,0%_0,0 %_0,0 %_ 6 _16%_12,0 %_0,0 %_0,0 %_ 7 20% 15,0% 0,0% 0,0% • · · 1 " ................ .......-.......................— 8 _17%_15,0%_3,0 %_0,0 %_ 9 _13%_15,0%_0,0 %_0,0 %_ 10 [12% 113,0% 0,0 % 0,0 % 21 _11_11 %_6,0 %_0,0 %_0,0 %_ _12_15%_2,0 %_0,0 %_0,0 %_ _13_22%_8,0 %_0,0 %_0,0 %_ J4_20%_10,0%_0,0 %_0,0 %_ _15_15%_11,0%_0,0 %_0,0 %_ 16 _29%_40%_8,0 %_1,0%_ 17 _12 %_14,0 %_0,0 %_0,0 %_ _18_15%_12,0%_0,0 %_0,0 %_ _19_22%_18,0%_1,0%_0,0 %_ 20 [23% 10,0 % 0,0 % 10,0%

Esimerkki 5

Ligniinin hajoamismekanismin selvittämiseksi entsyymitasolla suoritettiin entsyy-mianalyysi ligniiniperoksidaasille, ligniinin hajoamisen tärkeimmälle entsyymille. 5 Kaikki kolme bakteeria L35, L36 ja L13 konsortiosta 15 (Taulukko 3), joka pystyi hajottamaan ligniiniä aina 0,8 %:iin saakka, istutettiin yksitellen 1 litraan minimi-suola-ainetta (MSM), joka sisälsi 1 %:n glukoosia. Lignolyyttisten entsyymien in-dusoimiseksi viljelmiin lisättiin 1 mM veratryylialkoholia. Kaikkia viljelmiä kasvatet- • * · : V tiin 30-35 °C:n lämpötilassa kolmen vuorokauden ajan ravisteluolosuhteissa (100- v 10 120 r/min). Voimakkaan bakteerikasvun toteamisen jälkeen kaikki viljelmät erotet- :*·*: tiin sentrifugilla kierrosnopeudella 10 000 r/min 4 °C:n lämpötilassa. Supernatantti .**·. kerättiin entsyymitoiminnan tarkistamiseksi.

··· • * • · · II·

Solunulkoisten entsyymien konsentroimista varten suoritettiin 80-prosenttinen **·* ammoniumsulfaattisaostus käyttäen 100-prosenttista kyllästettyä ammoniumsul- 15 faattiliuosta ja suorittaen sen jälkeen dialyysi.

• 1 · • I I III · ·#·

Ligniiniperoksidaasin entsyymianalyysi suoritettiin sekä raaoille soluvapaille uut-teille että väkevöidylle näytteelle. Entsyymianalyysiä varten 10 mM veratryylialko-holia, 5 mM H202:sta ja 400 pl entsyymiliuosta lisättiin viinihappo (pH 3) -puskuriliuokseen. Tuotteen (veratryldehydi) muodostumista valvottiin 310 nm:ssä. 20 Ligniiniperoksidaasi katalysoi veratryylialkoholin hapettumisen H202:n vaikutukses-ta veratryldehydiksi. Veratryalkoholilla ei ole lainkaan absorbanssia 310 nm:ssä, kun taas veratryldehydi absorboi voimakkaasti (moolinen absorptiokerroin=9300 22 M-1 cm-1). Kaikilla kolmella bakteeri-isolaatilla oli erilainen lignolyyttisen toiminnan aste (taulukko 4).

Taulukko 4. L35:n, L36:n ja L13:n entsyymitoiminta ulkohalkaisijan kasvun suhteen 15 minuutin kasvatuksen jälkeen

Sarjan nro Isolaatin nro Absorbanssi, 310 nm _ 24 tuntia _72 tuntia _

__ALKU LOPPU ALKU LOPPU

J_JL35_0_0_ 1,352 1,491 2 _L36_0_0_ 1,265 1,438 3 L13 |o lo 1,426 1,537 5

Edut

Bakteereiden avulla tapahtuvalla ligniinin hajottamisella on valtava merkitys massa- ja paperiteollisuuden jätevesien biologisessa ennallistamisessa.

