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PATENTANSPRÜCHE
Verfahren zur Herstellung von zur Drogenproduktion verwendbaren Sporenkulturen eines Ergocristin produzieren den, auf Roggen virulenten Claviceps purpurea Stammes, da durch gekennzeichnet, dass man die Sporenkultur durch
Züchten des bei dem ungarischen Landesinstitut für Volkshygiene unter Nr. OKI 00163 deponierten Claviceps purpurea
Stammes herstellt.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Sporenkultur eines neuen, Ergocristin produzierenden, auf Roggenpflanzen virulenten Claviceps purpurea Stammes.
Zur Herstellung von Mutterkornalkaloiden sind zur Zeit zwei verschiedene Wege bekannt, einerseits die klassischen Verfahren, in welchen die auf Roggenpflanzen gezüchteten und eingesammelten Drogen als Ausgangsstoff verwendet und die Alkaloide aus diesen durch Extraktion gewonnen werden, und andererseits die auf sterile Fermentation mit geeigneten Claviceps Stämmen gegründete Alkaloidproduktion. Es sind schon mehrere, grossbetrieblich ausführbare Verfahren zur Realisierung der letzteren Methode bekannt (vgl. z.B. die ungarischen Patentschriften Nr. 150 631, 151 724, 238 und 164 816), doch hat die Züchtung von Mutterkorn-Drogen seine Bedeutung nicht verloren; ein erheblicher Teil der Weltproduktion von Peptidalkaloiden ist auch heute noch auf die Verwendung von gezüchteten, an verschiedenen Alkaloid-Typen angereicherten Drogen basiert.
Das ist besonders der Fall in der Produktion von Ergocristin und Ergotamin. Die Seitenkette der Peptidalkaloide besteht aus Prolin, einer Gruppe von charakteristischen Aminosäuren und aus einer für das betreffende Alkaloid (innerhalb der erwähnten Gruppe) spezifisch charakteristischen Aminosäure. Die für die erwähnten beiden Alkaloide (Ergocristin und Ergotamin) charakteristische Aminosäure ist das Phenylalanin. Es ist aber äusserst schwierig, die Bildung bzw. die Überproduktion von Phenylalanin während der sich innerhalb von einigen Tagen abspielenden fermentativen Biosynthese zu sichern, da während der selben Zeit auch der biosynthetische Aufbau des Lysergsäure-Teils des Alkaloidmoleküls stattfindet und dazu aus der Synthese der aromatischen Aminosäuren erhebliche Mengen von Tryptophan erforderlich sind.
Im Laufe der Aufrechterhaltung des Stammes und der auf einander folgenden Umimpfungen kann daher der ursprünglich anwesende Anteil der Ergotamin und Ergocristin produzierenden Stämme durch die ausgleichende Regulation der Stoffwechselwege in die Richtung der Produktion von Ergocornin und dann von wasserlöslichen Alkaloiden verschoben werden. Auch dieser Umstand dürfte dazu beigetragen haben, dass gewisse Fermentationsverfahren später nicht mehr mit Erfolg reproduziert werden konnten (vgl. z.B. tschechoslovakische Patentschrift 104 613, DE-PS 1 215 637, GB-PS 1192 912). Da man bei den auf die Aufarbeitung von Drogen basierten Verfahren mit solchen Schwierigkeiten nicht rechnen muss, werden solche Verfahren auch weiterhin in grossem Massstab verwendet und es besteht auch weiterhin der Bedarf nach der technologischen Weiterentwicklung solcher Verfahren.
Die grundlegende Bedingung einer solchen Weiterentwicklung ist aber die Herstellung von Claviceps purpurea Stämmen mit entsprechend hoher Alkaloidproduktionsfähigkeit.
Verschiedene Verfahren zur Herstellung von Claviceps purpurea Stämmen mit guter Produktionsfähigkeit für Ergolin-Alkaloiden wurden schon in mehreren Patentschriften beschrieben; es wurden verschiedene Wege zur Gewinnung von Stämmen mit höherer Produktionsfähigkeit vorgeschlagen.
Nach dem in der sowjetischen Patentschrift 232 468 beschrie benen Verfahren wird ein durch bestimmte kolonienmorpho logische Eigenschaften und Sporenmasse gekennzeichneter
Stamm für die Produktion von Ergotoxin ausgewählt. In der sowjetischen Patentschrift 232467 ist ein auf künstlichem
Nährboden beinahe mit den obigen identische morphologi sche Eigenschaften zeigender, in 80% Ergocryptin produzie render Stamm beschrieben. In der ungarischen Patentschrift
154 035 ist eine schnell durchführbare und wirksame Methode beschrieben, nach welchem die zur Produktion von Ergotoxin fähige Kulturen auf Grund der Farbe der Kolonien gegenüber den Ergotamin produzierenden Individuen angereichert werden können.
