CH682662A5 - Aminosäurederivate zur Peptidsynthese. - Google Patents

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CH682662A5 CH3001/91A CH300191A CH682662A5 CH 682662 A5 CH682662 A5 CH 682662A5 CH 3001/91 A CH3001/91 A CH 3001/91A CH 300191 A CH300191 A CH 300191A CH 682662 A5 CH682662 A5 CH 682662A5
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Description

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CH 682 662 A5
Beschreibung
Die Erfindung betrifft N-Methyltrityl-Carbamoylgruppen enthaltende Aminosäurederivate und ihre höheren Homologen.
Seit langem ist bekannt, dass die Amidgruppen der Aminosäuren Asparagin und Glutamin bei der Peptidsynthese häufig zu unerwünschten Nebenreaktionen führen (Gish et al. 1956, Ressler 1956, Katsoyannis et al. 1958 etc.).
Schutz der Amidfunktion verhindert diese Nebenreaktionen. Verwendung gefunden haben bisher die 4,4'-Dimethoxydiphenylmethyl (Mbs), die 2,4,6-Trimethoxybenzyl (Tmob) und seit kurzem auch die Tri-phenylmethyl (Trityl, Tri) -Schutzgruppe, welche letztere Gruppe, im Gegensatz zu den übrigen, bei der Abspaltung nicht zu Nebenprodukten führt (Lit.: P. Sieber + B. Riniker, Symposium on Solid Phase Synthesis, Oxford,U.K.; Sept. 1989).
Erfahrungen mit der Tritylschutzgruppe Hessen es als wünschenswert erscheinen, eine solche Gruppe zu finden, die die Vorteile der Tritylgruppe beinhaltet, aber schneller als diese abgespaltet werden kann. Darin besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung.
Sie betrifft Verbindungen der Formel I,
R1-NH-CH-COOR
conhr3
worin n gleich 1 oder 2 ist, Ri Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe, R2 Wasserstoff oder eine Carboxylschutzgruppe und R3 4-Methyltriphenylmethyl, 4,4'-Dimethyltriphenylmethyl und 4,4',4"-Trime-thyltriphenylmethyl bedeuten, Salze von solchen Verbindungen und reaktionsfähige Carbonsäurederivate davon. Die Konfiguration am chiralen HC-Atom ist beliebig, D, L oder D,L.
Verbindungen der Formel I führen bei der Spaltung nicht zur Alkylierung von Tryptophan, falls dieses im Peptid zugegen ist. Sie sind leicht herstellbar und diese neuen Schutzgruppen ebenso leicht mit Tri-fluoressigsäure oder diese Säure enthaltenden Gemischen abspaltbar. In der Reaktionsgeschwindigkeit der Spaltung übertreffen die Verbindungen der Formel I die analogen, tritylierten Verbindungen um das Zwei- bis Mehrfache (Fünffache). Sie sind wie die Tritylverbindungen besonders geeignet für die Fest-phasen-Peptidsynthesemethode, bei der basenlabile Schutzgruppen Ri zum Schutz der a-Aminogrup-pen verwendet werden, wie z.B. die 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-Gruppe. Selbstverständlich kommen als Aminoschutzgruppen Ri aber auch alle in der Peptidsynthese üblichen Gruppen wie Acyl-reste von Kohlensäurehalbestern, insbesondere tert.-Butyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl (gegebenenfalls substituiert), 2-Halogenniederalkoxycarbonyl oder Allyloxycarbonyl in Frage.
