CH696724A5 - Azaphenylalaninderivate. - Google Patents

Description

  [0001] Die Erfindung gehört zu dem Gebiet der pharmazeutischen Industrie und bezieht sich auf neue Azaphenylalaninderivate, Verfahren für ihre Herstellung und pharmazeutische Zusammensetzung, welche sie enthalten. Diese neuartigen Azaphenylalaninderivate sind als Koagulationshemmer verwendbar.

[0002] Thrombin ist eine Serinprotease, welches eines der Schlüsselenzyme in den Vorgängen der Blutkoagulation und in der Entwicklung von Thrombosen ist (Edit, J. F.; Allison, P.; Noble, S.; Ashton, J.; Golino, P.; McNard, J.; Buja, L. M.; Willerson, J. T., J. Clin. Invest. 1989, 84, 18.) 

[0003] Die Kristallstruktur der Serinprotease Thrombin ist bekannt (Bode, W.; Turk, D.; Karshikov, A.

   J., Protein Sci. 1992, 1, 426).
Derzeitig verwendete Koagulationshemmer haben viele nachteilige Wirkungen und begrenzte Wirksamkeit.

[0004] Niedermolekulare Thrombininhibitoren sollten eine selektive Wirksamkeit haben und oral verabreicht werden können. Es gibt reversible und irreversible Thrombinantagonisten (Kimball, S.D., Curr. Pharm. Design 1995, 1, 441, Das, J.; Kimball, S. D., Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 999, Kimball, S. D., Blood Coagulation and Fibrinolysis 1995, 6, 511, Breznik, M.; Pecar, S.; Farm. Vestn. 1997, 48, 545, Leung, D.; Abbenante, G.; Fairlie, D. P., J. Med. Chem. 2000, 43, 305).

[0005] Die Mehrheit der reversiblen Thrombinantagonisten leiten sich von der peptidomimetisch modifizierten Struktur D-Phe-Pro-Arg ab.

   Das Ziel der Modifikation ist es, chemische Stabilität, Selektivität und Wirksamkeit zur Verfügung zu stellen.

[0006] Der Wirkstoff Argatroban, beschrieben in EP-A-0 008 746 wird klinisch verwendet. Napsagatran ist ein selektiver reversibler Inhibitor von Thrombin, beschrieben in EP-A-0 559 046. In meta substituierte Phenylalaninderivate mit Amid oder Amidoximstruktur sind selektive Thrombininhibitoren, offenbart in WO 92/08 709. Amidinophenylalaninderivate und Aminopyridylalaninderivate, beschrieben in WO 95/13 274, haben selektive antithrombotische Wirkung.

[0007] Azapetide sind Peptidomimetika, in welchen das Calpha -Atom durch Stickstoff ersetzt ist.

   Der Vorteil dieser isoelektrischen Substitution ist die Erhaltung der chemischen Integrität der modifizierten Aminosäure und nur eine geringfügige Konformationsänderung, die für den Vorgang der molekularen Identifikation und Stabilisation des Ligand-Rezeptor-Komplexes und die metabolische Stabilisation wichtig ist (Gante, J, Synthesis 1989, 405, Gante J., Angew. Chem. 1994, 106, 1780), Die Herstellung von N-Naphtylsulfonylaminosäuren ist bekannt (Pendleton, R. G., et al. J. Pharm. Exp. Ther. 1979, 208, 24). Phenylderivate werden in WO 02/051 824 und in Zega, A.; Mlinsek, G. Sepic, P.; et al. Bioorg. Med. Chem., 2001; 9, 2745-2756, Zega, A.; Trampus-Bakija, A.; Fortuna, M.; Stegnar, M.; et al. Pharmazie, 2001, 56, 638-685) beschrieben.

   Eine Gruppe von Thrombininhibitoren mit dem Azaphenylalaninfragment, beschrieben in SI-20 025 zeigte in In-vitro-Untersuchungen submikromolare Konstanten.

[0008] Vor kurzem wurden ebenfalls die Inhibitoren des Faktors Xa Forschungsziele der pharmazeutischen Industrie. Die Struktur des aktiven Zentrums des Faktors Xa, erhalten durch Röntgenbeugung, hatte einen grossen Einfluss auf die Synthese von Xa-Inhibitoren. Hinsichtlich hoher Wirksamkeit und moderater Selektivität gibt es zurzeit keine Xa-Inhibitoren auf dem Markt, obwohl sich einige von ihnen in verschiedenen Stadien klinischer Untersuchungen befinden (Zega, A; Obreza, A.; Urleb, U. Farm. Vestn.; 1999, 50, 53-57, Rai, R.; Sprengler, K. C.; Elrod, K.C.; et al. Curr. Med. Chem. 2001, 8, 101-119).

   Ein niedermolekularer Inhibitor DX-9065a weist hohe Thrombinselektivität auf und ist ein Bis-Amidinoderivat (Hara, T.; Yokoyama, A.; Ishihara, H.; et al. Thromb. Haemost. 1994,71, 314-319). Vor kurzem wurden Verbindungen mit nur einer basischen Gruppe in ihrer Struktur veröffentlicht, mit verbesserter Bioverfügbarkeit (WO 9 857 951, Yee, Y. K.; Tebbe, A. L.; Linebarger, J. H.; J. Med. Chem. 2000, 43, 873-882).

[0009] Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, verbesserte neue Verbindungen mit koagulationshemmender Wirkung zur Verfügung zu stellen, wobei diese Verbindungen nach oraler Verabreichung wirksam sind, hochselektiv sind und eine niedrige Toxizität haben, ein Verfahren zu ihrer Herstellung als auch die Verwendung dieser Verbindungen für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung.

   Diese Aufgaben werden z.B. durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche 1, 3, 4 und 11 erzielt. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen definiert.

[0010] Die Erfindung bezieht sich auf neuartige Azaphenylalaninderivate und Analoga davon mit der allgemeinen Formel (I)
 <EMI ID=2.0> 
wobei
R<1> und Z H sind oder ein Rest mit der Formel
 <EMI ID=3.0> 
unter der Voraussetzung, dass eines von R<1> und Z H ist;
R<4>= H, Alkyl (C1-C3), OH, O-Alkyl (C1C3), NH2;
R<2> einen Rest der Formel darstellt
 <EMI ID=4.0> 
wobei
R<5> = H, Alkyl (C1-C3), COOR<10>,
R<6> = H, Alkyl (C1-C3), COOR<10>,
R<7> = H, Alkyl (C1-C3), COOR<10>,
R<10> = H, Alkyl (C1-C3),
R<8> = H, Alkyl (C1-C3), Cycloalkyl (C3-C6),
R<9> = H, Alkyl (C1-C3), Cycloalkyl (C3-C6),
R<11> = H, Alkyl (C1-C3), Benzyl,
X = CH, O, S,
Y = NR<12>, O, S,
R<12> = H, COCH3, Alkyl (C1-C3);

  
R<3> ist ein Rest der Formel
 <EMI ID=5.0> 

[0011] Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ihre pharmazeutisch akzeptablen Salze mit koagulationshemmender Wirkung und auf pharmazeutische Zusammensetzung, welche sie enthalten.

[0012] Die pharmazeutisch akzeptablen Salze der Verbindungen der Formel 1 enthalten bevorzugt die herkömmlichen nichttoxischen Salze oder die quaternären Ammoniumsalze, welche gebildet werden z. B. aus anorganischen oder organischen Säuren oder Basen.

   Beispiele für derartige Säureadditionsalze enthalten Acetat, Adipat, Alginat, Aspartat, Benzoat, Benzensulfonat, Bisulfat, Butyrat, Citrat, Camphorat, Camphersulfonat, Cyclopentanpropionat, Digluconat, Dodecylsulfat, Ethansulfonat, Fumarat, Glycoheptanoat, Hydrobromid, Hydrochlorid, Hydroiodid, Lactat, Maleat, Methansulfonat, Nicitinat, Nitrat, Oxalat, Pamoat, 3-Phenylpropionat, Picrat, Pivalat, Propionat, Pectinat, Succinat, Sulfat, Tartrat, Thiocyanat, Tosylat und Audecanoat. Basische Salze enthalten Ammoniumsalze, Alkalimetallsalze, wie etwa Natrium- oder Kaliumsalze, Erdalkalimetallsalze, wie etwa Calcium- und Magnesiumsalze, N-Methyl-D-glucamin und Salze mit Aminosäure wie etwa Arginin, Lysin usw.

   Ebenfalls können die basischen stickstoffhaltigen Gruppen mit derartigen Mitteln als niedrige Alkylhalide, Dialkylsulfate und Diamylsulfate, langkettige Halide, Aralkylhalide und anderen quaterniert werden. Die Auswahl der anorganischen oder organischen Säuren oder Basen sollte nicht auf diese Beispiele beschränkt sein.

[0013] Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ein Verfahren zur Herstellung von Azaphenylalaninderivaten und analoger der allgemeinen Formel (I).

[0014] Die Azaphenylalaninderivate und Analoga der allgemeinen Formel (I), falls
R1= 
 <EMI ID=6.0> 
werden bevorzugt wie folgt hergestellt:

  
4-Cyanobenzaldehyd der Formel (II)
 <EMI ID=7.0> 
wird mit BOC-carbazat der Formel (III) umgesetzt
 <EMI ID=8.0> 
zu der Verbindung der Formel (IV)
 <EMI ID=9.0> 
welche mittels Reduktion durch katalytische Hydrogenierung unter Verwendung von Pd als ein Katalysator zu der Verbindung (V) umgesetzt wird
 <EMI ID=10.0> 
welche mit Triphosgen und Amin der Formel (VI) reagiert
 <EMI ID=11.0> 
wobei R5, R6 und R7 die gleichen Bedeutungen haben wie in der Formel (I), oder mit Triphosgen und Amin der Formel (VII oder VIII),
 <EMI ID=12.0> 
wobei Y die gleiche Bedeutung wie in der Formel (I) hat, oder mit Triphosgen und Amin der Formel (IX)
 <EMI ID=13.0> 
wobei R<8> und R<9> die gleichen Bedeutungen wie in der Formel (I) haben, oder mit Triphosgen oder Amin der Formel (X),

 <EMI ID=14.0> 
wobei R<11> und X die gleichen Bedeutungen wie in der Formel (I) haben, zu der Verbindung (XI)

  
 <EMI ID=15.0> 
wobei R<2> die gleiche Bedeutung wie in der Formel (I) hat.

[0015] Die BOC-Schutzgruppe der Verbindungen (XI) wird bei Raumtemperatur unter Verwendung des Einströmens von gasförmigen Chlorwasserstoff in Essigsäure entfernt, um die Verbindung (XII) zu erhalten
 <EMI ID=16.0> 
wobei R<2> die gleiche Bedeutung wie in der Formel (I) hat.

[0016] Dann reagiert die Verbindung (XII) mit der aktivierten Naphtylsulfonylaminosäure oder mit aktivierter Arylalkylcarboxylsäure zu der Verbindung (XIII)
 <EMI ID=17.0> 
wobei R<2> und R<3> die gleichen Bedeutungen wie in der Formel (I) haben.

[0017] Die Verbindung (XIII) wird mit Hydroxylamin in reinem Ethanol zu der Verbindung mit der Formel (XIV) transformiert
 <EMI ID=18.0> 
wobei R<1> = 
 <EMI ID=19.0> 
, und R<3> die gleichen Bedeutungen wie in der Formel (I)

   haben und R<4> eine OH-Gruppe ist.

[0018] Die Verbindung (XIII) wird mit einströmendem gasförmigem Chlorwasserstoff in ethanolischer Lösung, Zugabe von Ammoniumacetat, gefolgt bei einem weiteren Einströmen von Chlorwasserstoff zu der Verbindung (XV) umgewandelt,

 <EMI ID=20.0> 
wobei R<1> = 
 <EMI ID=21.0> 
R<2> und R<3> die gleichen Bedeutungen wie in der Formel (I) haben und R<4> Wasserstoff ist.

