DE2218120A1 - N-geschützte Aminosäuren und Peptide - Google Patents

Description

, lEATENTANWÄLTE DR. I. MAAS

DR. F. VOITHENLEITNER MÜNCHEN 40

iSCHLEISSHEIAAER STR. 299-TEL. 3592201/205

X-3319/86 966

Eli Lilly and Company, Indianapolis/ Indiana, V.St.A. N-geschützte Aminosäuren und Peptide

Die Erfindung betrifft mit Alkinylcarbinyloxycarbonylgruppen N-geschützte Aminosäureverbindungen der Formel

R₁ O R₄

ι <> ι H

R-C=C-C-O-C-N-C-(CH₂)_m-C

R,

(CH₂)

-C-(CH₂)_m-C —]

"Rn ι

'8

- ρ

worin bedeuten:

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R ein Wasserstoffatom, ein Chloratom, einen Phenylrest oder einen durch C.-C.-Alkylreste, C₁-C₄-Alkoxygruppen oder Halogenatome substituierten Phenylrest,

R. für sich allein ein Wasserstoffatom oder einen

R₂ für sich allein einen C.-C.-Alkylrest oder

R. und R- zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 5-, 6- oder 7-gliedrigen carbocyclischen Ring,

R. und Rg, die untereinander gleich oder voneinander verschieden sein können, Wasserstoffatome oder niedere Alkylreste,

R₅ und R-, die untereinander gleich oder voneinander verschieden sein können, Wasserstoffatome, Niederalkylreste, hydroxysubstituierte Niederalkylreste, durch geschützte Hydroxygruppen substituierte Niederalkylreste, aminosubstituierte Niederalkylreste, durch geschützte Aminogruppen substituierte Niederalkylreste, mercaptosubstituierte Niederalkylreste, durch geschützte Mercaptogruppen substituierte Niederalkylreste, durch Niederalkylmercaptogruppen substituierte Niederalkylreste, carboxysubstituierte Niederalkylreste, durch geschützte Carboxygruppen substituierte Niederalkylreste, guanidinsubstituierte Niederalkylreste, durch geschützte Guanidinogrupppen substituierte Niederalkylreste, guanidinoxysubstituierte Niederalkylreste, Imidazolyimethylreste, geschützte Imidazolylmethylreste, Indolylmethylreste, geschützte Indolylmethylreste, Phenylreste, 4-Hydroxyphenylreste oder geschützte 4-Hydroxyphenylreste,

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eine Hydroxygruppe, Methoxygruppe, Xthoxygruppe, t-Butoxygruppe, 2,2,2-Trichloräthoxygruppe, N-Oxysuccinimidgruppe, Phenoxygruppe, Benzyloxygruppe, 4-Nitro-benzyloxygruppe, 2,4,5-Trichlorphenoxygruppe, Pentachlorphenäthoxygruppe oder Pentafluorphenoxygruppe, und deren Säureadditionssalze, Alkalisalze, Erdalkalisalze, Aminsalze, Diäthylaminsalze, Triäthylaminsalze, Dibenzylaminsalze, Dicyclohexylaminsalze und 1,4-Diazabicyclo/2,2,2/octansalze,

m und n, die untereinander gleich oder voneinander verschieden sein können, O oder eine ganze Zahl von 1 bis 4,

O oder eine ganze Zahl von 1 bis 14, mit der Maßgabe, daß dann, wenn ρ 1 oder größer ist, R_fi, R-, m und η in den einzelnen Aminosäureresten, die die Kette bilden, die gleichen oder verschiedene Bedeutungen haben können.

Diese Verbindungen werden durch Umsetzung einer Alkinylcarbinyloxycarbonylverbindung der allgemeinen Formel

R-C=C-C-O-C -

R,

-»-OiCH^-C τ

<^CH2>n

Rr

H R,

ι;

N-C-(CH₂)_m-C (CH₂)

~R,

IV

20984/, /117 3

worin R_ ein Fluoratom, ein Chloratom, eine Phenoxygruppe, eine p-Nitrophenoxygruppe, eine 2,4,5-Trichlorphenoxygruppe, eine Pentachlorphenoxygruppe, eine Pentafluorphenoxygruppe, eine N-Oxysuccinimidgruppe, ein Säureadditionssalz oder
ein Aminsalz bedeutet, q und s, die untereinander gleich oder voneinander verschieden sein können, Zahlen von O bis 13 sind, wobei" die Summe von q und s nicht größer als 13 ist, und R, R., R~, R₄, R₁-, R_ß und R₇ wie oben definiert sind, mit einer Aminosäureverbindung der Formel

NH₀-C-(CH-J-C
2 2 m

(CH₂J_n

R-

H R,

(CH₉).
ι

worin R_A, R_K, R,-, R₇, R_n, n, m und ρ wie oben definiert
sind, und gegebenenfalls, wenn R« eine Hydroxygruppe ist, Erzeugung des gewünschten Aminsalzes oder wie oben definierten Rg-Esters hergestellt.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden mit den N-geschützten Verbindungen der Formel III.

Erfindungsgemäß wird ein Chlor- oder Fluorameisensäureester eines Acetylencarbinols, vorzugsweise eines tertiären Acetylencarbinols wie S-Methyl-l-butin-S-ylchlorformiat, mit einer Aminosäure zu einer durch eine Alkinylcarbinyloxycarbonylgruppe geschützten Aminosäure umgesetzt.

2 0 9 8 A Λ / 1173

*■" J ·*

Ebenso werden die phenyl- und halogensubstituierten Phenylkohlensäureester von Acetylencarbinolen mit der Aminogruppe von Aminosäuren unter Bildung der alkinylcarbinyloxycarbonyl-geschützten Aminosäure umgesetzt.

Die Halogenameisensäureester und die Phenylkohlensäureester der Acetylencarbinole sind aktive Ester, die mit der Aminogruppe von Aminosäuren leicht unter Bildung der N-blockierten oder N-geschützten Aminosäure reagieren, wie es das folgende Reaktionsschema erläutert,

R₁ 0

I 11

R-C=SC-C-O-C- R,+ NH₀/ Y-/-COOH

J.

R- 0

H R-C=C-C-O-C-N-^ Y_/COOH ,

R₂

worin R ein Wasserstoffatom, ein Chloratom, einen Phenylrest oder einen substituierten Phenylrest, R₁ ein Wasserstoff atom oder einen Niederalkylrest, R₂ einen Nlederalkylrest, R- ein Fluoratom, ein Chloratom,, eine Phenoxygruppe oder eine substituierte Phenoxygruppe und Y einen Aminosäurerest bedeutet.

Die so erhältlichen Aminosäuren mit geschützter Aminogruppe werden für die Synthese von Peptiden, zum Beispiel der Peptidfragmente, die zur Synthese des hypoglyDämischen Agens Glucagon geeignet sind, sowie beliebiger anderer crewUnschter Peptidf ragmente, zum Beispiel Pentagastrin, verwendet.

0 8 8 4 4/1173

Die hierin beschriebene Aminoschutζgruppe ist deshalb eine besonders wertvolle Schutzgruppe, weil sie sich aus dem Peptidreaktionsprodukt nach der Ankupplung der geschützten Aminosäure leicht entfernen läßt. Die Schutzgruppe wird durch katalytische Hydrogenolyse bei neutralem pH-Wert unter milden Bedingungen für Temperatur und Druck leicht entfernt.

Es ist ein besonders vorteilhaftes Merkmal der acetylenischen Aminoschutzgruppe, daß sie in Gegenwart schwefelhaltiger Gruppen mittels katalytischer Hydrogenolyse entfernt werden kann. Beispielsweise kann N--geschütztes Methionin mit einer weiteren Aminosäure oder mit einem Aminopeptid zu dem gewünschten Peptid mit der N-terminalen acetylenischen Schutzgruppe umgesetzt werden, welche dann durch katalytische Hydrogenolyse entfernt werden kann. Ebenso können N-blockierte, S-blockierte Cysteinderivate zur Peptidsynthese verwendet werden, und die W-terminale acetylenische Schutzgruppe kann hinterher durch katalytische Hydrogenolyse entfernt werden.

Die Erfindung betrifft daher auch ein verbessertes Verfahren zur Synthese von Peptiden, in dem die Alkinylcarbinyloxycarbonylgruppe als Aminoschutzgruppe verwendet wird.

Die erfindungsgemäß erhältlichen geschützten Aminosäuren, in denen die Alkinylcarbinyloxycarbonylgruppe die Aminoschutzgruppe ist, lassen sich durch folgende allgemeine Formel I wiedergeben,

R₁ O R₄

I U H ,

R-C=C-C-O-C-N-C- (CH_) - COOH

^R5

Ί r ο η & ·: 0 'J

4 / 1 1 7 3

worin R, R., R₃, R₄, R₅, η· und m wie oben definiert sind.

Der Begriff "C₁-C₄-AIkYIrCSt", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet Reste wie Methyl, Äthyl, n-Propyl, iso-Propyl, η-Butyl, sec.-Butyl, iso-Butyl und tert.-Butyl. Die Bezeichnung "C^-C^-Alkoxygruppe" bezieht sich auf Gruppen wie Methoxy, &thoxy, n-Propoxy, iso-Propoxy, n-Butoxy und ähnliche Niederalkyläthergruppen. "Halogen" bezeichnet Fluor, Chlor, Brom und Jod.

Die Bezeichnung ''hydroxysubstituierter Niederalkylrest" umfaßt Reste wie Hydroxymethyl, alpha-Hydroxyäthyl, ß-Hydroxyäthyl, gamma-Hydroxypropyl, 2-Hydroxy-2-propyl, 2-Hydroxy-2-butyl, 2-Hydroxy-3-butyl, Hydroxytert.-butyl und dergleichen.

Der Begriff "durch eine geschützte Hydroxygruppe substituierter Niederalkylrest" bezeichnet die vorstehend genannten Hydroxyniederalkylreste, in denen die Hydroxyfunktion gegen eine Reaktion durch Gruppen wie Benzyl, substituiertes Benzyl, zum Beispiel p-Methoxybenzyl, Niederalkanoylgruppen wie Acetyl und Propionyl und Niederalkylgruppen wie die C^-C^Niederalkylgruppen, zum Beispiel Methyl und tert.-Butyl, geschützt ist.

Der Begriff "aminosubstituierter Niederalkylrest" bezeichnet Reste wie 2-Aminoäthyl, 3-Aminopropyl, 2-Aminopropyl, 2-Aminobutyl und ähnliche aminosubstituierte C--C₄-Niederalkylgruppen und "durch ^ine geschützte Aminogruppe substituierter Niederalkylrest" bezieht sich auf die vorstehenden Aminoniederalkylgruppen, in denen die Aminofunktion durch Substitution mit Gruppen wie t.-Butoxycarbonyl, 5-Amyloxycarbonyl und Adamantyloxycarbonyl geschützt ist.

2 03844/1173

Der Begriff ^::mercaptosubstituierter niederer Alkylrest^:i bezeichnet C.-C.-Alky!mercaptogruppen, zum Beispiel Mercaptomethyl, 2-Mercaptoäthyl, 3-Mercaptopropyl und dergleichen.

Der Begriff ^:ldurch eine Niederalkylmercaptogruppe substituierter Niederalkylrest' bezeichnet C. --C .-alkylmercaptosubstituierte Alkylreste, zum Beispiel Methylmercaptoäthyl, Isopropylmercaptomethyl, n-Propylmercaptoäthyl, flethylmercaptobutvl, 2-Methylmercapto~2-propyl, 3-Methylmercapto-2-butyl, 2-Methylmercaptomethyl-2-propyl und dergleichen.

Oer Begriff 'durch eine geschützte Mercaptogruppe substituierter Niederalkylrest" bezieht sich auf Mercaptoniederalkylaruppen, in denen die Mercaptogruppen durch Gruppen wie Tetrahydropyranyl, p-Methoxybenzyl, Isobutyloxymethyl, ß,ß~Diäthoxycarbonyläthyl, Benzyloxycarbonyl, tert.-Butyl, iMiederalkylcarbamoyl, zum Beispiel Äthylcarbamoyl, und Acetamidomethyl geschützt oder blockiert sind.

Der Begriff 'carboxysubstituierter Niederalkylrest^:; umfaßt Reste wie Carboxymethyl, Carboxyäthyl, 2-Carboxy-2-propyl und 2-Carboxymethyl-2-propyl.

Der Begriff "durch eine geschützte Carboxygruppe substituierter Niederalkylrest^:| bezeichnet die Benzyl- und tert.-Butylester der oben definierten carboxysubstituierten C.-C. -Niederalkylreste.

Die Bezeichnung 'guanidinsubstituierter Miederalkylrest^: umfaßt Reste wie Guanidiriomethyl, Guanidinoäthyl, 2-Guanidino-2-propyl und alpha,alpha-Dimethylguanidinoäthyl.

20984 4/1173

Der Begriff "durch eine geschützte Guanidinogruppe substituierter Niederalkylrest" bezeichnet guanidinsubstituierte C.--C^-Niederalkvlreste, in denen die Guanidine-funktion wie beispielsweise in der Aminosäure Arginin durch Gruppen wie Carbobenzoxy-, t.-Butyloxyearbonyl-, t.-Amyloxycarbonyl-, Adamantyloxycarbonyl- und Nitrogruppen geschützt ist.

Der Begriff "guanidinoxysubstituierter Niederalkylrest" bezeichnet solche oben genannten guanidinsubstituierten C -C.-Niederalkylsubstituenten, in denen die heterocyclische Guanidingruppe über ein weiteres Sauerstoffatom an die Niederalkylgruppe gebunden ist.

Die Bezeichnung "geschützte Imidasolylmethylgruppe" gibt an, daß die Imidaminogruppe durch Substitution mit Gruppen wie Benzyl, Adamantyloxycarbonyl und t.-Butoxycarbonyl geschützt ist.

Die alkilnylcarbinylosycajrbonyl-geschütsfcen Aminosäuren der Formel I werden durch ühtsst^img eines aktiven Esters eines Acetylencarbinols mit der gsviünsehten Aminosäure hergestellt. Die Chlor- und Fluoraiaeisensäureester oder die Phenyl- und substituierten Phenylkohlensäureester einiger sekundärer und tertiärer Acetyiencarbinole sind besonders vorteilhafte acetylenische aktive Ester zur Herstellung der Verbindungen der Formel I. Die für die erfindungsgemäßen Zwecke verwendeten Aeetylencarbinolhalogenameisensäure- und -phenylkohlensäureester lassen sich durch folgende Formel II darstellen,,

209844/1 1

^Rl

R-C = C-- C - O - C - R~

II

worin R, R. und R^ wie in Formel I definiert sind und R₃ ein Fluoratom, ein Chloratom, eine Phenoxygruppe, eine p-Nitrophenoxygruppe/ eine 2,4,5-Trichlorphenoxygruppe, eine Pentachlorphenoxygruppe oder eine Pentafluorphenoxygruppe bedeutet.

Die aktiven Acetylencarbinolester der Formel II werden aus leicht erhältlichen tertiären und sekundären Acetylencarbinolen nach allgemein bekannten Synthesemethoden hergestellt. Beispielsweise wird 3-Methyl-l-butin-3-ol mit Difluorcarbonyl oder mit Phosgen in Gegenwart eines Halogenwasserstoffakzeptors wie Triethylamin zu einem Acetylencarbinolchlor- oder -fluorameisensäureester der Formel II umgesetzt, in dem R₃ Chlor oder Fluor bedeutet. Die Acetylencarbinolkohlensäureester der Formel II, in denen R₃ eine Phenoxy- oder substituierte Phenoxygruppe bedeutet, werden durch Umsetzung eines Acetylencarbinols mit einem Halogenameisensäureester eines Phenols oder substituierten Phenols in Gegenwart eines Halogenwasserstoffakzeptors hergestellt. Zur Synthese der Acetylencarbinolkohlensäureester werden vorzugsweise Phenolchlorameisensäureester verwendet.

Die folgenden Verbindungen sind für die Halogenameisensäure- und aktiven Kohlensäureester der Formel II beispielhaft.