Carboxylschutzgruppen R2 sind solche, die in der Peptidchemie üblicherweise zur Anwendung kommen, wie z.B. Niederalkyl wie Methyl oder Ethyl, tert.alkyl, wie tertbutyl, benzyl, nitrobenzyl, methoxy-benzyl, benzhydryl, allyl, cycloalkyl, phenyl, ßßß-trihalogenethyl, ß-triniederalkylsilylethyl, wie ß-trimethylsi-lylethyl. Die Gruppe R2 kann aber auch die Funktion der Aktivierung der Carboxylgruppe ausüben. Derartige Derivate der Formel I können dann zur Acylierung, wie z.B. Knüpfung einer Peptidbindung verwendet werden. Man spricht dann von aktivierten Estern, wenn R2 ein ungesättigter Rest ist, dessen Doppelbindung nächstmöglich zur Carbonylgruppe situiert ist, was z.B. bei Vinylestern, Phenylestern, substituierten Phenylestern, wie z.B. Pentafluorphenylestern der Fall ist. Ebenso geeignet sind andere aktivierte Ester, wie z.B. Cyanomethylester, Thioester, wie z.B. Thiophenylester, N-Hydroxysuccinimid-ester, N-Hydroxyphthalimidester, 1-Hydroxybenztriazolester, 3-Hydroxy-3,4-dihydro4-oxo-1,2,3-benzotria-zinester. R2 kann auch so gestaltet sein, dass die Funktion -COOR2 in Formel I als Anhydrid aufge-fasst werden kann. In Frage kommen gemischte Anhydride, z.B. solche, die durch Umsetzung mit Kohlensäurehalbesterchloriden erhalten werden, ferner symmetrische Anhydride, Carboxyanhydride, Anhydride mit anorganischen Säuren, wie z.B. Säureazide, Azolide, Iminoanhydride, wie sie z.B. durch Anlagerung von Carbodiimiden an Verbindung der Formel I (R2 = H) erhalten werden. Diese Anhydride dienen demselben Zweck wie die aktivierten Ester, nämlich der Acylierung.
Die hier verwendeten Abkürzungen für die Aminosäuren sind die allgemein üblichen. So bedeuten Asp Asparaginsäure, Asn Asparagin, Gin Glutamin, Glu Glutaminsäure, Ser Serin, Leu Leucin, Gly Glycin, Lys Lysin, His Histidin, Pro Prolin, Tyr Tyrosin, Trp Tryptophan, Arg Arginin, Val Valin, Ile Isoleucin und Phe Phenylalanin.
Gemäss den international anerkannten Nomenklaturregeln bezeichnen die Abkürzungen für die Aminosäuren, z.B. die obengenannten Abkürzungen in diesem Text die freie Säure, und, falls nicht anders angegeben, in der L-Konfiguration. Die a-Aminogruppe ist an der linken Seite der Abkürzung, die Carboxygruppe an der rechten Seite zu denken. Substituenten (Schutzgruppen) in der Seitenkette von Aminosäuren werden unmittelbar hinter das Aminosäurekürzel in Klammern gesetzt. Somit steht z.B. Z-Asn(MeTrt)-OH für die Verbindung der Formel la.
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C-.HcCH_OCONHCHCOOH 6 5 2 |
^2 (la)
conhc(c6h5)2(c6h4-[4-ch3J)
Z = Cbz sind übliche Abkürzungen für den Carbobenzoxyrest
MeTrt wird vorgeschlagen als Abkürzung für die 4-Methyltrityl-Schutzgruppe (den 4-Methyltritylrest).
Die durch Verwendung der Verbindungen der Formel I bei der Peptidsynthese erzielten Vorteile sind im experimentellen Teil illustriert. Sie beruhen auf der rascheren Abspaltung der MeTrt-Gruppe im Vergleich zur Trt-Gruppe.
Die Verbindungen der Formel I können als Bausteine bei der Synthese von Peptiden, die Glutamin-und/oder Asparaginreste enthalten, oder als Zwischenprodukte zur Herstellung dieser Bausteine verwendet werden. Zur Peptidsynthese an fester Phase verwendet man diejenigen Verbindungen der Formel I, worin Ri eine Aminoschutzgruppe, wie insbesondere 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl oder tert.Bu-toxycarbonyl, R2 Wasserstoff und R3 4-Methyltrityl bedeuten, und reaktionsfähige Carbonsäurederivate davon.
Die erfindungsgemässe Amidschutzgruppe R3 ist stabil bei der katalytischen Hydrierung unter Bedingungen, unter denen Benzyloxycarbonyl (als R1) oder Benzyl als Carboxylschutzgruppe (als R2) abgespalten werden. Die Schutzgruppe R3 kann z.B. mit Trifluoressigsäure-Dichlormethan (1:1) im Temperaturbereich zwischen -20°C und +50°C, z.B. bei +30°C, abgespalten werden.
