CN109679930A - 一种生产亚硝酸盐还原酶的发酵方法 - Google Patents

一种生产亚硝酸盐还原酶的发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程及生物化学技术领域，是一种生产亚硝酸盐还原酶的菌株及其发酵方法。将菌株Lactobacillus plantarum(保藏号为CGMCC NO.1.12935)进行驯化与纯化后，发酵生产亚硝酸盐还原酶。将菌种驯化与纯化后从而提高该菌稳定发酵生产亚硝酸盐还原酶的产量，可用于消除食品与饲料中亚硝酸盐。从食品安全角度出发，开发乳酸菌亚硝酸盐还原酶用来降低和消除食品中亚硝酸盐的残留具有广阔前景和安全优势。

Description

一种生产亚硝酸盐还原酶的发酵方法
技术领域
本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程及生物化学技术领域，是一种生产亚硝酸盐还原酶的菌株及其发酵方法，本发明生产的亚硝酸盐还原酶主要应用于食品工业、酿造、发酵、医药等行业。
背景技术
亚硝酸盐是我国近年来食物中毒的主要化学致病因子之一。亚硝酸盐被吸收进入血液后，可使正常的血红蛋白中Fe2+氧化成Fe3+，使血红蛋白失去携氧功能,出现组织缺氧，甚至导致缺氧窒息。亚硝酸盐还是强致癌物亚硝胺的前体物质，潜在着致癌危害。它与胃癌、肝癌、食道癌发生有密切关系。根据流行病学调查发现，癌症高发区居民饮水中亚硝酸盐含量高于低发区。
目前，一些地区由于大量使用氮肥、以及使用工业废水和生活污水灌溉，致使水中亚硝酸盐污染严重，致使这些地区蔬菜、粮食、饲料中亚硝酸盐超标也较普遍。此外，我国传统腌泡菜、各种肉灌肠中一直存在亚硝酸盐超标问题。
鉴于食物中亚硝酸盐的危害严重，人们在努力寻找降低和去除食品亚硝酸盐的新途径。亚硝酸盐还原酶是催化亚硝酸盐还原的一类酶，可用于消除食品与饲料中亚硝酸盐。从食品安全角度出发，开发乳酸菌亚硝酸盐还原酶用来降低和消除食品中亚硝酸盐的残留具有广阔前景和安全优势。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能生产亚硝酸盐还原酶的培养方法和发酵研究。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
一、菌株的驯化与纯化。
1).菌株的驯化
在发酵培养基中加入0.01％～0.1％NaNO2，将菌株Lactobacillus plantarum(保藏号为CGMCC NO.1.12935)按发酵液体积的2～3％接种量接入发酵培养基中，在25～30℃培养36～48h后，得到驯化后的菌种。
所述的菌株Lactobacillus plantarum，该菌株已于2014年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其生物保藏号为CGMCC NO.1.12935。
发酵培养基：葡萄糖2g、蛋白胨1g、酵母粉0.4g、磷酸氢二钾0.2g、牛肉粉0.8g、硫酸镁0.02g、乙酸钠0.5g、柠檬酸三铵0.2g、硫酸锰0.005g、吐温-80 0.1g、蒸馏水1L，pH6.2±0.2，121℃高压蒸气灭菌30min。
2).菌株的纯化
按照微生物纯种分离的常规方法，将驯化后的菌种于30℃放置48-72h，接种到新的植物乳杆菌筛选固体培养基上，至少重复10次，纯化菌落，再在液体种子培养基中进行发酵检验，得到纯化后的菌株。
植物乳杆菌筛选固体培养基：葡萄糖2g、蛋白胨1g、酵母粉0.4g、磷酸氢二钾0.2g、牛肉粉0.8g、硫酸镁0.02g、乙酸钠0.5g、柠檬酸三铵0.2g、硫酸锰0.005g、吐温-80 0.1g、碳酸钙2g、蒸馏水1L。
液体种子培养基：葡萄糖2g、蛋白胨1g、酵母粉0.4g、磷酸氢二钾0.2g、牛肉粉0.8g、硫酸镁0.02g、乙酸钠0.5g、柠檬酸三铵0.2g、蒸馏水1L，pH6.2±0.2，121℃高压蒸气灭菌30min；
所述纯化后的菌株的生物化学特征为：
菌落形态特征：菌落为白色、不透明、表面光滑、边缘整齐、易挑取。通过简单染色、革兰氏染色、荚膜染色、芽孢染色等方法对该菌株生物学特性进行初步鉴定，结果表明该菌株为细菌，杆状(0.74-1.33)μm*(0.575-0.618)μm革兰氏阴性、无荚膜、无芽孢、无鞭毛。