2 0 9 8 /, 4 / 11 7 3

3-Methyl-l-butin~-3-ylchlorfor:miat S-Methyl-l-pentin-S-ylchlorformiat 3-£thyl-l-pentin--3~ylchlor£oriniat 3-Methyl-i-butin-3-ylfluorformiat l-Phenyl-S-inethyl-l-butin-a-yichlorforiniat l-Phenyl-3-methyl-l-pentin-3~ylfluorforniiat l-p-Tolyl-S-rnethyl-l-butin-S-ylchlorformiat l-p-Chlorphenyl-S-methyl-l-pentin-S-ylchlorformiat l-i'thinylcyclohex-l-ylchlorformiat l-Athinylcyclopent-l-ylchlor format l-Phenyläthinylcyclohex-l-ylchlorforraiat 3-Methyl-l-hexin-3-ylfluorformiat S-n-Propvl-l-hexin-S-ylchlorformiat S-Kthyl-l-heptin-S-ylchlorformiat 3-Methyl-l-butin-3-y.lphenylcarbonat 3~Methyl-l-butin-3-yl~2,4,S-trichlorphenylcarbonat S-Methyl-l-butin-S-ylpentachlorphenvlcarbonat 3-Methy1-1-butin-3-y!pentafluorphenylcarbonat 3-Xthyl-l-pentin-3-yl~2,4,S-trichlorphenylcarbonat l-Phenyl-3-methyl-l-butin-3-ylphenylcarbonat l-Phenyl-3-methyl-l-pentin-3-yl-2,4„5-trichlorphenylcarbonat l-Xthinylcyclohex-l-ylphenylcarbonat l-Kthinylcyclohex-l-yl-2,4,S-trichlorphenylcarbonat l-ilthinylcyclopent-l-yl~2 ,4 ,S-trichlorphenylcarbonat l-Äthinylcyclohept-l-ylphenylcarbonat l-Phenyläthinylcyclohex-l-yl-2,4,5-trichlorphenylcarbonat 3-Methyl-l-pentyl-3-ylpentafluorphenylcarbonat 3-Äthyl-l-heptin-3~yl-2,4,5-trichlorphenylcarbonat l-Chlor-S-methyl-l-butin-S-ylchlorformiat l-Chlor-S-methyl-l-pentin-S-ylchlorformiat l-Chloräthinylcyclohexyl-l-ylchlorformiat l-Chlor-S-äthyl-l-pentin-S-ylfluorformiat l-Butin-3-ylchlorformiat 1-Butin~3~ylphenylcarbonat l~Pentirv-3~yichlorformiat 1-Putin-3-yl-2,4,5-trichlorphenylcarbonat und ähnliche Ester

2098Λ4/1173

Wenn hierin der Begriff "Halogenformiat" oder "Halogenameisensäureester" verwendet wird, sind damit Chlorformiat und Fluorformiat bzw. Chlorameisensäureester und Fluorameisensäureester gemeint.

Wie erwähnt werden die Verbindungen der Formel I durch Umsetzung einer Aminosäure mit einem Acetylencarbinolhalogenformiat oder einem Acetylencarbinolphenylcarbonat der Formel II hergestellt.

Die Herstellung der amino-geschützten Aminosäure wird in folgender Weise durchgeführt: Wenn ein Halogenameisensäureester der Formel II, zum Beispiel ein Chlorameisensäureester, zur Herstellung einer Verbindung der Formel I verwendet wird, wird der Ester einer wässrigen Lösung des Natriumsalzes der gewünschten Aminosäure bei einer Temperatur zwischen etwa O und 15 ⁰C zugesetzt. Die Reaktionsmischung wird etwa 12 Stunden lang gerührt. Während dieser Zeit wird die Temperatur Raumtemperatur erreichen gelassen. Die wässrige Reaktionsproduktmischung wird mit Äther gewaschen und dann mit konzentrierter Salzsäure auf etwa pH 1 angesäuert. Das Produkt scheidet sich aus der angesäuerten wässrigen Mischung entweder als Feststoff oder als Ol ab.

Wenn das alkinylcarbinyloxycarbonyl-geschützte Aminosäurereaktionsprodukt auf diese Weise als fester Niederschlag erhalten wird, wird es abfiltriert und kann durch Umkristallisieren aus einem geeigneten Lösungsmittel weiter gereinigt werden.

Wenn die N-geschützte Aminosäure als öl oder halbfester Niederschlag erhalten wird, kann sie in Form eines kristallinen Aminsalzes in folgender Weise isoliert und gereinigt werden:

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Das abgeschiedene öl wird aus der wässrigen sauren Reaktionsmischung mit einem geeigneten Lösungsmittel, zum Beispiel Äthylacetat, extrahiert, und der Extrakt wird mit Wasser gewaschen und getrocknet. Der getrocknete Extrakt wird zur Trockne eingedampft, und das · als öl zurückbleibende Reaktionsprodukt wird in Äther aufgenommen. Nach Zugabe eines basischen organischen Amins zu der ätherischen Lösung wird das kristalline Aminsalz der alkinylcarbinyloxycarbonyl-geschützten Aminosäure erhalten. Geeignete Aminsalze können mit organischen Aminen wie Triäthylamin, Dibenzylamin, Dicyclohexylamin, l,4-Diazabicyclo/2,2,2/octan und dergleichen hergestellt werden. Ein bevorzugtes Amin ist Dicyclohexylamin. Die Aminsalze der N-geschützten Aminosäuren können durch Umkristallisieren aus einem geeigneten Lösungsmittel oder einer Mischung von Lösungsmitteln weiter gereinigt werden. Beispielsweise werden die Dicyclohexylaminsalze zweckmäßig aus einer Mischung von Äther und Pentan umkristallisiert.

Die Verbindungen der Formel I können auch durch Umsetzung eines aktiven Acetylencarbinolkohlensäureesters der Formel II, worin R₃ eine Phenoxygruppe oder substituierte Phenoxygruppe bedeutet, hergestellt werden.

Wenn ein Phenylkohlensäureester der Formel II mit einer Aminosäure umgesetzt wird, wird· die Reaktion folgendermaßen durchgeführt. Die Aminosäure und der Acetylencarbinolkohlensäureester werden in einer Lösungsmittelmischung aus Wasser und einem Cosolvens wie einem alkoholischen Lösungsmittel, zum Beispiel Isopropanol, tert.-Butanol, Isoamylalkohol oder einem anderen geeigneten Alkohol gelöst. Ein Halogenwasserstoffakzeptor, zum Beispiel ein tertiäres Amin v/ie Triäthylamin, wird zugesetzt-, und die Reaktionsmischiing wird etwa 2 Stunden

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bis etwa 8 Stunden bei einer Temperatur gerührt, die zwischen etwa 45 und 75 C gehalten wird.

Zur Isolierung des amino-geschützten Aminosäuresäurereaktionsprodukts wird die Reaktionsproduktmischung im Vakuum eingedampft und der ölige Rückstand in Wasser gelöst. Die Lösung wird mit einer organischen Säure, zum Beispiel Essigsäure oder Zitronensäure, auf etwa pH 3 angesäuert, und das abgeschiedene öl wird mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird gewaschen und getrocknet und dann im Vakuum eingedampft, wodurch die alkinylcarbinyloxycarbonylamino-geschützte Aminosäure entweder als öliger Rückstand oder als fester Rückstand erhalten wird. Das so erhaltene Reaktionsprodukt kann in Form der freien Säure der N-geschUtzten Aminosäure oder als Aminsalz davon in der oben in Verbindung mit der Herstellung aus den Halogenameisensäureestern beschriebenen Weise weiter gereinigt werden.

Die Herstellung beispielhafter N-geschützter Aminosäuren und ihrer Aminsalze wird in den Ausführungsbeispielen noch genauer erläutert.

Die so erhaltenen geschützten Aminosäuren sind in der Synthese von Peptiden vorteilhaft. Die freie Carboxylgruppe der amino-geschützten Aminosäure kann mit einer weiteren Aminosäure oder einem Peptid mit einer freien Aminogruppe zu der Amidbindung eines Dipeptide oder höheren Peptids umgesetzt werden. Diese Reaktion wird gewöhnlich so durchgeführt, daß zuerst ein aktiver Ester der zu kondensierenden Aminosäure hergestellt wird. Ein solcher Ester, der dafür verwendet werden kann, ist der 2,4,5-Trichlorphenylester der N-geschützten Aminosäure.

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Alternativ kann zuerst der aktive Ester einer ungeschützten Aminosäure hergestellt werden, und dann kann ihre Aminogruppe mit der Alkinylcarbinyloxycarbonylschutzgruppe geschützt werden. Aktive Ester der Aminosäuren, die gewöhnlich bei der Synthese von Peptiden angewandt werden, können auch für die erfindungsgemäßen Zwecke verwendet werden. Beispielsweise können die mit N-Hydroxysuccinimid erzeugten Ester, substituierte Phenylester und besonders die 2,4,5-Trichlorphenyl- und Pentachlorphenylester verwendet werden.

Einen Teil der Erfindung bildet ein zweckmäßiges Verfahren zur Herstellung eines aktiven Phenyl- oder substituierten Phenylesters einer alkinylcarbinyloxycarbonyl -ge schütz ten Aminosäure. Wenn gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung ein Acetylencarbinolkohlensäureester der Formel II (wobei R₃ eine Phenoxygruppe oder substituierte Phenoxygruppe ist) zur Herstellung einer alkinylcarbinyloxycarbonyl-geschützten Aminosäure verwendet wird, entsteht als Nebenprodukt der Umsetzung Phenol oder ein substituiertes Phenol. Das phenolische Nebenprodukt, das in der Reaktionsproduktmischung zusammen mit der alkinylcarbinyloxycarbonylgeschützten Aminosäure vorliegt, kann dann mit der freien Carboxylfunktion der N-geschützten Aminosäure durch Versetzen der Reaktionsproduktmischung mit einem geeigneten Kondensationsmittel, zum Beispiel Dicyclohexylcarbodiimid, zu dem aktiven Phenyl- oder substituierten Phenylester der alkinylcarbinyloxycarbonylamino-geschützten Aminosäure umgesetzt werden. Der alkinylcarbinyloxycarbonyl-geschützte Aminosäureester wird dann zur folgenden Anwendung bei der Synthese von Peptiden isoliert und gereinigt.

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Beispielsweise wird ein Acetylencarbinolkohlensäureester der Formel II wie vorher beschrieben mit der gewünschten Aminosäure unter Bildung einer Reaktionsproduktmischung aus der alkinylcarbinyloxycarbonylamino-geschützten Aminosäure und Phenol oder einem substituierten Phenol umgesetzt. Die Mischung wird zu einem Rückstand eingedampft, der dann mit Wasser behandelt und mit einer schwachen Säure, zum Beispiel Zitronensäure, auf einen pH-Wert von etwa 3 angesäuert wird. Die angesäuerte Lösung wird mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, zum Beispiel Äthylacetat, extrahiert, und der Extrakt wird gewaschen und getrocknet. Der Extrakt wird zu einer öligen Mischung aus der N-geschützten Aminosäure und dem Phenol oder substituierten Phenol eingedampft. Der Rückstand wird mit einem kleinen Volumen Äthylacetat versetzt, und die so erhaltene Lösung wird auf eine Temperatur von etwa O bis 5 ⁰C abgekühlt. Die kalte Lösung wird mit einem Kondensationsmittel, zum Beispiel Dicyclohexylcarbodiimid, versetzt, und die Reaktionsmischung wird über Nacht gerührt, während sie sich auf Raumtemperatur erwärmt. Der abgeschiedene Harnstoff, der sich bei der Umsetzung als Nebenprodukt bildet, wird abfiltriert, und das Filtrat wird eingedampft, wodurch der Kohlensäureester der N-geschützten Aminosäure als roher Rückstand erhalten wird. Der Rückstand kann durch Umkristallisieren aus einem geeigneten Lösungsmittel gereinigt, und das Reaktionsprodukt kann dadurch in kristalliner Form erhalten werden. Bevorzugte Lösungsmittel zum Umkristallisieren dieser Esterreaktionsprodukte sind Mischungen aus Äthylacetat und Pentan.

Die oben.beschriebenen Methoden werden durch das folgende allgemeine Reaktionsschema I erläutert.

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Reaktionsschema I

C - (CH₀)„, - COOH
ζ m

(CH₂)

R-CSC-C-O-C-X

*1

C-O

C-O

Il

-C-

" H

C-N

-C- (CH₂) - COOH + Phenol

^(CH2>n

DCH

DCH-Aminsalz

DCC

R 0 R «J· << η ·⁴

R-C=C-C-O-C-N-C-(CH₀) -C-C

2 <^CH2>n

X = Chlor oder Fluor

DcC = Dicyclohexylcarbodiimid DCH = Dicyclohexylamin Rr

209 8AA/1173

Alle bekannten Aminosäuren können erfindungsgemäß geschützt werden, beispielsweise die alpha-Aminomonocarbonsäuren wie Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isovalin, Phenylalanin, Tyrosin, Serin, Cystein und Methionin, die Monoaminodicarbonsäuren wie Arginin, Lysin und Ornithin, Glutamin und Asparagin und die heterocyclischen substituierten Aminosäuren wie Histidin, Tryptophan und Prolin und ebenso die ß-Aminosäuren wie alpha-Phenyl-ß-aminopropionsäure, ß-Phenyl-ß-aminopropionsäure, ß-Aminopropionsäure, ß-Aminobuttersäure, ß-Aminocapronsäure, omega-Hydroxy-ß-aminovaleriansäure, epsilon-Hydroxy-ßaminocapronsäure, ß-Aminoisovaleriansäure, ß-Aminogamma-guanidinovaleriansäure, ß-Aminoglutarsäure, ß-Amino-gamma-äthylmercaptobuttersäure und ß-Aminogamma-methylmercaptobuttersäure.

Die folgenden Verbindungen sind Beispiele für die erfindungsgemäß erhältlichen alkinylcarbinyloxycarbonyl-geschützten Aminosäuren und -ester.

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N- p-Methyl-l-butin-S-oxycarbonyl)-L-glycin N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-L-alanin N-(S-Methyl-l-pentin-S-oxycarbonyl)-L-valin N-(S-Methyl-l-butin-S-oxycarbonyl)-D-phenylglycin N-(3~Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-L-methionin N-(l-Chlor-S-methyl-l-butin-S-oxycarbonyl)-L-methionin N-(l-Phenyl-S-methyl-l-butin-S-oxycarbonyl)-L-asparaginsäure N-(S-Methyl-l-butin-S-oxycarbonyl)-L-cystein N-(l-Äthinylcyclohexyl-l-oxycarbonyl)-L-methionin N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)phenylalanin N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-L-tryptophan N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-S-trityl-L-cystein N-(3-Methyl~l-pentin-3-oxycarbonyl)-S-benzyl-L-cystein N-(l-Äthinylcyclopentyl-l-oxycarbonyl)-S-benzhydryl-L-cystein N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-O-t-butyl-L-serin N-(l-Phenyl-S-methyl-l-pentin-S-oxycarbonyl)-O-benzyl-L-serin N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)tyrosin alpha-N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-L-ornithin alpha-N-(3-Methyl-l-pentin-3-oxycarbonyl)-epsilon-t-butyloxycarbonyl-amino-L-lysin

alpha-N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)histidin N-(3-Äthyl-l-pentin-3-oxycarbonyl)glutaminsäure N-(3-Methyl-l-hexin-3-oxycarbonyl)isovalin N- (l-Jithinylcycloheptyl-l-oxycarbonyl) -alanin N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)methionin

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und deren Alkali-, Erdalkali- und Aminsalze, zum Beispiel die Lithium-, Natrium-, Kalium-, Calcium-, Diäthylamin-, Dicyclohexylamin-, Triäthylendiamin- und Dibenzylaminsalze, sowie deren aktive Ester, zum Beispiel die p-Nitrobenzyl-, Pentachlorphenyl-, Pentafluorphenyl- und 2,4,5-Trichlorphenylester und die mit N-Hydroxysuccinimid gebildeten Ester.