Die Verbindungen der Formel I werden in an sich bekannter Weise hergestellt. Das Herstellungsverfahren ist dadurch gekennzeichet, dass man eine Verbindung der Formel II,
r.-nh-hc-coor_
4 i 2
«fH2>n (II)
CONH,
worin R4 Wasserstoff oder eine unter den Reaktionsbedingungen stabile Aminoschutzgruppe bedeutet und n und R2 für die obengenannten Bedeutungen stehen, mit einer Verbindung der Formel III,
RsOH (III)
worin R3 die oben genannte Bedeutung hat, umsetzt und aus dem erhaltenen Produkt allenfalls diejenigen Schutzgruppen abspaltet, die nicht Bestandteil des gewünschten Endprodukts der Formel I sind. Das Verfahren wird im folgenden näher erläutert:
In einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie z.B. Essigsäure, wird die Reaktion in Gegenwart katalytischer Mengen einer starken Säure, vorzugsweise Schwefelsäure, sowie in Gegenwart eines wasserentziehenden Mittels, wie z.B. Essigsäureanhydrid, im Temperaturbereich zwischen 0°C und 100°C, bevorzugt zwischen 20°C und 70°C, z.B. bei 50°C durchgeführt.
Eine Aminoschutzgruppe R4 ist eine unter sauren Bedingungen stabile Aminoschutzgruppe, wie z.B. Trifluoracetyl oder vorzugsweise Benzyloxycarbonyl oder 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl.
Wenn im gewünschten Endprodukt der Formel I Ri und/oder R2 für Wasserstoff stehen, so müssen die Schutzgruppen R4 und R2 abgespalten werden.
Carboxylschutzgruppen R2, die unter den Reaktionsbedingungen stabil sind, können, falls erwünscht und so es sich um einfache Gruppen wie Methyl, Ethyl oder Allyl handelt, durch Verseifung abgespalten werden.
Trihalogenacetyl, wie z.B. Trifluoracetyl als Aminoschutzgruppe R4 wird durch milde Verseifung, wie z.B. mit Sodalösung abgespalten. Benzyloxycarbonyl als Aminoschutzgruppe R4 wird durch Hydrogeno-lyse in Gegenwart eines Schwermetallkatalysators, wie z.B. Palladium auf Bariumsulfat abgespalten.
9-Fluorenylmethyloxycarbonyl als Aminoschutzgruppe R4 wird mittels einer Lösung eines Amins, z.B. Piperidin in Dimethylacetamid abgespalten.
Die Ausbeuten über drei Stufen betragen etwa 45% der Theorie.
Verbindungen der Formel I können auch, insbesondere wenn Ri und/oder R2 gleich Wasserstoff ist, als Salze vorliegen, bzw. durch Zugabe von Säuren bzw. Basen in Salze übergeführt werden, wobei vorzugsweise stöchiometrische Mengen dieser Agenzien eingesetzt werden, um die Salzbildung zu vervollständigen. Innere Salze der Formel I (Ri = R2 = Wasserstoff) können aus anderen Salzen durch Neutralisation ihrer Lösung bis zum isoelektrischen Punkt und Isolierung hergestellt werden. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Verbindungen der Formel I, insbesondere die Ver3
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wendung derjenigen Verbindungen der Formel I, worin Ri eine Aminoschutzgruppe, wie Benzyloxycarbonyl, tert. Butoxycarbonyl oder insbesondere 9-Fluorenmethyloxycarbonyl, R2 Wasserstoff und R3 4-Methyltrityl bedeuten, sowie die Verwendung reaktionsfähiger Carbonsäurederivate dieser Verbindungen zur Synthese von Peptiden, insbesondere an fester Phase.
Die Erfindung betrifft auch Stoffe, die einen oder mehrere bivalente Reste der Formel IV,
0
1
-nh-hc-c-
(fVn (IV)
C-NHR,
ll 3
O
worin n für 1 oder 2 steht und R3 4-Methyltrityl oder 4,4'-Dimethyltrityl bzw. 4,4',4"-Trimethyltrityl bedeutet, enthalten. Bei diesen Verbindungen handelt es sich um Peptidderivate, bzw. -fragmente, wie sie bei der Peptidsynthese als Zwischenprodukte anfallen; sie können auch an ein Syntheseharz gebunden sein.
Die nachfolgenden Beispiele illustrieren die Erfindung, ohne sie in irgend einer Weise einzuschränken.
