CH632011A5 - Process for the preparation of 7-methoxycephalosporin derivatives - Google Patents

Description

  
 

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   PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung von 7-Methoxycephalosporinderivaten mit der Formel (A)
EMI1.1     
 worin R2 eine Stickstoff als Ringheteroatom enthaltende heterocyclische Gruppe darstellt und M bedeutet ein Wasserstoffatom, Alkalimetall, Erdalkalimetall, Schwermetall oder Basen die quaternäres Salz oder Aminsalz bilden, dadurch gekennzeichnet, dass Streptomyces oganonensis ATCC 31167 in einem Kulturmedium gezüchtet wird, welches Nährstoffe mit dem Zusatz eines heterocyclischen Thiols mit der Formel
R2SH, worin R2 die vorstehend genannte Bedeutung hat, oder eines Salzes des heterocyclischen Thiols oder eine Verbindung mit der Formel
R2-S-S-R2, worin R2 die gleiche schon genannte Bedeutung hat, enthält.



   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R2 eine 1-Methyl-1 H-tetrazol-5-ylgruppe ist und M ein Wasserstoffatom darstellt.



   3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R2 eine   5-Carboxymethylthio-1 ,3,4thiadiazol-2-ylgruppe    und M ein Wasserstoffatom darstellt.



   4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R2 eine   5-Methyl-1,3,4-thiadiazol-2-ylgruppe    und M ein Wasserstoffatom darstellt.



   5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R2 eine   1 ,3,4-Thiadiazol-2-ylgruppe    und M ein Wasserstoffatom ist.



   Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 7-Methoxycephalosporinderivaten mit der Formel (A)
EMI1.2     
 worin R2 eine Stickstoff als Ringheteroatom enthaltende hete rocyclische Gruppe darstellt und M bedeutet ein Wasserstoff atom, Alkalimetall, Erdalkalimetall, Schwermetall oder Basen, die quaternäres Salz oder Aminsalz bilden, dadurch gekenn zeichnet, dass Streptomyces oganonensis ATCC 31167 in einem Kulturmedium gezüchtet wird, welches Nährstoffe mit dem Zusatz eines heteroyclischen Thiols mit der Formel
R2SH, worin R2 die vorstehend genannte Bedeutung hat, oder eines Salzes des heterocyclischen Thiols oder eine Verbindung mit der Formel    R2-S-S-R2,    worin R2 die gleiche schon genannte Bedeutung hat, enthält.



   Als stickstoffhaltige heterocyclische Gruppe, die durch R2 in der vorstehenden allgemeinen Formel angezeigt wird, werden zur Verdeutlichung genannt: eine Carboxymethylthio-1,3thiadiazol-2-yl-Gruppe, eine   1 -Methyl-1 H-tetrazol-5-yl-Gruppe,    eine   5-Methyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl-Gruppe,    eine   1 ,3,4-Thiadia-    zol-2-yl-Gruppe usw.



   Der durch M dargestellte kationische Rest, der das Salz des Cephalosporins bildet, bedeutet einen anorganischen Rest oder einen organischen Rest. Als anorganischer Rest wird ein Alkalimetall, wie Natrium, Kalium usw.; ein Erkalkalimetall, wie Calcium, Magnesium, Barium usw.; sowie ein Schwermetall, wie Eisen, Kupfer, Zink usw. verwendet; als organischen Rest dienen Basen, die quaternäre Salze oder Aminsalze bilden, zum Beispiel Triäthylamin, Diäthanolamin, Piperidin, Morpholin usw.

  Praktische Beispiele für Verbindungen dieser Erfindung sind   745-Amino-5-carboxyvaleramidof345-carboxymethylthio-      1 ,3,4thiadiazol-2-yl > thiomethylj-methoxy-A    3-cephem4-carbonsäure,   75-Amino-5-carboxyvaleramido > 3-(1-methy1-1 H-      tetrazol-5-yl)thiomethyl-7-methoxy-h    3-cephem4-carbonsäure,   745-Amino-5-carboxyvaleramidof7-methoxy:345-methyl-1,3,4-    thiadiazol-2-yl)thiomethyl-A 3-cephem4-carbonsäure,   745-      Amino-5-carboxyvaleramidof7-methoxy-341    ,3,4-thiadiazol-2yl)thiomethyl- A3-cephem4-carbonsäure, sowie die Salze dieser Verbindungen.



   Einige 7-Methoxy-3-heterocyclothiomethylcephalosporine sind in der GB-PS 1 321 412 (1970) als durch chemische Synthese erhältliche Verbindungen beschrieben, jedoch sind in dieser britischen Patentschrift keine praktischen physikalischen und chemischen Eigenschaften dieser Verbindungen angegeben.  



   Aufgabe dieser Erfindung ist es, neue 7-Methoxycephalo



  sporinderivate und ein Verfahren zur Herstellung dieser Derivate durch Fermentation zur Verfügung zu stellen.



   Cephalophorine besitzen ausgezeichnete antimikrobielle Aktivitäten gegen gram-positive und gram-negative Bakterien, und unter diesen Verbindungen besitzen die Cephalosporinderivate mit einer Methoxygruppe in der 7-Position und einer heterocyclischen Thiomethylgruppe in der 3-Position ganz ausgezeichnete Wirkung bei der Behandlung von ernsthaften Erkrankungen, die durch die Infektion mit Bakterien, wie Pseudomonas und Proteus hervorgerufen werden, gegen die gewöhnliche Antibiotica nicht wirksam sind, oder die durch die Infektion mit den Bakterien hervorgerufen werden, die nicht empfindlich sind gegen gewöhnliche Cephalosporine, welche keine Methoxygruppe in der 7-Position aufweisen.



   Diese Verbindungen werden gewöhnlich hergestellt, indem zuerst die entsprechenden Verbindungen, die eine Acetoxymethylgruppe oder eine Carbamoyloxymethylgruppe in der 3-Position aufweisen, hergestellt werden, und zwar durch ein Fermentationsverfahren, und dann werden diese Verbindungen mit einer heterocyclischen Thiolverbindung umgesetzt.



   Einerseits hat die vorliegende Erfindung auch einen solchen Vorteil, dass die Verbindung mit einer heterocyclischen Thiomethylgruppe in der 3-Position direkt durch eine einzige Fermentationsstufe erhalten werden kann. Die so erhaltene Verbindung ist die Verbindung mit der allgemeinen Formel (A).



   Die Verbindungen der Formel A besitzen selbst ausgezeichnete antimikrobielle Aktivitäten, und weiterhin können die antimikrobiellen Eigenschaften und die antimikrobiellen Spektren der Verbindungen erhöht oder gewechselt werden, indem die Acylgruppen-Seitenkette in der 7-Position, dargestellt durch
EMI2.1     
 mit einer anderen Acylgruppe, wie z. B. a-Aminophenylacetylgruppe, a-Carboxyphenylacetylgruppe, a-Sulfophenylacetylgruppe, a-Hydroxyphenylacetylgruppe, Pyridylthioacetylgruppe, Thiadiazolylthioacetylgruppe, Triazolylacetylgruppe, Cyanomethylthioacetylgruppe, Trifluormethylthioacetylgruppe usw., gewechselt oder ausgetauscht werden. So sind die Verbindungen mit der Formel A ebenfalls als Zwischenprodukte verwendbar, um diese Derivate mit diesen Acylgruppen herzustellen.

  Zum Beispiel:   713-CyanomethylthioacetamidoJa-      methoxy-341-methyltetrazol-5-ylthiomethyl)t    3-cephem4-carbonsäure und   7a-Methoxy-341-methyltetrazolS5-ylthiomethylS      7ss4trifluormethylthioacetamidofA    3-cephem4-carbonsäure.



   Die Verbindungen der Formel A besitzen die Eigenschafter wie ein amphoteres Material, denn die Verbindungen haben eine Aminogruppe und zwei Carboxygruppen im Molekül, und dadurch ist die Isolierung und Reinigung der hergestellten Verbindungen mühsam.