Wie erwähnt können die alkinylcarbinyloxycarbonylgeschützten Aminosäuren in vielen Fällen in Form ihrer Aminsalze isoliert und gereinigt werden. Ein bevorzugtes Amin zur Herstellung von Amlnsalzen der N-geschützten Aminosäuren ist Dicyclohexylamin. In der folgenden Tabelle I sind beispielhafte Dicyclohexylaminsalze von erfindungsgemäß N-geschützten Aminosäuren aufgeführt.

209844/1 173

Tabelle I

Dicyclohexylamin(DCHA) salze von alkinylcarbinyloxycarbonyl-

geschützten Aminosäuren

R-C =

R1	- O	ο	H	- CH	O	- ο -	+
1			- N	ι	ιι		DCHA
C		- C -		R1	- C
ι
R-
ι
L

eingesetzte
Aminosäure

R¹

Schmp.

L-Methlonin	H
L-Phenyl- alanin	H
L-Methionin	H
L-Methionin	Cl
L-Methionin	C6H
S-Trityl-L- cystein	H
O-t-Butyl-L- serin	H
L-Valin	H
L-Glutamin	H
L-Tryptophan	H
D-alpha-Phenyl- glycin	H
O-t-Butyl-L- threonin	H
O-t-Butyl- Tr tyrosin	H

CH, CH.

CH.

CH.

CH.

CH

CH

CH₃ -CH₂

// A

-(CH₂)₅- -(CH₂J₂-SCH₃

-(CH₂)₂-SCH₃
-CH₂-S-C (0)₃

CH₃ -CH(CH₃J₂

CH.

CH₃ C₆H₅-

CH.
-Clf

117-119 205-206

119-121 115-117 132-133,5 177,5-179

CH₃ -CH₃-O-C(CH₃J₃ 146-148

126-128

CH₃ -CH₂-CH₂-C-NH₂ 152-154

₂- 178,5-180

138-140

-C-O-C(CH₃)₃ 160-162

125-128

2098A4/1173

" ²² " 2218720

Beispielhafte aktive Ester von alkinylcarbinyloxycarbonyl-geschützten Aminosäuren sind in der folgenden Tabelle II aufgeführt, in der zwei bevorzugte Estergruppen, nämlich die 2,4,5-Trichlorphenylester und die von N-Hydroxysuccinimid stammenden Ester, erläutert werden.

20984 W1 1 73

Tabelle II

	eingesetzte Aminosäure	N-(3-Methyl	R1	r PH	R"	-aminosäuren	— R"
Aktive Ester von	L-Methionin	CH3	-(CH2)2-S-CH		3 2,4,5-TCP1	•
	S-Benzhydryl- L-cystein	C = C-C-	-CH2-S-CH(0)		2 2,4,5-TCP
H -	S-Benzyl- L-Cystein	t	-CH2-S-CH20	-1-butin-3-oxycarbony1)	2,4,5-TCP	Schmp. 0C
	D-alpha-Phenyl- glycin	CH3	C6H5~	O O H	2,4,5-TCP	97-98
	L-Tryptophan		O-C-N-CH-C-O	2- 2,4,5-TCP	128-131
	\ I	I		59-62
		R1	69-71
		123-125

L-Phenylalanin

-N

128-130

1/ 2,4,5-TCP

2,4,5-Trichlorphenyl

2098AA/1173

Wie erwähnt, sind die erfindungsgemäß erhältlichen N-geschützten Aminosäuren bei der Synthese von Peptiden vorteilhaft. Die Erfindung bietet daher auch ein verbessertes Verfahren zur Synthese von Peptiden. Die N-geschützten Aminosäuren der Formel I können mit einer weiteren Aminosäure zu einem Dipeptid umgesetzt werden, oder die N-geschützte Aminosäure kann alternativ mit einem vorher erzeugten Peptid zu einem Peptid, das die weitere Aminosäure enthält, die von der N-blockierten Aminosäure geliefert wird, umgesetzt werden. Die Kupplung der N-geschützten Aminosäure mit einer weiteren Aminosäure oder einem Peptid mit einer freien Aminogruppe wird nach Methoden durchgeführt, die für die Synthese von Peptiden allgemein bekannt sind und angewandt werden. Beispielsweise können die N-geschUtzten Aminosäuren der Formel II mit der Aminogruppe einer weiteren Aminosäure oder eines Aminopeptids durch Reaktion des Carboxylteils der N-geschützten Aminosäure in Form eines aktiven Esters, eines gemischten Anhydrids, eines Säurehalogenids oder unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid und ähnlichen Peptidkupplungsmethoden, die gewöhnlich von den Fachleuten verwendet werden, gekuppelt werden.

Nach der Synthese des gewünschten Dipeptide oder Polypeptide läßt sich die Alkinylcarbinyloxycarbonylaminoschutzgruppe leicht durch katalytische Hydrogenolyse entfernen. Die erfindungsgemäße acetylenische Aminoschutzgruppe ist wegen ihrer leichten Entfernbarkeit bei neutralem pH-Wert mittels katalytischer Hydrogenolyse unter milden Bedingungen für Temperatur und Druck eine besonders vorteilhafte Aminoschutzgruppe für Peptidsynthesen. Die erfindungsgemäße Aminoschutzgruppe ist zur Blockierung von Aminogruppen besonders zweckmäßig, da sie sich in Gegenwart von schwefelhaltigen funktioneilen Gruppen, die im gleichen Peptidmolekül enthalten sein können, leicht entfernen läßt.

209 8AA/ 1 173

Wegen der leichten Abspaltung der erfindungsgemäßen Arainoschutzgruppen bei neutralem pH-Wert bleiben andere blockierende Gruppen in dem gleichen Peptidmolekül, die entweder durch saure oder alkalische Hydrolyse entfernt werden, praktisch unversehrt erhalten, während die Alkinylcarbinyloxycarbonylgruppe selektiv entfernt wird.

Die katalytische Hydrogenolyse der hierin beschriebenen Aminoschutζgruppen wird in einem inerten Lösungsmittel bei einer Temperatur zwischen etwa 15 und 45 C unter einem Wasserstoffdruck von etwa 1 bis etwa 5 Atmosphären in Gegenwart eines Hydrierungskatalysators durchgeführt. Ein bevorzugter Katalysator ist Palladium auf Kohle als Träger, zum Beispiel 5 oder 10 % Palladium auf Kohle. Andere Hydrierungskatalysatoren wie Platin, Platinoxid, Rhodium und Rutenium können als Trägerkatalysatoren auf üblichen Katalysatorträgern wie Kohle, Aluminiumoxid, Kieselgel und dergleichen verwendet werden. Diese Katalysatoren, einschließlich Palladium, können.auch in ihrer feinteiligen metallischen Form ohne einen Träger angewandt werden.

Bei der Hydrogenolyse können Lösungsmittel wie die Alkohole, Äther und Ester, zum Beispiel Methanol, Äthanol, Isopropanol, Tetrahydrofuran, Dioxan, Äthylacetat, Amylacetat und ähnliche Lösungsmittel verwendet werden. Lösungsmittel wie Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, wässrige Essigsäure und andere übliche Lösungsmittel können ebenfalls verwendet werden.

Die Reaktion wird vorzugsweise bei Raumtemperatur wnter einem Wasserstoffdruck von etwa 1,05 bis 3,2 kg/cm (15 bis 45 psi) in Gegenwart von etwa 0,05 bis 0,75 g 5 % Palladium-auf-Kohle pro mMol Peptid durchgeführt» Vorzugsweise werden 0,5 g 5 % Palladium-auf-Kohle pro mMol Peptid angewandt.

209844/117

Die Hydrogenolyse kann in einem Hydrierapparat nach Parr oder in einem geeigneten Glasgefäß, zum Beispiel einem offenen Becherglas, einem Rundkolben oder einem anderen Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Wenn die Hydrogenolyse in einem Kolben oder einem offenen Becherglas vorgenommen wird, wird der Katalysator in einer Lösung suspendiert, die das Peptid enthält, und durch die Lösung wird unter Rühren Wasserstoffgas geleitet. Während des Verlaufs der Hydrogenolyse entwickelt sich Kohlendioxyid aus der Reaktionslösung und kann in . einer Bariumhydroxidlösung aufgefangen werden, um zu ermitteln, wann die Hydrogenolysereaktion vollständig ist.

Wenn in der oben angegebenen Formel II R Chlor bedeutet, wird die Hydrogenolyse der Alkinylcarbinyloxycarbonylgruppe von der Hydrogenolyse des Chlorsubstituenten unter Bildung von Chlorwasserstoff begleitet. Der so erzeugte Chlorwasserstoff steht zur in situ Erzeugung des Hydrochloridsalzes der freien Aminogruppe, die durch Entfernung der Schutzgruppe entsteht, zur Verfügung.

Die Chloracetylenschutzgruppe, zum Beispiel die l-Chlor-B-methyl-l-butin-S-oxycarbonylgruppe, ist besonders für die Synthese von N-terminalen Glutaminpeptiden vorteilhaft. Glutaminpeptidreste gehen leicht eine intramolekulare Cyclisierung unter Bildung des unerwünschten Pyroglutaminylrestes in dem Peptid ein.

Wenn eine erfindungsgemäße Chloracetylenschutzgruppe verwendet wird, führt die Bildung von Chlorwasserstoff, die gleichzeitig mit der Hydrogenolyse der Schutzgruppe erfolgt, zum Glutaminrest des Peptids und verhindert die Cyclisierung des Glutaminrests.

209844/1173

Die Alkinylcarbinyloxycarbonylschutzgruppe ist eine besonders vorteilhafte Aminoschutzgruppe bei der Peptidsynthese, da sie durch selektive Hydrogenolyse aus Peptiden in Gegenwart der gewöhnlich verwendeten Carboxyl-, Amino-, Hydroxyl- und Thiolgruppenschutζgruppen, die in dem gleichen Peptid vorhanden sein können, entfernt werden kann. Beispielsweise kann die Alkinylcarbinyloxycarbonylgruppe mit Hilfe der oben beschriebenen Hydrogenolysemethode in Gegenwart von solchen Aminoschutζgruppen wie der tert.-Butyloxycarbonylgruppe (t-BOC) und der Adamantyloxycarbonylgruppe, zum Beispiel der t-BOC-geschützten epsilon-Aminogruppe von Lysin und der t-BOC-delta-Aminogruppe von Ornithin, entfernt werden.

Die acetylenische Aminoschutzgruppe kann aus Peptiden, die Schwefelgruppen zusammen mit Schutzgruppen enthalten, die einer Hydrogenolyse zugänglich sind, zum Beispiel die Benzylester und Benzylather, selektiv entfernt werden.

Ebenso ist die Alklnylcarbinyloxycarbonylaminoschutzgruppe durch katalytische Hydrogenolyse unter neutralen pH-Bedingungen in Gegenwart einer geschützten Sulfhydrylgruppe, zum Beispiel S-geschütztem Cystein, entfernbar. Zu solchen S-Schutzgruppen gehören beispielsweise die Tetrahydropyranylgruppe, die p-Methoxybenzylgruppe /Bull. Chem. Soc. Japan, 37, (3) 433 (1964)_/, die Isobutyloxymethylgruppe /J. Org. Chem. 35, 215 (1970); J. Chem. Soc. 3832 (1964_/, die β,β-Diäthoxycarbonyläthylgruppe, die S-Äthylmercaptogruppe /Bull. Chem. Soc. Japan, 40, 2913 (1969)_/, die Alkoxycarbonyl- und Benzyloxycarbonylgruppe / J. Am. Chem. Soc, 85, 1337 (1963)/, die Alkylcarbamoylgruppe /HeIv. Chim. Acta, 49, (14) 83 (1966)_/, die Acetamidomethylgruppe /Tetrahedron Letters, No. 26, 3057 (1968)_/, die tert.-Butylgruppe und ähnliche Thiolschutzgruppen, die gewöhnlich auf dem Gebiet der Peptidsynthesen verwendet werden.

209844/1173

Die Alkinylcarbinyloxycarbonylaminoschutzgruppe ist ein besonders wertvolles Hilfsmittel bei der Synthese von Peptiden, da sie sich aus der Aminogruppe von Aminosäuren, die eine Schwefelgruppe enthalten, zum Beispiel Methionin, Cystein und Peptiden, die diese Aminosäuren enthalten, entfernen läßt.

Es wird darauf hingewiesen, daß in der oben dargestellten Formel III der in eckigen Klammern angegebene Teil ein Aminosäurerest ist. Es ist zu beachten, daß Rg, R^, m und η für die einzelnen Aminosäurereste die gleichen oder verschiedene Bedeutungen haben können.

Wenn in der oben angegebenen Formel III R₅ einen geschützten Substituenten, zum Beispiel einen durch eine geschützte Mercaptogruppe substituierten Niederalkylsubstituenten darstellt, haben solche geschützten funktionellen Gruppen die gleichen Bedeutungen, wie sie vorher in Formel I definiert wurden.

Diejenigen Peptide der Formel III, die aus den natürlichen Aminosäuren hergestellt sind, bilden eine bevorzugte Gruppe von Peptiden, die für verschiedene auf dem Gebiet der Peptidchemie anerkannte Zwecke vorteilhaft sind. Solche Peptide, die natürliche Aminosäurereste enthalten, können zur Synthese von bekannten Polypeptiden, zum Beispiel Glucagon, mit bekannten physiologischen Eigenschaften verwendet werden. Diejenigen Verbindungen der Formel III, die aus Aminosäuren hergestellt sind, welche nicht natürlich vorkommen, können zur Synthese von löslichen Polymeren mit unterschiedlichem Molekulargewicht verwendet werden, die zum Beschichten von Oberflächen angewandt werden können.

2098U/1173

Erfindungsgemäß wird die Aminogruppe einer Aminosäure durch Umsetzung der Aminosäure mit einem acetylenischen Halogenformiat oder acetylenischen Carbonat der Formel II zu der N-geschützten Aminosäure der Formel I geschützt. Die Carboxylfunktion der N-geschützten Aminosäure wird dann in einen aktiven Ester, ein gemischtes Anhydrid oder ein Acylhalogenid übergeführt. Alternativ kann die Carboxylfunktion der Aminosäure zuerst in einen aktiven Ester, ein gemischtes Anhydrid oder ein Acylhalogenid umgewandelt und die Aminogruppe anschließend durch Umsetzung mit einem acetylenischen Halogenformiat oder Kohlensäureester der Formel II geschützt werden. Die Umwandlung der Carboxylfunktion in solche Derivate wird nach üblichen Methoden durchgeführt, die dem Fachmann wohl bekannt sind. In vielen Fällen kann die erfindungsgemäß erhältliche N-geschützte Aminosäure ohne Umwandlung der Carboxylfunktion unter Bildung eines Peptids gekuppelt werden, indem die Kupplungsreaktion mit Hilfe eines Kondensationsmittels wie Dicyclohexylcarbodiimid durchgeführt wird.

Die so erhaltenen N-geschützten Aminosäuren, aktiven Ester, gemischten Anhydride oder Acy!halogenide werden dann mit einer weiteren Aminosäure oder einem Aminopeptid zu dem gewünschten Peptid der Formel III umgesetzt, in dem die terminale Aminogruppe durch eine Alkinylcarbinyloxycarbonylgruppe geschützt ist. Weitere reaktive Gruppen, die in der Aminosäure oder dem Aminopeptid vorhanden sein können, werden zweckmäßig durch solche Schutzgruppen, wie sie üblicherweise bei der Peptidsynthese verwendet werden, geschützt«

Die N--terminale Alkinylcarbinyloxycarbonylschutzgruppe des so erhaltenen Di- oder Polypeptids wird dann durch katalytlsche Hydrogenolyse an 5 % Palladium-auf-Kohle nach der oben erläuterten Deblockisrasagsreaktion selektiv entfernt.

2Q98U/1173

-so- 221 Rl

Das so hergestellte Aminopeptid kann durch übliche Maßnahmen, zum Beispiel durch Extraktion, Umkristallisieren oder Adsorptionsmethoden, zum Beispiel Säulenchromatographie oder präparative Dünnschichtchromatographie, isoliert und gereinigt werden.

