CH649779A5 - Process for the preparation of spore cultures of an ergocristine-producing Claviceps purpurea strain which is virulent on rye - Google Patents
Process for the preparation of spore cultures of an ergocristine-producing Claviceps purpurea strain which is virulent on rye Download PDFInfo
- Publication number
- CH649779A5 CH649779A5 CH132380A CH132380A CH649779A5 CH 649779 A5 CH649779 A5 CH 649779A5 CH 132380 A CH132380 A CH 132380A CH 132380 A CH132380 A CH 132380A CH 649779 A5 CH649779 A5 CH 649779A5
- Authority
- CH
- Switzerland
- Prior art keywords
- strain
- production
- alkaloids
- spore
- producing
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 241000221751 Claviceps purpurea Species 0.000 title claims abstract description 16
- HEFIYUQVAZFDEE-UHFFFAOYSA-N ergocristinine Natural products N12C(=O)C(C(C)C)(NC(=O)C3C=C4C=5C=CC=C6NC=C(C=56)CC4N(C)C3)OC2(O)C2CCCN2C(=O)C1CC1=CC=CC=C1 HEFIYUQVAZFDEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 6
- OWEUDBYTKOYTAD-MKTPKCENSA-N ergocristine Chemical compound C([C@H]1C(=O)N2CCC[C@H]2[C@]2(O)O[C@](C(N21)=O)(NC(=O)[C@@H]1C=C2C3=CC=CC4=NC=C([C]34)C[C@H]2N(C)C1)C(C)C)C1=CC=CC=C1 OWEUDBYTKOYTAD-MKTPKCENSA-N 0.000 title abstract 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 37
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 25
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 25
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 claims description 31
- 150000003797 alkaloid derivatives Chemical class 0.000 claims description 17
- HEFIYUQVAZFDEE-MKTPKCENSA-N ergocristine Chemical compound C([C@H]1C(=O)N2CCC[C@H]2[C@]2(O)O[C@](C(N21)=O)(NC(=O)[C@@H]1C=C2C=3C=CC=C4NC=C(C=34)C[C@H]2N(C)C1)C(C)C)C1=CC=CC=C1 HEFIYUQVAZFDEE-MKTPKCENSA-N 0.000 claims description 14
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 14
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 14
- 241000576755 Sclerotia Species 0.000 claims description 12
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 11
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 11
- OFKDAAIKGIBASY-VFGNJEKYSA-N ergotamine Chemical compound C([C@H]1C(=O)N2CCC[C@H]2[C@]2(O)O[C@@](C(N21)=O)(C)NC(=O)[C@H]1CN([C@H]2C(C3=CC=CC4=NC=C([C]34)C2)=C1)C)C1=CC=CC=C1 OFKDAAIKGIBASY-VFGNJEKYSA-N 0.000 claims description 10
- 229960004943 ergotamine Drugs 0.000 claims description 10
- XCGSFFUVFURLIX-UHFFFAOYSA-N ergotaminine Natural products C1=C(C=2C=CC=C3NC=C(C=23)C2)C2N(C)CC1C(=O)NC(C(N12)=O)(C)OC1(O)C1CCCN1C(=O)C2CC1=CC=CC=C1 XCGSFFUVFURLIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 9
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 8
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 8
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 5
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 4
- XLMJRFCCCWFQRE-SJRQCXNHSA-N ecboline Chemical compound C([C@H]1[C@]2(O)O3)CCN1C(=O)CN2C(=O)[C@]3(C(C)C)NC(=O)[C@@H](CN(C)[C@@H]1C2)C=C1C1=C3C2=CNC3=CC=C1 XLMJRFCCCWFQRE-SJRQCXNHSA-N 0.000 claims description 4
- UJYGDMFEEDNVBF-UHFFFAOYSA-N ergocornin Chemical compound C1=CC(C=2C(N(C)CC(C=2)C(=O)NC2(C(=O)N3C(C(N4CCCC4C3(O)O2)=O)C(C)C)C(C)C)C2)=C3C2=CNC3=C1 UJYGDMFEEDNVBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229930015720 peptide alkaloid Natural products 0.000 claims description 4
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 3
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims description 3
- AWFDCTXCTHGORH-HGHGUNKESA-N 6-[4-[(6ar,9r,10ar)-5-bromo-7-methyl-6,6a,8,9,10,10a-hexahydro-4h-indolo[4,3-fg]quinoline-9-carbonyl]piperazin-1-yl]-1-methylpyridin-2-one Chemical class O=C([C@H]1CN([C@H]2[C@@H](C=3C=CC=C4NC(Br)=C(C=34)C2)C1)C)N(CC1)CCN1C1=CC=CC(=O)N1C AWFDCTXCTHGORH-HGHGUNKESA-N 0.000 claims description 2
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 claims description 2
- 241000221760 Claviceps Species 0.000 claims description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 2
- 229960003133 ergot alkaloid Drugs 0.000 claims description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 2