[0019] Die Azaphenylalaninderivate der allgemeinen Formel (I), wobei R1 = 
 <EMI ID=22.0> 
 werden wie folgt hergestellt:

  
4-Cyanobenzaldehyd der Formel (II)
 <EMI ID=23.0> 
wird mit Ethylenglykol in Anwesenheit von 4-Toluolsulfonsäure in die Verbindung (XVI) umgewandelt
 <EMI ID=24.0> 
welche mit Lithium-Aluminiumhydrid in die Verbindung der Formel (XVII) reduziert wird
 <EMI ID=25.0> 
welche mit Acetanhydrid zu der Verbindung (XVIII) reagiert

 <EMI ID=26.0> 

[0020] Die Verbindung (XVIII) wird mit 90%iger Methansäure zu der Verbindung (XIX) umgewandelt
 <EMI ID=27.0> 
welche mit BOC-carbazat der Formel (III)

 <EMI ID=28.0> 
zu der Verbindung der Formel (XX) umgewandelt wird

 <EMI ID=29.0> 
welche mittels Reduktion durch katalytische Hydrogenierung in die Verbindung (XXI) umgewandelt wird

 <EMI ID=30.0> 
welche mit Triphosgen und Amin der Formel (VI) reagiert

 <EMI ID=31.0> 
wobei R<5>, R<6> und R<7> die gleichen Bedeutungen wie in der Formel (I) haben,

   oder mit Triphosgen und Amin der Formel (VII oder VIII),

 <EMI ID=32.0> 
wobei Y die gleiche Bedeutung wie in der Formel (I) hat, oder mit Triphosgen und Amin der Formel (IX)
 <EMI ID=33.0> 
wobei R<8> und R<9> die gleichen Bedeutungen wie in der Formel (I) haben, oder mit Triphosgen und Amin der Formel (X)

 <EMI ID=34.0> 
wobei R<11> und X die gleichen Bedeutungen wie in der Formel (I) haben, zu der Verbindung (XXII)

 <EMI ID=35.0> 
wobei R<2> die gleiche Bedeutung wie in der Formel (I) hat.

[0021] Die BOC-Schutzgruppe in der Verbindung (XXII) wird durch HCl (g) in AcOH bei Raumtemperatur entfernt, um die Verbindung (XXIII) zu erhalten,

 <EMI ID=36.0> 
wobei R<2> die gleiche Bedeutung wie in der Formel (I) hat, welche mit aromatischem Sulfonylchlorid zu der Verbindung (XXIV) reagiert

 <EMI ID=37.0> 
wobei R<2> und R<3> die gleichen Bedeutungen wie in der Formel (I)

   haben.

[0022] Die Verbindung (XXIV) wird durch Erwärmen bis zum Kochen mit 5M HCl zu der Verbindung (XXV) umgewandelt

 <EMI ID=38.0> 
wobei R<1> = 
 <EMI ID=39.0> 
R<2> und R<3> die gleichen Bedeutungen wie in der Formel (I) haben.

[0023] Die Verbindungen, bei denen R<1> H ist und Z ist

 <EMI ID=40.0> 
werden auf analoge Weise wie vorher beschrieben hergestellt, mit der einzigen Ausnahme, dass die Ausgangsverbindung 3-Cyanobenzaldehyd anstelle von 4-Cyanobenzaldehyd ist.

[0024] Die Ausgangsverbindungen können, falls nicht anders angegeben, gemäss den in der Literatur beschriebenen Verfahren hergestellt werden; z.B. die Verbindung der Formel (IV) wie beschrieben durch A. Fässler, et al., J. Med.

   Chem. 1996, 39, 3203-3215.

[0025] Die Erfindung bezieht sich ferner auf die Verwendung von Verbindungen der Formel (I) für die Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzung verwendet als orale und parenterale Koagulationshemmer, z.B. Inhibitoren, die hauptsächlich Thrombin hemmen, und duale Inhibitoren von Thrombin und Faktor Xa.

   Sie können bei der Behandlung und Prävention einer Vielzahl von Thromboseformen verwendbar sein: (i) venöse Thromboembolien aufgrund der Bildung eines Thrombus innerhalb einer Vene (Venenthrombose) verbunden mit erworbenen (längere Bettlägerigkeit, chirurgische Eingriffe, Verletzungen, Krebserkrankungen, Schwangerschaft und Zuständen nach der Geburt) oder vererbten Risikofaktoren (Mangel an natürlichen Koagulationhemmern) Einengung oder Verschluss einer Lungenarterie durch einen abgelösten Thrombus (pulmonäre Embolie), (ii) cardiogene Thromboembolie, aufgrund der Bildung eines Thrombus im Herzen verbunden mit Herzrhythmusstörungen, Herzklappendefekten, künstlichen Herzklappen oder Herzerkrankungen, Embolien der peripheren Arterien verursacht durch einen abgelösten Thrombus, am häufigsten in das Gehirn (ischämischer Schlaganfall), (iii)

   arterielle Thrombose aufgrund des Durchlaufens atherosklerotischer Prozesse in den Arterien, welche eine Arterie einengen oder verschliessen und eine myocardiale Ischämie verursachen (Angina pectoris, akutes Koronarsyndrom) oder Herzmuskelzelltod (myocardialer Infarkt), Einengen oder Verschluss einer peripheren Arterie (periphere arterielle Verschlusskrankheit) und Einengen oder Verschliessen der Arterie nach einem Eingriff an dem Blutgefäss (Reverschluss oder Restenose nach transluminaler Koronararterienangeoplastie, Wiederverschluss oder Restenose nach perkutaner transluminaler Angioplastie der peripheren Arterien) und (iv) in einer Anzahl von Zuständen (z.B.

   Schwangerschaftskomplikationen, metastasierende maligne Erkrankungen, schwere Verletzungen, bakterielle Sepsis), falls thrombogene Aktivierung eine vielfältige Bildung von Thrombi in dem Gefässsystem verursacht (disseminierte, intravasale Koagulation). Die Auswahl der möglichen Verwendungen für die hergestellten pharmazeutischen Zusammensetzungen sollte nicht durch diese Beispiele beschränkt werden.

[0026] Die Verbindungen der Formel (I) können ebenfalls als eine zusätzliche Therapie im Zusammenhang mit thrombolytischer Therapie bei kurz zurückliegenden myocardialen Infarkten, in Kombination mit Acetylsalicylsäure bei Patienten mit instabiler Angina pectoris, bestimmt für eine perkutane transluminale Angioplastie,

   und bei der Behandlung von Patienten mit Thrombose und mit Heparin-induzierter Thrombozytopenie verwendet werden.

[0027] Die Koagulationshemmer können ferner für die Verhinderung der Koagulation von Blut, welches in Kontakt mit nicht biologischen Oberflächen ist (Gefässprothesen, Gefässstents, künstliche Herzklappen, extrakorporale Kreislaufsysteme, Chemodialyse), und in vitro verwendet werden, um die Koagulation in biologischen Proben zur Untersuchung oder zur Lagerung zu verhindern.

[0028] Ferner ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung zu stellen, welche die Verbindungen der Formeln (I) umfassen. Sie können als injizierbare oder orale Formulierungen formuliert werden. Zusätzlich zu den Wirkstoffen können bevorzugt verschiedene Standardzusätze in Abhängigkeit von der Verwendung enthalten sein.

   Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden gemäss Standardverfahren hergestellt. Die Zusammensetzung kann in einer derartigen Art und Weise formuliert werden, um eine kontrollierte und zeitversetzte Abgabe des Wirkstoffs zu erlauben. Dosierung, Häufigkeit und Art der Verabreichung hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, sie hängt ebenfalls von dem einzelnen Wirkstoff und seinen pharmakokinetischen Parametern und von dem Zustand des Patienten ab.

Biologische Tests

I. Enzymassay

1. Bestimmung der Wirksamkeit von Thrombininhibitoren

a) Prinzip

[0029] Thrombin spaltet Amidbindungen in einem synthetischen, chromogenen Substrat, wobei gelb gefärbtes p-Nitroanilin (p-NA) freigesetzt wird. Die Menge von erzeugtem p-NA ist direkt proportional zu der bei einer Wellenlänge von 405 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessenen Extinktion.

   Falls ein Thrombininhibitor hinzugegeben wird, sinkt die amidolytische Aktivität des Enzyms. Die Wirkung des Inhibitors wird als die Inhibitionskonstante (Ki) ausgedrückt.

b) Reagenzien

[0030] Thrombin (humanes Thrombin, 303 NIH-Einheiten, Sigma): Der Inhalt des Glasgefässes wurde in destilliertem Wasser gelöst, um eine Stammlösung von 20 NIH-Einheiten/ml zu ergeben. Die Stammlösung wird in 0,5-ml-Aliquots pipettiert und bei -70 C deg. gelagert. Unmittelbar vor der Verwendung wurde eine Arbeitslösung von Thrombin mit 2 NIH-Einheiten/ml Aktivität mit HBSA-Puffer hergestellt. Die Endkonzentration von Thrombin in einer Mikrotiterplatte ist 0,5 NIH-Einheiten/ml.
Chromogenes Thrombinstubstrat (S-2238, Chromogenix, 25 mg). Eine 1 mM Substratlösung wird hergestellt, in 0,5-ml-Aliquot pipettiert und bei -20 C deg. gelagert.

   Vor der Verwendung wurden 160 und 80 MicroM Substratlösungen mit destilliertem Wasser hergestellt. Die Endkonzentration des Substrats in der Reaktionsmischung war 40 bzw. 20 MicroM (Km = 2,6 MicroM).
HBSA-Puffer, pH 7,5: 10 mM Hepes-Puffer (HEPES, Sigma), 150 mM NaCl und 0,1% (w/v) bovines Serumalbumin (98% bovines Serumalbumin, Sigma) werden in zweifach destilliertem Wasser gelöst. Der pH wird mit 0,1 M NaOH-Lösung eingestellt.
Inhibitoren: Die Inhibitoren wurden in DMSO gelöst, um eine 10 mM Stammlösung zu ergeben. Die Arbeitslösungen (Endkonzentrationen im Bereich von 10 bis 100 MicroM) werden mit destilliertem Wasser hergestellt.

   Die höchste Konzentration an DMSO in einer Mikrotiterplatte überstieg 3% nicht.

c) Verfahren

[0031] Die Messungen wurden in einer Mikrotiterplatte durchgeführt. 50 Microl HBSA-Puffer, 50 Microl der Inhibitorlösung mit verschiedenen Konzentrationen (zur Kontrolle 50 Microl HBSA-Puffer) und 50 Microl Thrombinlösung wurden in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte pipettiert. Die Platte wird bei einer Temperatur von 25 deg. C für 15 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation wurde 50 Microl des chromogenen Substrats hinzugegeben, und die Mikrotiterplatte in dem Spektrophotometer platziert (Tecan, Sunrise). Der Extinktionsanstieg bei 405 nm wird in 10 Sekunden Abständen über eine Zeitspanne von 15 Minuten bei einer Temperatur von 25 deg. C gemessen.

[0032] Für die Bestimmung der Inhibitionskonstante (Ki) wurden 40 von 20 MicroM Substrat verwendet.

   Jede Messung wurde dreifach durchgeführt und das Ergebnis ist der Mittelwert von 3 Messungen.

2. Bestimmung der Inhibitionskonstante (Ki)

[0033] Die Ki wird gemäss dem durch Cheng und Prusoff (Biochem Pharmacol, 1973) beschriebenen Prinzip bestimmt. Die anfänglichen Reaktionsgeschwindigkeiten in der Anwesenheit und der Abwesenheit des Inhibitors werden gemessen. Die Änderung in der Extinktion pro Zeiteinheit (v) wird von dem anfänglichen, linearen Teil der Reaktion berechnet.