   Als Mikroorganismus, der zur Herstellung der 7-Methoxycephalosporin-Antibiotica Verwendung findet und der zu den Streptomyceten gehört, wird in dieser Erfindung ein neuer Stamm benutzt, nämlich Streptomyces oganonensis Y-G19Z, der zuvor von den Erfindern aus dem Erdboden bei der Stadt Ogano, Chichibugun, Bezirk Saitama (Japan), isoliert worden ist. Dieser Stamm ist in dem Institut für Mikrobielle Industrie, Zweigstelle für Industrielle Wissenschaft und Technologie, Ministerium für Internationalen Handel und Industrie, Japan, unter einer Hinterlegungs-Nummer FERM-P 2725 und auch in der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 (USA) am 21. August 1975 unter ATCC No. 31167 hinterlegt worden.



   Die mykologischen Eigenschaften des Stammes sind die fol genden: 1. Morphologische Charakteristiken von Streptomyces oganonensis Y-G19Z-Stamm
Der Stamm wächst sowohl auf natürlichen wie auch auf synthetischen Medien unter Bildung eines gut verzweigten Substratmycels, während die Bildung von atmosphärischem Mycel nicht ausreichend ist, da die Sporenbildung zu gering ist.



  Die Sporenketten sind gerade, gehören zum R- (rectus) oder RF- (Rectiflexibles) Typ und tragen 10 bis 50 Sporen in jeder Kette. Die Sporen sind elliptisch, sphärisch oder zylindrisch geformt und weisen eine Grösse von 0,45 bis   0,60x    0,55 bis 0,90   u    auf. Die Sporenoberfläche ist glatt. Es werden weder Flagellaten-Sporen noch Sporangium beobachtet.



  II. Kultur-Charakteristika des Stammes S. oganonensis Y-G19Z: Medium Wachstum   AtmosphärischesLösliches   
Mycel Pigment Czapek's Agar sehr gering spärlich nein weiss weiss Glukose gut leidlich nein Czapek's Agar cremegelb gelblich-grau sehr gerin Glukose gut gering nein Asparagin- weiss weiss Agar Glycerin gut gering nein Asparagin- weiss bis weiss bis Agar gelblich weiss gelblich weiss Anorganischer gut gering nein Salz-Stärke- gelblich grau gelblich grau Agar bis schwach gelblich braun Tyrosin-Agar gut gering schwach schwach gelb gelblich grau schwach gelblich grau Eisen und gut gut sehr gering Hefeextrakt- schwach gelb   bräunlich weiss hell    bräunlich Tyrosin-Agar bis gelblich bis gelblich grau braun grau Nährboden- gut gut, 

   pulverig schwach Agar schwach schwach gelblich braun gelblich braun orange bis schwach braun Bennett's Agar gut gut sehr schwach schwach bräunlich grau, gelblich braun schwach orange bis schwach rosa Calciummalat- mässig kein kein Agar cremefarbig
Kartoffel- gut gut bräunlich grau stücke schwach gelblich grau bis dunkel gelblich braun bis schwach gelblich braun bräunlich grau Blut-Agar gut kein gelblich grau olivegrau bis bis dunkel dunkel olive rötlich braun grau   Loeffer's    gut kein kein Serum-Medium
III.

  Physiologische Eigenschaften von S. oganonensis Y-G19Z -Stamm: Tyrosin-Formation negativ Nitrat-Reduktion positiv
Magermilch-Koagulation positiv, schwach   Magermilch-Peptonisation positiv, schwach Hydrolyse von Stärke positiv Verflüssigung von Gelatine positiv, schwach Cellulose-Abbau negativ Hämolyse positiv Löslichmachung von Calciummalat positiv
Ausnutzung von Kohlenstoffverbindungen   durch.    oganonensis Y-G19Z Kohlenstoffquelle Ausnutzung Glukose + Arabinose + Sukrose Xylose + Inositol Mannitol + Fruktose + Rhamnose Raffinose Charakteristische Merkmale für Streptomyces oganonensis   Y-G19Z-Stamm    können wie folgt zusammengefasst werden:
1. Es gehört zu dem nicht-chromogenen Streptomyces Stamm;
2. Sein atmosphärisches Mycel ist gerade ohne Verzweigung (R- oder RF-Typ);
3. Sporen sind sphärisch oder elliptisch;
4.

  Sporenoberfläche ist glatt;
5. Es gibt schwach gelblich graue bis schwach gelblich braune Gewächse auf verschiedenen Medien;
6. Die Farbe des sphärischen Mycels ist bräunlich weiss, gelblich weiss und gelblich grau;
7. Die erzeugte antibiotische Substanz Y-G19Z-D3 gehört zur   7-Methoxycephalosporingruppe.   



   Bei der Durchforschung bekannter Stämme, die die vorstehenden Eigenschaften aufweisen, können als am nächsten kommende Streptomyceten die folgenden angesehen werden: Streptomyces globisporus, beschrieben in S. A. Waksman:  The Actinomycetes    2,218(1961)    und International Journal   ol    Systematic Bacteriology, 18,   (4)324-325(1968).   



   Wenn man jedoch den bekannten S. globisporus, der in der vorstehenden Literatur beschrieben ist, mit dem Stamm   Y-Gl9Z    vergleicht, weicht dieser in den folgenden Eigenschaften, die in der Tabelle angegeben sind, ab:
Tabelle Eigenschaften   Y-Gl9Z      S.

   globisporus    Grösse der Spore   (lot)    0,45-0,60x0,55- 1,2-1,4x8-2,0
0,90 oder 0,9-1,4 kugelförmig Flüssiges Pigment oder kein gelblich bis Glycerin-Asparagin-Medium grünlich gelb Rhamnose-Verwertung negativ positiv Stärke-Hydrolyse stark schwach Magermilch-Koagulation positiv negativ Magermilch-Peptonisation schwach stark Produktion von positiv negativ Cephalosporin-Antibiotica
Aus den in der vorstehenden Tabelle angegebenen Differenzen ergibt sich, dass der in dieser Erfindung benutzte Stamm ein neuer Stamm ist, der sich von den vorstehend genannten bekannten Stämmen unterscheidet.



   Da der   Y-Gl 9Z-Stamm    als ein neuer Stamm durch die vorstehenden Beobachtungsergebnisse bestätigt worden ist, ist er als  Streptomyces oganonensis  bezeichnet worden.



   Wie schon bei den Ausführungen über den Streptomyces oganonensis   Y-1 9Z-Stamm    ausgeführt wurde, handelt es sich um einen 7-Methoxycephalosporin-Antibiotikum erzeugenden Stamm. Als ähnliche Stämme, die zu den Streptomyceten gehören, sind als Erzeuger von 7-Methoxycephalosporin-Antibiotika die folgenden bekannt: Streptomyces griseus, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces fimbriatus, Streptomyces halstedii, Streptomyces rochei, Streptomyces cinnamonensis, Streptomyces chartreusis und Streptomyces lactamdurans (vgl.

  Japanische Patent-Offenlegungsschrift   3286P7 1    und Belgische Patentschrift 764 160) sowie Streptomyces lipmanii (US-PS 3 719 563), Streptomyces clavuligerus (Japanisches Patent 45 594/'74), Streptomyces wadayamensis (Japanische Offenlegungsschrift   26488p74),    Streptomyces jumonjinensis (Japanische Offenlegungsschrift   42893P74),    Streptomyces heteromorphus und Streptomyces panayensis (Japanische Offenlegungsschrift   53594P75),    und Streptomyces chartreusis SF-1623 (Japanische Offenlegungsschriften   82291r75    und 121 488/'75).



   Die Herstellung der besprochenen Verbindung wird ausgeführt, indem man den   erwähnten    7-Methoxycephalosporin Antibiotika produzierenden Stamm kultiviert in einem üblichen Kulturmedium, dem ein Zusatz an heterocyclischer Thiolverbindung zugegeben wurde entsprechend der heterocyclischen Thiogruppe, die in die 3-Position eingeführt werden soll.