- ZAGRKAFMISFKIO-QMTHXVAHSA-N lysergic acid Chemical group C1=CC(C2=C[C@H](CN([C@@H]2C2)C)C(O)=O)=C3C2=CNC3=C1 ZAGRKAFMISFKIO-QMTHXVAHSA-N 0.000 claims description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 claims description 2
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 claims description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 239000004576 sand Substances 0.000 claims description 2
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000018842 conidium formation Effects 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 230000002784 sclerotic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- WVVSZNPYNCNODU-CJBNDPTMSA-N Ergometrine Natural products C1=CC(C=2[C@H](N(C)C[C@@H](C=2)C(=O)N[C@@H](CO)C)C2)=C3C2=CNC3=C1 WVVSZNPYNCNODU-CJBNDPTMSA-N 0.000 description 2
- WVVSZNPYNCNODU-XTQGRXLLSA-N Lysergic acid propanolamide Chemical compound C1=CC(C=2[C@H](N(C)C[C@@H](C=2)C(=O)N[C@H](CO)C)C2)=C3C2=CNC3=C1 WVVSZNPYNCNODU-XTQGRXLLSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 229960001405 ergometrine Drugs 0.000 description 2
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- RLGNNNSZZAWLAY-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dimethoxy-4-methylsulfanylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=C(CCN)C=CC(SC)=C1OC RLGNNNSZZAWLAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 235000015001 Cucumis melo var inodorus Nutrition 0.000 description 1
- 240000002495 Cucumis melo var. inodorus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000010685 fatty oil Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000014639 sexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
- C12P17/183—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system containing an indolo[4,3-F,G]quinoleine nucleus, e.g. compound containing the lysergic acid nucleus as well as the dimeric ergot nucleus
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
**WARNUNG** Anfang DESC Feld konnte Ende CLMS uberlappen **.
PATENTANSPRÜCHE
Verfahren zur Herstellung von zur Drogenproduktion verwendbaren Sporenkulturen eines Ergocristin produzieren den, auf Roggen virulenten Claviceps purpurea Stammes, da durch gekennzeichnet, dass man die Sporenkultur durch
Züchten des bei dem ungarischen Landesinstitut für Volkshygiene unter Nr. OKI 00163 deponierten Claviceps purpurea
Stammes herstellt.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Sporenkultur eines neuen, Ergocristin produzierenden, auf Roggenpflanzen virulenten Claviceps purpurea Stammes.
Zur Herstellung von Mutterkornalkaloiden sind zur Zeit zwei verschiedene Wege bekannt, einerseits die klassischen Verfahren, in welchen die auf Roggenpflanzen gezüchteten und eingesammelten Drogen als Ausgangsstoff verwendet und die Alkaloide aus diesen durch Extraktion gewonnen werden, und andererseits die auf sterile Fermentation mit geeigneten Claviceps Stämmen gegründete Alkaloidproduktion. Es sind schon mehrere, grossbetrieblich ausführbare Verfahren zur Realisierung der letzteren Methode bekannt (vgl. z.B. die ungarischen Patentschriften Nr. 150 631, 151 724, 238 und 164 816), doch hat die Züchtung von Mutterkorn-Drogen seine Bedeutung nicht verloren; ein erheblicher Teil der Weltproduktion von Peptidalkaloiden ist auch heute noch auf die Verwendung von gezüchteten, an verschiedenen Alkaloid-Typen angereicherten Drogen basiert.
Das ist besonders der Fall in der Produktion von Ergocristin und Ergotamin. Die Seitenkette der Peptidalkaloide besteht aus Prolin, einer Gruppe von charakteristischen Aminosäuren und aus einer für das betreffende Alkaloid (innerhalb der erwähnten Gruppe) spezifisch charakteristischen Aminosäure. Die für die erwähnten beiden Alkaloide (Ergocristin und Ergotamin) charakteristische Aminosäure ist das Phenylalanin. Es ist aber äusserst schwierig, die Bildung bzw. die Überproduktion von Phenylalanin während der sich innerhalb von einigen Tagen abspielenden fermentativen Biosynthese zu sichern, da während der selben Zeit auch der biosynthetische Aufbau des Lysergsäure-Teils des Alkaloidmoleküls stattfindet und dazu aus der Synthese der aromatischen Aminosäuren erhebliche Mengen von Tryptophan erforderlich sind.