   Für kompetitive Inhibitoren gilt, dass

 <EMI ID=41.0> 
und es folgt, dass

 <EMI ID=42.0> 

[0034] I = Inhibitorkonzentration, S = Substratkonzentration, Km = Michaeliskonstante, v0 = anfängliche Reaktionsgeschwindigkeit in der Abwesenheit des Inhibitors, vi = anfängliche Reaktionsgeschwindigkeit in der Gegenwart des Inhibitors.

[0035] Die Messungen wurden mit zwei Konzentrationen des Inhibitors und zwei Konzentrationen des Substrats durchgeführt. Für jede Kombination der verwendeten Konzentration des Substrats und des Inhibitors wurde Ki berechnet und das Ergebnis ist ihr gemittelter Wert.

3.

   Bestimmung der Selektivität der Inhibitorwirkung gegen Thrombin mit Bezug auf die Trypsin-Inhibition

a) Prinzip

[0036] Da Thrombin und Trypsin in Bezug auf die Spezifität gegen ein Substrat aufgrund vergleichbarer Strukturen im aktiven Zentrum eng verwandt sind, wird die Selektivität der Inhibitorwirkung gegen Thrombin mit Bezug auf die Trypsininhibition bestimmt, welche eine nicht spezifische Serinprotease ist. Die Inhibitorwirkung gegen Thrombin wird wie vorher beschrieben bestimmt. Die Trypsininhibition wird in der gleichen Art und Weise wie bei der Bestimmung der Inhibitorwirkung für Thrombin gemessen, ausser dass ein unterschiedliches chromogenes Substrat verwendet wird. Für beide Enzyme wird Ki berechnet.

   Die Selektivität des Inhibitors wird als ein Verhältnis von Ki für Trypsin zu Ki für Thrombin ausgedrückt.

b) Reagenzien

[0037] Trypsin (bovin, 6000 BAEE Einheiten/mg Protein, Sigma): Eine Stammlösung von Trypsin mit einer Aktivität von 300 U/ml wird hergestellt, in 0,2 ml Aliquots pipettiert und bei -70 deg. C gelagert. Unmittelbar vor der Verwendung wird die Stammlösung aufgetaut und eine Arbeitslösung mit 4 mU/ml mit HBSA-Puffer hergestellt. Die Endaktivität von Trypsin in einer Mikrotiterplatte ist 1 mU/ml.
Chromogenes Substrat für Trypsin (S-2222, Chromogenix, 25 mg): eine 2 mM Substratlösung wird hergestellt, in 0,3 ml Aliquots pipettiert und bei -20 deg. C gelagert. Vor der Verwendung wird die Stammlösung aufgetaut und 400 und 200 MicroM Substratlösungen werden hergestellt.

   Die Endkonzentrationen des Substrats der Reaktionsmischung sind 100 bzw. 50 MicroM (Km = 25 MicroM).
HBSA-Puffer, pH 7,5: 10 mM Hepespuffer (HEPES, Sigma), 150 mM NaCl und 0,1% (w/v) bovines Serumalbumin (98%iges bovines Serumalbumin, Sigma) werden in zweifach destilliertem Wasser gelöst. Der pH wird mit einer 0,1 M NaOH-Lösung eingestellt.
Inhibitor. Die Inhibitoren werden in DMSO gelöst, um eine 10 mM Stammlösung zu ergeben. Die Arbeitslösungen (Endkonzentration im Bereich von 10 bis 600 MicroM) werden mit destilliertem Wasser hergestellt. Die höchste Konzentration an DMSO in einer Mikrotiterplatte übersteigt 10% nicht.

[0038] Zur Bestimmung des Ki wurden 100 und 50 MicroM Substrat verwendet.

   Jede Messung wurde dreifach durchgeführt und das Ergebnis ist der Mittelwert von drei Messungen.

c) Verfahren

[0039] Das gleiche Verfahren wie vorher zur Messung der Inhibitoraktivität gegen Thrombin dargestellt, wird verwendet. Die Konzentrationen der Reagenzien zur Bestimmung der Inhibitoraktivität werden mit Bezug auf Trypsin verwendet.

d) Bestimmung der Inhibitionskonstante (Ki)

[0040] Sie wird auf dieselbe Art und Weise wie bei der Bestimmung von Ki für Thrombin bestimmt.

e) Bestimmung der Selektivität

[0041] Ki für Thrombin und Ki für Trypsin wurden bestimmt. Die Selektivität wird als das Verhältnis definiert:

 <EMI ID=43.0> 

4.

   Bestimmung der Selektivität der Inhibitoraktivität gegen Thrombin mit Bezug auf die Inhibition von Faktor Xa.

a) Prinzip

[0042] Da beide Enzyme eng verwandt sind und von vergleichbarer Struktur des aktiven Zehtrums, wird die Selektivität der Inhibitoraktivität gegen Thrombin mit Bezug auf die Inhibition von Faktor Xa bestimmt. Die Inhibition von FXa wird in der gleichen Art und Weise wie die Messung der Inhibition für Thrombin mit dem chromogenen Substrat S 2238 gemessen. Für beide Enzyme wird Ki berechnet. Die Selektivität des Inhibitors wird als ein Verhältnis von Ki für FXa zu Ki von Thrombin berechnet.

b) Reagenzien

[0043] Faktor Xa (Chromogenix, 71 nkat): Die Inhalte der Glasröhrchen werden in destilliertem Wasser gelöst, um eine Stammlösung mit 10 nkat/ml zu ergeben. Die Stammlösung wird in 0,5 ml Aliquots pipettiert und bei -20 deg. C gelagert.

   Unmittelbar vor der Verwendung wurden FXa-Arbeitslösungen mit einer Aktivität von 2 nkat/ml mit HBSA-Puffer hergestellt. Die Endaktivität von FXa in einer Microtiterplatte ist 0,5 nkat/ml.

[0044] Chromogenes Substrat für FXa (S-2222, Chromogenix, 25 mg): 2 mM Substratlösung wird hergestellt, in 0,5 ml Aliquots pipettiert und bei -20 deg. C gelagert. Vor der Verwendung wurden 800 und 400 MicroM Substratlösungen mit destilliertem Wasser hergestellt. Die Endkonzentration des Substrats in der Reaktionsmischung waren 200 bzw. 50 MicroM (Km = 25 MicroM).
HBSA-Puffer, pH 7,5: Der gleiche wie in dem Verfahren für Thrombin.
Inhibitor. Die Inhibitoren wurden in DMSO gelöst, um eine 10 mM Stammlösung zu ergeben. Die Arbeitslösungen (Endkonzentrationen im Bereich von 5 bis 300 MicroM) werden mit destilliertem Wasser hergestellt.

   Die höchste Konzentration an DMSO in einer Mikrotiterplatte übersteigt 3% nicht.

c) Verfahren

[0045] Das gleiche Verfahren wir vorher für die Messung der Inhibitoraktivität gegen Thrombin erwähnt, wird verwendet. Die Konzentrationen der für die Bestimmung der Inhibitoraktivität mit Bezug auf FXa beschriebenen Reagenzien werden verwendet.

d) Bestimmung der Inhibitionskonstante (Ki)

[0046] Sie wird in der gleichen Art und Weise wie bei der Bestimmung von Ki für Thrombin bestimmt.

e) Bestimmung der Selektivität

[0047] Ki für Thrombin und Ki für FXa werden bestimmt. Die Selektivität wird als ein Verhältnis definiert:

 <EMI ID=44.0> 

II.

   Koagulationsassay

[0048] Die Gerinnungszeit für normales gepooltes Plasma wird durch die Koagulationsassays (Thrombinzeit, aktivierte partielle Thromboplastinzeit und Prothrombinzeit) in einem Koagulometer nach Zugabe von verschiedenen Konzentrationen des Inhibitors gemessen. Die Ergebnisse werden als die Inhibitorkonzentration dargestellt, welche die Gerinnungszeit verdoppelt.

1. Thrombinzeit (TT)

a) Prinzip

[0049] Die Bestimmung der Thrombinzeit wird zur labormässigen Überwachung der Behandlung mit nicht fraktioniertem Heparin, zur Überwachung der thrombolytischen Therapie, zum Nachweis von Störungen in der Fibrinbildung und zur Diagnose von schweren Formen von Fibrinogenmangel verwendet. Die Thrombinzeit wird aufgrund der reduzierten Fibrinogenkonzentration, der Anwesenheit von Fibrinogenabbauprodukten oder Thrombininhibitoren im Plasma verlängert.

   Für das Verfahren wird Thrombin zum Plasma hinzugegeben. Thrombin wandelt Fibrinogen in Fibrin um, und die Zeit für die Gerinnungsbildung wird gemessen.

b) Reagenzien

[0050] Thrombin (Thrombinuntersuchungsreagenz, 1,5 IU/ml): Lyophilisiertes bovines Thrombin wird in 5 ml HEPES-Puffer-Saline (25 nM, pH 7,4) zu einer Konzentration von 2 U/ml gelöst. Normales gepooltes Plasma: Venöses Blut von wenigstens 10 offensichtlich gesunden Freiwilligen wird in einer 0,11 M Natriumcitratlösung gesammelt (ein Teil Natriumcitrat und 9 Teile Blut). Unmittelbar nach Entnahme des Blutes wird das Blut bei 2000 X g für 30 Minuten bei 4 deg. C zentrifugiert. Das Plasma wird entfernt, in 2 ml Aliquots pipettiert und bei -70 deg.

   C gelagert.
Inhibitoren: Die Inhibitoren werden in DMSO (10 mM Stammlösung) gelöst und mit destilliertem Wasser verdünnt, um Arbeitslösungen zu ergeben (höchste Konzentration 100 MicroM).

c) Verfahren

[0051] Es wurden 90 Microl Plasma und 10 Microl des Inhibitors in eine Küvette des Koagulometers (Fibrintime, Dade/Behring) pipettiert und auf 37 deg. C vorgewärmt. Es wurde bei 37 deg. C für 5 Minuten inkubiert. Es wurden 200 Microl der auf 37 deg. C vorgewärmten Thrombinlösung hinzugegeben. Nach der Thrombinhinzugabe wurde der Zeitmesser gestartet und die Zeit für die Gerinnungsbildung gemessen.

2. Aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT)

a) Prinzip

[0052] Die aPTT wird als eine Screening-Untersuchung für Koagulationsstörungen des inneren Koagulationspfades verwendet.

   Das Verfahren ist empfindlich für Störungen in den Koagulationsfaktoren VIII und IX und der Kontaktfaktoren. Die aPTT wird aufgrund des Mangels an den Faktoren oder aufgrund der Anwesenheit der Inhibitoren (zum Beispiel Lupus-Koagulationshemmer, Heparin) verlängert. Die Inkubation mit Plasma mit der optimalen Menge an Phospholipiden und ein Kontaktaktivator führt zu einer Aktivierung der Faktoren des inneren Koagulationspfades. Die Zugabe von Calciumionen löst den Koagulationsvorgang aus. Die Zeit der Fibringerinnungsbildung wird gemessen.

b) Reagenzien

[0053] Phospholipide mit einem Aktivator (Pathrombin SL, Dade/Behring): Siliciumdioxidpartikel, pflanzliche Phospholipide, Natriumchlorid (2,4 g/l), HEPES (14,3 g/l), pH 7,6 und Natriumazid (< 1 g/l).