Das so isolierte Dipeptid oder Polypeptid, das eine freie N-terminale Aminogruppe enthält, kann dann mit einer weiteren Aminosäure, die durch die erfindungsgemäße Alkinylcarbinyloxycarbonyl-Schutzgruppe geschützt ist, zu einem Tripeptid oder einem Polypeptid umgesetzt werden, das nunmehr letztere Aminosäure in der Peptidkette enthält. Die N-terminale Schutzgruppe wird dann durch die vorher beschriebene katalytische Hydrogenolyse entfernt, wodurch das freie N-terminale Aminotripeptid oder -polypeptid erhalten wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren, das aus den aufeinanderfolgenden Stufen der Kupplung einer M-geschützten Aminosäure der Formel I mit einer weiteren Aminosäure oder einem Aminopeptid mit anschließender katalytischer Hydrogenolyse der acetylenischen Schutzgruppe aus dem Kupplungsprodukt besteht, kann also zur Synthese von Peptiden mit jeder gewünschten Kettenlänge und jeder gewünschten Aminosäurezusammensetzung angewandt werden.

Das hierin beschriebene Verfahren zur Synthese von Peptiden ist wegen der günstigen Eigenschaften und Vorteile der Alkinylcarbinyloxycarbonylamino-Schutzgruppe eine besonders vorteilhafte Methode. Wie bereits erwähnt, läßt sich diese Schutzgruppe durch

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katalytische Hydrogenolyse bei neutralem pH-Wert leicht entfernen. Infolgedessen bleiben andere säure- oder baselabile Schutzgruppen des erzeugten Peptids intakt, wenn die acetylenische Schutzgruppe entfernt wird. Die erfindungsgemäße N-Schutzgruppe läßt sich auch in Gegenwart von schwefelhaltigen funktioneilen Gruppen leicht entfernen.

In vielen Fällen kann die Alkinylcarbinyloxycarbonyl-Schutzgruppe wegen ihrer Labilität gegen katalytische Hydrogenolyse in Gegenwart von anderen Schutzgruppen, die selbst durch katalytische Hydrogenolyse entfernbar sind, selektiv entfernt werden. Zwei solche häufig verwendeten Schutzgruppen sind die Benzylgruppe und die Benzyloxycarbonylgruppe (Carbobenzoxygruppe). Wenn beispielsweise N-Carbobenzoxy-L-methionylglycinäthylester Hydrogenolysebedingungen (1,1 g Verbindung in 25 ml Methanol, das 3 ml In HCl enthält, in Gegenwart von 0,3 g 5 % Pd/C) unterworfen wird, wird nach 4 Stunden das Ausgangsmaterial zurückgewonnen. Unter den gleichen Hydrogenolysebedingungen liefert N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-L-methionylglycinäthylester L-Methionylglycinäthylester in einer Ausbeute von etwa 80 %.

Die erfindungsgemäße Alkinylcarbinyloxycarbonyl-Schutzgruppe kann aus dem Peptidprodukt, einer Verbindung der Formel III, auch durch saure Hydrolyse entfernt werden. Die saure Spaltung kann durch Umsetzung des N-geschützten Peptids mit Trifluoressigsäure oder mit einer In Lösung von Chlorwasserstoff in Eisessig durchgeführt werden. Wenn also das N-geschützte Peptid der Formel III das

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gewünschte Endprodukt des erfindungsgemäße Syntheseverfahrens ist, können weitere säurelabile Schutzgruppen gleichzeitig mit der sauren Entfernung der Alkinylcarbinyloxycarbonylgruppe entfernt werden. Zusammen mit der sauren Abspaltung der Alkinylcarbinyloxycarbonylgruppe können solche gewöhnlich verwendeten blockierenden Gruppen wie die t.-Butyloxycarbonylgruppe, die O-t.-Butylgruppe und die t.-Butylestergruppe entfernt werden.

Wenn dagegen die Verbindung der Formel III ein Zwischenprodukt bei der Synthese eines Peptids mit höherem Molekulargewicht ist, kann eine selektive Entfernung der Alkinylcarbinyloxycarbonylgruppe durch katalytische Hydrogenolyse in der vorher beschriebenen Weise erreicht werden, wobei solche säurelabilen Schutzgruppen wie die t.-Butylather- und -ester-und t.-BOC-geschützte Aminogruppen für weitere Kupplungsreaktionen intakt bleiben.

Eine bevorzugte blockierende Gruppe nach der Erfindung ist die S-Methyl-l-butin-a-oxycarbonyl-Schutzgruppe der Formel

CH₃ O

I Il

H-CSC-C-O-C-

OHL·

Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung weiter erläutert.

209844/1173

Beispiel 1

L-Asparagyl-L-phenylalaninamid (wie von Morely, J. Chem. Soc. 1966, 555, beschrieben hergestellt) wird mit N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)~L-methionin-2,4,5-trichlorphenylester in DMF bei O °C in Gegenwart von Triäthylamin zu N-(3-Methyl— l-butin-3-oxycarbonyl)-L-methionin-L-aspartyl-L-phenylalaninamid in 61 % Ausbeute umgesetzt. Das so erhaltene Produkt wird in 80-prozentiger Essigsäure gelöst, und die Lösung wird 2,5 Stunden bei Raumtemperatur und einem Wasserstoffdruck von einer Atmosphäre in Gegenwart von 5 % Palladium-auf-Kohle hydriert, wodurch das Tripeptid L-Methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid in 62 % Ausbeute erhalten wird.

Beispiel 2

Das in Beispiel 1 hergestellte Tripeptid wird dann mit N-p-Methyl-l-butin-S-oxycarbonyl)-L-tryptophan-2,4,5-trichlorphenylester (Formel I) in DMF als Lösungsmittel in Gegenwart von Triäthylamin bei einer Temperatur zwischen etwa -2O und O C zu dem N-geschützten Tetrapeptid der Formel III N-(3-Methyl-lbutin-3-oxycarbonyl)-L-tryptophyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid umgesetzt. Die katalytische Hydrogenolyse des N-blockierten Tetrapeptids an 5 % Palladium-auf-Kohle bei Raumtemperatur liefert das bekannte Tetrapeptid Tetragastrin.

In den vorhergehenden Beispielen 1 und 2 wird die Kupplung der ri-geschützten Aminosäure mit den Aminopepticlen mit Hilfe des aktiven Esters der N-geschützten Aminosäure durchgeführt. Alternativ kann die Kupplung

20984 4/117 3

nach anderen Standardmethoden erfolgen, zum Beispiel durch Umsetzung eines gemischten Anhydrids der N-geschützten Aminosäure mit dem Aminopeptid.

Beispiel 3

Die Verbindungen der Formel I in Form von Aminsalzen, zum Beispiel den Dicyclohexylaminsalzen, können mit anderen Aminosäuren oder Aminopeptiden gekuppelt werden, indem die Kupplungsreaktion mit dem Kondensationsmittel Dicyclohexylcarbodiimid durchgeführt wird. Beispielsweise wird das Dicyclohexylaminsalz von N-p-Methyl-l-butin-S-oxycarbonyl)-L-methionin mit ß-Benzyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylesterhydrochlorid in einem inerten Lösungsmittel, zum Beispiel den chlorierten Kohlenwasserstoffen und vorzugsweise Methylenchlorid in Gegenwart von 1 Äquivalent Dicyclohexylcarbodiimid zu dem N-geschützten Peptid der Formel III N- O-Methyl-l-butin-a-oxycarbonyD-L-methioninß-benzyl-L-asparty1-L-phenylalaninmethylester umgesetzt. Die katalytische Hydrogenolyse des so hergestellten blockierten Peptids an 5 % Pd/C liefert das Tripeptid L-Methionin-(ß-benzyl)-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester, das als kristallines Hydrochloridsalz isoliert werden kann.

Die N-geschützten Aminosäuren und N-geschützten Peptide nach der Erfindung sind zur Herstellung einer großen Zahl von Peptiden vorteilhaft. Beispielsweise können sie bei der Synthese von Peptidfragmenten zur Herstellung des hypoglycämischen Mittels Glucagon verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen und das erfindungsgemäße Verfahren können auch zur Synthese von solchen bekannten Peptiden wie Oxytocin, Vasopressin,

20984A/ 1173

Secretin, Insulin, Gastrin, Proinsulin, Thyrocalcitonin, Corticotropin freisetzendem Faktor (CFR) ■, adrenocorticotropem Hormon (ACTH), Caeurulin und Cholecystokinin verwendet werden.

In der folgenden Tabelle III sind beispielhafte Peptide der Formel II, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt sind, aufgeführt. Zur Abkürzung wird die Nomenklatur verwendet, die für Aminosäuren und Peptide von der IUPAC - IUB Commission on Biochemical Nomenclature empfohlen wird. Die 3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl-Schutzgruppe, eine bevorzugte acetylenische blockierende Gruppe nach der Erfindung, ist für solche der Formel I und II beispielhaft und durch die Abkürzung MBOC (Methylbutinyloxycarbony1) wiedergegeben. Die Abkürzung PBOC bezeichnet die 3-Methyl-l-phenyl-l-butin-3-oxycarbonylgruppe und ECOC die l-Äthinylcyclohexyl-1-oxycarbony!-Schutzgruppe.

209844/1 173

Tabelle III

Alkinylcarbinyloxycarbonyl-geschützte Peptide

Nr. Peptid

1. MBOC-L-Trp-L-Leu-inethylester

2. MBOC-O-t-butyl-L-Ser-L-Arg-L-Arg-L-Ala-Gln-8-t-butyl-L-Asp.2HCl

3. MBOC-S-benzhydryl-L-Cys-Gly-äthylester

4. MBOC-S-trityl-L-Cys-Gly-äthylester

5. MBOC-L-Phe-S-trityl-L-Cys-Gly-äthylester

6. MBOC-L-Trp-L-Met-L-Asp-L-Phe-amid

7. MBOC-L-Met-L-Asp-L-Phe-amid

8. MBOC-L-Met-L-Asn-di-O-t-butyl-L-Thr

9. MBOC-L-Phe-L-Val-L-Gln-L-Trp-L-Leu-L-Met-L-Asn-di-O-t-butyl-L-Thr

10. MBOC-L-Phe-L-Val-L-Gln-L-Trp-L-Leu

11. PBOC-L-Met-L-Asn-di-O-t-buty1-L-Thr²

12. ECQC-L-Met-L-Asn-di-O-t-butyl-L-Thr³

13. MBOC-O-t-buty1-L-Ser-L-Arg-L-Arg-L-Ala-L-Gln-L-Trp-L-Leu-L-Met-L-Asn-di-O-t-butyl-L-threoninat .2HCl

14. MBOC-O-t-buty1-L-Ser-L-Ala-L-Glu-L-Ala-L-Phe-L-Pro-L-Leu-Glu-L-Phe

15. MBOC-S-benzyl-L-Cys-O-t-butyl-L-Ser-L-Asn-L-Leu-O-tbutyl-L-Ser-L-Thr

16. MBOC-L-His-L-Ser-L-Asp-Gly-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Glu-L-Leu-L-Ser-L-Arg-L-Leu-L-Arg-L-Asp

17. MBOC-L-Lys-L-Arg-L-Pro-L-Pro-Gly-L-Phe-L-Ser-L-Pro-L-Phe-L-Arg

18. MBOC-O-t-buty1-L-Tyr-O-t-butyl-L-Ser-Epsilon-t-BOC-L-Lys-O-t-butyl-L-tyr-L-Leu-ß-O-t-butyl-L-Asp-säure

1/MBOC = S-Methyl-l-butin-S-oxycarbonyl

2/PBOC = l-Phenyl-S-methyl-l-butin-S-oxycarbonyl

3/ECOC = l-Äthinylcyclohexyl-l-oxycarbonyl

2098 /♦ A/1173

Die alkinylcarbinyloxycarbonyl-geschützten Peptide,die in Tabelle III aufgeführt sind, liefern bei katalytischer Hydrogenolyse in der vorher beschriebenen Weise die -Aminopeptide in ausgezeichneten Ausbeuten. Beispielsweise liefert das mit Nr. 6 bezeichnete N-geschützte Tetrapeptid das Peptid Tetragastrin in 66 % Ausbeute.

Die mit Nr. 11 und 12 bezeichneten N-geschützten Tripeptide in Tabelle III liefern bei katalytischer Hydrogenolyse das 27-29-Peptidfragment von Glucagon in Ausbeuten von über 60 %. Dieses Fragment wurde in einer Ausbeute von 84 % bereits von E.Wunsch et al., Chem. Ber. 98, 803 (1965) synthetisiert.

Ebenso wird das 22-26-Fragment von Glucagon in ausgezeichneter Ausbeute durch Hydrogenolyse des N-geschützten Pentapeptids No. 10 sowie das 22-29-Octapeptidfragment von Glucagon aus Verbindung Nr. 9 erhalten.

Beispiel 4

Das 22-26-Glucagonpeptidfragment wird folgendermaßen hergestellt. N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-L-phenylalanyl-N-hydroxysuccinimidester wird mit L-Valyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-leucin in DMF als Lösungsmittel bei einer Temperatur von etwa -5 bis 10 C umgesetzt. Die Reaktionsmischung wird langsam auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und dann etwa 80 bis 90 Stunden durch Rühren bewegt, wodurch N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-L-phenylalanyl-L-valyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-leucin erhalten wird. Das so erzeugte N-geschützte Pentapeptid wird dann mit dem Tripeptidfragment L-Methionyl-L-asparaginyl- <ii-0-t-butyl-L-threoninat in einem Lösungsmittel win DNF über die in situ Herstellung und UmöfsLzunif dan H-Hydroxvsucainimidesters dar Carboxylgruppe von Ι-·.μκ·ϊμ

in dem Pentapeptid zu dem N-geschützten Octapeptidfragment von Glucagon (22-29) N-O-Methyl-l-butin-S-oxycarbonyl)-L-phenylalanyl-L-valyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-methionyl-L-asparaginyl-di-O-t-butyl-L-threoninat umgesetzt.

Beispiel 5

Das Tripeptidfragment von Glucagon (27-29) wird durch Umsetzung von N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-L-methionin mit L-Asparaginyl-di-O-t-butyl-L-threoninat in Gegenwart des Kupplungsreagens N-Äthoxycarbonyl-2-äthoxy-l_f2-dihydrochinolin (EEDQ) in einem geeigneten Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran oder DMF zu N-(3-Methyll-butin-S-oxycarbonyD-L-methionin-L-asparaginyl-di-O-t-butyl-L-threoninat hergestellt. Die katalytische Hydrogenolyse des N-geschützten Tripeptide liefert das Aminotripeptid zur Kupplung mit dem oben beschriebenen N-geschützten Pentapeptidfragment.

Dünnschichtchromatogramme werden in aufsteigender Technik in den angegebenen Lösungsmittelsystemen auf vorbeschichteten Platten mit einer 0,25 mm dicken Kieselgelschicht durchgeführt, die von der Firma Brinkmann Instruments, Inc., Westbury, N.Y. 11590 erhältlich sind.

Die Herstellung von acetylenischen Halogenameisensäureestern und aktiven Phenylkohlensäureestern wird durch die folgenden Beispiele 6 bis 10 erläutert.

Beispiel 6 l-Phenyl-S-methyl-l-butin-S-yl-phenylcarbonat

Eine Lösung von 16 g (0,1 Mol) 1-Phenyl-3-methy1-1-butin-3-ol und 12 ml Pyridin in 100 ml Methylenchlorid wird auf -10 ⁰C abgekühlt und tropfenweise mit einer Lösung von 15,2 ml Phenylchlorformiat in 50 ml Methylenchlorid versetzt. Nach beendeter Zugabe wird die Mischung 7 Stunden bei 0 ⁰C gerührt und über Nacht bei 4 ⁰C aufbewahrt. Die Mischung wird in 150 ml Eiswasser gegossen und die Methylenchloridschicht wird abgetrennt. Die wässrige Schicht wird mit 75 ml Methylenchlorid extrahiert. Die organischen Schichten werden vereinigt, zweimal mit 100 ml Wasser gewaschen, über wasserfreiem Na₃SO₄ getrocknet und im Vakuum zu einem öl eingedampft. Umkristallisieren aus 100 ml Petroläther (Siedebereich 30 bis 60) liefert 12,5 g (44,6 %) 1-Phenyl-S-methyl-l-butin-S-yl-phenylcarbonat, Schmp. 61,5 - 63 ⁰C.