Im Laufe der Aufrechterhaltung des Stammes und der auf einander folgenden Umimpfungen kann daher der ursprünglich anwesende Anteil der Ergotamin und Ergocristin produzierenden Stämme durch die ausgleichende Regulation der Stoffwechselwege in die Richtung der Produktion von Ergocornin und dann von wasserlöslichen Alkaloiden verschoben werden. Auch dieser Umstand dürfte dazu beigetragen haben, dass gewisse Fermentationsverfahren später nicht mehr mit Erfolg reproduziert werden konnten (vgl. z.B. tschechoslovakische Patentschrift 104 613, DE-PS 1 215 637, GB-PS 1192 912). Da man bei den auf die Aufarbeitung von Drogen basierten Verfahren mit solchen Schwierigkeiten nicht rechnen muss, werden solche Verfahren auch weiterhin in grossem Massstab verwendet und es besteht auch weiterhin der Bedarf nach der technologischen Weiterentwicklung solcher Verfahren.
Die grundlegende Bedingung einer solchen Weiterentwicklung ist aber die Herstellung von Claviceps purpurea Stämmen mit entsprechend hoher Alkaloidproduktionsfähigkeit.
Verschiedene Verfahren zur Herstellung von Claviceps purpurea Stämmen mit guter Produktionsfähigkeit für Ergolin-Alkaloiden wurden schon in mehreren Patentschriften beschrieben; es wurden verschiedene Wege zur Gewinnung von Stämmen mit höherer Produktionsfähigkeit vorgeschlagen.
Nach dem in der sowjetischen Patentschrift 232 468 beschrie benen Verfahren wird ein durch bestimmte kolonienmorpho logische Eigenschaften und Sporenmasse gekennzeichneter
Stamm für die Produktion von Ergotoxin ausgewählt. In der sowjetischen Patentschrift 232467 ist ein auf künstlichem
Nährboden beinahe mit den obigen identische morphologi sche Eigenschaften zeigender, in 80% Ergocryptin produzie render Stamm beschrieben. In der ungarischen Patentschrift
154 035 ist eine schnell durchführbare und wirksame Methode beschrieben, nach welchem die zur Produktion von Ergotoxin fähige Kulturen auf Grund der Farbe der Kolonien gegenüber den Ergotamin produzierenden Individuen angereichert werden können.
Zur Herstellung von Stämmen mit hoher Alkaloidproduktion sind die folgenden wichtigeren Schritte erforderlich:
1. die Züchtung eines veredelten Claviceps purpurea Stammes;
2. die Herstellung von zur Infizierung von Roggenpflanzen geeigneten Sporen durch fermentative Vermehrung des Stammes,
3. die Konservierung dieser Sporen bis zu deren Verwendung.
Die Zielsetzung der vorliegenden Erfindung war die Herstellung eines besonders Ergocristin in höherer Ausbeute produzierenden Stammes, welcher besonders die folgenden vorteilhaften Eigenschaften zeigt: - der Stamm zeigt an künstlichen Nährböden, sowohl auf Agar-Oberfläche, als auch in submersen, belüfteten Kulturen gute Sporenbildung: - die Sporen sind genügend resistent und somit gut erhaltbar; - die Sporen sind lebensfähig und virulent so dass sie, wenn sie wieder in ein Nährbodenmedium kommen, in 98 bis 100% auskeimen und auf Pflanzen aufgebracht die Pflanze wirksam infizieren; - die Quantität der pro Flächeneinheit produzierten Droge ist hoch; - die Droge zeigt einen hohen Gehalt an Hauptalkaloiden und enthält neben diesen Hauptalkaloiden nur unbeträchtliche Mengen von Nebenalkaloiden.
Der neue Stamm wurde durch die kombinierte Anwendung der geschlechtlichen und der selektiven Veredelung auf die folgende Weise hergestellt:
Aus dem Ausgangsstamm, welcher in der eigenen Sammlung des ungarischen Heilpflanzen-Forschungsinstituts unter Nr. 661/1974 registriert wurde, wurden unter Berücksichtigung der morphologischen Gesichtspunkte gut entwickelte, äusserlich einwandfreie Sklerotien mit glatter Oberfläche ausgewählt. Diese Sklerotien wurden auf feuchten Sand gelegt und 6 Wochen lang zwischen 0 C und 5 C gehalten, dann abgespült und auf einen feucht gehaltenen sterilen Schwamm gebracht. Nach 12 Tagen begann die Entwicklung von Stromen; die erschienenen Stromen haben sich in 6 Tagen voll entwickelt.