   Beispiele für die heterocyclischen Thiole, die dem Kulturmedium in dieser Erfindung hinzugefügt werden, sind: Pyrrolthiol, Imidazolthiol, Dihydroimidazolthiol, Pyrazolthiol, Triazolthiol, Tetrazolthiol, Methyltetrazolthiol, Pyridinthiol, Diazinthiol, Thiazolthiol, Dihydrothiazolthiol, Thiadiazolthiol, Thiatriazolthiol, Oxazolthiol, Isoxazolthiol, Oxadiazolthiol,   Indolthiol,    Benzimidazolthiol, Benzoxazolthiol, Benzothiazolthiol, Triazolpyridinthiol, Purinthiol usw. Diese heterocyclischen Ringe können einen oder mehrere Substituenten aufweisen, wie ein Halogenatom, eine Amino; Nitro-, Alkyl-, Hydroxy-, Alkoxy-, Aryl-, Aralkyl;   Furyl;    Thienyl-, Oxazolyl-, Carboxy-, Carboxymethyl-, Carboxyalkylthio; Carboxyalkyloxy-Gruppe usw.



   Diese heterocyclischen Thiole können als ihre Salze verwendet werden. Diese Salze sind anorganische Salze, wie Alkalimetallsalze, Erdalkalimetallsalze, Ammoniumsalze usw., und die Salze mit organischen Basen, wie Triäthylamin, Triäthanolamin, Dicyclohexylamin, Lysin, Arginin, Histidin, basische wasserlösliche Antibiotika, z. B. Kanamycin, Alkaloide, basische Proteine usw.



   Die Salze mit hoher Wasserlöslichkeit können selektiv verwendet werden, falls erforderlich, und ferner, wenn die heterocyclischen Thiole eine starke Toxizität zu den Antibiotika erzeugenden Stämmen aufweisen, können die nur spärlich in Wasser löslichen Salze selektiv verwendet werden.



   Auch können zwei Moleküle der gleichen heterocyclischen Thiolverbindung, die durch die S-S-Bindung verbunden sind, Verwendung finden, wie z. B. R2S-SR2.



   Die Herstellung der gemäss dieser Erfindung erhältlichen neuen Antibiotika wird durch Kultivierung des im Patentanspruch 1 genannten Stammes der Art Streptomyces in einem Kulturmedium unter Zugabe der vorstehend schon beschriebenen heterocyclischen Thiolverbindung oder des Salzes oder ihres Derivates   R2-S-S-R2    durchgeführt. Die Kultivierung wird nach den üblichen herkömmlichen Methoden zur Züchtung von Mikroorganismen durchgeführt, jedoch wird die submerse Kultur in einem flüssigen Kulturmedium bevorzugt. Jedes Kulturmedium, welches Nährstoffe für die 7-Methoxycephalosporin-Antibiotika herstellenden Stämme der Art Streptomyces enthält, kann verwendet werden. Es können synthetische Kulturmedien, halb-synthetische Kulturmedien und natürliche Kulturmedien, die die vorstehend genannten Nährstoffe enthalten, in dieser Erfindung Verwendung finden. 

  Für die Zusammenstel  lung des Kulturmediums können Glukose, Sukrose, Mannitol, Glycerin, Dextrin, Stärke, vegetabile Öle usw. als Kohlenstoffquellen Verwendung finden, und Fleischextrakt, Peptone, Klebermehl, Baumwollsaatmehl, Sojabohnenmehl, Erdnussmehl, Fischmehl, Kornschlempe, Trockenhefe, Hefeextrakt, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Harnstoff und andere organische und anorganische Stickstoffquellen können als Stickstoffspender Verwendung finden. Ebenso können, falls erforderlich, Metallsalze, wie Sulfate, Nitrate, Chloride, Carbonate, Phosphate usw. von Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, Zink und Eisen zu dem Kulturmedium hinzugefügt werden.

  Weiterhin können, falls erforderlich, Materialien, die die Bildung der Antibiotika begünstigen, oder Entschäumungsmittel, wie Methionin, Cystein, Cystin, Methyloleat, Lardöl, Siliconöl, oberflächenaktive Mittel usw., in geeigneter Weise zu dem Kulturmedium hinzugefügt werden.



   Das vorstehend genannte heterocyclische Thiol, dessen Salz oder dessen Derivat R2-S-S-R2 wird gewöhnlich in einer Konzentration von 0,1-5   mglml,    vorzugsweise 0,5-2 mg/ml als heterocyclisches Thiol hinzugefügt. Es kann zu dem Kulturmedium als eine sturzartige Zugabe vor der Kultivierung oder auch in verschiedenen unterteilten Portionen in den Eingangsstufen der Kultivierung zugefügt werden. Es ist im allgemeinen günstig, die Kultivierung unter aeroben Bedingungen durchzuführen. Die Kultivierungstemperatur liegt gewöhnlich zwischen etwa 18   "C    bis etwa 35   "C,    vorzugsweise um 30   "C.    Gute Ergebnisse werden erhalten, wenn das pH des Kulturmediums auf etwa 5-10, vorzugsweise etwa 6-8 gehalten wird.

  Der Kultivationszeitablauf hängt von der Zusammensetzung und der Temperatur des verwendeten Kulturmediums ab, aber im allgemeinen werden etwa 3 Tage bis etwa 10 Tage benötigt. Das hergestellte Material wird selektiv in dem Medium angereichert, nachdem die Kultivierung beendet ist.



   Das gemäss dieser Erfindung hergestellte Material kann isoliert und aus der Kulturbrühe nach den üblichen Methoden gewonnen werden, die für das Isolieren von Antibiotika aus dem kultivierten Mycel-Nährboden üblich sind. Das erfindungsgemäss hergestellte Antibiotikum ist hauptsächlich in der Kulturbrühe anwesend. Nach der Abtrennung des Mycels von der Nährbodenlösung durch Zentrifugieren oder Filtrieren wird das hergestellte effektive Material aus dem Filtrat extrahiert; das heisst, das hergestellte Material wird abgetrennt, wieder ausgezogen und gereinigt vom Filtrat.

  Hierbei werden Vorrichtungen und Verfahren verwendet, die ganz allgemein für die Herstellung von Antibiotika Verwendung finden, wie Methoden, die die Unterschiede der Löslichkeit in einem geeigneten Lösungsmittel ausnutzen, die die Unterschiede der adsorptiven Affinität zu verschiedenen Adsorbentien ausnutzen oder die auf Unterschieden der Trennmethoden in zwei flüssigen Phasen beruhen.



   Diese Methoden können, falls erforderlich, in einer geeigneten Kombination oder auch wiederholt angewandt werden.



   Einige praktische Beispiele der neuen 7-Methoxycephalosporin-Verbindungen dieser Erfindung werden nachfolgend genannt.



      1.745-Amino-5-carboxyvaleramidof345-carboxymethyl-      thio-1,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-7-methoxy-h    3-cephem4carbonsäure;
EMI4.1     
 Additionsverbindung:    5-Mercapto-l ,3,4-thiadiazol-2-thioessigsäure ;   
EMI4.2     

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der hergestellten Verbindung I mit der allgemeinen Formel A
EMI4.3     
 sind die folgenden:
1. weisses Pulver;
2.

  Schmelzbeginn bei 156-160   "C.    Hierbei tritt Braunfärbung ein, und die Zersetzung beginnt ab etwa 170   "C;   
3. leicht löslich in Wasser, spärlich löslich in Methanol, und sehr spärlich löslich in anderen organischen Lösungsmitteln;
4. amphoteres Material mit positiver Ninhydrin-Reaktion;
5. es besitzt das ultraviolette Absorptionsspektrum gemäss Fig. 1 der beigefügten Zeichnung, wenn es in einer 1/100 M Phosphat-Pufferlösung mit einem pH von 6,4 gemessen wird, wobei das Absorptionsmaximum bei 287   mlt    liegt;
6. es besitzt das Infrarot-Absorptionsspektrum gemäss Fig.



  2, wenn es in der Kaliumbromid-Tablette gemessen wird. Es ergeben sich Absorptionen bei   3413cm-1,      2920cm1,      1763cm-',      1620cm1,      1515cm-1    und 1380   cm';   
7. Bei der Bestimmung des kernmagnetischen Resonanzspektrums unter Verwendung von TMS als äusserem Standard in schwerem Wasser werden folgende Signale erhalten: 6Wert (p p m): 2,35 (4H, Multiplett), 2,96 (2H, Multiplett), 4,00 (3H, Singlett),   3,73-4,33    (2H, Quartett, J = 18   Hz),      4,25(1 H,      Multiplett),4,44    (2H, Singlett), 4,42 - 4,91 (2H, Quartett, J = 14 Hz), 5,63(1 H, Singlett);
8.