Zur Herstellung von Stämmen mit hoher Alkaloidproduktion sind die folgenden wichtigeren Schritte erforderlich:
1. die Züchtung eines veredelten Claviceps purpurea Stammes;
2. die Herstellung von zur Infizierung von Roggenpflanzen geeigneten Sporen durch fermentative Vermehrung des Stammes,
3. die Konservierung dieser Sporen bis zu deren Verwendung.
Die Zielsetzung der vorliegenden Erfindung war die Herstellung eines besonders Ergocristin in höherer Ausbeute produzierenden Stammes, welcher besonders die folgenden vorteilhaften Eigenschaften zeigt: - der Stamm zeigt an künstlichen Nährböden, sowohl auf Agar-Oberfläche, als auch in submersen, belüfteten Kulturen gute Sporenbildung: - die Sporen sind genügend resistent und somit gut erhaltbar; - die Sporen sind lebensfähig und virulent so dass sie, wenn sie wieder in ein Nährbodenmedium kommen, in 98 bis 100% auskeimen und auf Pflanzen aufgebracht die Pflanze wirksam infizieren; - die Quantität der pro Flächeneinheit produzierten Droge ist hoch; - die Droge zeigt einen hohen Gehalt an Hauptalkaloiden und enthält neben diesen Hauptalkaloiden nur unbeträchtliche Mengen von Nebenalkaloiden.
Der neue Stamm wurde durch die kombinierte Anwendung der geschlechtlichen und der selektiven Veredelung auf die folgende Weise hergestellt:
Aus dem Ausgangsstamm, welcher in der eigenen Sammlung des ungarischen Heilpflanzen-Forschungsinstituts unter Nr. 661/1974 registriert wurde, wurden unter Berücksichtigung der morphologischen Gesichtspunkte gut entwickelte, äusserlich einwandfreie Sklerotien mit glatter Oberfläche ausgewählt. Diese Sklerotien wurden auf feuchten Sand gelegt und 6 Wochen lang zwischen 0 C und 5 C gehalten, dann abgespült und auf einen feucht gehaltenen sterilen Schwamm gebracht. Nach 12 Tagen begann die Entwicklung von Stromen; die erschienenen Stromen haben sich in 6 Tagen voll entwickelt.
Zur Gewinnung von Sporen wurden die Stromen derjenigen Sklerotien ausgewählt, welche nur einige (3 bis 4) Pilzköpfe getrieben haben; von diesen wurden solche Stromen entnommen, deren Durchmesser grösser als 4 mm war und an deren Oberfläche durch mikroskopische Untersuchung die grössten Ausbuchtungen von Peritetien gesichtet wurden.
Diese Stromen wurden dann über einem flüssigen Malz Nährboden, unter sterilen Bedingungen, durch Wärmeeinwirkung zur Sporulation gebracht. Aus der mikroskopisch kontrollierten, Ascosporen enthaltenden Flüssigkeit wurden dann auf festem Malz-Agar-Nährboden Ausbreitungen gemacht. Die sich aus je einer Spore ausbildenden Kolonien wurden auf Grund ihres Entwicklungstempo und ihrer Sporenbildungsfähigkeit selektiert. Die Sporen der ausgewählten Kolonien wurden nach ihrer Vermehrung isoliert und unter parasitische Bedingungen gebracht, d.h. es wurden die Ähren
von sich im Vorantese-Zustand befindenden Roggenpflanzen mit Hilfe von Impfnadeln mit diesen Sporen infiziert. Von den Roggenpflanzen wurden dann diejenigen Sklerotien ausgewählt, bei welchen die Sklerotienansätze innerhalb der kürzesten Zeit nach dem Erscheinen des Honigtaus erschienen sind. Die auf diese Weise eingesammelten Körner wurden durch Dünnschichtchromatographie analysiert. Die weitere Selektion erfolgte auf Grund des Ergocristingehalts und der Menge der anwesenden verunreinigten Nebenalkaloiden.
Die auf diese Weise durch geschlechtliche Vermehrung gewonnenen Sklerotien-Kulturen wurden dann einer weiteren Selektionsreihe unterworfen, in welcher aus den Sklerotienteilchen auf festem Nährboden Kolonien gezüchtet und mit diesen flüssige Nährböden eingeimpft wurden; aus den so hergestellten submersen Kulturen wurden dann in Feldversuchen die am besten sporierenden, lebensfähigsten und höchste Virulenz zeigenden Kulturen auf Grund der Menge und des durchschnittlichen Alkaloidgehalts der produzierten Droge selektiert.