Zur Gewinnung von Sporen wurden die Stromen derjenigen Sklerotien ausgewählt, welche nur einige (3 bis 4) Pilzköpfe getrieben haben; von diesen wurden solche Stromen entnommen, deren Durchmesser grösser als 4 mm war und an deren Oberfläche durch mikroskopische Untersuchung die grössten Ausbuchtungen von Peritetien gesichtet wurden.
Diese Stromen wurden dann über einem flüssigen Malz Nährboden, unter sterilen Bedingungen, durch Wärmeeinwirkung zur Sporulation gebracht. Aus der mikroskopisch kontrollierten, Ascosporen enthaltenden Flüssigkeit wurden dann auf festem Malz-Agar-Nährboden Ausbreitungen gemacht. Die sich aus je einer Spore ausbildenden Kolonien wurden auf Grund ihres Entwicklungstempo und ihrer Sporenbildungsfähigkeit selektiert. Die Sporen der ausgewählten Kolonien wurden nach ihrer Vermehrung isoliert und unter parasitische Bedingungen gebracht, d.h. es wurden die Ähren
von sich im Vorantese-Zustand befindenden Roggenpflanzen mit Hilfe von Impfnadeln mit diesen Sporen infiziert. Von den Roggenpflanzen wurden dann diejenigen Sklerotien ausgewählt, bei welchen die Sklerotienansätze innerhalb der kürzesten Zeit nach dem Erscheinen des Honigtaus erschienen sind. Die auf diese Weise eingesammelten Körner wurden durch Dünnschichtchromatographie analysiert. Die weitere Selektion erfolgte auf Grund des Ergocristingehalts und der Menge der anwesenden verunreinigten Nebenalkaloiden.
Die auf diese Weise durch geschlechtliche Vermehrung gewonnenen Sklerotien-Kulturen wurden dann einer weiteren Selektionsreihe unterworfen, in welcher aus den Sklerotienteilchen auf festem Nährboden Kolonien gezüchtet und mit diesen flüssige Nährböden eingeimpft wurden; aus den so hergestellten submersen Kulturen wurden dann in Feldversuchen die am besten sporierenden, lebensfähigsten und höchste Virulenz zeigenden Kulturen auf Grund der Menge und des durchschnittlichen Alkaloidgehalts der produzierten Droge selektiert.
Nach dieser Methode wurde eine Reihe von Selektionen in den auf einander folgenden Schritten von zwei - auch parasitisches Wachstum in sich schliessenden - Vermehrungszyklen durchgeführt, wodurch ein neuer, gegenüber den bisher bekannten Stämmen vorteilhaftere Eigenschaften zeigender Claviceps purpurea Stamm erzeugt werden konnte.
Der neue, bei dem ungarischen Landesinstitut für Volkshygienie H - 1966 Budapest,Gyáli ut 2-4 (OKI) am 2. Mai
1977 unter Nr. MNG 00163 deponierte Stamm ist besonders zur betrieblichen Herstellung von Impfsporen-Präparaten vorteilhaft geeignet, da er die Sporenproduktion der Fermentation erhöht; er zeigt aber auch in der Feldproduktion der Droge vorteilhafte Eigenschaften, erhöht die Menge der produzierten Droge und verbessert erheblich die Qualität der Droge.
In der nachstehenden Tabelle sind die Ergebnisse der mit dem neuen Stamm OKI/MNG 00163 und (zum Vergleich) mit dem Ausgangsstamm Nr. 661/1974 des ungarischen Heilpflanzen-Forschungsinstituts durchgeführten Fermentations- und Feldversuche zusammengefasst.
OKI 661/1974
00163
Sporenproduktionsfähigkeit auf der Oberfläche, Sporenzahl/Rohr 1-2.109 0,5-1,109
Sporenzahl der Fermentations brühe, Sporen/ml 4-5.108 1-2.108
Keimfähigkeit des Impfsporen präparats,% 95-99 9F96
Virulenz (Konzeption im Phy totron, in % der Stiche) 70-80 50-60
Gewicht von 1000 Körner, g 175-200 140170
Drogenproduktion kg/ha (im Versuchswerk) 200-350 150-220 Ergocristingehalt, mg/g 5,0-6,2 2,6 -3,6
Nebenalkaloide:
Ergometrin, mg/g 0,2-0,3 0,1 -0,2
Ergotamin, mg/g Spuren 0,05-0,1
Gehalt an fetten Olen, % 15-20 16-18 Ergocristinproduktion, g/ha [Durchschnitt kg/ha.