  Das im derzeitig reinsten Zustand hergestellte Produkt besitzt die folgenden elementar-analytischen Werte: C: 35,95%, H: 3,87%, N: 10,85%,   S: 18,33%;    9. es ergibt a-Aminoadipinsäure bei der Hydrolyse mit 6 n Chlorwasserstoffsäure; 10. das Massenspektrum dieser Verbindung ergibt nach einer N-Chloracetylierung der Verbindung und Uberführung des Produktes in den Methylester das folgende Fragment mit mle 392, das heisst  
EMI5.1     

Unter Berücksichtigung aller vorstehenden Ergebnisse ist es ersichtlich, dass diese Verbindung eine 7-Methoxycephalosporin-Verbindung ist, denn die Verbindung ergibt eine Absorption bei 1763   cm-l    (cyclisches Lactam) im Infrarot-Absorptionsspektrum, und die Gegenwart der Signale bei 4,00 p p m (3H, Singlett, 7-OCH3), 5,63 p p m   (1 H,      Singlett,

   6-CH),      3,73 -    4,33 (2H, Quartett, J = 18 Hz, 2-CH2) und 4,42 - 4,91 (2H, Quartett, J = 14   Hz, 3-Seitenkette    CH2) in dem kernmagnetischen Resonanzspektrum. Die Verbindung ergibt a-Aminoadipinsäure bei der Säurehydrolyse, ferner ergibt die Verbindung Absorptionen bei 4,44 p p m (2H, Singlett, CH2 von -S-CH2 COOH) im nuklearmagnetischen Resonanzspektrum und ausserdem das Fragment von   nile    392 im Massenspektrum des Derivates; aus diesen Gründen ist entschieden worden, dass die Verbindung die vorstehend genannte Struktur hat, in die das heterocyclische Thiol eingeführt worden ist.



  II.   I.745-Amino-5-carboxyvaleramidof3A 1      -methyl- 1    H-tetrazol-5   ylSthiomethyl-7-methoxy-h    3-cephem4-carbonsäure:
EMI5.2     
 Additionsverbindung:    5-Mercapto-l-methyl-1    H-tetrazol;
EMI5.3     

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der hergestellten Verbindung II der Formel A
EMI5.4     


<tb>  <SEP> R2 <SEP> = <SEP> N <SEP> , <SEP> M <SEP> = <SEP> H <SEP> )
<tb>  <SEP> , <SEP> 7N
<tb>  <SEP> CII
<tb> sind <SEP> die <SEP> folgenden:

  <SEP> 3
<tb> 
I.weisses Pulver;
2. ergibt braune Verfärbung und Zersetzung bei   160-170"C;   
3. leicht löslich in Wasser, gering löslich in Methanol und spärlich löslich in anderen organischen Lösungsmitteln;
4. amphoteres Material mit positiver Ninhydrinreaktion;
5. es wird das in Fig. 3 dargestellte Ultraviolett-Absorptions spektrum bei Messung in 1/100 M Phosphat-Pufferlösung mit einem pH von 6,4 erhalten. Das Absorptionsmaximum liegt bei   273 mm;   
6. es wird das in Fig. 4 dargestellte Infrarot-Absorptionsspektrum bei Messung der Kaliumbromidtablette erhalten.

  Es    wurden Absorptionen bei 3413 cm-1, 2920cm-', 1765 cm-',
1620 cm-', 1515 cm1 und 1390cm-1 festgestellt;   
7. das kernmagnetische Resonanzspektrum, gemessen unter Verwendung von TMS als externem Standard in schwerem Wasser, ergab die folgenden Signale: 6Wert (p p m): 2,36 (4H, Multiplett), 2,96 (2H, Multiplett),   3,98 (3H, Singlett), 4,38 H, H, Multiplett), 4,50 (3H, Singlett), 5,59 H, H, Singlett);   
8. das bis jetzt in reinstem Zustand erhaltene Material ergab die folgenden elementar-analytischen Werte: C:   37,48%,    H: .4,25%, N: 16,74% und   S: 10,90%;   
9. es wird a-Aminoadipinsäure erhalten, wenn mit 6 n Chlorwasserstoffsäure hydrolysiert wurde.

  Es wird   5-Mercapto-l-    methyl-1 H-tetrazol durch Hydrolyse in Methanol durch Dowex 50 W (H-Typ) erhalten;
Berücksichtigt man die vorstehenden gesamten Ergebnisse, so ergibt sich, dass die Verbindung eine 7-Methoxycephalosporin-Verbindung ist, denn die Verbindung ergibt Signale bei 3,98 p p m (3H,   Singlett, 7-OCH3)    und 5,59 p p m (1H, Singlett, 6-CH) bei den kernmagnetischen Resonanzspektren und Absorption bei 1765 cm-' (cyclisches Lactam) im Infrarot-Absorptionsspektrum. Ferner wird a-Aminoadipinsäure durch Säurehydrolyse erhalten. 

  Ferner ergibt sich aus der Tatsache der Absorption bei 450 p p m (3H, Singlett, Tetrazol-N-methyl) im kernmagnetischen Resonanzspektrum und auch aus der Tatsache, dass 5-Mercapto-l-methyl-1H-tetrazol durch milde Hydrolyse erhalten wird, dass der Verbindung die vorstehend erläuterte Struktur zuerkannt wurde, in die das heterocyclische Thiol eingeführt wurde.



      111.745-Amino-5-carboxyvaleramidof7-methoxy-3-(5-me-      thyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-h    3-cephem4-carbonsäure.
EMI5.5     
  



  Additionsverbindung:    2-Mercapto-5-methyl-1 ,3,4-thiadiazol:   
EMI6.1     

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der hergestellten Verbindung III mit der Formel A
EMI6.2     
 sind die folgenden:
1. leicht gelb weisses Pulver;
2. zeigt keinen bestimmten Schmelzpunkt, ergibt braune Verfärbung und Zersetzung bei etwa 170   "C;   
3. leicht löslich in Wasser, schwach löslich in Methanol, aber unlöslich in anderen organischen Lösungsmitteln;
4. amphoteres Material mit positiver Ninhydrinreaktion;
5. ergibt das in Fig. 5 dargestellte Ultraviolett-Absorptionsspektrum, wenn in einer 11100 M Phosphat-Pufferlösung mit einem pH von 6,4 gemessen wird, wobei das Absorptionsmaximum bei 272 mu liegt;

  ;
6. es wird das in Fig. 6 dargestellte Infrarot-Absorptionsspektrum erhalten, wenn als Kaliumbromid-Tablette gemessen   wurde, mit Absorptionen bei 3420 cm-', 2930 cm', 1765cm-', 1610 cm-', 1515cm-1 und 1385 cm-';   
7. das kernmagnetische Resonanzspektrum, gemessen unter Verwendung von TMS als externem Standard in schwerem Wasser, ergibt die folgende Signale:    b-Wert    (p p m): 2,34 (4H, Multiplett), 2,95 (2H, Multiplett), 3,19 (3H, Singlett), 3,72-4,31 (2H, Quartett, J = 18 Hz), 3,99 (3H,   Singlett), 4,26(1 H,   Multiplett), 4,40-4,95 (2H, Quartett, J =   14 Hz), 5,63(1H, Singlett);   
8. die gegenwärtig am reinsten hergestellte Verbindung weist die folgenden elementar-analytischen Werte auf: C: 37,82%,   H: 4,01%,    N: 12,90%,   S:

   14,97%   
9. es wird a-Aminoadipinsäure erhalten, wenn mit 6 n Chlorwasserstoffsäure hydrolysiert wird. Es wird auch 2-Mercapto-5methyl-1,3,4-thiadiazol erhalten, wenn in Methanol mit Dowex 50 W (H-Typ) hydrolysiert wird.



   Wenn man alle vorstehenden Ergebnisse berücksichtigt, ist es ersichtlich, dass die Verbindung eine 7-Methoxycephalosporin-Verbindung ist, denn die Verbindung weist die Absorption bei 1765   cm-1    (cyclisches Lactam) im Infrarot-Absorptionsspektrum auf. Ferner werden die Signale bei 3,99 p p m (3H,   Singlett, 7-OCH3), 5,63    p p   m (1 H,    Singlett, 6-CH), 3,724,31 p p m (2H, Quartett, J=18 Hz,   2-CH2), 4,40-4,95    (2H, Quartett, J= 14 Hz, 3-Seitenkette CH2) erhalten.

