CS222689B2 - Způsob přípravy spor kmene Claviceps purpurea - Google Patents

Abstract

Vynález se týká způsobu přípravy spor kmene Claviceps purpurea, jehož podstata spočívá v tom, že se z výchozího kmene 661/1974 vyberou vyvinuté sklerooia, tato se nechají vyklíčit, největší svazky sklerocií se oddělí a za sterilních podmínek se kultivují ve sladinkové živné půdě pod mikroskopickou kontrolou. Vzniklé askospory se převedou na sladinkový agar, načež se vyvinutými vitálními, virulentními a dobře sporulujícími koloniemi infikují rostliny žita a celý postup se případně opakuje.

Description

Vynález se týká způsobu výroby kultury spor nového kmene Claviceps purpurea virulentního na žitu, produkujícího ergokristin.

Pro výrobu námelových alkaloidů jsou dnes známy dvě různé cesty, jednak klasické způsoby, u nichž se jako výchozí látka používají drogy kultivované a sbírané na žitu, z nichž se alkaloidy získávají extrakcí a jednak výroba alkaloidů, založená na sterilní fermentaci vhodných kmenů Claviceps. Pro realizaci posledně jmenované metody je známo již více způsobů, které lze provádět velkoprovozně (srovn. např. maSarské patentní spisy ě. 150 631,

151 724, 152 238 a 164 816), přesto ale pěstování námelových drog neztratilo na svém významu; podstatná 6ást světové produkce peptidických alkaloidů je i dnes ještě založena na použití kultivovaných drog, obohacených různými typy alkaloidů. To je zejména případ výroby ergokristinu a ergotaminu. Postranní řetězce peptidických alkaloidů sestává z prolinu, skupiny charakteristických aminokyselin a z aminokyseliny specifické pro dotyčný alkaloid ( v rozmezí zmíněné skupiny). Aminokyselina, charakteristická pro oba zmíněné alkaloidy (ergokristin a ergotamin) je fenylalanin. Je ale nejvýš obtížně zajistiti tvorbu popřípadě nadprodukci fenylalaninu během fermentativní biosyntézy, odehrávající se v průběhu několika dnů, nebol během téže doby probíhá i biosyntetická výstavba části kyseliny lysergové v molekule alkaloidu a k tomu jsou nezbytná značná množství tryptofánu ze syntézy aromatických kyselin.

Během udržování kmene a po sobě následujících přeočkování může proto původně přítomný podíl kmenů, produkujících ergotamin a ergokristin být vyrovnávající regulací cesty látkové výměny posunut do směru produkce ergokorninu a potom alkaloidů, rozpustných ve vodě.

I tato okolnost by mohla přispět k tomu, aby se určité způsoby fermentace později již nemohly s úspěchem reprodukovat (srovn. např. čs. patentní spis 104 613, NSR patentní spis 1 215 637, brit. patentní spis 1 192 912). Vzhledem k tomu, že se u způsobů, založených na zpracování drog, nemusí s podobnými potížemi počítat, používají se i dále tyto způsoby ve velkém měřítku a i nadále je potřeba takovéto způsoby technologicky dále vyvíjet. Základní podmínky takovéhoto dalšího vývoje je avšak výroba kmenů Claviceps purpurea s přiměřeně vysokou schopností produkce alkaloidů.

V řadě patentních spisů byly již popsány různé způsoby výroby kmenů Claviceps purpurea s dobrou produkční schopností ergolinových alkaloidů; byly navrženy různé cesty získání kmenů s vyšší produkční schopností. Podle způsobu, popsaného v sovětském patentním spise 232 488 se pro výrobu ergotoxinu vybere kmen vyznačující se určitými morfologickými vlastnostmi kolonií a rozměry spor. V sovětském patentním spisu 232 467 je popsán kmen, vykazující na umělých živných půdách téměř se shora uvedenými identické morfologické vlastnosti, produkující 80 % ergokryptinu. V maSarském patentním spisu 154 035 je popsána rychle proveditelná a účinná metoda, podle níž se kultury schopné produkovat ergotoxin mohou na základě barvy kolonií obohatit vůči individuím produkujícím ergotamin.