   Vor der Verwendung mussten die Reagenzien Raumtemperatur haben und gut geschüttelt sein.
Calciumchloridlösung: 0,025 mol/l
Normales gepooltes Plasma: Das gleiche wie für die Thrombinzeit.
Inhibitoren: Die gleichen wie für die Thrombinzeit.

c) Verfahren

[0054] Es wurden 90 Microl Plasma und 10 Microl des Inhibitors in eine auf 37 deg. C vorgewärmte Küvette des Koagulometers (Fibrintime, Dade/Behring) pipettiert. Es wurde für 37 deg. C für 5 Minuten inkubiert. Es wurde 100 Microl Phospholipide mit einem Aktivator hinzugegeben. Es wurde bei 37 deg. C für 2 Minuten inkubiert. Es wurden 100 Microl Calciumchlorid bei 37 deg. C zugegeben. Nach der Zugabe von Calciumchlorid wurde die Zeit für die Gerinnungsbildung gemessen.

3.

   Prothrombinzeit (PT)

a) Prinzip

[0055] Die Prothrombinzeit ist eine schnelle, empfindliche Screening-Untersuchung zur Bestimmung von Koagulationsstörungen des inneren Pfades (Faktoren n, V, VII und X). Aufgrund der hohen Sensitivität dieser Koagulationsfaktoren ist diese Untersuchung gut geeignet zur Überwachung einer oralen Koagulationshemmer-Therapie, zur Diagnose genetischer und erworbener Mängel von Koagulationsfaktoren und zur Überprüfung der Leber auf ihre Syntheseleistungen. Die Prothrombinzeit wird aufgrund des Koagulationsfaktorenmangels oder aufgrund der Anwesenheit von Inhibitoren verlängert.

   Für das Verfahren werden optimale Mengen von Thromboplastin und Calcium zu Plasma hinzugegeben und die Zeit für die Gerinnungsbildung gemessen.

b) Reagenzien

[0056] Thromboplastin (Thromborel S, Dade/Beehring): Humanes plazentales Thromboplastin mit Calciumchlorid und Stabilisationsmitteln; gelöst in 4 ml destilliertem Wasser. Vor der Verwendung wurde das Reagenz auf 37 deg. C für wenigstens 30 Minuten aufgewärmt. Normales gepooltes Plasma: Das gleiche wie für die Thrombinzeit. Inhibitoren: Die gleichen wie für die Thrombinzeit.

c) Verfahren

[0057] Es wird 90 Microl Plasma und 10 Microl des Inhibitors in eine auf 37 deg. C vorgewärmte Küvette des Koagulometers (Fibrintime, Dade/Behring) pipettiert. Es wird für 37 deg. C für 5 Minuten inkubiert. Es werden 200 Microl Thromboplastin, vorgewärmt auf 37 deg. C, hinzugegeben.

   Nach der Zugabe des Thromboplastins wird die Zeit für die Gerinnungsbildung gemessen.

[0058] Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert, jedoch keineswegs begrenzt.

Beispiel 1:

[0059] N-{2-[2-(1-Azepanylcarbonyl)-2-(4-cyanobenzyl)hydrazino]-2-oxoethyl}-2-naphthalinsulfonamid

[0060] 1.00 g (3,77 mmol) 2-[(2-Naphthylsulfonyl)amino]essigsäure wurde in 20 ml Dichlormethan; gelöst, und während des Rührens wurden 420 mg (3,87 mmol) Ethylchlorformiat und 526 mg (4,00 mmol) N-Ethyl-N,N-diisopropylamin hinzugeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt, gefolgt durch die Zugabe von pulverisiertem 2-(1-Azepanylcarbonyl)-2-(4-cyanobenzyl)hydrazinchlorid (1,00 g; 3,24 mmol). Nach der Zugabe wurde die Mischung bei Raumtemperatur für 3 Tage gerührt.

   Das Lösungsmittel wurde auf einem Rotationsverdampfer entfernt, der Rückstand in 50 ml Ethylacetat gelöst und dann mit 1M HCl, 1M NaOH und destillierten Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde im Vakuum verdampft. Das Rohprodukt wurde aus Ethanol umkristallisiert.

[0061] Ausbeute: 1,34 g (79%)
Schmelzpunkt: 149-151 deg.

   C
IR(KBr, cm<-1>): 3410, 3253, 2919, 2232, 1708,1613,1440,1343,1156, 659
<1>H-NMR (DMSO-d6): delta  (ppm) 1,46 (m, 8H, Ch2-Azepin 3 ¾, 4 ¾, 5 ¾, 6 ¾); 1,65 (m, 4H, CH2-Azepin2 ¾, 7 ¾); 3,33 (m, 2H, CO-CH2-NH); 4,09 (m, 1H, NHCO); 4,47 (s, 2H, Ar-CH2), 7,58 und 7,79 (2d, 2H jedes, J2, 6=8,27, Ar-H2, 3, 5, 6); 7,69-8,47 (m, 7H, Ar-H (Naphthalin)); 10,29 (s, 1H NHSO2)
Molekülmasse: berechnet: 519 (C27H29N5O4S); gefunden: 520 (MH<+>).

Beispiel 2:

[0062] 4-[(1-(1-Azepanylcarbonyl)-2-{2-[(1-naphtylsufonyl)amino]acetyl}hydrazino)methyl]-N ¾-hydroxybenzolcarboxamid

[0063] N-{2-[2-(1-Azepanylcarbonyl)-2-(4-cyanobenzyl)hydrazino)-2-oxoethyl}-2-naphthalinsulfonamid (400 mg, 0,77 mmol) wurde in wasserfreiem Ethanol gelöst und Hydroxylamin (28,0 mg, 0,85 mmol) wurde hinzugegeben.

   Die Reaktionsmischung wurde zum Siedepunkt 12 Stunden erwärmt.

[0064] Das Lösungsmittel wurde auf einem Rotationsverdampfer entfernt und das Produkt mit Ether gewaschen.

[0065] Ausbeute: 386 mg (87%)
Schmelzpunkt: 104-108 deg. C
IR (KBr, cm<-1>): 3359, 2624, 1782, 1640, 1422, 1345, 1157, 1075, 750, 661
<1>H-NMR (CDCI3):delta  (ppm) 1,49-1,89 (m, 8H, CH2-Azepin3 ¾, 4 ¾, 5 ¾, 6 ¾); 2,07 (m, 4H, CH2-Azepin2 ¾, 7); 3,48 (m, 2H, CO-CH2-NH); 4,18 (s, 1H, NHCO); 4,68 (m, 2H, Ar- CH2), 4,90 (s, 1H, =N-OH); 7,42 und 7,61 (2d, 2H jedes, J 2,6 =8,17, J 3,5=8,15, Ar-H2, 3, 5, 6); 7,64-8,34 (m, 7H, Ar-H (Naphtalen)); 8,42 (s, 2H, NH2-Amidoxim); 10,35 (s, 1H NHSO2)
Molekülmasse:

   berechnet 552 (C27H32N6O5S), gefunden 553 (MH<+>).

Beispiel 3:

[0066] Amino{4-[(1-(1-azepanylcarbonyl)-2-{2-[(1-naphthylsulfonyl)amino]acetyl}hydrazino)methyl]phenyl}-methanaminhydrochlorid

[0067] N-{2-[2-(1-Azepanylcarbonyl)-2-(4-cyanobenzyl)hydrazino]-2-oxoethyl}-2-naphtalinsulfanamid (520 mg, 1,00 mmol) wurde in 25 ml wasserfreiem Ethanol gelöst, und gasförmiges HCl wurde für 20 Minuten eingesprudelt. Nach Abschluss des Einsprudelns, wurde die Lösung bei Raumtemperatur 4 Stunden gerührt, gefolgt durch die Zugabe von Ammoniumacetat (85,0 mg, 1,10 mmol). Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 2 Tage gelassen. Das gasförmige HCl wurde abermals für 20 Minuten eingesprudelt. Nach einer Stunde wurde das gebildete Ammoniumchlorid abfiltriert und das Ethanol auf einem Rotationsverdampfer verdampft.

   Das Produkt wurde in Ether gelöst und durch Saugen abfiltriert.

[0068] Ausbeute: 481 mg (84%)
IR (KBr, cm<-1>): 2969, 2758, 1783, 1669, 1344, 1158, 1076, 749, 660, <1>H-NMR (DMSO-d6):delta  (ppm) 1,57-1,76 (m, 8H, CH2-Azepin3 ¾, 4 ¾, 5 ¾, 6 ¾); 3,03 (m, 4H, CH2-Azepin2 ¾, 7 ¾); 3,37 (m, 2H, CO-CH2-NH); 4,31 (m, 1H, NHCO): 4,74 (s, 2H, Ar-CH2), 7,62 und 7,90 (2d, 2H jedes, J2, 6=8,14, J3, 5=8,19, Ar-H2, 3, 5, 6); 7,35-8,49 (m, 7H, Ar-H (Naphthalin)); 9,30 (s, 1H NHSO2); 9,42 (2s, 2H, Amidin)
Molekülmasse: berechnet: 537 (C27H33N6O4S); gefunden: 538 (MH<+>).

Beispiel 4:

[0069] Ethyl 2-[2-(1-azepanylcarbonyl)-2-(4-cyanobenzyl)hydrazino]-1-benzyl-2-oxoethylcarbamat 1,10 g (4,64 mmol) N-(Ethoxycarbonyl)phenylalanin wurde in Dichlormethan (25 ml) gelöst, und 0,50 ml (5,18 mmol) Ethylchlorformiat wurde tropfenweise hinzugegeben.

   Die Mischung wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, gefolgt durch die Zugabe von DIEA (2 ml) und 1,35 g (4,49 mmol) 2-(1-Azepanylcarbonyl)-2-(4-cyanobenzyl)hydraziniumchlorid. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt, dann wurde das Lösungsmittel im Vakuum verdampft und der Rückstand in Ethylacetat (50 ml) gelöst. Die Lösung wurde mit 2 X 25 ml 10%ige Citronensäure und 25 ml wässriger NaHCO3 extrahiert und mit Wasser und Saline gewaschen. Die organische Phase wurde über Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde ferner mit Säulenchromatographie (Dichlormethan/Methanol 20:1) gereinigt.

[0070] Ausbeute: 438 mg (22%), Schmelzpunkt: 133-137 deg.

   C
IR (KBr, cm<-1>): 3321, 2950, 2225, 1666, 1531, 1421, 1289, 1043, 757, 559 H-NMR (CDCI3):delta  (ppm) 1,21 (t, 3H, J=6,78 Hz, CH2CH3), 1,57 (m, 4H, CH2), 1,75 (m, 4H, CH2), 3,01 (m, 2H, Ar-CH2), 3,43 (t, 4H, J=5,80 Hz, CH2), 4,13 (t, 3H, J=6,73 Hz, CH2CH3), 4,41 (s, 2H, Ar-CH2), 4,53 (s, 1H, CH), 5,04 (s, 1H, NHCOOEt), 6,48 (s, 1H, N-NHCO), 7,29 (m, 5H, Ar-H), 7,51 (d, 2H, J=8,20 Hz, Ar-H<3, 5>), 7,66 (d, 2H, J=8,33 Hz, Ar-H<2, 6>)
Molekülmasse: berechnet: 491 (C27H33N5O4), gefunden: 492 (MH<+>).

Beispiel 5:

[0071] Ethyl 2-[2-{4-[Amino(imino)methyl]benzyl}-2-(1-azepanylcarbonyl)hydrazino)-1-benzyl-2-oxoethylcarbamat

[0072] Ethyl 2-(2-(1-Azepanylcarbonyl)-2-(4-cyanobenzyl)hydrazino]-1-benzyl-2-oxoethylcarbamat wurde in reinem Alkohol (20 ml) suspendiert und der gasförmige Chlorwasserstoff wurde für eine halbe Stunde eingesprudelt.

   Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 4 Stunden gelassen, dann wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mit Diethylether (2 X 20 ml) gewaschen und in reinem Ethanol gelöst. Die Lösung wurde mit gasförmigem Ammoniak für 10 Minuten behandelt und das Ethanol unter reduziertem Druck entfernt.