  Es wird a-Aminoadipinsäure bei der Säurehydrolyse erhalten; und weiter auf Grund der Tatsache, dass die Absorption bei 3,19 p p m (3H, Singlett, Thiadiazol C-CH3) in dem kernmagnetischen Resonanzspektrum erhalten wird und auch 2-Mercapto-5-methyl1,3,4-thiadiazol durch milde Hydrolyse erhalten wird, wird der Verbindung die vorstehend erläuterte Struktur zuerkannt, in die das heterocyclische Thiol eingeführt wurde.



      IV.745-Amino-5-carboxyvaleramidof7-methoxy-341,3,4-thia- diazol-2-yl)thiomethyl-h 3-cephem4-carbonsäure.   
EMI6.3     




  Additionsverbindung:    2-Mercapto-1 ,3,4-thiadiazol;   
EMI6.4     

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der hergestellten Verbindung IV der Formel A
EMI6.5     
 sind die folgenden:
1. leicht gelbweisses Pulver;
2. sie zeigt keinen bestimmten Schmelzpunkt, jedoch erfolgen Braunverfärbung und Zersetzung bei etwa 175-180   "C;   
3. leicht löslich in Wasser, schwach löslich in Methanol, jedoch in anderen organischen Lösungsmitteln unlöslich;
4. amphoteres Material mit positiver Ninhydrin-Reaktion;
5. ergibt das in Fig. 7 dargestellte Ultraviolett-Absorptionsspektrum bei Messung in einer 1:

  :100 M Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von   6,4,    Absorptionsmaximum bei 274   mlt;   
6. es wird das in Fig. 8 dargestellte Infrarot-Absorptionsspektrum erhalten, wenn mit der Kaliumbromid-Tablette gemessen wurde, wobei die Absorptionen bei 3400 cm-', 2925   cm-1,    1765   cm-1,      1610 cm-',    1515 cm-' und 1365 cm-' liegen;
7. das kernmagnetische Resonanzspektrum, gemessen unter Verwendung von TMS als externem Standard in schwerem Wasser, ergibt die folgenden Signale:   8-Wert    (p p m):

   2,30 (4H, Multiplett), 2,93 (2H, Multiplett), 3,69-4,29 (2H, Quar   tett, J = 18 3,97 (3H, Singlett), 4,26 H, H, Multiplett), 4,45-4,99 (2H, Quartett, J= 14 Hz), 5,56 H, H, Singlett), 9,85(1 H, Singlett);   
8. das derzeit im reinsten Zustand erhaltene Produkt besitzt die folgenden elementar-analytischen Werte: C: 37,53%, H: 4,36:, N: 12,77%,   S: 16,42%;     
9. es wird a-Aminoadipinsäure bei der Hydrolyse mit 6 n Chlorwasserstoffsäure erhalten. Es wird auch 2-Mercapto-1,3,4thiadiazol bei der Hydrolyse in Methanol mit Dowex 50 W (H-Typ) erhalten.



   Berücksichtigt man alle Ergebnisse, so ergibt sich, dass die Verbindung eine 7-Methoxycephalosporin-Verbindung ist, denn die Verbindung ergibt im Infrarot-Absorptionsspektrum eine Absorption bei   1765cm1,    und es werden die Signale bei 3,97 p p m (3H, Singlett, 7-OCH3), 5,56 p p   m (1 H,    Singlett,   6-CH), 3,69-4,29    p p m (2H, Quartett, J= 18 Hz, 2-CH2), 4,45-4,99 (2H, Quartett, J= 14   Hz, 3-Seitenkette    CH2) erhalten. a-Aminoadipinsäure wird durch Säurehydrolyse erhalten.

  Aus den Tatsachen, dass die Absorption bei 9,85 p p   m (1 H,    Singlett, Thiazol CH) im kernmagnetischen Resonanzspektrum vorhanden ist und   2-Mercapto-1 ,3,4-thiadiazol    bei milder Hydrolyse erhalten wird, ist der Verbindung die zuvor genannte Struktur zugeordnet worden, in die das heterocyclische Thiol eingeführt worden ist.



   Nachfolgend werden die Ergebnisse von verschiedenen chromatographischen Analysen und Papierelektrophoretischen Untersuchungen der hergestellten Verbindungen   1, ll, lll    und IV angegeben.



   Die erhaltenen Rf-Werte dieser Verbindung in der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung mikrokristalliner Cellulose (Avicel SF) sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben:
1 2 3 Hergestellte Verbindung 1 0,39 0,37 0,32 hergestellte Verbindung II 0,39 0,34 0,31 hergestellte Verbindung III 0,43 0,43 0,40 hergestellte Verbindung IV 0,39 0,38 0,33 Cephalosporin C 0,37 0,36 0,31 7-Methoxycephalosporin C 0,41 0,36 0,32 Cephamycin C 0,37 0,36 0,31   Y-Gl 9Z-D3    0,26 0,26 0,22   Y-G 1 9Z-D2    0,39 0,32 0,26 Verwendetes Entwicklungslösemittelsystem (Volumenverhältnis):    1. Isopropanol: n-Butanol: Essigsäure :Wasser(21:3:7:9).   



   2. n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4:1:2).



   3. n-Butanol : Essigsäure : Wasser (6:1,5:2,5).



   Die Kontrollprobe, Cephamycin C, ist   745-Amino-5-carbo-      xyvaleramidof3-carbomoyloxymethyl-7-methoxy-A    3-cephem4-carbonsäure.



   Die Verbindungen Y-G19Z-D3 und Y-G19Z-D2, die in den vorstehenden Vergleichsuntersuchungen verwendet wurden, sind neue 7-Methoxy-cephalosporin-Verbindungen, die zuvor aus der Kulturflüssigkeit des Streptomyces oganonensis durch die gleichen Erfinder (vgl. Japanische Patentanmeldungen Nr.



  109   7531'74    und 146 593/'75) isoliert worden sind.



   Die Rf-Werte, die bei der Papierverteilungschromatographie unter Verwendung von Wattman Nr. 1 Filterpapier und einem Entwicklungslösungsmittelsystem aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser   (4:1:2    im Volumenverhältnis) bestimmt wurden, lauten:
Rf-Wert Hergestellte Verbindung 1 0,40 hergestellte Verbindung II 0,39 Cephalosporin C 0,36 7-Methoxy-cephalosporin C 0,40 Cephamycin C 0,35   Y-G 1 9Z-D3    0,24   Y-G 1 9Z-D2    0,25
Dann wurden die Verbindungen unter Verwendung einer Hitachi 635   Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatogra-    phie-Apparatur analysiert und dadurch folgende Resultate erzielt:
Säule: 3 x 500 mm Säule aus rostfreiem Stahl
Kunstharz: Hitachi 2610 (kationisches Austauschharz)    Entwicklungslösungsmittelsystem    0,2 M Citratpufferlösung (pH 3,6).



     Fliessgeschwindigkeit:    0,6 ml/min.



   Schreibträgergeschwindigkeit: 1,0 cmlmin.



   Retentionszeit Hergestellte Verbindung I 5 min   33s    hergestellte Verbindung II 6 min 00 s hergestellte Verbindung III 9 min 35 s Cephalosporin C 5 min 18 s 7-Methoxy-cephalsporin C 5 min   09s    Cephamycin C 5 min 18 s Y-G19Z-D3   3min42s    Y-G19Z-D2   3min42s   
Nachstehend werden weitere Ergebnisse von Analysen unter Verwendung der vorstehend erläuterten Apparatur, die unter folgenden Bedingungen erhalten wurden, in der Tabelle angegeben:
Säule:    > u    Bondapa Cis (Hersteller: Waters Ltd.) 4 x 300 mm.



   Entwicklungslösungsmittel-System: Acetonitril: 0,1 % Essigsäurelösung (pH 3,3)   (1:9    im Volumenverhältnis).



     Fliessgeschwindigkeit:    0,8 ml/min.