Pro výrobu kmenů s vysokou produkcí alkaloidů jsou potřebné následující důležitější kroky:

1. Kultivace zuělechtěného kmene Claviceps purpurea;

2. Výroba spor vhodných pro infikování žita, fermentativním rozmnožováním kmene;

3. Konzervováni spor až do jejich použití.

Cílem předloženého vynálezu byla výroba kmene, produkujícího ve zvýšených výtěžcích především ergokristin, který vykazuje zejména následující výhodné vlastnosti:

- kmen vykazuje na umělých živných půdách, jak na povrchu agaru, tak i v submeržních, provětrávaných kulturách dobrou tvorbu spor;

- spory jsou dostatečně rezistentní a dají se tedy dobře uchovávat; ,

- spory jsou schopné života a virulentní, takže, když přijdou znovu do prostředí živné půdy vyklíčí z 98 až 100 % a přeneseny na rostliny účinně tyto rostliny infikují;

- kvantita drogy produkované na jednotku plochy je vysoká;

- droga vykazuje vysoký obsah hlavních alkaloidů a vedle těchto hlavních alkaloidů obsahuje jen nepatrná množství vedlejších alkaloidů;

Nový kmen byl podle vynálezu vyroben kombinovaným použitím pohlavního a selektivního zušlechlování nésledujícícm způsobem:

Z výchozího kmene, který byl registrován ve vlastní sbírce maďarského výzkumného ústavu pro léčení rostlin pod č. 661/1974, byly vybrány s přihlédnutím k morfologiekým hlediskům dobře vyvinutá, zevně bezvadná sklerocia s hladkým povrchem. Tato sklerocia byla položena na vlhký písek a po dobu 6 týdnů udržována při teplotě mezi 0 až 5 °C, potom opláchnuta a nanesena na sterilní houbu, která byla udržována vlhká. Po 12 dnech počal vývoj svazků vláken; svazky vláken, které se objevily se úplně vyvinuly za 6 dní. Pro získání spor byly vybrány ty svazky vláken, které vyhnaly jen několik paliček (3 až 4); z těchto byly vybrány ty svazky vláken, jejichž průměr byl větší než 4 mm a na jejichž povrchu byla na základě mikroskopického zjištění nalezena největší plodnicová lůžka s periteciemi. Tyto svazky vláken byly potom přivedeny na tekuté sladové živné půdě za sterilních podmínek působením tepla ke sporulaci.

Z mikroskopicky kontrolované kapaliny, obsahující askospory byly potom udělány na pevné slad-agarové živné půdě rozlivky. Kolonie, tvořící se z každé spory byly vybírány na základě tempa jejich vývoje a jejich schopnosti tvořit spory. Spory vybraných kolonií byly po svém znemožnění izolovány a byly pro ně vytvořeny parazitické podmínky, tj. těmito sporami byly infikovány pomocí očkovacích jehel klasy žita před antézí. Ze žita byla potom vybrána ta sklerocia, u kterých se zárodky sklerocií objevily během nejkratšího času po objevení se medové šlávy. Tímto způsobem sebraná zrna byla analyzována chromatografii na tenké vrstvě. Další výběr následoval na základě obsahu ergokristinu a množství přítomných znečišlujícich vedlejších alkaloidů.

Kultury sklerocií získané tímto způsobem pohlavním rozmnožováním byly potom podrobeny další řadě selekce, při které byly z částic sklerocií kultivovány na pevné živné půdě kolonie a těmito byly očkovány tekuté živné půdy; ze submerzních kultur, vyrobených tímto způsobem byly potom při polních pokusech vybrány nejlépe sporující, vitální a největší virulenci vykazující kultury na základě množství a průměrného obsahu alkaloidů produkované drogy.

Podle této metody byla provedena řada selekcí v po sobě následujících krocích dvou - i parazitický růst v sobě zahrnujících rozmnožovacích cyklech - čímž mohl být vyroben nový, oproti dosud známým kmenům výhodnější vlastnosti vykazující kmen Claviceps purpurea.