Beispiele 7 und 8

Nach der allgemeinen Arbeitsweise von Beispiel 6 werden weitere Pheny!kohlensäureester wie folgt hergestellt:

3-Methyl-l-butin-3-yl-2,4,5-trichlorphenyl-carbonat durch Umsetzung von 2,4,5-Trichlorphenylchlorformiat in Methylenchlorid mit 3-Methyl-l-butin-3-ol und Pyridin in Methylenchlorid. Schmelzpunkt 82 - 82,5 ⁰C.

Analyse ber. für C₁₃HgO₃₃

theor.: C 46,95; H 2,94; 0 15,62; Cl 34,59 gef.: C 46,65; H 3,02; 0 15,82; Cl 34,51.

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3-Methyl-l-pentin-3-y1-2,4,5-trichlorphenyl-carbonat durch Umsetzung von 2,4,5-Trichlorphenylchlorformiat in Methylenchlorid mit 3-Methyl-l-pentin-3-ol und Pyridin in Methylenchlorid. Schmelzpunkt 55 - 57 ⁰C.

Analyse ber. für C₁₃H₁-O₃Cl₃ : theor.: C 48,55; H 3,45; Cl 33,08; gef.: C 48,38; H 3,69; Cl 33,42.

Beispiel 9 S-Methyl-l-butin-S-oxycarbonylchlorid

Eine Lösung von 40 g (2,45 Mol)Phosgen in 400 ml Benzol wird tropfenweise mit einer Lösung von 8,9 g (0,106 Mol) 3-Methyl-l-butin-3-ol und 12 g (0,152 Mol) Pyridin in 200 ml Benzol und 400 ml Äther versetzt. Die Zugabe erfolgt tropfenweise in einer Zeit von 2 Stunden unter Rühren und soviel Kühlung, daß die Temperatur unter 20 ⁰C gehalten wird. Die Mischung wird weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, das Pyridinhydrochlorid wird abfiltriert und das Filtrat wird in 500 ml Eiswasser gegossen. Die organische Schicht wird abgetrennt, mit 500 ml Wasser gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum zu einem öl eingedampft. Das öl wird ohne weitere Reinigung verwendet.

Beispiel 10

Nach der allgemeinen Arbeitsweise von Beispiel 9 wird folgende Verbindung hergestellt:

l-Äthinyl-l-cyclohexanyloxycarbonylchlorid durch Umsetzung von 1-Äthinyl-l-cyclohexanol und Pyridin in einer Mischung von Benzol und Äther mit einer Lösung von Phosgen in Benzol.

209844/1 1 73

Beispiel 11

N-(l-Äthinyl-l-cyclohexanyloxycarbonyl)-L-methionin-

dicyclohexy!aminsalz

Eine Lösung von 11,6 g (77,8 mMol) L-Methionin und 11,0 g (104 mMol) Na₃CO₃ in 165 ml Wasser mit einer Temperatur von 0 bis 5 ⁰C wird mit 90 mMol 1-Äthinyl-l-cyclohexanyloxycarbonylchlorid versetzt und die Mischung wird 20 Stunden bei einer Temperatur von 0 bis 5 C gerührt. Die Mischung wird dreimal mit Äther extrahiert und die wässrige Lösung wird mit cone. HCl auf pH 1 angesäuert. Das öl wird dreimal mit je 100 ml Äthylacetat extrahiert und die Extrakte werden dreimal mit jeweils 100 ml Wasser und 10-prozentiger NaCl-Lösung gewaschen und über wasserfreiem Na₃SO₄ getrocknet. Das Äthylacetat wird im Vakuum verdampft, das verbleibende öl wird in 100 ml Äther gelöst und es werden 14 g (77,3 mMol) Ν,Ν-Dicyclohexylamin zugesetzt. Der Äther wird im Vakuum verdampft. Das erhaltene öl wird dreimal mit Petroläther (Siedebereich 30 bis 60) verrieben und aus Äther/Pentan zu 18,23 g (52,2 %) Produkt umkristallisiert. Schmelzpunkt 119 - 121 ⁰C.

Analyse ber. für C₂₆H₄₄N₃O₄S:

theor.: C 64,97; H 9,23? N 5,83; S 6,67; gef.: C 64,94; H 9,25; N 5,74; S 6,93.

Beispiele 12 und 13

Nach der allgemeinen Arbeitsweise von Beispiel 11 werden unter Verwendung entsprechender Reaktionsteilnehmer folgende Verbindungen hergestellte

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N-O-Methyl-l-butin-S-oxycarbonyl)-L-phenyialanindicyclohexylaminsalz durch Umsetzung einer wässrigen Lösung von Na₃CO₃ und L-Phenylalanin mit 3-Methyl-1-butin-3-oxycarbonylchlorid und anschließende Umsetzung mit Dicyclohexylamin. Schmelzpunkt 205 - 206 C. /alpha_/ " + 44,351 (C_# 2% MeOH).

N-O-Methyl-l-butin-S-oxycarbonyl)-L-methionin-dicyclohexylaminsalz durch Umsetzung einer wässrigen Lösung von L-Methionin und Na₃CO₃ mit 3-Methyl~l-butin-3-oxycarbonylchlorid und anschließende Umsetzung mit Dicyclohexylamin. Schmelzpunkt 117 - 119 ⁰C.

Analyse ber. für C₂₃H₄₀N₂O₄S: theor.: C 62,69; H 9,15; N 6,36; S 7,28; gef.: C 62,79; H 9,00; N 6,38; S 7,55.

Beispiel 14 N-(3-Methvl-l-butin-3-oxycarbonyl)-D-alpha-phenylglycin-

dicyclohexylaminsalz

Eine Mischung von 9,06 g (60 mMol) D-Phenylglycin, 20,5 g (69 mMol) 3-Methyl-l~butin-3-yl-2,4,5-trichlorphenylcarbönat, 21 ml (150 mMol) Triäthylamin, 48 ml Wasser und 72 ml t-Butanol wird 2 Stunden auf 60 - 65 ⁰C erwärmt. Die Lösung wird im Vakuum zu einem öl eingedampft, das öl wird mit 100 ml Wasser versetzt und der pH-Wert der Mischung wird mit 10-prozentiger Zitronensäure auf 3 eingestellt. Das Öl wird mit 150 ml Äthylacetat extrahiert und der Extrakt wird mit 10-prozentiger NaCl-Lösung gewaschen und fünfmal mit je 100 ml konzentrierter NaHCO₃-

2 0 9 0 /₊.; / 1 1 7 3

Lösung extrahiert. Die Bicarbonatschicht wird mit 10-prozentiger Zitronensäurelösung auf pH 3 angesäuert, das öl wird mit 150 ml Äthylacetat extrahiert und der Extrakt wird über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet. Das Äthylacetat wird im Vakuum zu einem öl eingedampft. Das öl wird in 100 ml Äther gelöst und mit einer Lösung von 10,8 g (60 mMol) Dicyclohexylamin in 50 ml Äther behandelt. Bei langsamer Zugabe von 100 ml Pentan scheidet sich ein kristalliner Niederschlag ab, der nach 2 Stunden abfiltriert wird. Es werden 19,5 g (73,5 % ) Produkt erhalten. Schmelzpunkt 138 - 140 ⁰C.

/" - 76,62 (C, 2 MeOH).

Elementaranalyse ber. für ^₂₆H₃QN₂O₄:

theor. C 70,56; H 8,65; N 6,33; 0 14,46; gef.: C 70,46; H 8,87; N 6,42; 0 14,31.

Beispiele 15 bis 20

Nach der allgemeinen Arbeitsweise von Beispiel 14 werden unter Verwendung geeigneter Reaktionsteilnehmer folgende weitere Verbindungen hergestellt:

N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-L-tryptophan-dicyclohexylaminsalz durch Umsetzung einer Mischung von 3-Methyl-l-butin-3-yl-2,4,5-trichlorphenylcarbonat und L-Tryptophan und anschließende Erzeugung des Dicyclohexylaminsalzes. Schmelzpunkt 178,5 - 180 ⁰C.

Analyse ber. für ^C2q^H42^N3°4^:

theor.: C 70,27; H 8,34; N 8,48; 0 12,91; gef.: C 70,02; H 8,59; N 8,69; 0 12,78.

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N-(S-Methyl-l-butin-S-oxycarbonyl)-L-glutamin-dicyclohexylaminsalz durch Umsetzung einer Mischung von 3-Methyll-butin-3-yl-2,4,5-trichlorphenylcarbonat und L-Glutamin und anschließende Erzeugung des Dicyclohexylaminsalzes. Schmelzpunkt 152 - 154 ⁰C.

Analyse ber. für C-^HoqN-jO,-

theor.: C 63,13; H 8,98; N 9,60; gef.: C 62,98; H 8,97; N 9,70.

N-O-Methyl-l-butin-S-oxycarbonyl)-L-valin-dicyclohexylaminsalz durch Umsetzung von L-Valin mit 3-Methyll-butin-3-yl-2,4,5-trichlorphenylcarbonat und anschließende Erzeugung des Dicyclohexylaminsalzes. Schmelzpunkt 128 - 128 ⁰C.

Analyse ber. für ^C23^H4o^N2°4^:
theor.: C 67,61; H 9,87; N 6,86; gef.: C 67,86; H 9,80; N 6,61.

N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-L-methionindicyclohexylaminsalz durch Umsetzung von L-Methionin mit 3-Methyl-l-butin-3-yl-2,4,5-trichlorphenylcarbonat und anschließende Erzeugung des Dicyclohexylaminsalzes, Schmelzpunkt 116 - 118 ⁰C.

Analyse ber. für ^C23^H4o^N2°4^S: theor.: C 62,69; H 9,15; N 6,36; S 7,28; gef.: C 62,58; H 9,40; N 6,17; S 7,23.

2098U/1 173

N-(3-Methylbutiny1-3-oxycarbonyl)-S-trityl-L-cysteindicyclohexylaminsalz durch Umsetzung von S-Trityl-L-cystein mit 3-Methyl-l-butin-3-yl--2,,4,5-trichlorphenylcarbonat und anschließende Erzeugung des Dicyclohexylaminsalzes. Schmelzpunkt 177,5 - 179 ⁰C.

Analyse ber. für C₄₀H₅₀N₂O₄S.: theor.: C 73,75; H 7,70; N 4,28; O 9,77.; S 4,89; gef.: C 72,70; H 8,00; N 4,39; 0 10_y22;S 4,80.

N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-(0-tert.-butyl)-L-serin-dicyclohexylaminsalz durch Umsetzung von 0-tert.-Butyl-L-serin mit 3-Methyl-l-butin-3-y1-2,4,5-trichlorphenylcarbonat und anschließende Erzeugung des Dicyclohexylaminsalzes. Schmelzpunkt 146 - 148 Co

Analyse ber. für ^C25^H44^N2°5^:
theor.: C 66,34; H 9,80; N 6,19; gef.: C 66,12; H 9_f7O; N 6,21.

Beispiel 21

l-Phenyl-S-methyl-l-butin-S-oxycarbonyl-L-methionin-dicyclo-

hexylamiasalz

Eine Lösung von 1,49 g (10 mMol) L-Methionin in 4,7 ml Triton (40 % in Methanol) wird im Vakuum zu einem öl eingedampft. Das öl wird zweimal mit 8 ml DMF behandelt, wobei jedesmal im Vakuum eingedampft wird. Der Rückstand wird mit einer Lösung von 2,8 g (10 mMol) l-Phenyl-3-methyl-lbutin-3-yl-phenylcarbonat in 8 ml DMF versetzt und die

209 844/1173

Mischung wird 65 Stunden lang gerührt. Die Lösung wird zu 90 ml Wasser gegeben und nach 5 Minuten langem Rühren zweimal mit je 35 ml Äther extrahiert. Die wässrige Schicht wird mit Zitronensäure bei O C auf pH 3 angesäuert und 30 Minuten lang gerührt. Der Feststoff wird abfiltriert, in 75 ml Äther gelöst und über wasserfreiem Na2S0. getrocknet. Die getrocknete Ätherlösung wird im Vakuum zu einem öl eingedampft. Das Öl wird in 75 ml Äther gelöst und die Lösung wird mit 1,81 g (10 mMol) NjN-Dicyclohexylamin behandelt und 2,5 Stunden bei 4 C aufbewahrt. Der kristalline Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet, wodurch 3,36 g (65 %) Produkt erhalten werden. Schmelzpunkt 132 - 133,5 ⁰C.

Elementaranalyse ber. für C-QH₄₄N^O₄S:

theor.: C 67,41; H 8,58; N 5,42; S 6,20; gef.: C 67,51; K 8,7ü; N 5,31; S 6,25.

Die folgenden Beispiele erläutern dia Herstellung aktiver Ester von alkinylcarbinyloxycarbonylgeschützten Aminosäuren.

Beispiel 22

2,4,5-Trichlorphenyl-N-(3-methyl-l-butin-3-oxycarbonyI)-L-

tryptophinat

Eine Mischung von 4,08 g (20 mMol) L-Tryptophan, 6,84 g (23 mMol) 3-Methyl-l-butin-3-yl-2,4,5-trichlorphenylcarbonat, 7 ml (50 mMol) Triäthylamin, 16 ml Wasser und 24 ml t-Butanol wird 1,75 Stunden unter Rühren auf 60 bis 65 ⁰C erwärmt. Die Lösung wird im Vakuum zu einem

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dicken Sirup eingedampft _t der mit 30 ml Wasser versetzt und mit einer 10-prozentigen Lösung von Zitronensäure auf pH 3 angesäuert wird. Die angesäuerte Lösung wird zweimal mit je 50 ml Äthylacetat extrahiert und der Extrakt wird zweimal mit je 50 ml 10-prozentiger Salzlösung gewaschen. Der gewaschene Extrakt wird getrockent und im Vakuum zu einem öl eingedampft. Das Öl wird in Äthylacetat (60 ml) gelöst und die Lösung wird auf 0 ⁰C gekühlt. Die kalte Lösung wird mit 4,28 g (21 mMol) NjN-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und die Mischung wird über Nacht gerührt und auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff wird abfiltriert und das Filtrat wird im Vakuum zu einem öl eingedampft. Umkristallisieren aus Äthylacetat/Pentan liefert 7,74 g (78,5 %) Produkt. Schmelzpunkt 123 - 125 ⁰C.

Elementar analyse ber. für C₂₃H₁QN₂OXl₃: theor.: C 55,95; H 3,88; N 5,67; Cl 21,54; gef.: C 55,88; H 4,08; N 5,65; Cl 21,26.

Beispiele 23 bis 26

Nach der allgemeinen Arbeitsweise von Beispiel 22 werden unter Verwendung geeigneter Reaktionsteilnehmer folgende weitere Verbindungen hergestellt;

2,4,5-Trichlorphenyl-N-(3-methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-D-alpha-phenylglycinat durch Umsetzung von D-alpha-Phenylglycin mit S-Methyl-l-butin-a-yl-a^S-trichlorphenylcarbonat und anschließende Umsetzung des erhaltenen Produkts mit NiN-Dicyclohexylcarbodiimid. Schmelzpunkt 69 - 71 ⁰C.

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Analyse ber. für C₂₀H₁₆NO₄Cl₃:

theor.: C 54,37; H 3,54; N 3,27; Cl 24,23; gef.: C 54,72; H 3,95; N 3,42; Cl 24,20.