   Schreibträgergeschwindigkeit: 1,0 cm/min.



   Retentionszeit hergestellte Verbindung I 3 min   14s    hergestellte Verbindung II 1 min   52s    hergestellte Verbindung III 2 min   55s    hergestellte Verbindung IV 1 min   56s   
Die durch Hochspannungs-Papierelektrophorese erhaltenen Ergebnisse sind die folgenden: Filterpapier: Wattman Nr. 1   Entwicklungslösemittel:    10 %ige Essigsäure (pH 2,2).

 

  Spannung: 42 Volt/cm.



  Laufzeit: 1 Stunde. Migrationsentfer nung Hergestellte Verbindung I - 3,6 cm hergestellte Verbindung II - 3,3 cm hergestellte Verbindung III - 3,6 cm hergestellte Verbindung IV - 3,9 cm Cephalosporin C - 3,5 cm 7-Methoxy-cephalosporin C - 3,4 cm Cephamycin C - 3,5 cm Y-G19Z-D3 - 6,1 cm   Y-G1 9Z-D2 -6,1cm    Cysteinsäure - 7,5 cm Glutathion - 1,2 cm
Dann wurde die antibakterielle Aktivität der hergestellten Verbindungen   1, II, III    und IV bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammen mit jenen von Cephalosporin C als Vergleichssubstanz angegeben.



  Herzinfusions-Agar Plattenmethode  (verwendete 500   yglml-lösung)   
Die Zahlenwerte in der Tabelle geben den Durchmesser (mm) der Inhibitionszone an.  



     1 II    III IV C Sarcina lutea ATCC 9341 0 0 0 0 14,0   Staphylococcus aureus 209 P      0    0 0 0 12,8 Bacillus subtilis ATCC 6633 0 0 0 0 23,1 Escherichia coli NIHJ 19,2 18,7 14,2 13,0 10,4 Klebsiella pneumoniae 21,8 23,5 23,0 23,0 13,0 Salmonella gallinarum 24,0 25,2 23,5 25,1 23,5 Proteus vulgaris OX 19 22,6 20,2 20,0 21,0 17,5   Proteus mirabilis IMF OM-9    22,2 19,8 19,5 23,0 23,0 Bemerkung: I: Verbindung I dieser Erfindung II: Verbindung II dieser Erfindung III: Verbindung III dieser Erfindung IV: Verbindung IV dieser Erfindung C: Cephalosporin C (Vergleich)
Jede der erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen 1,   II, III    und IV kann in verschiedenen Formen, einzeln oder in Kombination mit anderen Medikamenten, verwendet werden.



  Dies bedeutet, dass die Verbindungen dieser Erfindung oral, durch intramuskuläre Injektionen, durch intravenöse Injektion etc. in der Form von Kapseln, Tabletten, Pulver, Granulaten, Lösungen und Suspensionen verabreicht werden können. Verschiedene Träger werden den Zubereitungen hinzugefügt, zum Beispiel Mannitol, Sukrose, Glukose, sterilisiertes destilliertes Wasser, Salzlösung und ein vegetabiles Öl, wie Erdnussöl, Sesamöl. Weiterhin können andere Ingredientien, wie Stabilisatoren, Bindemittel, Antioxidantien, Konservierungsmittel, ein Gleitmittel bei der Herstellung von Tabletten, Suspendiermittel Viskositätsmittel, Duftstoff   usw    hinzugefügt werden.



   Als Salze der Verbindungen der Formel A werden die Salze mit den im Patentanspruch 1 definierten Kationen M, die pharmakologisch nichttoxisch oder brauchbar sind, verwendet. Die Dosierung der Medikamente hängt hauptsächlich von dem Zustand und dem Gewicht des Wirtes ab. Sie hängt auch von der Verabreichungsart ab, z. B. orale oder parenterale Verabreichung. Im allgemeinen werden 50 mg/kg in einer Dosis oder in einigen aufgeteilten Dosen pro Tag verabreicht.



   Die Verbindungen A 1 dieser Erfindung besitzen ausgezeichnete antimikrobielle Aktivitäten; diese werden für die Prophylaxe und Behandlung von Erkrankungen bei Mensch und Tier verwendet. Ferner können sie auch in geeigneter Weise als Zwischenprodukte zur Herstellung anderer effektiver 7-Methoxycephalosporin-Derivate Verwendung finden. In solchen Fällen wird es bevorzugt, die Verbindung der Formel Al als reines Produkt oder als ein hochkonzentriertes Rohpro   dukt zu isolieren.   



   Besonders wenn die Substituentengruppe
EMI8.1     
 in der 7-Position der Verbindung der Formel A durch eine andere Acylamidgruppe ersetzt wird, verschwinden die amphoteren Eigenschaften und das so modifizierte saure Produkt wird zur Isolierung gut geeignet, und es wird in organischen Lösungsmitteln löslich. Daher wird die Modifikation der Verbindung der Formel A, wie vorstehend schon erläutert, für die Anwendung in der industriellen Praxis bevorzugt.



   Die In-vivo-Effekte der Verbindungen II, III sind nachstehend angegeben:
An 5 gesunde, männliche Mäuse des ddY Stammes wurden 106 Zellen von E. coli NIHJ intraperitoneal injiziert. Nach 2 Stunden wurde jede Probe subkutan verabreicht. Die Überlebensprozentangaben nach 5 Tagen werden in der fogenden Tabelle angegeben. Ähnliche Untersuchungen wurden mit 105 Zellen von Proteus mirabilis 1287 ausgeführt.



   Die Kontrollgruppe bestand jedesmal aus 10 Mäusen
E coli NIHJ   Proteus mirabilis    1287 Dosis 3 1 0,5 0 3 1 0,5 0 (mg/Maus) Probe II 100 100 100 0 40 20 0 0 Probe III 80 80 40 0 100 20 20 0 Nachstehend werden die Beispiele dieser Erfindung im einzelnen verdeutlicht.



  Beispiel 1
Herstellung von   7-(5-AminoS-carboxyvaleramido > 3-(5-car-    boxy-methylthio-1,3,4-thiadiazol-2-yl) thiomethyl-7-methoxy-A d3-cephem4-carbonsäure I:
Ein Kulturmedium, welches 1%   Stärke, 1%      Glukose,1,5%      Sojabohnenmehl, 0,5%      Hefeextrakt,0,1%    Dikaliumhydrogen   phosphat,0,05%    Magnesiumsulfat und 0,3% Natriumchlorid enthielt, wurde in eine 500 ml Sakaguchiflasche mit je 100 ml eingefüllt und bei   1200    C für 20 Minuten sterilisiert. Jede Flasche wurde mit Streptomyces oganonensis   Y-G19ZStamm    beimpft und 48 Stunden bei   30     C kultiviert.



   In weiteren Ansätzen wurde das gleiche Kulturmedium in 2000 ml Sakaguchiflaschen mit je 400 ml gefüllt und bei   1200    C für 20 Minuten sterilisiert. Es wurde mit dem gleichen Stamm in einer Konzentration von   2 - 3%    beimpft und 24 Stunden bei   30     C kultiviert, um eine Kultur zu erhalten.



   Weiterhin wurden 60 Liter eines Kulturmediums, welches 7%   Stärke, 2%      Glutenmehl, 2%      Sojabohnenmehl, 0,8%    Glycerin, 0,1%   Casaminosäure, 0,01%    Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid enthielt, jeweils in zwei 100 Liter Fermentoren zusammen mit 10 ml Adecanol als Entschäumungsmittel eingefüllt. Es wurde 30 Minuten bei   1200    C sterilisiert. Jedes Medium wurde mit 800 ml der Züchtungskultur beimpft, und dann wurde 24 Stunden bei 30   "C    kultiviert.

  In wässeriger Natriumhydroxidlösung wurde   5-Mercapto-1 ,3,4-thiadiazol-2-thioessigsäure    aufgelöst, und die gebildete Lösung wurde bei hohem Druck sterilisiert und zu jedem Fermentor bis zu   0,05%    des Impfmaterials zugegeben und dann wurde 90 Stunden kultiviert.