Nový kmen, deponovaný v maďarském Zemském ústavu pro hygienu lidu (OKI) pod číslem 00163, se zejména dobře hodí pro provozní výrobu preparátů pro očkování sporami, nebot zvyšuje produkci spor při fermentací; tento kmen ukazuje ale i při polní produkci drogy výhodné vlastnosti, zvyšuje množství produkované drogy a zlepšuje značně kvalitu drogy.

V dále uvedené, tabulce jsou shrnuty výsledky fermentačních a polních pokusů, provedených s novým kmenem OKI 00163 (pro srovnání) s výchozím kmenem č. 661/1974 maáarského výzkumného ústavu pro léčení rostlin.

222689 4

Tabulka

	OKI 00163	661/1974
produkční schopnost spor na povrchu,
počet spor/trubici	1 až 2.10s	0,5 až 1.10’
počet spor ve fermentační břečce, spory/ml '	4 až 5.10®	1 až 2.10®
klíčivost preparátu pro očkování sporami, %	95 až 99	90 až 96
virulence (koncepce ve fytotronu,
v % vpichů)	70 až 80	50 až 60
hmotnost 1 000 zrn, g	175 až 200	140 až 170
produkce drog kg/ha (při pokusech)	200 až 350	150 až 220
obsah ergokrietinu, mg/g	5,0 až 6,2	2,6 až 3,6
vedlejší alkaloidy:
ergometrin mg/g	0,2 až 0,3	0,1 až 0,2
ergotamin mg/g	stopy	0,05 až 0,1
obsah mastných olejů, %	15 až 20	16 až 18
produkce ergokrietinu, g/ha
(průměr kg/ha.průměr mg/g)	1 540	590

Morfologické charakteristika nového kmene, získaného selekcí podle vynálezu a výchozího kmene:

Kmen OKI 00163:

a) Slad-agar: po 28 dnech bílé, 0,5 až 0,6 cm velké kolonie s krátkými vzdušnými mycelii; počínaje 12. dnem tvorba konidií podle velikosti: 1,3 ^um až 3,8/jm, nejčastější velikost: 2,5 ^um.

b) Mannit-citrét-ager: po 28 dnech ploché, krémově zbarvené, 1,0 až 1,5 cm velké, řasnaté kolonie; tvorba konidií počínaje 15. dnem.

c) Průměrná velikost konidií (100 nevybraných zrn) 2,6,/im; povrch hladký.

Výchozí kmen 661/1974:

a) Slad-agar: po 28 dnech šedobílé, 0,8 až 12,0 cm velké kolonie, s rozšířenými vzdušnými mycelii; tvorba konidií počínaje 15. dnem; průměrná velikost konidií: 3,4 /un.

b) Mannit-citrát-agar: po 28 dnech bílé, 1,5 až 2,0 cm velké, plstnaté, rozšířené kolonie ;. tvorba konidií počínaje 20. dnem; průměrná velikost konidií: 4/im.

o) Průměrná velikost sklerocií (100 nevybraných zrn) 18 mm; povrch popraskaný.

Produkce očkovacích spor z fermentace se zvýší použitím nového kmene na dvojnásobek; produkce drogy se zvýší o 50 % a obsah alkaloidů získané drogy je téměř o 100 % vyšší. Podstatně vyěším obsahem alkaloidů se také ovlivní příznivě výtěžek alkaloidů; jako další přednost lze uvést, že zvýšení obsahu alkaloidů není doprovázeno zvýšeným nahromaděním mastných látek, takže relativní množství mastných látek v droze je nižší. Způsob podle vynálezu je blíže vysvětlen pomocí následujících příkladů.

Příklad 1

Ve skleněném fermentoru o objemu 5 litrů se očkuje 24 dnů stará slad-agarová kultura kmene OKI 00163 na živné půdě následujícího složení:

sladový výtažek 2,0 % bramborový prášek 1,0% glukóza 0,5 % hodnota pH živné půdy 6,0 . Kultura se při 24 °C, za míchání při otáčkách 440 ot./min, provětrávání 0,5 litru vzduchu na litr fermentační kapaliny za minutu, inkubuje 3 dny.