Beispiel 6:

[0073] [Amino(4-{[2-(2-ammonio-3-phenylpropanoyl)-1-(1-azepanylcarbonyl)hydrazino]methyl}phenyl)methylen]ammoniumdichlorid

[0074] Das Rohprodukt des vorherigen Stadiums wurde in 1M HCl (30 ml) gelöst und wurde für zwei Stunden refluxiert. Das Wasser wurde unter reduziertem Druck entfernt und der Rückstand mit Säulenchromatographie (Ethylacetat/Methanol 2:1) gereinigt.

[0075] Ausbeute: 222 mg (49%)
Schmelzpunkt: 221-223 deg.

   C
IR (KBr, cm<-1>): 3232, 2940, 2229, 1784, 1716, 1538, 1403, 1257, 1054, 959, 823, 752, 701
H-NMR (CDCl3):delta  (ppm) 1,24 (t, 3H, J=6,76 Hz, CH2CH3). 1,49 (m, 4H, CH2), 1,68 (m, 4H, CH2), 3,03 (m, 2H, Ar-CH2), 3,39 (t, 4H, J=5,97 Hz, CH2), 4,12 (t, 3H, J=6,72 Hz, CH2CH3), 4,43 (s, 2H, Ar-CH2), 4,62 (s, 1H, CH), 5,01 (s, 1H, NHCOOEt), 6,45 (s, 1H, N-NHCO), 7,26 (m, 5H, Ar-H), 7,53 (d, 2H, J=8,17 Hz, Ar-H<3, 5>), 7,68 (d, 2H, J=8,29 Hz, Ar-H<2, 6>), 9,29 (s, 4H, H2N-C=NH2<+>)
Molekülmasse: berechnet: 509 (C24H34N6O2CI2);

   gefunden 437 ((M-2HCl)H<+>).

Beispiel 7:

[0076] N ¾-(1-Azepanylcarbonyl)-N ¾-(4-cyanobenzyl)-1-(2-naphtylsulfonyl)-2-pyrrolidincarbohydrazid

[0077] 2,20 g (7,21 mmol) 1-(2-Naphtylsulfonyl)prolin wurde in 35 ml Dichlormethan gelöst, und während des Rührens wurden 815 mg (7,50 mmol) Ethylchlorformiat und 1,20 g (9,30 mmol) N-Ethyl-N,N-diisopropylamin hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für eine Stunde gerührt, gefolgt durch die Zugabe von pulverisiertem 2-(1-Azepanylcarbonyl)-2-(4-cyanobenzyl)hydrazinchlorid (2,00 g, 6,48 mmol). Nach der Zugabe wurde sie weiter für 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde auf einem Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand in 50 ml Ethylacetat gelöst, gefolgt durch Waschen mit 10%iger Citronensäure, 5%iger NaHCO3-Lösung und destilliertem Wasser.

   Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum verdampft. Das Rohprodukt wurde aus Acetone repräzipitiert.

[0078] Ausbeute: 0,82 g (23%)
Schmelzpunkt: 158-159 deg. C
IR (KBr, cm<-1>): 3461, 2234, 1708, 1614, 1527, 1428, 1342, 1156, 1082, 1015, 759, 662, 548
H-NMR (DMSO-d6):delta  (ppm) 1,47 (s, 4H, CH2,) 1,64 (s, 4H, CH2), 1,75 (m, 4H, CH2), 3,24 (m, 4H, CH2), 3,24 (m, 2H, CH2), 4,12 (m, 1H, CH), 4,47 (s, 2H, Ar-CH2), 7,57 (d, 2H, J=8,29 Hz, Ar-H<3, 5>), 7,71 (dqu, 2H, J1=7,16 Hz, J2=1,50 Hz, Ar-H), 7,80 (d, 2H, J=8,29 Hz, Ar-H<2, 6>), 7,84 (dd, 1H, J1=8,67 Hz, J2=1,89 Hz, Ar-H), 8,07 (d, 1H, J=7,91 Hz, Ar-H), 8,15 (m, 2H, Ar-H), 8,47 (s, 1H, Ar-H), 10,29 8s, 1H, NH)
Molekülmasse: berechnet: 559 (C30H33N5O4S); gefunden:

   560 (MH<+>).

Beispiel 8:

[0079] Amino{4[(1-(1-azepanylcarbonyl)-2-{[1-(2-naphthylsulfonyl)-2-pirrolidinyl]carbonyl{hydrazino)methyl]phenyl} methanaminhydrochlorid

[0080] N ¾-(1-Azepanylcarbonyl-N-(4-cyanobenzyl)-1-(2-naphtylsulfonyl)-2-pirrolidincarbohydrazid (754 mg, 1,35 mmol) wurde in 25 ml wasserfreiem Ethanol gelöst, und gasförmiges HCl wurde für 20 Minuten eingesprudelt. Nach Abschluss des Einsprudelns wurde die Lösung bei Raumtemperatur für 4 Stunden gerührt, gefolgt durch die Zugabe von Ammoniumacetat (115,0 mg, 1,50 mmol). Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 2 Tage altern gelassen. Das gasförmige HCl wurde für 20 Minuten wieder eingesprudelt. Nach 1 Stunde wurde das gebildete Ammoniumchlorid filtriert und Ethanol auf einem Rotationsverdampfer verdampft.

   Das Produkt wurde in Äther gelöst und durch Saugen abfiltriert.

[0081] Ausbeute: 320 mg (40%)
Schmelzpunkt: 123-127 deg. C
IR (KBr, cm<-1>): 3034, 1781, 1681, 1602, 1402, 1347, 1158, 1076,1010, 823, 748, 660
<1>H-NMR (DMSO-d6): delta  (ppm) 1,57 (m, 4H, CH2-Azepin4 ¾,5 ¾); 1,76 (m, CH2-Azepin3 ¾,6 ¾); 2,03 (m, 4H, CH2-Prolin); 3,02 (m, 4H, CH2-Azepin2 ¾,7 ¾); 3,32 (m, 2H, CH2-Prolin); 3,63 (q, 1H, J=3,63 Hz, CH2-Prolin); 4,96 (s, 2H, Ar-CH2), 7,52 (d, 2H, J=8,18 Hz, Ar-H<2, 5>), 7,68 (dqu, 2H, J1=7,14 Hz, J2= 1,67 Hz, Ar-H), 7,81 (d, 2H, J=8,18 Hz, Ar-H<2, 6>), 7,93 (dd, 1H, J1=8,59 HZ, J2=2,11 Hz, Ar-H), 8,12 (m, 3H, Ar-H), 8,49 (s, 1H, Ar-H), 9,41 (s, 4H, NH2-C=NH2<+>) 9,59 (s, 1H, NH) Molekülmasse: berechnet: 599 (C30H37N5O4SCI); gefunden:

   577((M-HCl)H<+>).

Beispiel 9:

[0082] N ¾-(1-Azepanylcarbonyl)-N ¾-(4-cyanobenzyl)-2-(2-naphthyloxy)acetohydrazid
750 mg (3,71 mmol) von 2-(2-Naphthyloxyessigsäure und 1,00 g (3,24 mmol) von 2-(1-Azepanylcarbonyl)-2-(4-cyanobenzyl)hydrazinchlorid wurden in 15 ml Dimethylformamid gelöst. Während des Rührens wurden 500 mg (3,70 mmol) von 1-Hydroxybenzotriazol und 748 mg (3,90 mmol) EDC hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für eine Stunde gerührt.
Das Lösungsmittels wurde auf einem Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand in 50 ml Ethylacetat gelöst, gefolgt durch Waschen mit 10%iger Citronensäure, 5%iger NaHCO3-Lösung und destilliertem Wasser. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde im Vakuum verdampft.

   Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie gereinigt (mobile Phase: Dichlormethan: Methanol 9:1).

[0083] Ausbeute: 963 mg (63%)
Schmelzpunkt: 142 bis 144 deg. C
IR (KBr, cm<-1>) 3228, 2925, 2854, 2227, 1630, 1509, 1426, 1216, 1120, 960, 838, 748, 547_H-NMR (CDCl3): delta  (ppm) 1,55 (m, 4H, CH2-Azepin4 ¾, 5 ¾; 1,75 (m, 4H, CH2-Azepin3 ¾, 6 ¾); 3,43 (t, 4H, J=5,86 Hz, CH2-Azepin2 ¾, 7 ¾); 4,54 (s, 2H, CH2); 4,68 (s, 2H, Ar-CH2); 7,06 (s, 1H, NH); 7,34 (d, 2H, J=8,40 Hz, Ar-H<3, 5>); 7,39-7,58 (m, 3H, Ar-H); 7,47 (d, 2H, J=8,40 Hz, Ar-H<2, 6>); 7,68-7,84 (m, 3H, Ar-H); 8,14 (s, 1H, Ar-H)
Molekülmasse: berechnet: 456 (C27H28N4O3); gefunden:

   457 (MH<+>).

Beispiel 10:

[0084] tert-Buty 2-{4-[(Acetylamino)methyl]benzyl}-2-[(4-methyl-1-piperidinyl)carbonyl]-1-hydrazinecarboxylat
1,26 g (4,39 mmol) Bis-trichlormethylcarbonat wurden in 20 ml Dichlormethan gelöst und die Lösung wurde mit Argon entgast. 2,50 g (8,53 mmol) tert-Butyl 2-{4-[(Acetylamino)methyl]benzyl}-1-hydrazinecarboxylat wurden in 30 ml Dichlormethan gelöst, 1,65 g (12,79 mmol) N-Diisopropyl-N-ethylamin wurde hinzugegeben und die Mischung wurde tropfenweise zu der Lösung von Bis-trichlormethylcarbonat hinzugegeben. Während der tropfenweisen Zugabe wurde die Reaktionsmischung in einem Eiswasserbad gekühlt. Die Mischung wurde für eine weitere halbe Stunde bei Raumtemperatur gerührt. 2,04 ml (25,60 mmol) 4-Methylpiperidin wurden hinzugegeben und für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur gerührt.

   Die Reaktionsmischung wurde dann mit 4 X 25 ml einer 10%igen Citronensäurelösung und 30 ml gesättigter NaHCO3-Lösung extrahiert, gefolgt durch Waschen mit 30 ml gereinigtem Wasser und 20 ml gesättigter Saline. Die organische Phase wurde über Na2SO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand in 10 ml Diethylether gelöst. Es wurde ein weisses Präzipitat gebildet und durch Saugen abfiltriert.

[0085] Ausbeute: 2,10 g (59%)
Schmelzpunkt: 124-126 deg.

   C
IR (KBr, cm<-1>) 3282, 2923, 2858, 1727, 1638, 1443, 1253, 1158, 1020, 978, 757, 611
H-NMR (CDCI3): delta  (ppm) 0,95 (d, 2H, J=6,40 Hz, pip-CH3; 1,10-1,25 (m, 2H, pip-CH2); 1,44 (s, 9H, C(CH3)3); 1,60-1,73 (m, 3H, pip-CH2, pip-CH); 2,03 (s, 3H, CO-CH3), 2,82 (m, 2H, pip-CH2); 3,92 (d, 2H, J=13,19 Hz, pip-CH2); 4,42 (d, 4H, J=5,65 Hz, CH2-Ar-CH2); 5,89 (s, 1H, NH-CO); 6,27 (s, 1H, NH-COO); 7,27 (s, 4H, Ar-H)
Molekülmasse: berechnet: 418 (C22H34N4O4); gefunden: 419 (MH<+>)

Beispiel 11:

[0086] 2-{4-[(Acetylamino)methyl]benzyl}-2-[(4-methyl-1-piperidinyl)carbonyl]hydraziniumchlorid
2,65 g (6,33 mmol) tert-Butyl 2-{4-[(acetylamino)methyl]benzyl}-2-[(4-methyl-1-piperidinyl)carbonyl]-1-hydrazincarboxylat wurden in Essigsäure (20 ml) gelöst und gasförmiges HCl wurde für eine halbe Stunde eingesprudelt.