Durch schnitt mg/g] 1540 590
Die morphologische Charakterisierung des durch die er findungsgemässe Selektion erhaltenen neuen Stammes und des Ausgangsstammes:
Stamm OKI 00163: a) Malz-Agar: nach 28 Tagen weisse, 0,5 bis 0,6 cm grosse Kolonien mit kurzen Luftmyzelien; vom 12 Tag Konidienbildung; Grössenverteilung der Konidien: 1,3 llm bis 3,8 ,um, häufigste Grösse: 2,5 llm.
b) Mannit-Citrat-Agar: nach 28 tagen flache, cremefarbige, 1,0 bis 1,5 cm grosse, faltige Kolonien; Konidienbildung vom 15. Tag angefangen.
c) Durchschnittliche Grösse der Konidien (von 100 unausgewählten Körnern) 2,5 llm; Oberfläche glatt.
Ausgangsstamm 661/1974: a) Malz-Agar: nach 28 Tagen grauweisse, 0,8 bis 12,0 cm grosse Kolonien, mit ausgebreiteten Luftmyzelien; Konidienbildung vom 15 Tag; durchschnittliche Grösse der Konidien: 3,4 tim.
b) Mannit-Citrat-Agar: nach 28 Tagen weisse, 1,5 bis 2,0 cm grosse, filzartige, ausgebreitete Kolonien; Konidienbildung vom 20. Tag angefangen; durchschnittliche Grösse der Konidien: 4 gm.
c) Durchschnittliche Grösse der Sklerotien (von 100 unausgewählten Körnern) 18 mm; Oberfläche rissig.
Die Impfsporenproduktion der Fermentation wird durch die Anwendung des neuen Stammes auf das Zweifache erhöht; die Drogenproduktion wird um 50% erhöht und der Alkaloidgehalt der erhaltenen Droge ist beinahe um 100% höher. Durch den wesentlich höheren Alkaloidgehalt wird auch die Alkaloidausbeute-günstig beeinflusst; als weiterer Vorteil kann noch erwähnt werden, dass die Erhöhung des Alkaloidgehalts nicht von einer erhöhten Anhäufung der Fettstoffe begleitet wird, so dass die relative Menge der Fettstoffe in der Droge niedriger wird.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird durch die nachstehenden Beispiele näher veranschaulicht.
Beispiels
In einem Glasfermentor mit 5 Liter Rauminhalt wird eine 24 Tage alte Malz-Agar-Kultur des Stammes OKI 00163 auf einen Nährboden mit folgender Zusammensetzung geimpft: Malzextrakt 2,0% Kartoffelpulver 1,0% Glucose 0,5% pH-Wert des Nährbodens: 6,0
Die Kultur wird bei 24 C, unter Rühren mit 440 U/min Belüftung mit 0,5 Liter Luft pro Liter Fermentationsflüssigkeit pro Minute 3 Tage langinkubiert.
Mit der auf obige Weise erhaltenen Inoculum-Kultur werden dann 100 Liter Nährboden der folgenden Zusammensetzung eingeimpft: Mannit 8,0% Citronensäure 0,7% Maisquellwasser (auf Trockensubstanz berechnet) 0,1% Kaliumdihydrogenphosphat 0,025% Magnesiumsulfat 0,025%
Die Fermentation wird in einem mit Rührwerk ausgerüsteten, säurefesten Fermentor mit 160 Liter Rauminhalt durchgeführt.
Die Inkubation wird bei 24 C, unter Rühren mit 230 U/min und Belüftung mit 1,0 Liter Luft pro Liter Fermenta tionsflüssigkeit pro Minute, bei pH 4,5 bis 5,0, sechs Tage lang fortgesetzt. Der pH-Wert der Fermentationsflüssigkeit wird durch die Zugabe von Ammoniumhydroxyd zwischen den angegebenen Grenzen gehalten.
Am Ende der Fermentation zeigt die Fermentationsflüssigkeit eine Sporenzahl von 4,2:108/ml.
Die erhaltene Biomasse wird abgetrennt, mit 30 Liter 10%aber Saccharoselösung verdünnt, in Flaschen abgefüllt und unter Tielkühlung aufbewahrt.
Das auf obige Weise erhaltene Impfsporen-Präparat zeigt 99% Keimfähigkeit. Dieses Impfsporen-Präparat wird dann auf eine Konzentration von 30 000 Sporen/mm3 verdünnt und in diesem Zustand zum Infizieren von Roggenpflanzen vor der Ahrenbildung verwendet. Aus dem Ernteertrag werden auf diese Weise 250 kg Droge pro ha gewonnen; der Gehalt der Droge an fetten Olen beträgt 20%.