Verwendete Abkürzungen Ac Acetyl
DC Dünnschichtchromatographie
DCM Dichlormethan
Fmoc 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl
HPLC High Performance Liquid Chromatography
OSu N-Hydroxysuccinimidester
TFA Trifluoressigsäure
Z (Cbz) Benzyloxycarbonyl
Beispiel 1: Z-AsnfMeTrtt-QH
Ein Gemisch von 66,5 g Z-Asn-OH (250 mM), 137,2 g 4-Methyltriphenylcarbinol (500 mM), 750 ml Essigsäure und 47 ml (500 mM) Acetanhydrid wird bei Raumtemperatur 5 Minuten gerührt. Nach Zugabe von 1,25 ml konz. Schwefelsäure wird auf 50°C erhitzt; es entsteht nach 15 Minuten eine klare, gelbe Lösung. Nach 2Z> h wird abgekühlt und in 5 I Eiswasser ausgegossen. Der Niederschlag wird abfiltriert, gut mit Wasser gewaschen und in etwa 500 ml Essigsäureethylester gelöst. Die organische Phase wird mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck auf 300 ml Öl eingeengt. Z-Asn(MeTrt)-OH wird durch Zugabe von Di-isopropylether zum Kristallisieren gebracht.
Smp. 187°—197°C.
Ausbeute: 75%.
Beispiel 2: H-AsnfMeTrti-OH
Eine Suspension von 52,3 g Z-Asn(MeTrt)-OH (100 mM) in 400 ml Methanol und 100 ml In wässri-ger Salzsäure wird in Gegenwart von 2 g eines 10%-igen Palladium-auf-Kohle-Katalysators bei Raumtemperatur und Normaldruck hydriert. Nach beendeter Wasserstoffaufnahme wird der Katalysator abfiltriert, mit Methanol ausgewaschen und das Filtrat nach Zusatz von 13,9 ml Triethylamin (100 mM) und 100 ml Wasser auf ca. 300 ml eingeengt; der kristalline Niederschlag wird abfiltriert und mit Wasser chloridfrei gewaschen. Das erhaltene H-Asn(MeTrt)-OH enthält 0,5 Mol bis 1 Mol Wasser und zersetzt sich ab 222°C.
Ausbeute: 80%.
Beispiel 3: Fmoc-AsnfMeTrtt-OH
19,9 g H-Asn(MeTrt)-OH x 0,5 H2O (50 mM) werden in einer Lösung von 10,6 g Natriumcarbonat (100 mM) in 125 ml H2O und 25 ml Dioxan suspendiert. Zu dieser Suspension wird bei Raumtemperatur unter Rühren innert 1 h eine Lösung von 16,9 g Fmoc-OSu ( 50 mM) in 68 ml Dioxan zugetropft.
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Nach beendeter Reaktion (über Nacht) wird das Reaktionsgemisch mit H2O verdünnt und mehrfach mit Ether extrahiert. Die Extrakte werden verworfen. Anschliessend wird die h^O-Phase mit 400 ml Essigester überschichtet, mit halbkonzentrierter Salzsäure angesäuert (pH 2-3), die organische Phase mit halbgesättigter Kochsalzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Einengen unter vermindertem Druck zum Ol (ca. 50 g), wird aus Ether und Diisopropylether kristallisiert.
Smp. ab 190°-202°C (Zersetzung).
Ausbeute: 75%.
Beispiel 4: Z-GlnfMeTrti-OH
Ein Gemisch von 140,14 g Z-Gln-OH (0,5 Mol), 274,4 g 4-Methyltriphenylcarbinol (1 Mol), in 1,5 I Essigsäure und 93, 4 ml Essigsäureanhydrid (1 Mol) wird 7 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von 2, 5 ml konz. Schwefelsäure wird das Reaktionsgemisch auf 50°C erhitzt; es entsteht nach 15 Minuten eine klare, gelbe Lösung. Nach 2% h wird abgekühlt und in 5 I Eiswasser ausgegossen. Der Niederschlag wird abfiltriert, gut mit Wasser gewaschen und in etwa 1 I Essigsäureethylester gelöst. Die organische Phase wird mit einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck auf 400 ml Öl eingeengt. Das Z-Gln(MeTrt)-OH wird durch Zugabe von Diisopropylether zum Kristallisieren gebracht.
Smp. 187°—197°C.
Ausbeute: 75%.