   Nach vollständiger Kultivierung wurde die Kulturbrühe auf pH 2,0 eingestellt und dann mit Radiolite (als Filterhilfsmittel) vermischt. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer Filterpresse filtriert. Die Filtrate wurden miteinander vereinigt, und es wurden 100 Liter Filtratgemisch erhalten. Die Filtrate wurden auf pH 3,0 mit wässeriger Natriumhydroxidlösung eingestellt und durch eine 12 Liter Amberlite XAD-2 Säule gegeben.



  Die Säule wurde mit 30 Liter Wasser gewaschen und mit 30 Liter wässerigem Aceton eluiert. Das Eluat wurde gesammelt und eingeengt auf 5,5 Liter. Nach Entfernung der sich gebildeten Verunreinigungen wurde Wasser zu dem Rückstand hinzugefügt, um 10 Liter Lösung zu erhalten. Die so erhaltene Lösung wurde auf pH 3,5 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt und dann durch eine 3 Liter Amberlite IRA-68   (Cl-Typ > Säule    gegeben. Nach Waschen der Säule mit 6 Liter Wasser wurde mit wässeriger Lösung (pH 7,2), die 1 M Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat enthielt, eluiert. Es wurden etwa 5 Liter Lösung mit antimikrobiellem aktivem Material erhalten. Die Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt, durch eine ein Liter Amberlite XAD-2-Säule gegeben, und nach dem Waschen der Säule mit Wasser wurde die Säule mit wässerigem 500/oigem Aceton gewaschen. 

  Es wurde etwa 400 ml wässerige Lösung mit antimikrobiellem aktivem Material erhalten. Durch Lyopholisierung der Lösung wurde etwa
18 g Rohprodukt der hergestellten Verbindung I erhalten.  



   Dann wurde 18 g des rohen Pulvers einer Säulenchromatographie unter Verwendung von etwa 800 ml DEAE-Sephadex A-25 (Essigsäure-Typ) unterworfen. Die Säule war mit einer kleinen Menge 0,5 M Ammoniumbromid-Essigsäurepufferlösung gefüllt. Es wurde in die effektiven Komponenten fraktioniert. Die erhaltenen antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden gesammelt, durch eine 500 ml Amberlite XAD-2-Säule gegeben, und nach dem Waschen der Säule mit Wasser wurde die Säule mit einer wässerigen 25%igen Acetonlösung eluiert. Die erhaltenen Eluate wurden zum Trocknen eingedampft.



   Dann wurde ein Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol: Wasser (7:3 Volumenverhältnis) verwendet, um den erhaltenen Rückstand des Produktes einer Säulenchromatographie unter Verwendung von mikrokristalliner Cellulose (Avicel), präpariert mit einem Lösungsmittelgemisch der gleichen, vorstehend angegebenen Zusammensetzung, zu unterwerfen. Die erhaltene antimikrobiell aktive Fraktion wurde tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF aufgetragen, und mit einem Gemisch aus Isopropanol : n-Butanol : Essigsäure : Wasser (21:3:7:9 Volumenverhältnis) entwickelt. Dann wurde Pyridinlösung von 0,25% Ninhydrin aufgesprüht und anschliessend erwärmt, um die Färbung zu entwickeln. Dann wurden die Fraktionen mit einem Rf-Wert von 0,39 gesammelt, die Fraktion im Vakuum bei etwa 45-50   "C    zur Trockne eingedampft.



  Der erhaltene Rückstand wurde einer Säulenchromatographie mit mikrokristalliner Cellulose (Avicel) unterworfen. Die Füllung war mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol:   n-Butanol: Essigsäure:    Wasser   (21:3:7:9    Volumenverhältnis) präpariert. Die so erhaltene antimikrobiell aktive Fraktion wurde dann einer Dünnschichtchromatographie mit Avicel SF unter Verwendung des vorstehend genannten Lösungsmittelgemisches unterworfen und unter gleicher Nachbehandlung weiterverarbeitet. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,39 wurden   gesammelt    und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Produktrückstand wurde mit mikrokristalliner Cellulosesäulenchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (6:1,5:2,5 im Volumenverhältnis) weitergereinigt.

  Die gereinigte aktive Fraktion wurde zur Trockne eingedampft und dann in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgenommen. Die Lösung wurde in einer Säule Sephadex G-10 unter Verwendung von Wasser entwickelt. Die Fraktionen mit antimikrobiel   ler    Aktivität wurden gesammelt und einer Dünnschichtchroma tographie, wie schon vorstehend erläutert, unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol : Essigsäure : Was ser (6:1,5:2,5 im Volumenverhältnis) unterworfen. Die Fraktionen mit Rf-Werten 0,32 wurden gesammelt, eingeengt und dann einer Lyophilisation unterworfen. Es wurden etwa 80 mg weisse 7-(5-Amino-5-carboxy-valeramido)-3-(5-carboxymethyl   thio-1,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-7-methoxy-h    3-cephem-4carbonsäure erhalten.



  Beispiel 2
Herstellung von   7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(1 -me-    thyl-l   H-tetrazol-5-yl)thiomethyl-7-methoxy-h    3-cephem4-car   bonsäure II:   
Ein Kulturmedium, welches 1% Stärke, 1%   Glukose, 1,5%      Sojabohnenmehl, 0,5%      Hefeextrakt, 0,1    Dikaliumhydrogenphos   phat, 0,05%    Magnesiumsulfat und 0,3% Natriumchlorid enthielt, wurde in 500 ml Sakaguchi-Flaschen mit jeweils 100 ml gefüllt   und 20 Minuten bei 120 "C sterilisiert. Dann wurde jedes    Medium mit Streptomyces oganonensis Y-G197-Stamm beimpft. Anschliessend wurde 48 Stunden bei 30   "C    kultiviert.



  Dann wurde das schon genannte Kulturmedium in zwei Liter Sakaguchiflaschen mit jeweils 400 ml eingefüllt. Nach dem Sterilisieren für 20 Minuten bei 120   "C    wurde jedes Medium mit 2-3% der vorstehend erhaltenen Kulturbrühe beimpft und anschliessend weitere 24 Stunden bei 30   "C    kultiviert, um einen Impfansatz zu erhalten.



   60 Liter eines Kulturmediums, welches 7%   Stärke, 2%    Glu   tenmehl, 2%      Sojabohnenöl, 0,8%      Glycerin,0,1%    Casaminosäure,   0,01%    Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid enthielt, wurde in zwei Liter Fermentoren mit jeweils 10 ml Adecanol als Entschäumungsmittel gefüllt. Nach dem Sterilisieren für 30 Minuten bei 120   "C    wurde jedes Medium mit 800 ml des vorstehend hergestellten Impfansatzes versetzt, und anschliessend wurde 24 Stunden bei 30   "C    kultiviert. Dann wurde   l-Methyl-5-mer-      capto-1H-tetrazol    in wässeriger Natriumhydroxidlösung aufgelöst.

  Die Lösung wurde bei hohem Druck sterilisiert und zu der Kulturbrühe hinzugefügt, um deren Konzentration auf 0,05% einzustellen. Das Gemisch wurde 90 Stunden weiter kultiviert.



   Nach vollständiger Kultivierung wurde die so gebildete Kulturbrühe auf pH 2,0 eingestellt und dann mit Radiolite als Hilfsmittel zum Filtrieren unter Rühren versetzt, das Gemisch unter Verwendung einer Filterpresse filtriert. Die erhaltenen Filtrate wurden vereinigt, und es wurden etwa 100 Liter Filtratgemisch erhalten.



   Das Filtrat wurde auf pH 3,0 mit wässeriger Natriumhydroxidlösung eingestellt, durch eine 12 Liter Amberlite XAD-2 Säule gegeben, und nach dem Waschen der Säule mit 30 Liter Wasser wurde die Säule mit 30 Liter einer wässerigen 50%igen Acetonlösung eluiert. Das Eluat wurde auf 5,5 Liter eingeengt, und das Konzentrat wurde auf pH 3,5 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt und durch eine Dreiliter Amberlite IRA-68   (Cl-Typ}Säule    geleitet. Die Säule wurde mit 6 Liter Wasser gewaschen und mit einer wässerigen Lösung (pH 7,2), die 1 M Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat enthielt, fraktioniert. Es wurden etwa 5 Liter einer Lösung, die ein antimikrobiell aktives Material enthielt, erhalten.