Ligniinin bakteriaalinen hajoaminen antaa uutta tietoa teollisen ligniinijätteen 10 muuntamisesta hyödyllisiksi raaka-aineiksi.

• · • « • · * • · · · • M • * » • · · ··· • • · ··« • · • · · • · · ··* * e·· • • * ·*· • * • » · • t * «·· « «·* t · • * • «t « · * · • · • · · • · t t e • « ·

Claims (37)

1. CBTCC/52-03 MTCC 5094

1. Synerginen lignolyyttisten bakteerien konsortio ligniinin hajottamiseksi, joka konsortio sisältää bakteerikannat CBTCC/52-03, CBTCC/53-03 ja CBTCC54-03 missä tahansa mahdollisissa yhdistelmissä, ja joita bakteerikantoja säilytetään 5 kansainvälisessä säilytyspaikassa (IMTECH) Intian Chandigarhissa ja joiden kir-jausnumerot ovat vastaavasti MTCC 5094, MTCC 5095 ja MTCC 5098.

2. CBTCC/53-03 MTCC 5095

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen synerginen bakteerikonsortio, jossa konsortio sisältää bakteerikannat MTCC 5094, MTCC 5095 ja MTCC 5098 kunkin painoprosentin ollessa 20-40 %.

3. CBTCC/54-03 MTCC 5098 jota voidaan hyödyntää ligniinin hajottamisessa mainitun, seuraavat vaiheet sisäl-10 tävän menetelmän avulla: a) suunnitellun bakteerien erotuspaikan bakteerikasvuston rikastaminen; b) lignolyyttisten bakteerien eristäminen käyttäen erilaisia aineita; c) vaiheessa (b) eristettyjen bakteerien viljely määritetyissä olosuhteissa, kuten kasvualusta, lämpötila, pH, hiililähde jne.; 15 d) eristettyjen bakteeri-isolaattien ligniinin hajotuskyvyn tarkistaminen istuttamalla ne 10 millilitraan 0,4-prosenttista ligniiniä; • * ··· “P' e) niiden bakteeri-isolaattien valitseminen, jotka pystyvät tehokkaasti poistamaan • · · I.. ligniinin väriä; • · • « • · :·:: f) valituksi tulleiden bakteeri-isolaattien akklimatisointi ligniinin pitoisuuden lisäämi- *·· 20 seksi niiden lignolyyttisen toiminnan paranemisen toteamiseksi; g) toisen valintaluettelon laadinta ja bakteeri-isolaattien formulointi niiden ligniinin :***. hajoamiseen kohdistuvan synergisen vaikutuksen toteamiseksi; • · · • · · • · · h) mikrobiaalisen, kolmen bakteeri-isolaatin, jotka hajottavat ligniiniä aina 0,8 %:iin saakka, sisältävän konsortion valitseminen vaiheen (g) valittujen luettelosta, ja ha- • 25 luttaessa; • « • · · • ·· i) mainitun konsortion bakteeri-isolaattien viljely määritetyissä olosuhteissa ent-syymitoiminnan toteamiseksi sekä raa’asta että rikastetusta näytteestä; j) tuloksena olevan viljelmän erottaminen sentrifugilla voimakkaan ulkohalkaisijan kasvun tapahduttua (1,00-1,20); k) supernatantin kerääminen ja rikastaminen ammoniumsulfaattisaostuksen avulla ja sitä seuraavalla dialyysillä, ja

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen synerginen bakteerikonsortio, jossa konsor tio sisältää osuudeltaan samankokoiset bakteerikannat MTCC 5094, MTCC 5095 ja MTCC 5098.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen synerginen bakteerikonsortio, jossa bakteerit on eristetty sahanpurujen ja maan seoksesta.

5 I) ligniiniperoksidaasin analysointi kummastakin näytteestä, sekä raa'asta että vä-kevöidystä, mittaamalla tuotteen (veratryldehydi) muodostuminen tunnetun spekt-rofotometrimenetelmän avulla 310 nm:ssä.