遗传学特征：
所述纯化后的菌株的16S rRNA全基因碱基序列为SEQ ID NO.1；菌株16S rRNA全基因序列共1483bp(Genbank登录号为：MH596000.1)。
菌株与植物乳杆菌属有相似性，用Mega5.0软件对其16S rRNA序列进行系统学分析，并用邻接法(Neigbor-Joining)构建系统树表明本菌株与交植物乳杆菌属属于同一类群，关系最紧密，16SrRNA序列分析表明，与Genbank国际基因序列数据库记录的最相似的菌株Lactobacillus plantarum NBRC 15891(NR 113338.1)的相似性为99％。
二、一种发酵生产亚硝酸盐还原酶的方法，包括以下步骤：
(1)将纯化后的菌株接种于固体种子培养基上，在25～30℃培养36～48h后，得到亚硝酸盐还原酶产生菌；
(2)将亚硝酸盐还原酶产生菌按发酵液体积的2％接种量接入发酵培养基，逐级扩大培养，在25～30℃培养36～48h后，制备成液体一级种子；将液体一级种子按发酵液体积的2％接种量接入发酵培养基，在25～30℃培养36～48h后，制备成液体二级种子；
(3)将液体二级种子，按发酵液体积的2％接种量接入液体种子发酵培养基中，在25～30℃培养36～48h后得到发酵液，即菌株发酵生产亚硝酸盐还原酶结束；
(4)将步骤(3)的发酵液在4,000～8,000rpm，离心10min，弃去上清液，沉淀菌体用PBS缓冲液(pH7.4)洗涤两次，将洗涤后的菌体重悬于10mL预冷的PBS缓冲液(pH7.4)中，超声裂解10min，每次3s，间隔5s，功率200W。然后10000r/min，4℃，离心20min收集到的液体即为粗酶液；
(5)重复以上步骤，得到原始菌株的粗酶液，与(4)得到的粗酶液进行酶活测定。
本发明的有益效果是，将菌种驯化与纯化后从而提高该菌稳定发酵生产亚硝酸盐还原酶的产量，可用于消除食品与饲料中亚硝酸盐。从食品安全角度出发，开发乳酸菌亚硝酸盐还原酶用来降低和消除食品中亚硝酸盐的残留具有广阔前景和安全优势。
附图说明
图1为纯化后的菌株在扫描电镜下的形态，其中a为放大500倍，b为放大2500倍；
图2为纯化后的菌株的16S rDNA的序列系统发育树；
图3为纯化后的菌株的生长曲线，该菌株延滞期为0～12h；对数期为12～28h；稳定期为28～40h，衰亡期为40～60h；
图4为亚硝酸盐还原酶产酶曲线。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
菌株的驯化与纯化。
1.菌株的驯化
在发酵培养基中加入0.01％～0.1％NaNO2，按发酵液体积的2％接种量接入发酵培养基中，在25～30℃培养36～48h。
发酵培养基：葡萄糖2g、蛋白胨1g、酵母粉0.4g、磷酸氢二钾0.2g、牛肉粉0.8g、硫酸镁0.02g、乙酸钠0.5g、柠檬酸三铵0.2g、硫酸锰0.005g、吐温-80 0.1g、蒸馏水1L，pH6.2±0.2，121℃高压蒸气灭菌30min。
2.菌株的纯化
按照微生物纯种分离的常规方法，将驯化后的菌种于30℃放置48-72h。接种到新的植物乳杆菌筛选固体培养基上，至少重复10次，纯化菌落。再在液体种子培养基中进行发酵检验，结果得到一株亚硝酸盐还原酶产量较高的纯化后的菌株。
植物乳杆菌筛选固体培养基：葡萄糖2g、蛋白胨1g、酵母粉0.4g、磷酸氢二钾0.2g、牛肉粉0.8g、硫酸镁0.02g、乙酸钠0.5g、柠檬酸三铵0.2g、硫酸锰0.005g、吐温-80 0.1g、碳酸钙2g、蒸馏水1L。
液体种子培养基：葡萄糖2g、蛋白胨1g、酵母粉0.4g、磷酸氢二钾0.2g、牛肉粉0.8g、硫酸镁0.02g、乙酸钠0.5g、柠檬酸三铵0.2g、蒸馏水1L，pH6.2±0.2，121℃高压蒸气灭菌30min；
实施例2
纯化后的菌株的分离鉴定：
(1)纯化后的菌株的菌体及菌落形态特征
菌落形态特征为：菌落为白色、不透明、表面光滑、边缘整齐、易挑取。通过简单染色、革兰氏染色、荚膜染色、芽孢染色等方法对该菌株生物学特性进行初步鉴定，结果表明该菌株为细菌，杆状(0.74-1.33)μm*(0.575-0.618)μm革兰氏阴性、无荚膜、无芽孢、无鞭毛，如图1所示。
遗传学特征：
纯化后的菌株的16S rRNA全基因碱基序列SEQ ID NO.1；菌株16S rRNA全基因序列共1483bp(Genbank登录号为：MH596000.1)；