2,4,5-Trichlorphenyl-N-(S-methyl-l-butin-S-oxycarbonyl)-S-benzyl-L-cysteinaz durch Umsetzung von S-Benzyl-L-cystein mit 3-Methyl-l-butin-3-yl-2,4,5-trichlorphenylcarbonat und Umsetzung des so erhaltenen Produkts mit Ν,Ν-Dicyclohexylcarbodiimid. Schmelzpunkt 59 - 62 ⁰C.

Analyse ber. für C₂₃H₂₀₄₃

theor.: C 52,76; H 4,03; N 2,80; 0 12,78; Cl 21,24; S 6,40; gef.: C 52,66; H 4,26; N 2,99; 0 11,75; Cl 22,23; S 6,67.

2,4,5-Trichlorphenyl-N-(3-methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-S-benzhydryl-L-cysteinat durch Umsetzung von S-Benzhydryl-L-cystein mit 3-Methyl-l-butin-3-yl-2,4,5-trichlorphenylcarbonat und anschließende Umsetzung des so erhaltenen Produkts mit N^-Dicyclohexylcarbodiimid. Schmelzpunkt 128 - 131 ⁰C.

Analyse ber. für C₂₈H₂₄NO₄Cl₃S:

theor.: C 58,29; H 4,19; N 2,43; 0 ll,09;Cl 18,44; S 5,56; gef.: C 58,59; H 4,45; N 2,59; 0 1O,83;C1 18,31; S 5,39.

2,4,5-Trichlorphenyl-N-(3-methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-L-methioninat durch Umsetzung von L-Methionin mit 3-Methyl-l-butin-3-yl-2,4,5-trichlorphenylcarbonat und anschließende Umsetzung des so erhaltenen Produkts mit Ν,Ν-Dicyclohexylcarbodiimid. Schmelzpunkt 97 - 98 °C.

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Analyse ber. für C₁₇H₁₈NO₄Cl₃S: theor.: C 46,54; H 4,14; N 3,19; 0 14,59; Cl 24,24; S 7,31; gef.: C 46,48; H 4,30; N 3,38; 0 14,40; Cl 24,09; S 7,59.

Beispiel 27 N-Hydroxysuccinimidester von N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl) L-phenylalanin

4,56 g (0,01 Mol) N-p-Methyl-l-butin-S-yl-S-oxycarbonyl)-L-phenylalanin-N^-dicyclohexylaminsalz werden in 20 ml Äthylacetat suspendiert und die Lösung wird zweimal mit je 20 ml 10-prozentiger Zitronensäure und 20 ml 10-prozentiger Salzlösung geschüttelt. Die gewaschene Lösung wird über wasserfreiem Na₃SO₄ getrocknet und dann im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in 25 ml THF gelöst und die Lösung wird mit 1,15 g (0,01 Mol) N-Hydroxysuccinimid und anschließend mit 2,06 g (0,01 Mol) N^-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Die Mischung wird 3 Stunden bei 0 ⁰C gerührt und dann über Nacht bei 4 ⁰C aufbewahrt. Der Dicyclohexy!harnstoff wird abfiltriert und das Filtrat wird im Vakuum zu einer schaumigen Substanz eingedampft. Umkristallisieren des Produkts aus Chloroform/Petroläther (Siedebereich 30 - 60 ) ergibt 3,0 g (78 %) Produkt. Schmelzpunkt 128 - 130 ⁰C.

Elementaranalyse ber. für C_1nH₀^N₀Q,:

Xy ΔΌ i. 0

theor.: C 61,28; H 5,41; N 7,52; 0 25,78. gef.: C 61,07; H 5,68; N 7,79; 0 25,50.

Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Peptidsyntheseverfahren zur Herstellung von Peptiden der Formel III.

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Beispiel 28

N-<3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-L-tryptophyl-L-leucin-

methy!ester

37,18 g (75 mMol) N-(3-Methyl-1-butin-3-oxycarbonyl)-L-tryptophan-dicyclohexylaminsalz werden in 150 ml Äthylacetat suspendiert und die Suspension wird zweimal mit je 100 ml 10-prozentiger Zitronensäurelösung und 10-prozentiger Natriumchloridlösung geschüttelt. Die gewaschene Lösung wird dann über Na₃SO₄ getrocknet und die getrocknete Lösung wird im Vakuum zu einem öl eingedampft. Das öl wird in 50 ml DMF gelöst und die Lösung wird auf -15 C gekühlt. Die kalte Lösung wird zu einer vorher bereiteten Lösung von 9,10 g (50 mMol) L-Leucinmethylesterhydrochlorid und 5,5 ml (50 mMol) N-Methylmorpholin in 50 ml DMF mit -15 ⁰C gegeben. Die Mischung wird über Nacht bei -13 ⁰C gerührt und mit einer Lösung von 2,1 g (25 mMol) NaHCO₃ in Wasser behandelt. Nach mehreren Stunden wird die Lösung unter Rühren in 1,5 1 einer kalten Natriumchloridlösung gegossen. Die erhaltene gummiartige Substanz wird mit 500 ml Äthylacetat extrahiert und der Extrakt wird zweimal mit 200 ml 1 η NaHCO₃ -Lösung und dreimal mit 200 ml Wasser gewaschen und dann über Na₃SO₄ getrocknet. Der getrocknete Extrakt wird im Vakuum eingedampft und der Rückstand wird aus Äther/Petroläther zu 14,11 g Produkt in Form eines amorphen Feststoffs umkristallisiert. TLC, ein Fleck (Chlor-Toluidin); R_f 0,81 /CHCl₃: MeOH: HOAc (75:24:1)_/; NMR (CDCl₃) delta 0,84 (M,7,gamma CH₃ und gamma CH Leu), 1,43 (M,2,BCH₃ Leu), 4,52 (g alphaCH Trp), 5,41 (M, alphaCH Leu), 6,13 (d, alphaNH Trp), 8,30 (M, alpha-NH Leu).

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Elementaranalyse ber. für C₂₄H₃₁N₃O₅:

theör.: C 65,29; H 7,08; N 9,52; O 18,12; gef.: C 65,36; H 7,20; N 9,68; 0 18,03.

Beispiel 29

N-(S-Methyl-l-butin-S-oxycarbonyl)-O-t-butyl-L-seryl-L-arginyl-L-arginyl-L-alanyl-L-glutaminyl-ß-t-butyl-L-aspartat-

dihydrochlorid

Eine Suspension von 2,53 g N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl) O-t-butyl-L-serin-dicyclohexylaminsalz in Äthylacetat wird mit 10-prozentiger Zitronensäurelösung und dann mit 10-prozentiger Salzlösung geschüttelt. Die gewaschene Lösung wird über Na₂SO₄ getrocknet und dann im Vakuum zu einem öl eingedampft. Das öl wird in 15 ml DMF gelöst und die Lösung wird auf - 15 ⁰C abgekühlt. Die kalte Lösung wird mit 0,61 ml N-Methylmorpholin und 0,69 ml Isobutylchlorformiat versetzt und 15 Minuten bei -15 ⁰C gerührt. Die Reaktionsmischung wird in eine vorher bereitete kalte ( -15 ⁰C) Lösung von 3,05 g (3,5 mMol) L-Arginyl-L-arginyl-L-alanyl-L-glutaminyl-ß-t-butyl-L-aspartat-dihydrochlorid in 25 ml DMF und 5 ml Essigsäure gegossen. Die Mischung wird bei

- 15 ⁰C 4 Stunden lang gerührt und dann 66 Stunden bei

- 15°C aufbewahrt. Nach Zusatz von kaltem Äther (800 ml) wird das Produkt abfiltriert und auf dem Filterkuchen mit Äther und einer gesättigten Natrxumchloridlösung gewaschen. Das Produkt wird in Methanol gelöst und die Lösung wird im Vakuum zur Trockne eingedampft. Das verbleibende Produkt wird durch azeotrope Entfernung von Wasser mit 20 ml Benzol getrocknet.Restliehe Salzspuren werden

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durch Lösen des getrockneten Produkts in heißem DMF und Filtrieren der heißen Lösung entfernt. Die filtrierte Lösung wird dann im Vakuum eingedampft. Das verbleibende Produkt wird in Methanol gelöst und durch Zugabe von Äther als kristalliner Niederschlag erhalten. Das Produkt wird abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Ausbeute 2,57 g (71,5 %) . TlC (Chlor-Toluidin).; R_f 0,39 ^Butanol: Essigsäure :Wasser (ICX): 10:31/1 NMR (DMSO) delta 1,11 (s, 9 O-t-Butylather), 1,37 (S, 9 O-t-Butylester), 1,60 (S, 6=C(CH₃)₂), 3,41 (S, =C-H); quantitative Aminosäureanalyse, saure Hydrolyse, Asp. (0,96), Ser (0,76), GIu (0,95), AIa (1,00), Arg (1,97).

Elementaranalyse ber. für C..H-,Ν.,O-oCl^J

theor.: C 47,95; H 7,16; N 17,73; 0 20,25; Cl 6,90; gef.: C 47,69; H 7,36; N 17,81; 0 20,50; Cl 6,66.

Beispiel 30 N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-S-benzhydryl-L-cysteinyl-

glycinäthy!ester

Eine Mischung von 2,88 g (5 mMol) N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-S-benzhydryl-L-cystein-2,4,5-trichlorphenylester und 0,7 g (5 mMol) Glycinäthylester in 80 ml Methylenchlorid wird unter Rühren während einer Zeit von 1 Stunde mit einer Lösung von 0,7 ml (5 mMol) Triäthylamin in 20 ml Methylenchlorid versetzt. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel im Vakuum verdampft, wodurch ein öliger Rückstand erhalten wird. Das öl wird in Äthylacetat gelöst und die Lösung wird zur Entfernung von Triäthylaminhydrochlorid filtriert.

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Das Äthylacetatfiltrat wird im Vakuum eingedampft und das erhaltene öl wird aus Äthylacetat/Petroläther urakristallisiert und im Vakuum getrocknet. Ausbeute 1,41 g (58,3 %). Schmelzpunkt 98 - 100 ⁰C.

TLC, ein Fleck (Chlor-Toluidin), R_f 0,82 /CHCl₃: MeOH:

HOAc (75:24:1)_/.

Elementaranalyse ber. für C₂₆H₃-N₂O₅S:

theor.: C 64,61; H 6,27; N 5,80; S 6,64; gef.: C 64,75; H 6,43; N 5,75; S 6,78.

Beispiel 31

Äthyl-N-(3-methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-S-trityl-L-cystein-

glycinat

4,99 g ( 1,63 mMol) N- (3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-S-trityl-L-cystein-dicyclohexylaminsalz und 1,07 g (7,63 mMol) Glycinäthylesterhydrochlorid in 15 ml Methylenchlorid mit 0 ⁰C werden unter Rühren mit 1,57 g (7,63 mMol) N,N-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das Rühren bei 0 ⁰C wird fortgesetzt und dann wird die Reaktionsmischung über Nacht auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Der Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat wird im Vakuum zu einem schaumigen Rückstand eingedampft. Der Schaum wird in 30 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung wird mit jeweils 10 ml 1 η NaHCO.-Lösung, Salzlösung, 10-prozentiger Zitronensäurelösung und 10-prozentiger Salzlösung gewaschen. Die gewaschene Lösung wird über Na₃SO₄ getrocknet, filtriert und im Vakuum zu 3,52 g (82,6 % ) eines weißen flockigen Schaums eingedampft,

209844/1 173

der Kristallisationsversuchen widersteht.

NMR (CDCl₃) 1,25 (t,3,J=7H_z OCH₂CH₃), 1,66 (S,6,C= C(CH₃J₂O), 2,49 (S, 1, H-C=C-), 2,67 (Dublett oder Dubletts, 2, J=6 und 7, H , -CH₀S-), 3,95 (d,2,J=7H

Z^* Z

OCONH-), 6,49 (m,1,CONH-), 7,35 (M,150).

Elementaranalyse ber. für ^C32^H34^N2°5^Si theor.: C 68,80, H 6,14; N 5,O2; 0 14,31; S 5,73; gef.: C 68,56; H 6,42; N 5,00; 0 14,28; S 5,83.

Beispiel 32

Äthyl-N-Q-methyl-l-butin-S-oxycarbonyl)-L-phenylalanyl-S-trityl-L-cysteinylglycinat

Eine Mischung von 1,24 g (2 mMol) Äthyl-S-trityl-L-cysteinylglycinat-tosylatsalz und 0,912 g (2 mMol) N-(3-Methyll-butin-S-oxycarbonyD-L-phenylalanin-dicyclohexylaminsalz in 10 ml Methylenchlorid wird unter Rühren bei 0 ⁰C mit 0,412 g (2 mMol) N^-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das Rühren bei 0 C wird einige Stunden fortgesetzt und dann wird die Reaktionsmischung über Nacht auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Die Mischung wird filtriert und das Filtrat wird im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 40 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung wird filtriert und nacheinander mit 1 η NaHCO^-Lösung,

209844/1173

10-prozentiger NaCl-Lösung, 10-prozentiger Zitronensäure und 10-prozentiger NaCl-Lösung gewaschen. Die gewaschene Lösung wird über Na₃SO₄ getrocknet, filtriert und dann im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus Äthylacetat/Petroläther umkristallisiert. Ausbeute 0,74 g (52,4 %), Schmelzpunkt 181 - 181 ⁰C (Zersetzung).

Elementaranalyse berechnet für C₄-H₄₃N₃OgS:

theor.: C 69,77; H 6,14; N 5,95; O 13,60; S 4,54; gef.: C 69,51; H 6,27; N 6,04; 0 13,71; S 4,67.

Beispiel 33

N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-L-tryptophyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid

Eine Mischung von 1,165 g (2,56 mMol) N-(3-Methyl-lbutin-3-oxycarbonyl)-L-tryptophan-2,4,5-trichlorphenylester, 1,0 g (2,33 mMol) L-Methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamidmonohydrat und 0,26 ml (2,33 mMol) Triäthylamin in 15 ml DMF wird 8 Stunden bei -15 ⁰C und 60 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Während dieser Zeit hat Auflösung stattgefunden. Die Reaktionslösung wird in 50 ml Eiswasser gegossen, und die kalte wässrige Lösung wird mit gesättigter wässriger Zitronensäurelösung auf pH 3 angesäuert. Das Reaktionsprodukt, das als Niederschlag ausfällt, wird abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Das Produkt wird dann in 50 ml absolutem Äthanol zur Entfernung von Wasser und 2,4,5-Trichlorphenol gekocht.

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Das Reaktionsprodukt wird von dem gekühlten Äthanol abfiltriert und im Vakuum über Kaliumhydroxidplätzchen getrocknet. Ausbeute 1,09 g (66 %); Schmelzpunkt etwa 209 - 210 ⁰C (Zersetzung).

Die Dünnschichtchromatographie des Produkts ergibt einen Fleck (Ninhydrin und Chlor-Toluidin); R_f 0,79 mit

THF: C_cH_lo:H_o0, 94:7:5.
Ό i.e. e.

Elementaranalyse ber. für ^C35^H42^N6°8^Si

theor.: C 59,47; H 5,98; N 11,98; 0 18,10; S 4,53; gef.: C 59,15; H 6,21; N 11,87; 0 18,42; S 5,00.

1,01 g (1,42 mMol) des Reaktionsprodukts werden in 20 ml DMF gelöst und 4 Stunden über 0,142 g 5 % Palladium-auf-Kohle hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und mit DMF gewaschen. Das Filtrat wird mit Kohle entfärbt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Das Hydrogenolyseprodukt, L-Tryptophyl-L-methionyl-L-asparty1-L-phenylalaninamid, wird aus 20 ml heißem DMF und 15 ml Äthylacetat umkristallisiert. Ausbeute 0,25 g (17,7 %); Schmelzpunkt etwa 224 - 226 ⁰C. Dünnschichtchroraatogramm: ein Fleck (Ninhydrin und Chlortoluidin); R_f 0,30 mit THF:Cyclohexan:Wasser 94:7:5. Quantitative Aminosäureanalyse nach saurer Hydrolyse in Gegenwart von Thioglycolsäure: Trp (0,99), Asp (1,00),Met (0,93), Phe (0,90).