Beispiel 5: H-GlnfMeTrti-OH
Eine Susp, von 107,3 g Z-Gln(MeTrt)-OH (200 mM) in 800 ml Methanol und 200 ml In wässriger Salzsäure wird in Gegenwart von 0,4 g eines 10%-igen Palladium-auf-Kohle-Katalysators bei Raumtemperatur und Normaldruck hydriert. Nach beendeter Wasserstoffaufnahme wird der Katalysator abfiltriert, mit Methanol ausgewaschen und das Filtrat nach Zusatz von 27,9 ml Triethylamin (200 mM) + 200 ml H2O auf ca. 600 ml eingeengt; der kristalline Niederschlag wird abfiltriert und mit Wasser chloridfrei gewaschen. Das erhaltene H-Gln(MeTrt)-OH enthält 0,5 Mol bis 1 Mol Wasser und zersetzt sich langsam ab 231 °C.
Ausbeute: 85%.
Beispiel 6: Fmoc-GInfMeTrtì-OH
41,15 g H-Gln(MeTrt)-OH x 0,5 H2O (100 mM) wurden suspendiert in einer Lösung von 21,2 g Na-triumcarbonat (200 mM) in 250 ml H2O und 50 ml Dioxan. Zu dieser Suspension wird bei Raumtemperatur unter Rühren innert einer Stunde eine Lösung von 33,7 g Fmoc-OSu (100 mM) in 135 ml Dioxan zugetropft. Nach beendeter Reaktion (über Nacht) wird das Reaktionsgemisch mit H2O verdünnt und mehrfach mit einem Gemisch aus Diisopropylether/Diethylether (1:1) extrahiert. Die Extrakte werden verworfen. Anschliessend wird die Wasserphase mit 800 ml Essigester überschichtet, mit halbkonzentrierter Salzsäure auf pH 2-3 angesäuert, die organische Phase mit halbgesättigter Kochsalzlösung extrahiert und über Natriumsulfat getrocknet, unter vermindertem Druck zum Öl eingeengt und aus Ether kristallisiert.
Smp. ab 108°C (Zersetzung bis 144°C).
Ausbeute: 75%.
Beispiel 7: Vergleichende Spaltversuche: Trt versus MeTrt
Die beiden Modellpeptide Ac-Pro-Asn(Trt)-Gly-Phe-Gly-OH (VI) und Ac-Pro-Asn(MeTrt)-Gly-Phe-Gly-OH (VII) wurden im 1.2-mmol-Massstab am Sasrin nach gängiger Solid-Phase-Technik synthetisiert (M. Mergler et. al., Tetrahedron Letters 2S, 4005 [1988]). Als Kupplungsreagens wurde 2-[1 H-Benzotria-zol(l)-yl]-1,1,3,3-tetramethylharnstoff tetrafluorborat eingesetzt (R. Knorr et al., Tetrahedron Letters 30. 1927 [1989]).
Die Ausbeute an Rohpeptid war in beiden Fällen nahezu quantitativ bei Reinheiten von > 97% (DC und HPLC).
Von den Verbindungen VI und VII wurde dann das Verhalten gegenüber dem Spaltreagens TFA/ DCM 1:1 (v/v) bei 20° untersucht. Zu diesem Zweck wurden 5-mg-Portionen von VI und VII mit je 100 nl Spaltreagens versetzt und der zeitliche Verlauf der Abspaltung der Trt- bzw. MeTrt-Gruppe mittels semiquantitativer DC verfolgt. Als Resultat wurde erhalten, dass die Abspaltungs-Halbwertszeit bei VI ca. 5 Minuten und bei VII ca. 1 Minute beträgt.
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Claims (6)

Patentansprüche
1. Verbindung der Formel I,
R -NH-CH-COOR-
<fVn
CONHR3
worin n gleich 1 oder 2 ist, Ri Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe, R2 Wasserstoff, eine Carboxylschutzgruppe oder eine carboxylaktivierende Gruppe und R3 4-Methyitriphenylmethyl, 4,4'-Dime-thyltriphenylmethyl, 4,4',4"-Trimethyltriphenylmethyl bedeuten sowie Salze einer solchen Verbindung mit einer salzbildenden Gruppe.
2. Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, worin Ri den 9-Fluorenylmethyloxycarbonylrest bedeutet.
3. Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, worin Ri den Carbobenzoxyrest bedeutet.
4. Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, worin Ri Wasserstoff bedeutet.
5. Verbindung der Formel V,
A-NH-HC-CO-B
(CH_) (V)
j /. XI
CONHR3
worin n und R3 die unter Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben und A, bzw. B, den aminoendstän-digen, bzw. carboxylendständigen Rest eines Peptids oder Peptidfragments bedeuten.
6. Verwendung der Verbindungen der Formel I zur Synthese von Peptiden.
6
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