   Die Säure wurde im Vakuum verdampft und Diethylether zu dem Rückstand gegeben. Die Kolbenwand wurde mit einem Glasstab gerieben, bis ein weisses Pulver gebildet wurde; derweil wurde ein Waschen mit Diethylether zweimal wiederholt.

[0087] Ausbeute: 1,98g (88%)
Schmelzpunkt: 196-198 deg. C
IR (KBr, cm<-1>) 3419, 3256, 2926, 2685, 1689, 1552, 1434, 1235, 972, 728
H-NMR (CDC13): delta  (ppm) 0,97 (d, 2H, J=6,03 Hz, pip-CH3); 1,19 (m, 2H, pip-CH2); 1,52-1,70 (m, 3H, pip-CH2, pip-CH); 2,07 (s, 3H, CO-CH3); 2,91 (t, 2H, J=12,43 HZ, pip-CH2); 3,96 (d, 2H, J=12,43 Hz, pip-CH2; 4,31 (d, 2H, J=4,15 Hz, Ar-CH2); 4,61 (s, 2H, Ar-CH2); 7,26 (d, 2H, J=7,91 Hz, Ar-H); 7,32 (d, 2H, J=7,92 HZ, Ar-H); 7,99 (s, 1H, NH-CO)
Molekülmasse: berechnet: 354,5 (C17H27N4O2CI); gefunden:

   319 ((M-HCl)H<+>, 100).

Beispiel 12:

[0088] N-(4-{[1-[(4-Methyl-1-piperidinyl)carbonyl]-2-(1-naphthylsulfonyl)hydrazino]methyl}benzyl)acetamid

[0089] 1,98 g (5,59 mmol) 2-{4-[(Acetylamino)methyl]benzyl}-2-[(4-methyl-1-piperidinyl)carbonyl]hydrazinchlorid und 1,39 g (6,13 mmol) Naphthalin-2-sulfonylchlorid wurden in Dichlormethan (25 ml) gelöst, 2,16 g (16,7 mmol) N-Diisopropyl-N-ethylamin wurden hinzugegeben und bei Raumtemperatur für 3 Tage gerührt. Die Lösung wurde mit 4 X 25 ml 10%iger Citronensäure und 30 ml gesättigter NaHCO3-Lösung extrahiert. Die organische Phase wurde mit 30 ml gereinigtem Wasser und 30 ml Saline gewaschen und über Na2SO4 getrocknet. Das Dichlormethan wurde im Vakuum verdampft und ein leicht braun-gelber schaumiger Feststoff wurde gebildet.

[0090] Ausbeute: 1,89 g (67%) Schmelzpunkt: 80-83 deg.

   C
JR (KBr, cm<-1>) 3285, 2925, 1656, 1546, 1430, 1338, 1165, 970, 750, 554
H-NMR (CDCI3): delta  (ppm) 0,52 (d, 3H, J=6,03 Hz, pip-CH3); 1,28 (m, 2H, pip-CH2); 1,64 (m, 3H, pip-CH2, pip-CH); 2,05 (s, 3H, CO-CH3); 2,32-2,71 (m, 2H, pip-CH2): 3,72 (m, 2H, pip-CH2); 4,32 (m, 2H, Ar-CH2); 4,41 (d, 2H, J=5,66 Hz, Ar-CH2); 5,72 (s, 1H, NH-CO); 7,16 (d, 2H, J=8,29 HZ, Ar-H); 7,22 (d, 2H, J=7,91 HZ, Ar-H); 7,46 (s, 1H, naphth-H); 7,62 (m, 2H, 2xnaphth-H); 7,81 (dd, 1H, J1=8,67 HZ, J2=1,88 HZ, naphth-H); 7,94 (q, 3H, J=7,66 Hz, 3xnaphth-H); 8,45 (s, 1H, NH-SO2)
Molekülmasse: berechnet: 508 (C27H32N4O4S); gefunden:

   509 (MH<+>).

Beispiel 13:

[0091] (4-{[1-[4-Methyl-1-piperidinyl)carbonyl]-2-(1-naphthylsufonyl)hydrazino]methyl}phenyl)methanaminehydrochlorid

[0092] 1,89 g (3,72 mmol) N-(4-{ [1-[(4-Methyl-1-piperidinyl)carbonyl]-2-(1-naphthylsulfonyl) hydrazino] methyl} benzyl)acetamid wurde in 30 ml vorgewärmtem Isopropylalkohol (60 deg. C) gelöst. 30 ml 4M HCl wurde hinzugegeben und die Mischung für 5 Stunden refluxiert. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum verdampft. Das Produkt wurde durch Säulenchromatographie gereinigt; stationäre Phase: Silicagel, mobile Phase: Dichlormethan:Methanol (9:1).

[0093] Ausbeute: 550 mg (29%)
Schmelzpunkt: 156-160 deg.

   C
IR (KBr, cm<-1>) 3285, 2925, 1656,1546, 1430, 1338, 1165, 970, 750, 554
H-NMR (CDCI3): delta  (ppm) 0,17 (m, 2H, pip-CH2), 0,44 (d, 3H, J=6,03 Hz, pip-C3), 1,22 (d, 2H, J=10,54 HZ, pip-CH2, pip-CH2), 2,27-2,74 (m, 2H, pip-CH2), 3,53 (s, 2H, pip-CH2 3,97 (s, 2H, Ar-CH2), 4,32 (m, 2H, Ar-CH2), 7,22 (d, 2H, J=8,29 HZ, Ar-H), 7,42 (d, 2H, J=8,29 HZ, Ar-H), 7,64-7,75 (m, 3H, 3xnaphth-H), 7,77 (dd, 1H, J1=8,67 Hz, J2=l,88 HZ, naphth-H), 7,81-8,00 (m, 1H, naphth-H), 8,02-8,18 (m, 2H, 2xnaphth-H), 8,46 (d, 1H, J=1,88 HZ, NH-SO2)
Molekülmasse: berechnet: 502,5 (C25H31N4O3SCI); gefunden:

   467 ((M-HCl)H<+>).

Beispiel 14:

[0094] tert-Butyl 2-{4-[(acetylamino)methyl]benzyl}-2-(4-morpholinylcarbonyl)-1-hydrazincarboxylat

[0095] 1,26 g (4,39 mmol) Bis-trichlormethylcarbonat wurden in 20 ml Dichlormethan gelöst und die Lösung mit Argon entgast. 2,50 g (8,53 mmol) terr-Butyl 2-{4-[(acetylamino)methyl]benzyl}-1-hydrazincarboxylat wurde in 30 ml Dichlormethan gelöst, 1,65 g (12,79 mmol) N-Diisopropyl-N-ethylamin wurde hinzugegeben und die Mischung wurde tropfenweise zu der Bis-trichlormethylcarbonat-Lösung hinzugegeben. Während des tropfenweisen Zugebens wurde die Mischung in einem Eiswasserbad gekühlt. Die Mischung wurde für eine zusätzliche halbe Stunde bei Raumtemperatur gerührt. 2,23 ml (25,60 mmol) Morpholin wurde hinzugegeben und für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur gerührt.

   Die Reaktionsmischung wurde dann mit 4 X 25 ml 10%iger Citronensäurelösung, 30 ml gesättigter NaHCO3-Lösung extrahiert, gefolgt durch Waschen mit 30 ml gereinigtem Wasser und 20 ml gesättigter Saline. Die organische Phase wurde über Na2SO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand in 10 ml Diethylether gelöst. Ein weisses Präzipitat wurde gebildet, welches durch Saugen abfiltriert wurde.

[0096] Ausbeute: 1,81g (52%)
Schmelzpunkt: 125-128 deg.

   C
IR (KBr, cm<-1>) 3308, 2980, 2857, 1728, 1641, 1430, 1289, 1114, 1025, 873, 746, 604
H-NMR (CDC13): delta  (ppm) 1,46 (s, 9H, C(CH)3)3, 2,03 (s, 3H, CO-CH3), 3,44 (t, 4H, J=4,71 Hz, 2xMorph-CH2), 3,68(t, 4H, J=4,71 Hz, 2xMorph-CH2), 4,43 (d, 2H, J=5,65 Hz, Ar-CH2), 4,49 (s, 2H, Ar-CH2 5,84 (d, 1H, NH-CO), 6,27 (s, 1H, NH-COO), 7,27 (s, 4H, Ar-H)
Molekülmasse: berechnet: 406 (C20H30N4O5); gefunden: 407 (MH<+>).

Beispiel 15:

[0097] 2-{[Acetylamino)methyl]benzyl}-2-(4-morpholinylcarbonyl)hydraziniumchlorid

[0098] 1,81 g (4,46 mmol) tert-Butyl 2-{4-[(acetylamino)methyl]benzyl}-2-(4-morpholinylcarbonyl)-1-hydrazincarbonxylat wurde in Essigsäure (20 ml) gelöst und gasförmiges HCl würde für eine halbe Stunde eingesprudelt. Die Säure wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand in Diethylether gelöst.

   Die Kolbenwand wurde mit einem Glasstab gerieben, bis ein weisses Pulver gebildet wurde; derweil wurde das Waschen mit Diethylether zweimal wiederholt.

[0099] Ausbeute: 0,92 g (60%)
Schmelzpunkt: 209-211 deg. C
IR(KBr, cm<-1>) 3427, 1685,1560,1432, 1274, 1112, 1022, 892, 571
H-NMR (CDCI3): delta  (ppm) 1,88 (s, 3H, CO-CH3), 3,46 (d, 4H, J=4,90 Hz, 2xMorph-CH2), 3,61 (d, 4H, J=4,90 Hz, 2xMorph-CH2), 4,25(d, 2H, J=6,03 Hz, Ar-CH2), 4,50(s, 2H, Ar-CH2), 7,28 (s, 4H, Ar-H), 8,43 (s, NH-CO)
Molekülmasse: berechnet: 342,5 (C15H23N4O3Cl); gefunden:

   307 ((M-HCl)H<+>, 100).

Beispiel 16:

[0100] N-(4-{[1-(4-Morpholinylcarbonyl)-2-(1-naphthylsulfonyl)hydrazino]methyl}benzyl)acetamid

[0101] 0,92 g (2,69 mmol) 2-{4-[(Acetylamino)methyl]benzyl}-2-(4-morpholinylcarbonyl)hydrazinchlorid und 0,67 g (2,95 mmol) Naphthalin-2-sulfonylchlorid wurden in Dichlormethan (25 ml) gelöst, 1,04 g (8,06 mmol) Diisopropylethylamin wurden hinzugegeben und bei Raumtemperatur für 3 Tage gerührt. Die Mischung wurde mit 4 X 25 ml 10%iger Citronensäure und 30 ml gesättigter NaHC3-Lösung extrahiert. Die organische Phase wurde mit 30 ml gereinigtem Wasser und 30 ml gesättigter Saline gewaschen und über Na2SO4 getrocknet. Das Dichlormethan wurde im Vakuum verdampft und ein blasser braun-gelber, schaumiger Feststoff wurde gebildet.

[0102] Ausbeute: 0,66 g (50%)
Schmelzpunkt: 84-88 deg.

   C
IR(KBr, cm<-1>) 3426, 2856,1655, 1420, 1340, 1274, 1166, 1114,1024, 752, 547
H-NMR (CDCl3): delta  (ppm) 2,05 (s, 3H, CH3), 3,14 (s, 4H, 2xMorph-CHz), 3,33-3,40 (m, 2H, Morph-CH2 3,58-3,81 (m, 2H, Morph-CH2 4,30 (m, 2H, Ar-CH2 4,41 (d, 2H, J=5,65 Hz, Ar-CH<2) 5,77 (s, 1H, NH-CO), 7,19 (m, 4H, Ar-H), 7,38 (s, 1H, naphth-H), 7,68 (m, 2H, 2xnaphth-H), 7,81 (dd, J1=8,67 Hz, J2=1,86 Hz, naphth-H), 7,95 (m, 3H, 3xnaphth-H), 8,44 (s, NH-SO2)
Molekülmasse: berechnet: 496 (C25H28N4O5S); gefunden: 497 (MH<+>).