Kulturou inokula, získanou shora uvedeným způsobem se potom naočkuje 100 litrů živné půdy následujícího složení:

mannit 8,0 % kyselina citrónová 0,7 % nabotnávací kukuřičná voda (počítáno na sušinu) 0,1 % dihydrogenfosforečnan draselný 0,025 % síran hořečnatý 0,0025 %

Fermentace se provádí ve fermentoru o obsahu 160 litrů, vybaveném míchadlem a odolném vůči kyselinám.

Inkubace pokračuje při 24 °C, za míchání při 230 ot./min a provzdušňování 1,0 litrem vzduchu na litr fermentační kapaliny za minutu, při pH 4,5 až 5,0 šest dní. Hodnota pH fermentační kapaliny se udržuje přídavkem hydroxidu amonného v uvedených mezích.

Q

Na konci fermentace vykazuje fermentační kapalina poče< spor 4,2:10 /ml.

Získaná biomasa se oddělí, zředí 30 litry 10% roztoku so harózy, naplní do lahví a uchovává za hlubokého chlazení.

Shora uvedeným způsobem získaný preparát očkovacích spor vykazuje 99 % klíčivosti. Tento preparát očkovacích spor se zředí na koncentraci 30 000 spor/mm³ a v tomto stavu se použije k infikováni žita před tvorbou klasů. Z výtěžku sklizně se tímto způsobem získá 250 kg drogy z hektaru; obsah mastných olejů v droze činí 20 %.

Obsah ergokristinu: 6,2 mg/g

Obsah ergotaminu: 0,1 mg/g

Obsah ergometrinu: 0,2 mg/g.

Příklad 2

Kmen OKI 00163 se inkubuje na slad-agaru při 24 °C 2, dní; získané spory se smyjí s povrchu kultury sterilním fyziologickým roztokem kuchyňské soli. Tímto roztokem kuchyňské soli, obsahujícím spory se potom ve fytotronu infikují kultivované rostliny žita; spory se injikují, vnáší injekční stříkačkou, pěti vpichy do každého klasu do těla rostliny. Pro srovnání byla stejná procedura provedena s výchozím kmenem 661/1974, a to stejným způsobem. Oběma kmeny bylo infikováno vždy 100 klasů.

Plně vyvinutá sklerocia byla sebrána ve zralém stavu. Získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce:

Kmen	Sklerocia (kusy)	Celková hmotnost sklerocií	Obsah ergokristínu mg/g
OKI 00613	470	79 g	5,9
661/1974	420	57 g	3,0

Příklad 3

Kultura kmene OKI 00163, 28 dní stará, kultivovaná na slad-agaru byla smyta sterilním roztokem kuchyňské soli a počet spor byl nastaven kapalinou na 30 000 spor/mm . Touto kapa2 linou byly na 30 m velké pokusné parcele infikovány rostliny žita ve čtyřech souběžných pokusech. Pro srovnání byly za identických podmínek provedeny paralelní pokusy s předem stejným způsobem připravenou kulturou výchozího kmene 661/1974.

Infikování bylo provedeno ručně pomocí infikovacích destiček; zralá sklerocia byla rovněž ručně beze ztrát sebrána. Výsledky dosažené s novým kmenem a pro srovnání s použitým výchozím kmenem byly shrnuty v dále uvedené tabulce.

Kmen	Hmotnost 1 000 zrn g	Obsah ergokristinu mg/g	Výtěžek sklizně kg/ha	Výtěžek ergokristinu g/ha
OKI 00163	190	6,10	390	2 380
661/1974	160	3,26	210	685

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

Claims (1)

1. Způsob přípravy spor kmene Claviceps purpurea, virulentního na žitu a produkujícího ergokristin, vyznačený tím, že se z kmene Claviceps purpurea 661/1974 vyberou vyvinutá sklerocia, která se nechají vyklíčit, největší svazky sklerocií se oddělí a za sterilních podmínek se kultivují ve sladinkové živné půdě, vzniklé askospory se převedou na sladinkový agar, načež se vitální, virulentní a dobře sporulující kolonie infikují do rostlin žita a celý cyklus se případně opakuje.