Ergocristingehalt: 6,2 mg/g Ergotamingehalt: 0,1 mg/g Ergometringehalt: 0,2 mg/g.
Beispiel 2
Der Stamm OKI 00163 wird auf Malz-Agar bei 24 C 21Tage inkubiert; die erhaltenen Sporen werden mit steriler physiologischer Kochsalzlösung von der Oberfläche der Kultur abgewaschen. Mit dieser sporenhaltigen Kochsalzlösung werden dann die im Phytotron gezüchteten Roggenpflanzen infiziert; die Sporen werden mit Hilfe einer Injektionsspritze, durch 5 Stiche je Ähre in den Pflanzenkörper eingebracht.
Zum Vergleichen wurde die gleiche Prozedur mit dem Ausgangsstamm 661/1974 in gleicher Weise durchgeführt. Mit den beiden Stämmen wurden je 100 Ahren infiziert.
Die voll entwickelten Sklerotien wurden in reifem Zustand eingesammelt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst: Stamm Sklerotien Gesamtgewicht Ergocristin (Stück) der Sklerotien gehalt, mg/g OKI00613 470 79g 5,9 661/1974 420 57g 3,0
Beispiel 3
Eine auf Malz-Agar gezüchtete, 28 Tage alte Kultur des Stammes OKI 00163 wurde mit steriler Kochsalzlösung abgewaschen und die Sporenzahl der Waschflüssigkeit auf 30 000 Sporen/mm3 eingestellt. Mit dieser Flüssigkeit wurden auf 30 m2 grosse Versuchsparzellen Roggenpflanzen in vier Parallelversuchen infiziert. Zum Vergleich wurden unter identischen Umständen Parallelversuche mit einer auf gleiche Weise vorbereiteten Kultur des Ausgangsstammes 661/1974 durchgeführt.
Die Infizierung wurde mit der Hand, mit Hilfe von zierplatten durchgeführt; die reifen Sklerotien wurden ebenfalls mit der Hand, verlustfrei eingesammelt. Die mit dem neuen Stamm und mit dem zum Vergleich eingesetzten Ausgangsstamm erzielten Erträge wurden in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst: Stamm Gewicht Ergo- Ernte- Ergo von 1000 cristin- ertrag cristin
Körner gehalt ertrag g mg/g kg/ha g/ha OKI 00163 190 6,10 390 2380 661/1974 160 3,26 210 685
Claims (3)
- PATENTANSPRÜCHE Verfahren zur Herstellung von zur Drogenproduktion verwendbaren Sporenkulturen eines Ergocristin produzieren den, auf Roggen virulenten Claviceps purpurea Stammes, da durch gekennzeichnet, dass man die Sporenkultur durch Züchten des bei dem ungarischen Landesinstitut für Volkshygiene unter Nr. OKI 00163 deponierten Claviceps purpurea Stammes herstellt.Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Sporenkultur eines neuen, Ergocristin produzierenden, auf Roggenpflanzen virulenten Claviceps purpurea Stammes.Zur Herstellung von Mutterkornalkaloiden sind zur Zeit zwei verschiedene Wege bekannt, einerseits die klassischen Verfahren, in welchen die auf Roggenpflanzen gezüchteten und eingesammelten Drogen als Ausgangsstoff verwendet und die Alkaloide aus diesen durch Extraktion gewonnen werden, und andererseits die auf sterile Fermentation mit geeigneten Claviceps Stämmen gegründete Alkaloidproduktion. Es sind schon mehrere, grossbetrieblich ausführbare Verfahren zur Realisierung der letzteren Methode bekannt (vgl. z.B. die ungarischen Patentschriften Nr. 150 631, 151 724, 238 und 164 816), doch hat die Züchtung von Mutterkorn-Drogen seine Bedeutung nicht verloren; ein erheblicher Teil der Weltproduktion von Peptidalkaloiden ist auch heute noch auf die Verwendung von gezüchteten, an verschiedenen Alkaloid-Typen angereicherten Drogen basiert.Das ist besonders der Fall in der Produktion von Ergocristin und Ergotamin. Die Seitenkette der Peptidalkaloide besteht aus Prolin, einer Gruppe von charakteristischen Aminosäuren und aus einer für das betreffende Alkaloid (innerhalb der erwähnten Gruppe) spezifisch charakteristischen Aminosäure. Die für die erwähnten beiden Alkaloide (Ergocristin und Ergotamin) charakteristische Aminosäure ist das Phenylalanin. Es ist aber äusserst schwierig, die Bildung bzw. die Überproduktion von Phenylalanin während der sich innerhalb von einigen Tagen abspielenden fermentativen Biosynthese zu sichern, da während der selben Zeit auch der biosynthetische Aufbau des Lysergsäure-Teils des Alkaloidmoleküls stattfindet und dazu aus der Synthese der aromatischen Aminosäuren erhebliche Mengen von Tryptophan erforderlich sind.Im