5 Sarjan nro Viljelmä Säilytysnumero

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen synerginen bakteerikonsortio, jossa baktee rit on eristetty sahanpurujen ja maan seoksesta Intian Uttar Pradeshissa sijaitse- ·· · : V vasta Roorkeesta. • M

··«« :*·*; 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen synerginen bakteerikonsortio, jossa MTCC • .*··. 5094:n ominaisuudet ovat seuraavat: gram-negatiivinen, muoto - pienet sauva- 20 bakteerit.

• · · ··· · ··· • · ***·' 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen synerginen bakteerikonsortio, jossa MTCC 5095:n ominaisuudet ovat seuraavat: gram-negatiivinen, muoto - pallobakteerit. • · « Φ a a Φ • •a

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen synerginen bakteerikonsortio, jossa MTCC 5098:n ominaisuudet ovat seuraavat: gram-negatiivinen, muoto - pitkät sauvabak-.···, 25 teerit. Φ a • · a

• :.· · 9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen bakteerikonsortio, jossa konsortio hajottaa ligniiniä aina 0,8 %:iin saakka.

10 CBTCC/53-03 ja CBTCC54-03 sisältävän bakteerikonsortion istuttaminen ligniiniä sisältävään liuokseen 1-5 vuorokauden ajaksi lämpötilassa 25-35 °C, joita bakteerikantoja säilytetään kansainvälisessä säilytyspaikassa IMTECHissä Intian Chandigarhissa, ja niiden kirjausnumerot ovat MTCC 5094, MTCC 5095 ja MTCC 5098.

10. Sellaisen bakteerikonsortion valmistusmenetelmä, joka sisältää akklimatisoidut lignolyyttisten bakteerien isolaatit (CBTCC/52-03, CBTCC/53-03 ja CBTCC/54-03), joita säilytetään kansainvälisessä säilytyspaikassa IMTECHissä, Intian Chan-digarhissa Budapestin sopimuksen mukaisesti,

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, jossa maa-aineen rikastus suoritetaan 100 ml.ssa maauutetta ja 0,3-%:isessa ligniinissä 96 tunnin ajan.

12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, jossa lignolyyttisten bakteeri en eristäminen suoritetaan käyttämällä neljää erilaista ainetta: 0,3 -%: inen iignii-ni+agar; maauute+agar; 50-%: inen maauute+agar; 0,3-%: inen ligniini+50-%:inen maauute.

13. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, jossa eristettyjen bakteeri-15 isolaattien viljely suoritetaan pH-arvossa 6,8-7,2 ja lämpötilassa 30-35 °C.

14. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, jossa ligniinin hajottaminen ‘ suoritetaan istuttamalla eristetyt bakteeri-isolaatit 10 millilitraan 0,4-prosenttista lig- ‘.‘Il niiniä.

• · · • · · ·«· • · ]*·;* 15. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, jossa valituksi tulleet bakteeri- : 20 isolaatit akklimatisoidaan suurempiin ligniinipitoisuuksiin, joiden vahvuudet ovat 0,5 % - 1 % 30 ml:n koeputkissa.

16. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, jossa mainittu kolmen ligno-lyyttisen bakteerin sisältävä konsortio on saatu testaamalla erilaisia eristettyjen bakteerien yhdistelmiä ja valitsemalla konsortio, joka on pystynyt hajottamaan lig- • « · *·* * 25 niiniä aina 0,8 %:iin saakka.

··· • · · • · · : 17. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, jossa mainitun konsortion .·]: bakteeri-isolaatteia viljellään erikseen 1000 ml:n määrässä minimisuola-ainetta, • ·· jossa on 1,0 % glukoosia.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, jossa viljelypulloa pidetään kasvatuskaapissa 30-34 °C:n lämpötilassa kierrosluvulla 100-120 r/min kolmen vuorokauden ajan voimakkaan kasvun aikaansaamiseksi.

19. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, jossa viljelmät erotetaan sent-5 rifugilla kierrosluvulla 10 000 r/min 30 minuutin ajan lämpötilassa 4 °C.

20. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, jossa kerätty supematantti konsentroidaan 80-prosenttisen ammoniumsulfaattisaostuksen ja sitä seuraavan dialyysin avulla.

21. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, jossa ligniiniperoksidaasi ana-10 lysoidaan kummastakin näytteestä, sekä raa'asta että väkevöidystä, mittaamalla tuotteen (veratryldehydi) muodostuminen spektrofotometrin avulla 310 nm:ssä.

22. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, jossa sahanpurumaa rikastetaan ennen erottamista halutun lignolyyttisen bakteerikasvuston saamiseksi.

23. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, jossa sahanpurumaa rikaste-15 taan seuraavasti: ..... a) rikastamalla maa maauutteessa ja 0,3-prosenttisessa ligniinissä; « · • · ...7 b) pitämällä rikastuspulloa kasvatuskaapissa kierrosluvulla 100-120 r/min 30- 32 °C:ssa. ··· • · • f*· : .·.

24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen menetelmä, jossa 5-7 grammaa maata ri- .···. 20 kastetaan 100-120 ml:ssa maauutetta ja 0,3-prosenttisessa ligniinissä.

« · ··* ... 25. Patenttivaatimuksen 23 mukainen menetelmä, jossa rikastus suoritetaan kierrosluvulla 100-120 r/min 30-32 °C:n lämpötilassa 96 tunnin ajan. • · * · ···

26. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, jossa lignolyyttiset bakteerit .···. eristetään sahanpurupaikasta seuraavia aineita käyttäen: * · • · · j:*: 25 a) 0,3-%:inen ligniini+agar; b) maauute+agar; • · c) 50%:inen maauute+agar; d) 0,3-%:inen ligniini+50-%:inen maauute.

27. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, jossa eristetyt lignolyyttiset bakteerikannat akklimatisoidaan suurempaan ligniinipitoisuuteen seuraavasti: a) istuttamalla eristetyt bakteerikannat 0,5-1,00-prosenttiseeen ligniiniin, ja b) pitämällä putkia kasvatuskaapissa 30-32 °C:ssa pitkän aikaa.

28. Patenttivaatimuksen 27 mukainen menetelmä, jossa lignolyyttisten bakteeri en isolaatit istutetaan 0,5-1,00-prosenttiseen ligniiniin.

29. Patenttivaatimuksen 27 mukainen menetelmä, jossa istutettuja ligniiniputkia pidetään 30-32 °C:ssa kolmen kuukauden ajan.

30. Ligniinin hajotusmenetelmä, johon sisältyy bakteerikannat CBTCC/52-03,

31. Patenttivaatimuksen 30 mukainen menetelmä, jossa bakteerikonsortio sisäl tää bakteerikantojen MTCC 5094, MTCC 5095 ja MTCC 5098 kokosolu-bakteeri-isolaatit. «· · • · · • « • ·

32. Patenttivaatimuksen 30 mukainen menetelmä, jossa konsortio sisältää bak-teerikannat MTCC 5094, MTCC 5095 ja MTCC 5098. • ♦ · ««· • · !**;* 20

33. Patenttivaatimuksen 30 mukainen menetelmä, jossa konsortio sisältää bak- teerikantoja MTCC 5094, MTCC 5095 ja MTCC 5098 määrinä 20-40 paino-% ku-takin.

34. Patenttivaatimuksen 30 mukainen menetelmä, jossa konsortio sisältää osuudeltaan samanlaiset bakteerikannat MTCC 5094, MTCC 5095 ja MTCC 5098. ··♦ • · · *;!.* 25

35. Patenttivaatimuksen 30 mukainen menetelmä, jossa bakteerit on eristetty • · *·"* sahanpurujen ja maan seoksesta. • · » · · • * « ··* ·

36. Patenttivaatimuksen 30 mukainen menetelmä, jossa bakteerit on eristetty • t sahanpurujen ja maan seoksesta Intian Roorkeesta.

37. Patenttivaatimuksen 30 mukainen menetelmä, jossa konsortio hajottaa ligniiniä aina 0,8 %:iin saakka.