Nach dieser Methode wurde eine Reihe von Selektionen in den auf einander folgenden Schritten von zwei - auch parasitisches Wachstum in sich schliessenden - Vermehrungszyklen durchgeführt, wodurch ein neuer, gegenüber den bisher bekannten Stämmen vorteilhaftere Eigenschaften zeigender Claviceps purpurea Stamm erzeugt werden konnte.
Der neue, bei dem ungarischen Landesinstitut für Volkshygienie H - 1966 Budapest,Gyáli ut 2-4 (OKI) am 2. Mai
1977 unter Nr. MNG 00163 deponierte Stamm ist besonders zur betrieblichen Herstellung von Impfsporen-Präparaten vorteilhaft geeignet, da er die Sporenproduktion der Fermentation erhöht; er zeigt aber auch in der Feldproduktion der Droge vorteilhafte Eigenschaften, erhöht die Menge der produzierten Droge und verbessert erheblich die Qualität der Droge.
In der nachstehenden Tabelle sind die Ergebnisse der mit dem neuen Stamm OKI/MNG 00163 und (zum Vergleich) mit dem Ausgangsstamm Nr. 661/1974 des ungarischen Heilpflanzen-Forschungsinstituts durchgeführten Fermentations- und Feldversuche zusammengefasst.
OKI 661/1974
00163
Sporenproduktionsfähigkeit auf der Oberfläche, Sporenzahl/Rohr 1-2.109 0,5-1,109
Sporenzahl der Fermentations brühe, Sporen/ml 4-5.108 1-2.108
Keimfähigkeit des Impfsporen präparats,% 95-99 9F96
Virulenz (Konzeption im Phy totron, in % der Stiche) 70-80 50-60
Gewicht von 1000 Körner, g 175-200 140170
Drogenproduktion kg/ha (im Versuchswerk) 200-350 150-220 Ergocristingehalt, mg/g 5,0-6,2 2,6 -3,6
Nebenalkaloide:
Ergometrin, mg/g 0,2-0,3 0,1 -0,2
Ergotamin, mg/g Spuren 0,05-0,1
Gehalt an fetten Olen, % 15-20 16-18 Ergocristinproduktion, g/ha [Durchschnitt kg/ha.
Durch schnitt mg/g] 1540 590
Die morphologische Charakterisierung des durch die er findungsgemässe Selektion erhaltenen neuen Stammes und des Ausgangsstammes:
Stamm OKI 00163: a) Malz-Agar: nach 28 Tagen weisse, 0,5 bis 0,6 cm grosse Kolonien mit kurzen Luftmyzelien; vom 12 Tag Konidienbildung; Grössenverteilung der Konidien: 1,3 llm bis 3,8 ,um, häufigste Grösse: 2,5 llm.
b) Mannit-Citrat-Agar: nach 28 tagen flache, cremefarbige, 1,0 bis 1,5 cm grosse, faltige Kolonien; Konidienbildung vom 15. Tag angefangen.
c) Durchschnittliche Grösse der Konidien (von 100 unausgewählten Körnern) 2,5 llm; Oberfläche glatt.
Ausgangsstamm 661/1974: a) Malz-Agar: nach 28 Tagen grauweisse, 0,8 bis 12,0 cm grosse Kolonien, mit ausgebreiteten Luftmyzelien; Konidienbildung vom 15 Tag; durchschnittliche Grösse der Konidien: 3,4 tim.
b) Mannit-Citrat-Agar: nach 28 Tagen weisse, 1,5 bis 2,0 cm grosse, filzartige, ausgebreitete Kolonien; Konidienbildung vom 20. Tag angefangen; durchschnittliche Grösse der Konidien: 4 gm.
c) Durchschnittliche Grösse der Sklerotien (von 100 unausgewählten Körnern) 18 mm; Oberfläche rissig.
Die Impfsporenproduktion der Fermentation wird durch die Anwendung des neuen Stammes auf das Zweifache erhöht; die Drogenproduktion wird um 50% erhöht und der Alkaloidgehalt der erhaltenen Droge ist beinahe um 100% höher. Durch den wesentlich höheren Alkaloidgehalt wird auch die Alkaloidausbeute-günstig beeinflusst; als weiterer Vorteil kann noch erwähnt werden, dass die Erhöhung des Alkaloidgehalts nicht von einer erhöhten Anhäufung der Fettstoffe begleitet wird, so dass die relative Menge der Fettstoffe in der Droge niedriger wird.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird durch die nachstehenden Beispiele näher veranschaulicht.