Laufe der Aufrechterhaltung des Stammes und der auf einander folgenden Umimpfungen kann daher der ursprünglich anwesende Anteil der Ergotamin und Ergocristin produzierenden Stämme durch die ausgleichende Regulation der Stoffwechselwege in die Richtung der Produktion von Ergocornin und dann von wasserlöslichen Alkaloiden verschoben werden. Auch dieser Umstand dürfte dazu beigetragen haben, dass gewisse Fermentationsverfahren später nicht mehr mit Erfolg reproduziert werden konnten (vgl. z.B. tschechoslovakische Patentschrift 104 613, DE-PS 1 215 637, GB-PS 1192 912). Da man bei den auf die Aufarbeitung von Drogen basierten Verfahren mit solchen Schwierigkeiten nicht rechnen muss, werden solche Verfahren auch weiterhin in grossem Massstab verwendet und es besteht auch weiterhin der Bedarf nach der technologischen Weiterentwicklung solcher Verfahren.Die grundlegende Bedingung einer solchen Weiterentwicklung ist aber die Herstellung von Claviceps purpurea Stämmen mit entsprechend hoher Alkaloidproduktionsfähigkeit.Verschiedene Verfahren zur Herstellung von Claviceps purpurea Stämmen mit guter Produktionsfähigkeit für Ergolin-Alkaloiden wurden schon in mehreren Patentschriften beschrieben; es wurden verschiedene Wege zur Gewinnung von Stämmen mit höherer Produktionsfähigkeit vorgeschlagen.Nach dem in der sowjetischen Patentschrift 232 468 beschrie benen Verfahren wird ein durch bestimmte kolonienmorpho logische Eigenschaften und Sporenmasse gekennzeichneter Stamm für die Produktion von Ergotoxin ausgewählt. In der sowjetischen Patentschrift 232467 ist ein auf künstlichem Nährboden beinahe mit den obigen identische morphologi sche Eigenschaften zeigender, in 80% Ergocryptin produzie render Stamm beschrieben. In der ungarischen Patentschrift 154 035 ist eine schnell durchführbare und wirksame Methode beschrieben, nach welchem die zur Produktion von Ergotoxin fähige Kulturen auf Grund der Farbe der Kolonien gegenüber den Ergotamin produzierenden Individuen angereichert werden können.Zur Herstellung von Stämmen mit hoher Alkaloidproduktion sind die folgenden wichtigeren Schritte erforderlich: 1. die Züchtung eines veredelten Claviceps purpurea Stammes;
- 2. die Herstellung von zur Infizierung von Roggenpflanzen geeigneten Sporen durch fermentative Vermehrung des Stammes,
- 3. die Konservierung dieser Sporen bis zu deren Verwendung.Die Zielsetzung der vorliegenden Erfindung war die Herstellung eines besonders Ergocristin in höherer Ausbeute produzierenden Stammes, welcher besonders die folgenden vorteilhaften Eigenschaften zeigt: - der Stamm zeigt an künstlichen Nährböden, sowohl auf Agar-Oberfläche, als auch in submersen, belüfteten Kulturen gute Sporenbildung: - die Sporen sind genügend resistent und somit gut erhaltbar; - die Sporen sind lebensfähig und virulent so dass sie, wenn sie wieder in ein Nährbodenmedium kommen, in 98 bis 100% auskeimen und auf Pflanzen aufgebracht die Pflanze wirksam infizieren; - die Quantität der pro Flächeneinheit produzierten Droge ist hoch; - die Droge zeigt einen hohen Gehalt an Hauptalkaloiden und enthält neben diesen Hauptalkaloiden nur unbeträchtliche Mengen von Nebenalkaloiden.Der neue Stamm wurde durch die kombinierte Anwendung der geschlechtlichen und der selektiven Veredelung auf die folgende Weise hergestellt: Aus dem Ausgangsstamm, welcher in der eigenen Sammlung des ungarischen Heilpflanzen-Forschungsinstituts unter Nr. 661/1974 registriert wurde, wurden unter Berücksichtigung der morphologischen Gesichtspunkte gut entwickelte, äusserlich einwandfreie Sklerotien mit glatter Oberfläche ausgewählt. Diese Sklerotien wurden auf feuchten Sand gelegt und 6 Wochen lang zwischen 0 C und 5 C gehalten, dann abgespült und auf einen feucht gehaltenen sterilen Schwamm gebracht. Nach 12 Tagen begann die Entwicklung von Stromen; die erschienenen Stromen haben sich in 6 Tagen voll entwickelt.Zur Gewinnung von Sporen wurden die Stromen derjenigen Sklerotien ausgewählt, welche nur einige (3 bis 4) Pilzköpfe getrieben haben; von diesen wurden solche Stromen entnommen, deren