Beispiel 17:

[0103] (4-{[1-(4-Morpholinylcarbonyl)-2-(1-Naphthylsulfonyl)hydrazino]methyl}phenyl)methanaminhydrochlorid
0,66 g (1,33 mmol) N-(4-{[1-(4-Morpholinylcarbonyl)-2-(1-Naphthylsulfonyl)hydrazino]methyl}benzyl)acetamid wurden in 30 ml vorgewärmtem Isopropylalkohol (60 deg. C) gelöst. 30 ml 4M HCl wurde hinzugegeben und die Mischung für 5 Stunden refluxiert.

   Das Lösungsmittel wurde im Vakuum verdampft. Das Produkt wurde durch Säulenchromatographie gereinigt; stationäre Phase: Silicagel, mobile Phase: Dichlormethan: Methanol (9:1).

[0104] Ausbeute: 340 mg (52%)
Schmelzpunkt: 124-126 deg. C
IR(KBr, cm<-1>) 3411, 16 662, 1504, 1459, 1419, 1335, 12 272, 1211, 1166, 1113, 1067, 1023, 830, 754, 688, 544
H-NMR (CDCI3): delta  (ppm) 2,96 (m, 2H, Morph-C2 3,11 (m, 6H, 3xMorph-CH2 3,97 (d, 2H, J=5,66 Hz, Ar-CH2 4,17-4,52 (m, 2H, Ar-C2 7,22 (d, 2H, J=7,53 Hz, Ar-H), 7,41 (d, 2H, J=7,92 Hz, Ar-H), 7,82-7,66 (m, 3H, 3xnaphth-H), 7,99-7,84 (m, 1H, naphth-H), 8,03-8,21 (m, 3H, 3xnaphth-H), 8,47 (s, 1H, NH-SO2)
Molekülmasse: berechnet: 490,5 (C25H31N4O3SCI); gefunden:

   455 ((M-HCl)H<+>).

Beispiel 18:

[0105] tert-Butyl 2-{4-[acetylamino)methyl]benzyl}-2-{[cyclopentyl(methyl)amino]carbonyl}-1-hydrazincarboxylat

[0106] 1,26 g (4,39 mmol) Bis-trichlormethylcarbonat wurden in 20 ml Dichlormethan gelöst und auf 0 deg. C gekühlt. Die Lösung aus 2,00 g (6,83 mmol) tert-Butyl 2-{4-[(acetylamino)methyl]benzyl}-1-hydrazincarboxylat und 1,65 g (12,79 mmol) N-Diisopropyl-N-ethylamin in 30 ml Dichlormethan wurde tropfenweise hinzugegeben und die Temperatur langsam gesteigert. Die resultierende Mischung wurde bei Raumtemperatur für eine halbe Stunde gerührt, gefolgt durch die Zugabe von 2,14 g (21,60 mmol) N-Cyclopentyl-N-methylamin. Nach einer weiteren Stunde Rühren wurde das Lösungsmittel im Vakuum verdampft und der Rückstand in 50 ml Ethylacetat gelöst.

   Die Lösung wurde mit 4 X 25 ml 10%-iger, wässriger Lösung von Citronensäure und 30 ml wässrigem Natriumhydrogencarbonat extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser und Saline gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand in 10 ml Diethylether gelöst. Nach 2 Tagen wurde das Präzipitat gesammelt und ferner durch Säulenchromatographie (Dichlormethan/Methanol 20:1) gereinigt.

[0107] Ausbeute: 1,31 g (46%)
Schmelzpunkt: 124-127 deg.

   C
IR(KBr, cm<-1>)3274, 2974, 1726, 1640, 1550, 1369, 1285, 1160, 1067, 794
H-NMR (CDCl3): delta  (ppm) 1,44 (s, 9H, (CH3)3), 1,46-1,85 (m, 8H, CH2), 2,03 (s, 3H, CO-CH3), 2,32 (m, 1H, CH), 2,80 (s, 3H, N-CH3), 4,38 (m, 2H, Ar-CH2), 4,42 (d, 2H, J=5,64 Hz, Ar-CH2), 5,93 (s, 1H, NH-COO), 6,54 (s, 1H, NH-CO), 7,28 (m, Ar-H)
Molekülmasse: berechnet: 418 (C22H34N4O4); gefunden: 419 ((MH<+>).

Beispiel 19:

[0108] 2-{4-[(Acetylamino)methyl]benzyl} -2-{[cyclopentyl(methyl) amino]carbonyl} hydraziniumchlorid

[0109] 1,20 g (2,87 mmol) tert-Butyl 2-{4-[(acetylamino)methyl]benzyl}-2-{[cyclopentyl(methyl)ammo] carbonyl}hydrazincarboxylat wurden in 20 ml Essigsäure gelöst, und gasförmiger Chlorwasserstoff wurde für 30 Minuten eingesprudelt Die Säure wurde im Vakuum verdampft, und Diethylether wurde zu dem Rückstand hinzugegeben.

   Nach kräftigem Rühren und zahlreichen Waschungen mit Diethylether wurde ein weisser Feststoff erhalten.

[0110] Ausbeute: 765 mg (77%)
Schmelzpunkt: 165-169 deg. C
IR (KBr, cm<-1>) 3254, 2987, 1782, 1653, 1548,1425, 1234, 1022, 798, 744, 602, H-NMR (CDCI3): delta  (ppm) 1,51-1,89 (m, 8H, CH3), 2,02 (s, 3H, CO-CH3), 2,49 (m, 1H, CH), 2,87 (s, 3H, N-CH3), 4,24 (m, 2H, Ar-CH2), 4,52 (s, 2H, Ar-CH2), 7,22 (m, Ar-H), 10,12 (s, 1H, NH-CO)
Molekülmasse: berechnet: 445 (C17H27N4O2CI); gefunden:

   319 ((M-HCl)H<+>.

Beispiel 20:

[0111] 1-{4-[(Acetylamino)methyl]benzyI}-N-cyclopentyl-N-methyl-2-(2-naphthylsulfonyl)-1-hydrazincarboxamid

[0112] 733 mg (2,07 mmol) 2-{4-[(Acetylamino)methyl]benzyl}-2-{[cyclopentyl(methyl)amino]carbonyl}hydrazinchlorid, 481 mg (2,12 mmol) Naphthalin-2-sulfonylchlorid und 843 mg (6,54 mmol) N-Diisopropyl-N-ethylamine wurden in Dichlormethan (25 ml) gelöst und bei Raumtemperatur für 3 Tage gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde in 30 ml Ethylacetat gelöst und mit 4 X 25 ml 10%iger Citronensäure und 30 ml wässrigem NaHCO3 extrahiert.

   Die organische Phase wurde ferner mit Wasser (30 ml) und Saline (30 ml) gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel entfernt, um einen blassgelben Feststoff zu ergeben, welcher ferner durch Umkristallisation aus Ethanol gereinigt wurde.

[0113] Ausbeute: 211 mg (20%)
Schmelzpunkt: 91-93 deg.

   C
IR (KBr, cm<-1>) 3448, 2962, 1772, 1651, 1558, 1395, 1262, 1166, 1025, 859, 803, 669, 549
H-NMR (CDCI3): delta  (ppm) 1,27-1,73 (m, 8H, CH2), 2,06 (s, 3H, CO-CH3), 2,29 (m, 1H, CH), 2,60 (s, 3H, N-CH3), 4,32 (m, 2H, Ar-CH2), 4,44 (d, 2H, J=6,13 Hz, Ar-CH2) 7,15 (d, 2H, J=8,13 Hz, Ar-H<3, 5>), 7,21 (d, 2H, J=8,11 Hz, Ar-H<2, 6>), 7,42 (s, NHSO2), 7,67 (dqu, 2H, J1=7,51 Hz, J2=1,79 Hz, Ar-H), 7,79 (dd, 1H, J1=8,70 Hz, J2=1,76 Hz, Ar-H), 7,90 (s, 1H, NH-CO), 7,97 (m, 3H, Ar-H), 8,43 (s, 1H, Ar-H)
Molekülmasse: berechnet: 508 (C27H32N4O4S); gefunden: 509 (MH<+>).

Beispiel 21:

[0114] (4-{[1-{[Cyclopentyl(methyl)amino]carbonyl}-2-(2-naphthylsulfonyl)hydrazino]methyl}phenyl)methanaminium-chlorid

[0115] Die Lösung von 183 mg (0,36 mmol) 1-{4-[(Acetylamino)methyl]benzyl}-N-cyclopentyl-N-methyl-2-(2-naphthylsulfonyl)-1-hydrazincarboxamid in 30 ml Isopropanol bei 60 deg.

   C (30 ml) wurde mit 4M HCl (30 ml) behandelt und für 5 Stunden refluxiert. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt und das Produkt durch Säulenchromatographie (Dichlormethan/Methanol 9:1) gereinigt.

[0116] Ausbeute: 81 mg (45%)
Schmelzpunkt: 170-173 deg. C
IR (KBr, cm<-1>) 3425, 3137, 2968, 1744, 1591, 1275, 1122, 973, 815, 637
H-NMR (CDCl3): delta  (ppm) 1,18-1,75 (m, 8H, CH2), 2,34 (m, 1H, CH), 2,57 (s, 3H, N-CH3), 4,22 (m, 2H, Ar-CH2), 4,43 (m, 2H, Ar-CH2), 7,18 (d, 2H, J=8,35 Hz, Ar-H<3, 5>), 7,24 (d, 2H, J=8,27 Hz, Ar-H<2, 6>), 7,37 (s, NHSO2), 7,64 (dqu, 2H, J1=8,29 Hz, J2=1,84 Hz, Ar-H), 7,82 (dd, 1H, J1=8,56 Hz, J2=1,72 Hz, Ar-H), 8,04 (m, 3H, Ar-H), 8,41 (s, 1H, Ar-H)
Molekülmasse: berechnet: 503 (C25H31N4O3SCl); gefunden:

   467 ((M-HCl)H<+>)

Beispiel 22:

[0117] N-(3-Cyanobenzyl)-N ¾-(2-naphthoyl)-1 -azepancarbohydrazid

[0118] 2-(1-Azepanylcarbonyl)-2-(3-cyanobenzyl)hydraziniumchlorid (312 mg, 1,03 mmol), N-Diisopropyl-N-ethylamine (2 ml) und Benzoylchlorid (210 mg, 1,11 mmol) wurden in Dichlormethan (30 ml) gelöst. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 2 Tage gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde in 30 ml Ethylacetat gelöst und mit 4 X 25 ml 10%iger Citronensäure und 30 ml wässrigem NaHCO3 extrahiert. Die organische Phase wurde ferner mit Wasser (30 ml) und Saline (30 ml) gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel wurde entfernt. Das Produkt wurde mit Diethylether gewaschen und ferner durch Umkristallisation aus Ethanol gereinigt.

[0119] Ausbeute: 378 mg (86%)
Schmelzpunkt: 139-141 deg.