Beispiels
In einem Glasfermentor mit 5 Liter Rauminhalt wird eine 24 Tage alte Malz-Agar-Kultur des Stammes OKI 00163 auf einen Nährboden mit folgender Zusammensetzung geimpft: Malzextrakt 2,0% Kartoffelpulver 1,0% Glucose 0,5% pH-Wert des Nährbodens: 6,0
Die Kultur wird bei 24 C, unter Rühren mit 440 U/min Belüftung mit 0,5 Liter Luft pro Liter Fermentationsflüssigkeit pro Minute 3 Tage langinkubiert.
Mit der auf obige Weise erhaltenen Inoculum-Kultur werden dann 100 Liter Nährboden der folgenden Zusammensetzung eingeimpft: Mannit 8,0% Citronensäure 0,7% Maisquellwasser (auf Trockensubstanz berechnet) 0,1% Kaliumdihydrogenphosphat 0,025% Magnesiumsulfat 0,025%
Die Fermentation wird in einem mit Rührwerk ausgerüsteten, säurefesten Fermentor mit 160 Liter Rauminhalt durchgeführt.
Die Inkubation wird bei 24 C, unter Rühren mit 230 U/min und Belüftung mit 1,0 Liter Luft pro Liter Fermenta tionsflüssigkeit pro Minute, bei pH 4,5 bis 5,0, sechs Tage lang fortgesetzt. Der pH-Wert der Fermentationsflüssigkeit wird durch die Zugabe von Ammoniumhydroxyd zwischen den angegebenen Grenzen gehalten.
Am Ende der Fermentation zeigt die Fermentationsflüssigkeit eine Sporenzahl von 4,2:108/ml.
Die erhaltene Biomasse wird abgetrennt, mit 30 Liter 10%aber Saccharoselösung verdünnt, in Flaschen abgefüllt und unter Tielkühlung aufbewahrt.
Das auf obige Weise erhaltene Impfsporen-Präparat zeigt 99% Keimfähigkeit. Dieses Impfsporen-Präparat wird dann auf eine Konzentration von 30 000 Sporen/mm3 verdünnt und in diesem Zustand zum Infizieren von Roggenpflanzen vor der Ahrenbildung verwendet. Aus dem Ernteertrag werden auf diese Weise 250 kg Droge pro ha gewonnen; der Gehalt der Droge an fetten Olen beträgt 20%.
Ergocristingehalt: 6,2 mg/g Ergotamingehalt: 0,1 mg/g Ergometringehalt: 0,2 mg/g.
Beispiel 2
Der Stamm OKI 00163 wird auf Malz-Agar bei 24 C 21Tage inkubiert; die erhaltenen Sporen werden mit steriler physiologischer Kochsalzlösung von der Oberfläche der Kultur abgewaschen. Mit dieser sporenhaltigen Kochsalzlösung werden dann die im Phytotron gezüchteten Roggenpflanzen infiziert; die Sporen werden mit Hilfe einer Injektionsspritze, durch 5 Stiche je Ähre in den Pflanzenkörper eingebracht.
Zum Vergleichen wurde die gleiche Prozedur mit dem Ausgangsstamm 661/1974 in gleicher Weise durchgeführt. Mit den beiden Stämmen wurden je 100 Ahren infiziert.
Die voll entwickelten Sklerotien wurden in reifem Zustand eingesammelt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst: Stamm Sklerotien Gesamtgewicht Ergocristin (Stück) der Sklerotien gehalt, mg/g OKI00613 470 79g 5,9 661/1974 420 57g 3,0
Beispiel 3
Eine auf Malz-Agar gezüchtete, 28 Tage alte Kultur des Stammes OKI 00163 wurde mit steriler Kochsalzlösung abgewaschen und die Sporenzahl der Waschflüssigkeit auf 30 000 Sporen/mm3 eingestellt. Mit dieser Flüssigkeit wurden auf 30 m2 grosse Versuchsparzellen Roggenpflanzen in vier Parallelversuchen infiziert. Zum Vergleich wurden unter identischen Umständen Parallelversuche mit einer auf gleiche Weise vorbereiteten Kultur des Ausgangsstammes 661/1974 durchgeführt.
Die Infizierung wurde mit der Hand, mit Hilfe von zierplatten durchgeführt; die reifen Sklerotien wurden ebenfalls mit der Hand, verlustfrei eingesammelt. Die mit dem neuen Stamm und mit dem zum Vergleich eingesetzten Ausgangsstamm erzielten Erträge wurden in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst: Stamm Gewicht Ergo- Ernte- Ergo von 1000 cristin- ertrag cristin
Körner gehalt ertrag g mg/g kg/ha g/ha OKI 00163 190 6,10 390 2380 661/1974 160 3,26 210 685