Durchmesser grösser als 4 mm war und an deren Oberfläche durch mikroskopische Untersuchung die grössten Ausbuchtungen von Peritetien gesichtet wurden.Diese Stromen wurden dann über einem flüssigen Malz Nährboden, unter sterilen Bedingungen, durch Wärmeeinwirkung zur Sporulation gebracht. Aus der mikroskopisch kontrollierten, Ascosporen enthaltenden Flüssigkeit wurden dann auf festem Malz-Agar-Nährboden Ausbreitungen gemacht. Die sich aus je einer Spore ausbildenden Kolonien wurden auf Grund ihres Entwicklungstempo und ihrer Sporenbildungsfähigkeit selektiert. Die Sporen der ausgewählten Kolonien wurden nach ihrer Vermehrung isoliert und unter parasitische Bedingungen gebracht, d.h. es wurden die Ähren **WARNUNG** Ende CLMS Feld konnte Anfang DESC uberlappen**.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH132380A CH649779A5 (en) | 1980-02-19 | 1980-02-19 | Process for the preparation of spore cultures of an ergocristine-producing Claviceps purpurea strain which is virulent on rye |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH132380A CH649779A5 (en) | 1980-02-19 | 1980-02-19 | Process for the preparation of spore cultures of an ergocristine-producing Claviceps purpurea strain which is virulent on rye |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CH649779A5 true CH649779A5 (en) | 1985-06-14 |
Family
ID=4207755
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CH132380A CH649779A5 (en) | 1980-02-19 | 1980-02-19 | Process for the preparation of spore cultures of an ergocristine-producing Claviceps purpurea strain which is virulent on rye |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CH (1) | CH649779A5 (de) |
-
1980
- 1980-02-19 CH CH132380A patent/CH649779A5/de not_active IP Right Cessation
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE68914344T2 (de) | Immununterdrückende Verbindungen. | |
| DE3051175C2 (de) | ||
| DE2035814B2 (de) | Pleuromutilin-Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung | |
| DE2028403C3 (de) | Pepstatin | |
| DE2428957C2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Desacetoxycephalosporin C | |
| DE3006989C2 (de) | ||
| CH649779A5 (en) | Process for the preparation of spore cultures of an ergocristine-producing Claviceps purpurea strain which is virulent on rye | |
| DE3104151C2 (de) | ||
| DE69219720T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Streptovaricin C | |
| DE2316429A1 (de) | Verfahren zur herstellung eines neuen metaboliten | |
| DE3881566T2 (de) | Antitumor-derivate, verfahren zu ihrer herstellung und pharmazeutische zusammensetzungen, die sie enthalten. | |
| DE1792038C3 (de) | Verfahren zur Herstellung einer Mischung von etwa gleichen Teilen Ergotamin und Ergocryptin | |
| CH664758A5 (de) | Verfahren zur herstellung von clavin-mutterkornalkaloiden. | |
| AT267057B (de) | Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums | |
| DE69821843T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von C9,C11 und C13 Alkanolen und dazu fähiger Mikroorgamismus | |
| DE1617910A1 (de) | Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Steffisburgensimycin | |
| AT269363B (de) | Verfahren zur Herstellung eines Produktionsstammes einer Claviceps purpurea (Fr.) Tul.-Kultur zur Erzeugung von Mutterkornalkaloiden | |
| DE3115516A1 (de) | Verfahren zur herstellung von inokulum fuer die produktion von zitronensaeure | |
| DE3228062A1 (de) | Produktionsstamm von claviceps purpurea | |
| HU176003B (hu) | Eljárás ergokrisztint termelő, rozsra-virulens Claviceps purpurea törzs spóratenyészetének előállítására | |
| CS222689B2 (cs) | Způsob přípravy spor kmene Claviceps purpurea | |
| DD295871A5 (de) | Verfahren zur mikrobiellen herstellung von cyclosporinen | |
| DE2011618A1 (de) | Enzyme zur Hydrolyse von Dextran | |
| DE2608337A1 (de) | Neue organische verbindung, ihre herstellung und verwendung | |
| DD288396A5 (de) | Verfahren zur verbesserung der genetischen stabilitaet rhizosphaerer mikroorganismen |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PL | Patent ceased | ||
| PL | Patent ceased |