Elementaranalyse ber. für ^25^H36^N6^6^:

theor.: C 58,37; H 6,08; N 14,08; gef.: C 58,10; H 6,38; N 13,80.

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Beispiel 34

N-(3-Methyl-l~butin-3-oxycarbonyl)-L-methionin-L-aspartyl-L-phenylalaninamid

Eine Mischung von 3,4 g (7,75 mMol) N-(3-Methy1-1-butin-3-oxycarbonyl)-L-methionin-2,4,5-trichlorphenylester und 2,16 g (7,75 mMol) L-Aspartyl-L-phenylalaninamid in 30 ml DMF wird auf O ⁰C gekühlt und unter Rühren mit 1,09 ml Triäthylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wird 9 Stunden bei 0 ⁰C und dann 10 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird in eine Mischung von 115 ml Eiswasser, 0,45 ml Essigsäure und 39 ml Cyclohexan gegossen. Der gummiartige Feststoff wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und dann in 39 ml Äthanol auf eine Temperatur von 50 bis 60 ⁰C erwärmt. Das Reaktionsprodukt wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum über KOH-Plätzchen getrocknet. Ausbeute 2,47 g (61,2 %); Schmelzpunkt etwa 203 - 204 ⁰C (Zersetzung).

Dünnschichtchromatografie: ein Fleck (Chlor-Toluidin); R_f 0,56 mit CHCl₃:MeOH:HOHC, 75:24:1.

Elementaranalyse ber. für C₂₄H₃₃N₄O₇S:

theor.: C 55,37; H 6,20; N 10,76; S 6,16; gef.: C 55,61; H 6,39; N 10,71; S 6,37.

Beispiel 35 L-Methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamidmonohydrat

2,36 g (4,53 mMol) N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl) L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid in 200 ml

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80-prozentiger Essigsäure werden 2,5 Stunden über 0,454 g 5 % Palladium-auf-Kohle hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat wird im Vakuum zu einem öl eingedampft. Der ölige Rückstand wird im Vakuum dreimal mit je 50 ml Benzol azeotrop behandelt, und der erhaltene Feststoff wird in 50 ml Methanol gekocht, abfiltriert und im Vakuum über KOH getrocknet. Ausbeute 1,16 g (62,4 %); Schmelzpunkt 211 - 214 ⁰C.

Elementaranalyse ber. für ^c ₁g^I!26^N4⁰5^SH2^0:

theor.: C 50,45; H 6,59; N 13,08; S 7,48; gef.: C 50,63; H 6,86; N 12,92; S 7,39.

Beispiel 36

N-P-Methyl-l-pentln-S-oxycarbonyl)-L-methionyl-L-asparaginyl-di-0-t.-buty1-L-threoninat

Eine Lösung von 2,27 g (5 mMol) N-(3-Methyl-l-pentin-3-oxycarbonyl)-L-methionin-dicyclohexylaminsalz in 30 ml DMF wird auf -15 ⁰C gekühlt und mit 0,625 ml Pivaloylchlorid behandelt. Die Mischung wird 15 Minuten bei -15 C gerührt und mit einer vorgekühlten (-15 ⁰C) Lösung von 1,55 g (4,5 mMol) L-Asparaginyldi-O-t.-butylthreoninat in 15 ml DMF versetzt. Die Mischung wird 2,5 Stunden bei 0 ⁰C gerührt und mit 15 ml In NaHCO.,-Lösung behandelt. Nach 5 Minuten langem Rühren wird die kalte Lösung in 145 ml 90-prozentige NaCl-Lösung gegossen und 15 Minuten lang gerührt. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und mit Wasser und gesättigter NaHCO₃-Lösung gewaschen. Das Produkt wird in 100 ml Äthylacetat gelöst und zur Entfernung von Dicyclohexylaminhydrochlorid filtriert. Das Filtrat wird zweimal mit

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-59- 22181

je 30 ml 10-prozentiger Zitronensäurelösung und dreimal mit je 50 ml Wasser gewaschen und dann über Na₂SO₄ getrocknet. Das getrocknete Filtrat wird im Vakuum zu 1,65 g eines schaumigen Feststoffs eingedampft. TLC, ein Fleck (Chlor-Toluidin) ; R_f 0,44 /CHCl₃:MeOH:HOAc (75:24:1)_/,

Elementaranalyse ber. für C₂₈H₄₈N₄OgS:

theor.: C 55,98; H 8,05; N 9,33; 0 21,30; S 5,34; gef.: C 56,20; H 8,22; N 9,08; 0 21,01; S 5,54.

Beispiel 37 Herstellung der 22-26-Aminosäuresequenz von Glucaqon

Eine Lösung von 14,68 g (21,2 mMol) N-Carbobenzoxy-L-valyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-leucinmethylester in 600 ml 50-prozentigem wässrigem Dioxan wird mit 21,2 ml (42,4 mMol) 2n Natriumhydroxidlösung versetzt und zur Verseifung des Methylesters 17 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wird durch Zugabe von 21,2 ml In Salzsäure auf pH 5,3 angesäuert. Dann wird der pH-Wert der Mischung mit 10-prozentiger Zitronensäurelösung auf 3,5 eingestellt. Die Reaktionsmischung wird mit 100 ml Wasser unter Rühren verdünnt, und die verdünnte Mischung wird mehrere Stunden bei 4 ⁰C aufbewahrt. Das Reaktionsprodukt wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und über KOH-Plätzchen getrocknet. Das Material zeigt im Dünnschichtchromatogramm auf Kieselgelplatten einen einzigen Fleck (Chlor-Toluidin); R_f 0,56 mit CHCl₃:n-Butanol:Essigsäure:Wasser (75:24:12:2). Das NMR-Spektrum des Produkts zeigt die Abwesenheit von O-Methylresonanz bei 3,6 ppm in DMSO.

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Das verseifte Carbobenzoxytetrapeptid wird in 300 ml DMF gelöst und 5 Stunden über 2,0 g 5 % Pd-auf-Kohle bei Raumtemperatur hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert, und das Filtrat wird im Vakkum eingedampft, wodurch 8,66 g (75,2 %) L-Valyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-leucin als gummiartiger Rückstand erhalten werden. Das Material ergibt bei Dünnschichtchroraatographie auf Kieselgel einen einzigen Fleck; R- 0,37 mit dem Lösungsmittelsystem Äther:Methanol:Wasser (75:24:1). Das NMR-Spektrum zeigt die Abwesenheit von Resonanz, die der Carbobenzoxygruppe entspricht. Die quantitative Aminosäureanalyse des sauren Hydrolysats des deblockierten Tetrapeptids ergibt GIu (1,0), Leu (1,07), VaI (0,96).

Eine Mischung von 6,93 g (12,73 mMol) L-VaIy1-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-leucin, das wie oben beschrieben erhalten wurde, und 5,39 g (14,01 mMol) N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-L-phenylalanin-N-hydroxysuccinimidester in 100 ml DMF wird 5 Stunden bei 0 ⁰C gerührt und dann auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Dann wird die Reaktionsmischung 90 Stunden lang gerührt und hierauf im Vakuum auf ein Volumen von etwa 20 ml eingedampft. Nach Zugabe von Äther wird das Reaktionsprodukt, N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-L-phenylalanyl-L-valyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-leucin, als fester Niederschlag erhalten. Ausbeute 8,48 g (83 %) ; Schmelzpunkt etwa 170 - 175 ⁰C. Das Peptidprodukt wird aus siedendem Methanol/Wasser umkristallisiert und über KOH-Plätzchen getrocknet. Ausbeute 3,3 g (33 %); Schmelzpunkt etwa 207 - 209 ⁰C. Im Dünnschichtchromatogramm zeigt sich ein einziger Fleck (Chlor-Toluidin); R_f 0,44 mit Chloroform!Methanol!Essigsäure (25:24:1); R_f 0,186 mit Tetrahydrofuran!Cyclohexan:Wasser (94:7:5). Das Produkt hat folgendes Kernresonanzspektrum in DMSO:

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delta 0,84 (M, 14, CH₃-VaHn und Leucin, ßCH-Valin, gammaCH-Leucin), delta 1,5 (S,B-CH₀-Leucin), delta 1,53 Iß,6,C C-C(CH₃)₂_/, delta 3,33 (S, C C-H), Delta 10,78 (S, Indol NH, - Tryptophan).

Quantitative Aminosäureanalyse des sauren Hydrolysate; GIu (1,0), Leu (1,04), VaI (0,97), Phe (0,96).

Elementaranalyse ber. für ^C42^H55^N7°g^:

theor.: C 62,91; H 6,91; N 12,23; 0 17,95; . gef.: C 62,72; H 7,00; N 12,23; 0 18,20.

Beispiel 38

Das Hydrochloridsalz des N-geschützten Peptids (3,21 g, 4 mMol) von Beispiel 37 wird in 10 ml DMF gelöst, und die Lösung wird unter Rühren zu einer kalten (0 C) Lösung von 2,57 g (5 mMol) L-Methionyl-L-asparaginyldi-O-t.-butyl-L-threoninat und 0,55 ml (5 mMol) N-Methylmorpholin in 40 ml DMF gegeben. Der Reaktionsmischung, die bei einer Temperatur von etwa 0 C gehalten wird, wird unter Rühren eine Lösung von 0,69 g (6 mMol) N-Hydroxysuccinimid in 5 ml DMF und eine Lösung von 0,824 g (4 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in 5 ml DMF zugesetzt. Die Reaktionsmischung wird 2 Stunden bei 0 ⁰C und 64 Stunden bei Raumtempratur gerührt. Dann wird die Mischung mehrere Stunden auf 0 ⁰C gekühlt, und der Niederschlag aus Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert. Das Filtrat wird im Vakuum auf ein kleines Volumen eingedampft und mit üthylacetat verdünnt. Die verdünnte Reaktionsmischung wird dann mehrere Stunden bei 4 ⁰C aufbewahrt, und das abgeschiedene Produkt wird abfiltriert. Das Produkt wird nacheinander mit Äther und Wasser gewaschen und dann über KOH-Plätzehen

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getrocknet, wodurch 4,38 g N-p-Methyl-butin-S-oxycarbonyl)-L-phenylalanyl-L-valyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-methionyl-L-asparaginyl-di-O-t-butyl-L-threoninat (87 % Ausbeute) vom Schmelzpunkt etwa 221 - 225 ⁰C (Zersetzung) erhalten werden. Das Material zeigt im Dünnschichtchromatogramm auf Kieselgel einen einzigen Fleck (Chlor-Toluidin); R_f 0,88 mit Chloroform!Methanol!Essigsäure (75:24:1). Die quantitative Aminosäureanalyse des sauren Hydrolysats des Produkts liefert folgendes Ergebnis: Asp (1,0), Thr (0,95), GIu (0,99), VaI (0,99), Met (0,97), Leu (1,03) und Phe (0,99).

Elementaranalyse ber. für Cg₃H₉₃N₁₁O₁₄S:

theor.: C 60,03; H 7,44; N 12,22; 0 17,77; S 2,54; gef.: C 59,87; H 7,26; N 12,25; 0 18,04; S 2,44.

Beispiel 39

Das Reaktionsprodukt von Beispiel 38 (MBOC-L-phen-L-val-L-glu-L-trp-L-leu-L-met-L-asp-di-O-t.-butyl-L-thr) wird in 75 ml DMF gelöst und bei Raumtemperatur in Gegenwart von 1,19 g 5 % Pd-C hydriert. Die Hydrogenolyse wird durch Auffangen des entwickelten Kohlendioxids in einer Bariumhydroxidfalle verfolgt. Die Hydrogenolyse ist anscheinend in 1,5 Stunden beendet, wird jedoch 3 Stunden fortgeführt. Der Katalysator wird abfiltriert, und das Filtrat wird mit Kohle entfärbt. Die geklärte Reduktionsmischung wird im Vakuum zu einem Rückstand eingedampft. Der Rückstand wird in DMF gelöst, und das Produkt wird durch tropfenweise Zugabe von Wasser zu der Lösung abgeschieden. Das Produkt wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum über Nacht getrocknet, wodurch 1,77 g (64,7 % Ausbeute) Substanz vom Schmelzpunkt etwa 239 - 240,5 ⁰C (Zersetzung) erhalten werden. Das Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm auf Kieselgel einen einzigen

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Fleck. R_f 0,29 mit Chloroform:Methanol!Essigsäure (75:24:1). Die quantitative Aminosäureanalyse des sauren Hydrolysats des Produkts, L-phe-L-val-glu-L-trp-L-leu-L-met-L-asp-di-O-t-butyl-L-thr, liefert folgendes Ergebnis: Asp (1,13), thr (1,08), glu (1,0), val (0,98), met (1,13), leu (1,05), phe (1,16), trp ( )

Elementaranalyse ber. für Cq^Hov¹*!!⁰!?^'

theor.: C 59,51; H 7,62; N 13,39; 0 16,69; S 2,79; gef.: C 59,62; H 7,85; N 13,15; 0 16,70; S 3,00.

Beispiel 40 Herstellung der 27-29-Aminosäuresequenz von Giucagon

Methode A N-O-Methyl-l-butin-S-oxycarbonyl)-L-methionyl-L-asparaginyl-di-O-tert.-butyl-L-threoninat

8,8 g (0,02 Mol) N-O-Methyl-l-butin-S-oxycarbonyD-L-methionindicyclohexylaminsalz werden in 50 ml Äthylacetat suspendiert, und die Suspension wird einmal mit 40 ml 10-prozentiger Zitronensäurelösung und zweimal mit je 40 ml 10-prozentiger Natriumchloridlösung geschüttelt und dann über wasserfreiem Na₃SO₄ getrocknet. Das Äthylacetat wird im Vakuum verdampft, und das verbleibende öl wird in 40 ml Tetrahydrofuran gelöst. Es werden 6,90 g (0,02 Mol) L-Asparaginyl-di-O-tert.-butyl-L-threoninat und anschließend 4,99 g (0,022 Mol) N-Äthoxycarbonyl-2-äthoxy-l,2-dihydrochinolin (EEDQ) zugesetzt, und die Reaktionsmischung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird im Vakuum zu einem öl eingedampft, und das öl wird in 50 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird dreimal mit je 50 ml 10-prozentiger Zitronensäurelösung und 10 prozentiger Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Na^SO. getrocknet. Das Äthylacetat wird im Vakuum zu einem

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weißen Schaum eingedampft. Der Schaum wird in der Mindestmenge Äther gelöst, und es wird soviel Cyclohexan zugesetzt, daß das Produkt als feines Pulver ausfällt. Der Niederschlag wird abfiltriert, und das Filtrat wird im Vakuum eingedampft. Das erhaltene amorphe Produkt wird gesammelt. Ausbeute 8,3 g (71 %). TLC: 1 Fleck (Ninhydrin und Chlor-Toluidin); R_f 0,76 /Butanol-Essigsäure-Wasser (100:1O:3OJ_/.

Elementaranalyse ber. für ^C27^H46^N4°r^S:

theor.: C 55,27; H 7,91; N 9,55; 0 21,81; S 5,46; gef.: C 55,31; H 8,19; N 9,36; O 21,89; S 5,73.

L-Methionyl-L-asparaginyl-di-0-tert.-butyl-L-threoninat

1,174 g (2 mMol) N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-L-methionyl-Ii-asparaginyl-di-O-tert. -butyl-L-threoninat werden in 50 ml Methanol gelöst. Die Lösung wird mit einer kleinen Menge wasserfeuchtem 5 % Pd/C versetzt, und durch die Lösung wird unter Schütteln 2,75 Stunden lang Wasserstoff geleitet. Der Katalysator wird abfiltriert, und das Filtrat wird im Vakuum zu einem öl eingedampft. Das öl wird nacheinander mit Pentan und Äther verrieben. Verdampfen der Lösungsmittel im Vakuum liefert 0,585 g (61,4 %) eines weißen schaumigen Feststoffs. TLC: 1 Fleck (Ninhydrin und Chlor-Toluidin); R_f 0,56 mit 2-Butanol-3 % NH₃ (3:1).