   C
IR (KBr, cm<-1>) 3281, 2922, 2236, 1637,1524, 1289, 1210,1010, 912, 822, 759, 698, 595
H-NMR (CDCI3): delta  (ppm) 1,55 (m, 4H, Azep-CH2), 1,73 (m, 4H, Azep-CH2), 3,49 (t, 4H, J=5,84 Hz, Azep-CH2), 4,69 (s, 2H, Ar-CH2), 7,42 (t, 1H, J=7,89 Hz, Ar-H), 7,59 (m, 3H, Ar-H), 7,69 (d, 1H, J=7,91 Hz, Ar-H), 7,77 (dd. 1H, J1=8,29 Hz, J2=1,88 Hz, Ar-H), 7,81 (s, 1H, Ar-H), 7,89 (m, 3H, Ar-H), 8,24 (s, 1H, Ar-H), 8,47 (s, 1H, NH-CO)
Molekülmasse: berechnet 426 (C26H26N4O2); gefunden: 427 (MH<+>)

Beispiel 23:

[0120] Amino(3-{[1-(1-azepanylcarbonyl)-2-(2-naphthoyl)hydrazino]methyl}phenyl)methaniminiumchlorid

[0121] N-(3-Cyanobenzyl)-N ¾-(2-naphthoyl)-1-azepanecarbohydrazid (212 mg, 0,50 mmol) wurden in reinem Ethanol (20 ml) suspendiert und gasförmiger Chlorwasserstoff wurde für eine halbe Stunde eingesprudelt.

   Die Reaktionsmischung wurde für 4 Stunden bei Raumtemperatur gelassen, dann wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mit Diethylether (2 X 20 ml) gewaschen und in reinem Ethanol gelöst. Die Lösung wurde mit gasförmigem Ammoniak für 10 Minuten behandelt, und das Ethanol wurde unter reduziertem Druck entfernt.

[0122] Ausbeute: 193 mg (81%)
Schmelzpunkt: 247-251 deg.

   C
TR (KBr, cm-1) 3410, 1773, 1652, 1559, 1394, 955, 753
H-NMR (CDCl3): delta  (ppm) 1,58 (m, 4H, Azep-CH2) 1,76 (m, 4H, Azep-CH2), 3,02 (t, 4H, J=5,15 Hz, Azep-CH2), 3,82 (s, 2H, Ar-CH2) 7,61-7,67 (m, 5H, Ar-H), 7,84 (m, 2H, Ar-H), 7,98-8,12 (m, 3H, Ar-H), 8,42 (s, 1H, Ar-H), 9,39 (s, 1H, NH-CO), 9,43 in 9,58 (2s, 4H, H2N-C=NH2<+>)
Molekülmasse: berechnet: 479 (C26H30N5O2CI); gefunden: 444 ((M-HCI)H<+>)

Beispiel 24:

[0123] 3-{[1-(1-Azepanylcarbonyl)-2-(2-naphthoyl)hydrazino]methyl}-N ¾-hydroxybenzolcarboximidamid

[0124] N-(3-Cyanobenzyl)-N ¾-(2-naphthoyl)-1-azepanecarbohydrazid (133 mg, 0,31 mmol) und Hydroxylamin (12 mg, 0,36 mmol) wurden in reinem Ethanol (10 ml) gelöst und über Nacht refluxiert. Das Lösungsmittel wurde verdampft und das Produkt durch Säulenchromatographie (Dichlormethan/Methanol 9:1) gereinigt.

[0125] Ausbeute: 107 mg (75%)
Schmelzpunkt: 129-131 deg.

   C
IR (KBr, cm-1) 3334, 2924, 1772, 1652, 1506, 1374, 1301, 1129, 954, 749 H-NMR (CDCl3): delta  (ppm) 1,43 (m, 4H, Azep-CH2), 1,57 (m, 4H, Azep-CH2), 3,36 (t,-4H, J=5,61 Hz, Azep-CH2), 4,53 (s, 2H, Ar-CH2), 5,69 (s, 1H, NOH), 7,31 (t, 1H, J=7,76 Hz, Ar-H), 7,49 (m, 3H, Ar-H), 7,57 (m, 2H, Ar-H), 7,78 (dd, 1H, J1=8,69 Hz, J2=1,83 Hz, Ar-H), 7,89 (m, 3H, Ar-H), 8,38 (s, 1H, Ar-H), 9,57 (s, 2H,NH2), 10,64 (s, 1H, NH-CO).
Molekülmasse: berechnet: 459 (C26H29N5O3); gefunden: 460 ((MH<+>).

Beispiel 25:

[0126] Ergebnisse der biologischen Assays:
In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse der biologischen Assay für Verbindungen gemäss der vorherigen Beispiele angegeben. Die anderen Verbindungen stellen weitere, nicht besonders durch ein Beispiel dargestellte Ausführungsbeispiele dar.

[0127] 
 <EMI ID=45.0> 

Claims (11)

1. Verbindung der Formel (I) <EMI ID=46.0> wobei R<1> und Z H sind oder ein Rest mit der Formel <EMI ID=47.0> unter der Voraussetzung, dass eines von R<1> und Z H ist; R<4> = H, Alkyl (C1-C3), OH, O-Alkyl (C1-C3), NH2; R<2> einen Rest der Formel darstellt <EMI ID=48.0> wobei R<5> = H, Alkyl (C1-C3), COOR<10>, R<6> = H, Alkyl (C1-C3), COOR<10>, R<7> = H, Alkyl (C1-C3), COOR<10>, R<10> = H, Alkyl (C1-C3) R<8> = H, Alkyl (C1-C3), Cycloalkyl (C3-C6) R<9> = H, Alkyl (C1-C3), Cycloalkyl (C3-C6) R<11> = H, Alkyl (C1-C3), Benzyl, X = CH2, O, S, Y = NR<12>, O, S, R<12> = H, COCH3, Alkyl (C1-C3); R<3> ist ein Rest der Formel <EMI ID=49.0> und pharmazeutisch akzeptable Salze davon.

2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung (4-{[1-{[Cyclopentyl(methyl)amino]carbonyl}-2-(2-naphthylsulfonyl)hydrazino]methyl}phenyl)methanaminium-chlorid ist.

3. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, wobei Z H ist, mit den folgenden Schritten: a) in dem Fall R<1>= <EMI ID=50.0> wird 4-Cyanobenzaldehyd der Formel (II) <EMI ID=51.0> mit BOC-carbazat der Formel (III) umgesetzt <EMI ID=52.0> zu der Verbindung der Formel (IV) <EMI ID=53.0> welche mittels Reduktion durch katalytische Hydrogenierung unter Verwendung von Pd als ein Katalysator zu der Verbindung (V) umgesetzt wird <EMI ID=54.0> welche mit Triphosgen und Amin der Formel (VI) reagiert <EMI ID=55.0> wobei R<5>, R<6> und R<7> die gleichen Bedeutungen haben wie in Anspruch 1, oder mit Triphosgen und Amin der Formel (VII oder VIII), <EMI ID=56.0> wobei Y die gleich Bedeutung wie in Anspruch 1 hat, oder mit Triphosgen und Amin der Formel (IX) <EMI ID=57.0> wobei R<8> und R<9> die gleichen Bedeutungen wie in Anspruch 1 haben,

oder mit Triphosgen oder Amin der Formel (X), <EMI ID=58.0> wobei R<11> und X die gleichen Bedeutungen wie in Anspruch 1 haben, zu der Verbindung (XI) <EMI ID=59.0> wobei R<2> die gleiche Bedeutung wie in Anspruch 1 hat, und von der die BOC-Schutzgruppe bei Raumtemperatur unter Verwendung des Einströmens von gasförmigem Chlorwasserstoff in Essigsäure entfernt wird, um die Verbindung (XII) zu erhalten, <EMI ID=60.0> wobei R<2> die gleiche Bedeutung wie in Anspruch 1 hat; welche dann mit der aktivierten Naphtylsulfonylaminosäure oder mit aktivierter Arylalkylcarboxylsäure zu der Verbindung (XIII) reagiert <EMI ID=61.0> wobei R<2> und R<3> die gleichen Bedeutungen wie in Anspruch 1 haben;

welche dann mit Hydroxylamin in reinem Ethanol zu der Verbindung mit der Formel (XIV) transformiert wird <EMI ID=62.0> wobei R<1> = <EMI ID=63.0> R<2> und R<3> die gleichen Bedeutungen wie in Anspruch 1 haben und R<4> eine OH-Gruppe ist; und welche dann mit einströmendem gasförmigem Chlorwasserstoff in ethanolischer Lösung, Zugabe von Ammoniumacetat, gefolgt bei einem weiteren Einströmen von Chlorwasserstoff zu der Verbindung (XV) umgewandelt wird, <EMI ID=64.0> wobei R<1 = > <EMI ID=65.0> R<2> und R<3> die gleichen Bedeutungen wie in der Formel (I) haben und R<4> Wasserstoff ist;

b)in dem Fall R1 = <EMI ID=66.0> wird 4-Cyanobenzaldehyd der Formel (II) <EMI ID=67.0> mit Ethylenglykol in Anwesenheit von 4-Toluolsulfonsäure in die Verbindung (XVI) umgewandelt <EMI ID=68.0> welche mit Lithium-Aluminiumhydrid in die Verbindung der Formel (XVII) reduziert wird <EMI ID=69.0> welche mit Acetanhydrid zu der Verbindung (XVIII) reagiert <EMI ID=70.0> welche dann mit 90%iger Methansäure zu der Verbindung (XIX) umgewandelt wird <EMI ID=71.0> welche mit BOC-carbazat der Formel (III) <EMI ID=72.0> zu der Verbindung der Formel (XX) umgewandelt wird <EMI ID=73.0> welche mittels Reduktion durch katalytische Hydrogenierung in die Verbindung (XXI) umgewandelt wird <EMI ID=74.0> welche mit Triphosgen und Amin der Formel (VI) reagiert <EMI ID=75.0> wobei R<5>, R<6> und R<7> die gleichen Bedeutungen wie in der Formel (I) haben,

oder mit Triphosgen und Amin der Formel (VII oder VIII), <EMI ID=76.0> wobei Y die gleiche Bedeutung wie in der Formel (I) hat, oder mit Triphosgen und Amin der Formel (IX) <EMI ID=77.0> wobei R<8> und R<9> die gleichen Bedeutungen wie in der Formel (I) haben, oder mit Triphosgen und Amin der Formel (X) <EMI ID=78.0> wobei R<11> und X die gleichen Bedeutungen wie in der Formel (I) haben, zu der Verbindung (XXII) <EMI ID=79.0> wobei R<2> die gleiche Bedeutung wie in der Formel (I) hat, von der die BOC-Schutzgruppe durch HCl (g) in AcOH bei Raumtemperatur entfernt wird, um die Verbindung (XXIII) zu erhalten, <EMI ID=80.0> wobei R<2> die gleiche Bedeutung wie in der Formel (I) hat, welche mit aromatischem Sulfonylchlorid zu der Verbindung (XXIV) reagiert <EMI ID=81.0> wobei R<2> und R<3> die gleichen Bedeutungen wie in Anspruch 1 haben,

welche dann durch Erwärmen bis zum Kochen mit 5M HCl zu der Verbindung (XXV) umgewandelt wird <EMI ID=82.0> wobei R1 = <EMI ID=83.0> R<2> und R <3> die gleichen Bedeutungen wie in der Formel (I) haben.

4. Verwendung der Verbindung nach Anspruch 1 für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung.

5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei Z <EMI ID=84.0> ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausgangsverbindung 3-Cyanobenzaldehyd ist.

6. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung ein Arzneimittel mit koagulationshemmender Wirkung ist.

7. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung ein Inhibitor von Thrombin ist.

8. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung ein dualer Inhibitor von Thrombin und Faktor Xa ist.

9. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung Thrombin im Blut von Menschen und anderen Säugetieren hemmt.

10. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung Fibrin- und Thrombusbildung im Blut von Menschen und anderen Säugetieren hemmt.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung mit einer therapeutisch wirksamen Menge der Verbindung nach Anspruch 1 und pharmazeutisch akzeptablen Zusatzstoffen.