菌株与植物乳杆菌属有相似性，用Mega5.0软件对其16S rRNA序列进行系统学分析，并用邻接法(Neigbor-Joining)构建系统树表明本菌株与交植物乳杆菌属属于同一类群，关系最紧密，见图2。16SrRNA序列分析表明，与Genbank国际基因序列数据库记录的最相似的菌株Lactobacillus plantarum NBRC 15891(NR 113338.1)的相似性为99％。
实施例3
(1)培养基制备：
①固体种子培养基：葡萄糖2g、蛋白胨1g、酵母粉0.4g、磷酸氢二钾0.2g、牛肉粉0.8g、硫酸镁0.02g、乙酸钠0.5g、柠檬酸三铵0.2g、琼脂2g、蒸馏水1L，pH6.2±0.2，121℃高压蒸气灭菌30min；
②液体种子培养基：葡萄糖2g、蛋白胨1g、酵母粉0.4g、磷酸氢二钾0.2g、牛肉粉0.8g、硫酸镁0.02g、乙酸钠0.5g、柠檬酸三铵0.2g、蒸馏水1L，pH6.2±0.2，121℃高压蒸气灭菌30min；
③发酵培养基：葡萄糖2g、蛋白胨1g、酵母粉0.4g、磷酸氢二钾0.2g、牛肉粉0.8g、硫酸镁0.02g、乙酸钠0.5g、柠檬酸三铵0.2g、硫酸锰0.005g、吐温-80 0.1g、蒸馏水1L，pH6.2±0.2，121℃高压蒸气灭菌30min。
④按常规方法将所述菌株接种于固体种子培养基上，在25～30℃培养36～48小时；
(2)将亚硝酸盐还原酶产生菌按发酵液体积的2％接种量接入发酵培养基，逐级扩大培养，在25～30℃培养36～48h后，制备成液体一级种子；将液体一级种子按发酵液体积的2％接种量接入发酵培养基，在25～30℃培养36～48h后，制备成液体二级种子；
(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的2％接种量接入液体发酵培养基中，在25～30℃培养36～48时，即微生物发酵生产亚硝酸盐还原酶结束；
(4)将(3)的发酵液在4,000～8,000rpm，离心10min，弃去上清液，沉淀菌体用PBS缓冲液(pH7.4)洗涤两次，将洗涤后的菌体重悬于10mL预冷的PBS缓冲液(pH7.4)中，超声裂解10min，每次3s，间隔5s，功率200W。然后10000r/min，4℃，离心20min收集到的液体即为粗酶液；
(5)根据不同需要和使用对象不同，将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
实施例4
纯化后菌株的生长曲线测定
将纯化后的平板，挑取单菌落接入液体种子培养基，作为种子液，30℃，160rpm振荡培养24h后，1％接种液体种子培养基，30℃，160rpm振荡培养，每隔2-4h测定菌液OD600nm，以空白培养基调零，约120h，绘制生长曲线(如图3)。12h进入对数期，30h进入稳定期，42h进入衰亡期。
实施例5
发酵过程中不同时间产酶量活性的测定
挑取适量菌落于发酵培养基中，于30℃，160rpm培养，每隔12h测定亚硝酸盐还原酶酶活(如图4)，30h～60h酶活较高，其中48h酶活最高。
实施例6
酶活测定
将原始菌株重复以上步骤，得到原始菌株的粗酶液，与纯化后菌株得到的粗酶液进行酶活测定。NiR酶活性的测定：NiR活性测定采用Na2S2O4-MV法。利用甲基紫精作为人工电子供体使NiR催化NO2 -还原为NO或NH3。亚硝酸盐还原酶的消耗可以通过反应液中总的亚硝酸盐量减去剩余的NO2 -量得到。NO2 -含量可用盐酸萘乙二胺法测定，即在酸性条件下与对氨基苯磺酸发生重氮反应，生成的重氮化合物又与盐酸萘乙二胺生成了紫红色偶氮化合物，可在538nm下显色测定。
测定酶活反应体系500μL：0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.5)50μL，0.1mol/L NaNO225μL，0.1mol/L MV 15μL，0.1mol/L Na2S2O4 80μL，酶液300μL。37℃水浴中反应10min，剧烈振荡终止反应(以磷酸缓冲液为空白)。取10μL用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐残留量。亚硝酸还原酶活力单位通过在37℃下，每分钟还原1μmol亚硝酸盐所消耗的酶量来表示。比活力用1mg蛋白质中酶的活力单位数来表示。原始菌株产亚硝酸盐还原酶的酶活为370.2U，驯化菌株产亚硝酸盐还原酶酶活为560.6U，明显高于原始菌株。