Elementaranalyse ber. für ^C2i^H4o^N4°6^S:

theor.: C 52,92; H 8,46; N 11,75; S 6,73; gef.: C 52,49; H 8,55; N 10,19; S 6,34.

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Einengen der zum Verreiben verwendeten Lösungsmittel liefert weitere 0,192 g (20 %) Produkt, das mit einer kleinen Menge Ausgangsstoff verunreinigt ist, wie durch TLC festgestellt wird.

Methode B

N-Q-Methyl-l-butin-S-oxycarbonyl)-L-methionyl-L-asparaginyldi-0-tert.-butyl-L-threoninat

Eine Suspension von 4,41 g (10 mMOl) N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyD-L-methionin-dicyclohexylaminsalz in 75 ml Äthylacetat wird zweimal mit je 20 ml 10-prozentiger Zitronensäurelösung und zweimal mit je 20 ml Wasser gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die getrocknete Lösung wird zu einem öligen Rückstand eingedampft. Das öl wird in 20 ml DMF gelöst und die Lösung wird auf -15 ⁰C gekühlt. Der Lösung werden 1,1 ml (10 ΐηΜοϊ) N-Methylmorpholin und 1,23 ml (9,5 mMol) Isobutylchlorformiat zugesetzt. Die Mischung wird 15 Minuten bei -15 ⁰C gerührt und dann mit einer vorher bereiteten auf -15°C vorgekühlten Lösung von 2,59 g (7,5 mMol) L-Asparaginyl-di-0-tert.»butyl-L-threoninat in 90 ml DMF behandelt. Die Mischung wird 15 Stunden bei -15 C gerührt, dann mit einer kalten Lösung von 0,21 g NaHCO₃ in 20 ml Wasser behandelt und hierauf 30 Minuten bei -15 ⁰C gerührt. Die Lösung wird unter intensivem Rühren in 800 ml gesättigte NaCl-Lösung gegossen. Das gummiartige Produkt wird abfiltriert und in Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zu einem klaren öl eingedampft, das aus Äther/Petroläther (30-60) umkristallisiert wird. Das kristalline Produkt wird abfiltriert und im Vakuum über KOH getrocknet. Ausbeute 2,58 g (58,7 %).

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TLC: ein Fleck (Chlor-Toluidin); R_f 0,66 /2-Butanol-3% Ammoniumhydroxid (3:1)_/; NMR (DMSO) 1,05 (d,3,J=6H₂, BCH₃ Thr) , 1,14 (S, 9,O-t-Butylather), 1,41 (S,9, O-t-Butylester), 1,61 (s,6 C-C(CH₃J₂), 2,04 (S,3,SCH₃MeU , 3,37 (S, 1,H-C C), 4,08 (M,3,ßCHThr, alphaCH Thr, alphaCHMet), 4,71 (M,1,5,6 und 8H₂, alphaCH Asn), 6,94 und 7,37 (S,1, CONH₃ASn), 7,25 (d,l,J=8H₀, NH Met), 7,52 (d,l,J=8, NH Asn), 8,25 (d,l,J=8, NH Thr).

Elementaranalyse ber. für C₂-H₄₆N₄OgS: theor.: C 55,27; H 7,91; N 9,55; 0 21,81; S 5,46 gef.: C 55,33; H 8,15; N 9,27; 0 22,01; S 5,24.

Beispiel 41

N-(l-Äthinylcyclohexyl-l-oxycarbonyl)-L-methionyl-L-asparaginyl-di-O-t-butyl-L-threoninat

Die Verbindung wird nach der Methode B von Beispiel durch Umsetzung von N-(l-Äthinylcyclohexyloxycarbonyl)-L-methionin (aus dem Dicyclohexylaminsalz isoliert) mit L-Asparaginyl-di-O-t-butyl-L-threonlnat hergestellt.

Elernentaranalyse für C₃₀H₅₀N₄OgS: theor.: C 57,48; H 8,04; N 8,94; 0 20,42; S 5,11; gef.: C 57,20; H 7,84; N 8,74; 0 20,67; S 5,35.

209844/117 3.

Beispiel 42

N- (l-Phenyl-3-methyl-l-butin-3-oxycarbonyl) -L-methionyl-L-asparaginyl-di-0-t-butyl-L-threoninat

Die Verbindung wird nach Methode A von Beispiel 40 durch Umsetzung von l-Phenyl-S-methylbutinyl-S-oxycarbonyl-L-methionin (aus seinem Dicyclohexylaminsalz isoliert) mit L-Asparaginyl-di-O-tert.-butyl-L-threoninat hergestellt. Schmelzpunkt 72,5 - 75 ⁰C.

Elementaranalyse für C₃₃H₅₀N₄OgS: theor.: C 59_f8O; H 7,60; N 8,45; S 4,84; gef.: C 59,55; H 7,81; N 8,36; S 4,89.

Die Hydrogenolyse der in den Beispielen 41 und 42 beschriebenen geschützten Tripeptide nach Methode A liefert das Tripeptid L-Methionyl-L-asparaginyl-di-O-t-butyl-L-threoninat, das 27-29-Aminosäurefragment von Glucagon.

Beispiel 43

N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-O-t-butyl-L-seryl-L-arginyl-L-arginyl-L-alanyl-L-glutaminyl-O-t-butyl-L-aspartyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-qlutaminyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-methionyl-L-asparaginyl-di-O-t-butyl-L-

threoninat-dihydrochlorid

Eine Lösung von 1,438 g (1,25 mMol) L-Phenylalanyl-L-valyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-methionyl-L-asparaginyldi-O-t-butyl-L-threoninat in 15 ml DMP, die bei einer Temperatur von -15°C gehalten wird, wird mit einer Lösung von 1,921 g (1,87 mMol) N-O-Methyl-l-butin-S-oxycarbonyl)-

20984A/1T73

O-t-butyl-L-seryl-L-arginyl-L-arginyl-L-alanyl-L-glutaminyl-O-t-butyl-L-aspartat-dihydrochlorid in 8 ml DMF versetzt. Der Reaktionsmischung werden unter Rühren 0,431 g (3,74 mMol) N-Hydroxysuccinimid, 0,258 g (1,25 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid und 7 ml DMF zugesetzt. Die Reaktionsmischung wird 3 Stunden bei -15 ⁰C, 90 Stunden bei 4 ⁰C und dann 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird filtriert und das Filtrat wird mit Äthylacetat verdünnt, wobei sich ein Niederschlag bildet. Der Niederschlag wird abfiltiert und dreimal aus Methanol/Äthylacetat zu 0,615 g (22 % Ausbeute) N-O-Methyl-l-butin-S-oxycarbonyl)-O-t-butyl-L-Ser-L-Arg-L-Arg-L-Ala-L-Glu-O-t-butyl-L-Asp-L-Phe-L-Val-L-Glu-L-Trp-L-Leu-L-Met-L-Asn-di-O-t-butyl-L-Thr. 2HCl umkristallisiert.

Eine quantitative Aminosäureanalyse des sauren Hydrolysats des Reaktionsprodukts ergibt folgende relative Anteile an Aminosäuren:

Thr (0,98), Asp (2,2), Met (0,95), Leu (1,0), GIu (2,2), VaI (0,98), Phe (0,93), AIa (1,2), Arg (2,2), Ser (1,00).

Beispiel 44

N-(l-Chlor-S-methyl-l-butin-S-oxycarbonyl)-L-methionyl-L-asparaginyl-di-O-t-butyl-L-threoninat

Eine Suspension von 1,8 g (4 mMol) N-(l-Chlor-3-methyll-butin-S-oxycarbonyU-L-methionin-dicyclohexylaminsalz in 10 ml Äthylacetat wird zweimal mit 10 ml 10-prozentiger Zitronensäurelösung und einmal mit 10-prozentiger Salzlösung geschüttelt. Die erhaltene Lösung

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wird über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zu einem öligen Rückstand eingedampft. Das öl wird in 10 ml THF gelöst und die Lösung wird mit 1,38 g (4 mMol) L-Asparaginyl-di-O-t-butyl-L-threoninat und 0,998 g (4,4 mMol) N-Äthoxy-a-äthoxy-l^-dihydrochinolin (EEDQ) versetzt. Die Reaktionsmischung wird über Nacht gerührt und dann im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der schaumige Rückstand wird in 20 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung wird dreimal mit jeweils 20 ml 10-prozentiger Zitronensäurelösung und 10-prozentiger Salzlösung gewaschen. Die gewaschene Lösung wird getrocknet und eingedampft, wodurch 1,09 g (44 % Ausbeute) des N-geschützten Tripeptids erhalten werden.

Elementaranalyse für ^C27^H46°8^{S C1:}

theor.: C 52,12; H 7,45; N 9,00; 0 20,57; S 5,15; Cl 5,70; gef.: C 52,24; H 7,39; N 8,75; 0 20,42; S 4,90; Cl 5,68.

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Claims (9)

Patentansprüche

1. Alkinylcarbonyloxycarbonyl-M-geschützte Amino

säureverbindungen der Formel

Il

R-C=C-C-O-C-N-C-(CH₀) C--

λ m

R,

R₁

-N-C-(CH₂) _m-C-

R-

worin

III

ein Wasserstoffatom, ein Chloratom, einen Phenylrest oder einen durch C.-C.-Alkylreste, C^-C₄-Alkoxygruppen oder Halogenatome substituierten Phenylrest,

^₁ für sich allein ein Wasserstoffatom oder einen C.,-C.-Alkylrest,

*2 für sich allein einen C.-C.-Alkylrest oder

und R₂ zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 5-, 6- oder 7-gliedrigen carbocyclischen Ring,

ί. und R_ß, die untereinander gleich oder voneinander verschieden sein können, Wasserstoffatome oder Niederalkylreste,

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R₅ und R₇, die untereinander gleich oder voneinander verschieden sein können, Wasserstoffatome, Niederalkylreste, hydroxysubstituierte Niederalkylreste, durch geschützte Hydroxygruppen substituierte Niederalkylreste, aminosubsti- -tuierte Niederalkylreste, durch-geschützte Aminogruppen substituierte Niederalkylreste, mercaptosubstituierte Niederalkylreste, durch "geschützte Mercaptogruppen substituierte Niederalkylreste , niederalkylmercaptosubstituierte Niederalkylreste, carboxysubstituierte Niederalkylreste, durch geschützte Carboxygruppen substituierte Niederalkylreste, guanidinosubstituierte Niederalkylreste, durch geschützte Guanidinogruppen substituierte Hiederalkylreste, guanidinooxysubstituierte Niederalkylreste, Imidazolylmethylreste, geschützte Imidazolylmethylreste, Indolylmethylreste, geschützte Indolylmethylreste, Phenylreste, 4-Hydroxyphenylreste oder geschützte 4-Hydroxyphenylreste,

Rg eine Hydroxygruppe, Methoxygruppe, Äthoxygruppe, t.-Butoxygruppe, 2,2,2-Trichloräthoxygruppe, N-Oxysuccinimidgruppe, Phenoxygruppe, Benzyloxygruppe, 4-Nitrobenzyloxygruppe, 2,4,5-Trichlorphenoxygruppe, Pentachlorphenäthoxygruppe oder Pentafluorphenoxygruppe und deren Säureadditionssalze, Alkalisalze, Erdalkalisalze, Aminsalze, Diäthylaminsalze, Triäthylaminsalze, Dibenzylaminsalze, Dicyclohexylaminsalze und 1,4-Diazabicyclo-/2,2,2^/octansalze,

m und n, die untereinander gleich oder voneinander verschieden sein können, O oder eine ganze Zahl von 1 bis 4 und

P O oder eine ganze Zahl von 1 bis 14

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BR - 72 -

bedeuten, mit der Maßgabe, daß dann, wenn ρ 1 oder mehr bedeutet, R--, R-,, m und η in den einzelnen Aminosäure-

b /

resten, die die Kette bilden, die gleichen oder verschiedene Bedeutungen haben können.

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ρ eine ganze Zahl von 1 bis 4 bedeutet.

3. Verbindung nach Anspruch 2, nämlich N-(3-Methyll-butin-3-oxycarbonyl)-L-tryptophyl-L-leucyl-methylester, N-O-Methyl-l-butin-S-oxycarbonyl)-S-benzhydryl-L-cysteinylglacinäthylester, N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-S-trityl-L-cysteinylglycinäthylester, N-(3-methyl-l-butin-S-oxycarbonyD-L-phenylalanyl-S-trityl-L-cysteinylglycinäthylester, N-(1-Phenyl-3-methy1-1-butin-3-oxycarbonyl)-L-methionyl-L-asparaginyl-di-O-t.-butyl-L-threonin, N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-L-phenylalanyl-L-valyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-leucin oder N-(3-Methyl-l-butin-3-oxy-carbonyl)-L-tryptophyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid.

4. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ρ eine ganze Zahl von 5 bis 14 bedeutet.

5. Verbindung nach Anspruch 4, nämlich N-(3-Methyll-butin-3-oxycarbonyl)-O-t.-butyl-L-seryl-L-arginyl-L-arginyl-L-alanyl-L-glutaminyl-ß-t.-butyl-L-asparaginsäure-dihydrochlorid, N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-S-benzyl-L-cysteinyl-O-t.-butyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-O-t-butyl-L-serinyl-L-threonin, N-(3-Methyl-1-butin-3-oxycarbonyl)-L-phenylalanyl-L-valyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L~leucyl-L-methionin-L-asparaginyldi-O-t.-butyl-L-threonin, N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-O-t.-butyl-L-seryl-L-arginyl-L-arginyl-L-alanyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-methionyl-L-asparaginyl-di-O-t.-butyl-L-threonin-dihydrochlorid,

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N-n-Methyl-l-butin-S-oxycarbonyl)-O-t.-butyl-L-tyrosyl-O-t.-butyl-L-seryl-L-epsilon-t-butyloxycarbamyl-L-lysyl-O-t, butyl-L-tyrosyl-L-leucyl-ß-O-t-butyl-L-asparaginsäure oder N-O-Methyl-l-butin-S-oxycarbonyl)-L-histidyl-L-seryl-L-asparaginyl-glycyl-L-threonyl-L-phenylalanyl- L-threonyl-L-seryl-L-glutanyl-L-leucyl-L-seryl-L-arginyl-L-leucyl-L-arginyl-L-asparaginsäureamid.

6. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ρ Ο bedeutet.

■7. Verbindung nach Anspruch 6, nämlich N-(3-Methyl-lbutin-3-oxycarbonyl)-L-methionin, N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)--L-phenylalanin, N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-D-alpha-phenylglycin, N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-S-trityl-L-cystein; N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-L-methionin-2,4,5-trichlorphenylcarbonat, N-O-Methyl-l-butin-S-oxycarbonyl)-O-t.-butyl-L-serin oder N-(3-Methyl-l-butin-3-oxycarbonyl)-O-t.-butyl-L-threonin.

8. Verfahren zur Herstellung von Peptiden durch (1) Umsetzung einer N-geschützten Aminosäure in Form

(a) eines aktiven Esters,

(b) eines Acylhalogenids in Gegenwart eines Halogenwasserstoffakzeptors oder

(c) der freien Säure in Gegenwart eines Kondensationsmittels

mit einer Aminosäure oder einem Peptid,

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(2) Entfernung der N-Schutzgruppe aus dem erhaltenen Peptid und

(3) anschließende Umsetzung der nun verfügbaren Aminofunktion des neu entstandenen Peptids mit einer N-geschützten Aminosäure und anschließende Entfernung der N-Schutzgruppe aus dem neu-erzeugten Peptid,

dadurch gekennzeichnet, daß man (1) eine N-geschützte Aminosäure nach Anspruch 6 mit einer Aminosäure oder einem Peptid umsetzt, und (2) die N-Schutzgruppe aus dem neu-erzeugten Peptid durch Umsetzung des N-geschützten Peptids mit Wasserstoff in Gegenwart eines Hydrierungskatalysators unter Bildung des neu erzeugten Peptids entfernt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die katalytische Hydrogenolyse des N-geschützten Peptids in Gegenwart eines Palladiumkatalysators durchführt.

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