序列表
<110> 大连大学
<120> 一种生产亚硝酸盐还原酶的发酵方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1483
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgaacgaact ctggtattga ttggtgcttg 60
catcatgatt tacatttgag tgagtggcga actggtgagt aacacgtggg aaacctgccc 120
agaagcgggg gataacacct ggaaacagat gctaataccg cataacaact tggaccgcat 180
ggtccgagct tgaaagatgg cttcggctat cacttttgga tggtcccgcg gcgtattagc 240
tagatggtgg ggtaacggct caccatggca atgatacgta gccgacctga gagggtaatc 300
ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt 360
ccacaatgga cgaaagtctg atggagcaac gccgcgtgag tgaagaaggg tttcggctcg 420
taaaactctg ttgttaaaga agaacatatc tgagagtaac tgttcaggta ttgacggtat 480
ttaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag 540
cgttgtccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg ttttttaagt ctgatgtgaa 600
agccttcggc tcaaccgaag aagtgcatcg gaaactggga aacttgagtg cagaagagga 660
cagtggaact ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagatata tggaagaaca ccagtggcga 720
aggcggctgt ctggtctgta actgacgctg aggctcgaaa gtatgggtag caaacaggat 780
tagataccct ggtagtccat accgtaaacg atgaatgcta agtgttggag ggtttccgcc 840
cttcagtgct gcagctaacg cattaagcat tccgcctggg gagtacggcc gcaaggctga 900
aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 960
tacgcgaaga accttaccag gtcttgacat actatgcaaa tctaagagat tagacgttcc 1020
cttcggggac atggatacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg 1080
ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta ttatcagttg ccagcattaa gttgggcact 1140
ctggtgagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc 1200
ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggatggta caacgagttg cgaactcgcg 1260
agagtaagct aatctcttaa agccattctc agttcggatt gtaggctgca actcgcctac 1320
atgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc 1380
cttgtacaca ccgcccgtca caccatgaga gtttgtaaca cccaaagtcg gtggggtaac 1440
cttttaggaa ccagccgcct aaggtgggac agatgattag ggg 1483

Claims (5)

1.一种发酵生产亚硝酸盐还原酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将纯化后的菌株接种于固体种子培养基上，在25～30℃培养36～48h后，得到亚硝酸盐还原酶产生菌；
所述的纯化后的菌株由菌株Lactobacillus plantarum，其保藏号为CGMCCNO.1.12935，驯化；
(2)将亚硝酸盐还原酶产生菌按发酵液体积的2％接种量接入发酵培养基，逐级扩大培养，在25～30℃培养36～48h后，制备成液体一级种子；将液体一级种子按发酵液体积的2％接种量接入发酵培养基，在25～30℃培养36～48h后，制备成液体二级种子；
(3)将液体二级种子，按发酵液体积的2％接种量接入液体种子发酵培养基中，在25～30℃培养36～48h后得到发酵液，即菌株发酵生产亚硝酸盐还原酶结束；
(4)将步骤(3)的发酵液在4,000～8,000rpm，离心10min，弃去上清液，沉淀菌体用PBS缓冲液(pH7.4)洗涤两次，将洗涤后的菌体重悬于10mL预冷的PBS缓冲液(pH7.4)中，超声裂解10min，每次3s，间隔5s，功率200W，然后10000r/min，4℃，离心20min收集到的液体即为粗酶液。
2.根据权利要求1所述的一种发酵生产亚硝酸盐还原酶的方法，其特征在于，所述的驯化步骤为：
1).菌株的驯化
在发酵培养基中加入0.01％～0.1％NaNO2，将菌株Lactobacillus plantarum(保藏号为CGMCC NO.1.12935)按发酵液体积的2～3％接种量接入发酵培养基中，在25～30℃培养36～48h后，得到驯化后的菌种；
所述的菌株Lactobacillus plantarum，该菌株已于2014年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其生物保藏号为CGMCC NO.1.12935；
2).菌株的纯化
按照微生物纯种分离的常规方法，将驯化后的菌种于30℃放置48-72h，接种到新的植物乳杆菌筛选固体培养基上，至少重复10次，纯化菌落，再在液体种子培养基中进行发酵检验，得到纯化后的菌株。
3.根据权利要求2所述的一种发酵生产亚硝酸盐还原酶的方法，其特征在于，所述的发酵培养基的配方为：葡萄糖2g、蛋白胨1g、酵母粉0.4g、磷酸氢二钾0.2g、牛肉粉0.8g、硫酸镁0.02g、乙酸钠0.5g、柠檬酸三铵0.2g、硫酸锰0.005g、吐温-80 0.1g、蒸馏水1L，pH6.2±0.2，121℃高压蒸气灭菌30min。
4.根据权利要求2所述的一种发酵生产亚硝酸盐还原酶的方法，其特征在于，所述的植物乳杆菌筛选固体培养基的配方为：葡萄糖2g、蛋白胨1g、酵母粉0.4g、磷酸氢二钾0.2g、牛肉粉0.8g、硫酸镁0.02g、乙酸钠0.5g、柠檬酸三铵0.2g、硫酸锰0.005g、吐温-80 0.1g、碳酸钙2g、蒸馏水1L。
5.根据权利要求1所述的一种发酵生产亚硝酸盐还原酶的方法，其特征在于，所述的液体种子培养基的配方为：葡萄糖2g、蛋白胨1g、酵母粉0.4g、磷酸氢二钾0.2g、牛肉粉0.8g、硫酸镁0.02g、乙酸钠0.5g、柠檬酸三铵0.2g、蒸馏水1L，pH6.2±0.2，121℃高压蒸气灭菌30min。
CN201910118301.7A 2019-02-15 2019-02-15 一种生产亚硝酸盐还原酶的发酵方法 Pending CN109679930A (zh)

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CN1687408A (zh) * 2005-06-03 2005-10-26 张庆芳 乳酸菌发酵生产亚硝酸还原酶的方法
CN101597598A (zh) * 2009-07-21 2009-12-09 上海应用技术学院 亚硝酸盐还原酶的制备方法及其酶制品
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