  Die Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt, durch eine Einliter Amberlite XAD-2-Säule gegeben, mit Wasser gewaschen und mit einer wässerigen Lösung von 50%igem Aceton eluiert. Es wurde etwa 400 ml wässerige Lösung, die das antimikrobiell aktive Material enthielt, gewonnen. Durch Lyophilisierung der Lösung wurde etwa 54 g des rohen Pulvers der hergestellten Verbindung II erhalten. Das rohe Pulver wurde einer Säulenchromatographie mit etwa 800 ml DEAE Sephadex A-25 (Essigsäure-Typ), gefüllt mit einer kleinen Menge 0,5 M Ammoniumbromid-Essigsäurepufferlösung, unterworfen, um die aktiven Komponenten zu fraktionieren. Die antimikrobiell aktiven Komponenten wurden gesammelt, durch eine 500 ml Amberlite XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit einer wässerigen Lösung von 25%igem Aceton eluiert.

  Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden gesammelt und dann im Vakuum zur Trockne eingedampft.



   Der gebildete Rückstand wurde der Säulenchromatographie unter Verwendung von mikrokristalliner Cellulose (Avicel) unterworfen, gefüllt mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol: Wasser (7:3 Volumenverhältnis) unter Verwendung des Lösungsmittelgemisches mit der vorstehend angegebenen Zusammensetzung. Die erhaltene antimikrobiell aktive Fraktion wurde gesammelt, tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF aufgetragen, mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : Essigsäure   : Wasser (6:1,5:2,5    Volumenverhältnis) entwickelt und eine Lösung von 0,25% Ninhydrin in Pyridin wurde aufgesprüht, und anschliessend wurde durch Erwärmen die Anfärbung entwickelt. Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,31 gesammelt. Die Fraktionen wurden unter vermindertem Druck eingeengt und getrocknet.

 

  Der gebildete Rückstand wurde einer Säulenchromatographie mit mikrokristalliner Cellulose (Avicel) unterworfen. Die Füllung war mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol: n-Butanol : Essigsäure : Wasser   (21:3:7:9    Volumenverhältnis) präpariert. Die erhaltenen antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden einer Dünnschichtchromatographie mit Avicel SF mit dem Lösungsmitelgemisch mit der zuvor genannten gleichen   Zusammensetzung unterworfen, wobei die gleiche Prozedur, wie vorstehend angegeben, angewendet wurde. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,39 wurden gesammelt und im Vakuum zur Trockne eingedampft.



   Der so gebildete Rückstand wurde einer mikrokristallinen Cellulosesäulenchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (6:1,5:2,5 Volumenverhältnis) unterworfen, um die effektive Komponente zu reinigen. Die so gereinigte aktive Fraktion wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft, in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgelöst und in einer Sephedex G   1 säule    unter Verwendung von destilliertem Wasser entwikkelt. Die Fraktionen mit antimikrobieller Aktivität wurden gesammelt und einer Dünnschichtchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol : Essigsäure Wasser (6:1,5:2,5 Volumenverhältnis), wie vorstehend angegeben, unterworfen. Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,31 gesammelt, konzentriert und dann lyophilisiert.

  Es wurde etwa 60 mg weisses   745-Amino-5-carboxyvaleramidof3-      (1 -methyl-1      H-tetrazol-5-yl)thiomethyl-7-methoxy-h    3-cephem4carbonsäure erhalten.



  Beispiel 3
Herstellung von   745-Ami      o-5-carboxyvaleramido > 7-me-      thoxy-345-methyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-h 3-cephem4-    carbonsäure III:
Ein Kulturmedium, welches 1%   Stärke, 1%      Glukose, 1,5%      Sojabohnenmehl, 0,5%      Hefeextrakt, 0,1%    Dikaliumhydrogen   phosphat, 0,05%    Magnesiumsulfat und 0,3% Natriumchlorid enthielt, wurde in 500 ml Sakaguchiflaschen mit je 10 ml gefüllt und 20 Minuten bei 120   "C    sterilisiert. Jedes Medium wurde dann mit Streptomyces oganonensis Y-G19Z Stamm beimpft und 48 Stunden bei 30   "C    kultiviert.

  Ein weiteres Kulturmedium, wie vorstehend beschrieben, wurde in Zweiliter-Sakaguchiflaschen mit je 400 ml gefüllt und 20 Minuten bei 120   "C    sterilisiert. Jedes Medium wurde mit der vorstehend kultivierten Brühe mit einer 2-3%igen Konzentration beimpft und dann 24 Stunden bei 30   "C    kultiviert, wodurch eine Animpfkultur erhalten wurde.



   Separat wurden je 60 Liter des Kulturmediums, das 7%   Stärke, 2%      Glutenmehl, 2%      Sojabohnenmehl, 0,8%    Glycerin, 0,1%   Casaminsäure, 0,01%    Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid enthielt, in zwei 100 Liter Fermentoren zusammen mit 10 m] Adecanol als Entschäumungsmittel gefüllt. Es wurde 30 Minuten bei 120   "C    sterilisiert und mit 800 ml der Animpfungskultur beimpft. Es wurde 24 Stunden bei 30   "C    kultiviert. Dann wurde 2-Mercapto-5-methyl-1,3,4-thiadiazol in wässeriger Natriumhydroxidlösung gelöst und unter hohem Druck sterilisiert und zu der Kulturbrühe hinzugegeben, so dass die Konzentration davon 0,05% in der Brühe betrug, worauf 90 Stunden weiter kultiviert wurde.



   Nach beendeten Kultivierung wurde die Kulturbrühe auf pH 2,0 eingestellt und mit Radiolite als Filterhilfsmittel unter Rühren vermischt. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer Filterpresse filtriert und die Filtrate wurden vereinigt und ergeben etwa 300 Liter Filtratgemisch.



   Das Filtrat wurde auf pH 3,0 eingestellt durch Zugabe von wässeriger Natriumhydroxidlösung und dann durch eine 12 Liter Amberlite XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit 30 Liter Wasser gewaschen. Es wurde mit 30 Liter wässerigem   50'/obigem    Aceton eluiert. Das Eluat wurde auf 5,5 Liter eingeengt, und das Konzentrat wurde auf pH 3,5 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt und durch eine 3 Liter Amberlite IRA-68 (cl-Typ)Säule gegeben. Die Säule wurde mit 6 Liter Wasser gewaschen. Es wurde mit einer wässerigen Lösung (pH 7,2), die 1 M Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat enthielt, eluiert. Es wurden etwa 5 Liter eines antimikrobiell aktiven Materials erhalten. Die Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt und durch eine Einliter-Amberlite XAD-2 Säule gegeben.

  Nach dem Waschen der Säule mit Wasser wurde die Säule mit einer wässerigen Lösung von 50%igem Aceton eluiert. Es wurde etwa 400 ml wässerige Lösung, die das antimikrobiell aktive Material enthielt, gewonnen. Das Produkt wurde lyophilisiert.



   Unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol :Essigsäure :Wasser   (4:1:2    Volumenverhältnis) wurde der gebildete Rückstand einer Säulenchromatographie unterworfen unter Verwendung mikrokristalliner Cellulose (Avicel), gefüllt mit dem Lösungsmittelgemisch der vorstehend angegebenen gleichen Zusammensetzung. Dann wurden die erhaltenen antimikrobiell aktiven Fraktionen fraktioniert und tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte von Avicel SF aufgetragen   und mit einem Lösungsmittelgemisch Isopropanol :butanol n-Butanol:    Essigsäure : Wasser   (21:3:7:9    im Volumenverhältnis) entwikkelt. Eine Pyridinlösung von 0,25% Ninhydrin wurde übergesprüht und unter Erwärmen die Anfärbung entwickelt.

  Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,43 wurden gesammelt und im Vakuum zur Trockne bei 45-50   "C    gebracht. Der erhaltene Rückstand wurde der Säulenchromatographie mit mikrokristalliner Cellulose (Avicel) unterworfen. Die Säule war präpariert mit einem Lösungsmittelgemisch aus Acetonitril : Wasser (7:3 Volumenverhältnis). Die erhaltene antimikrobiell aktive Fraktion wurde einer Dünnschichtchromatographie mit Avicel SF, wie bei der vorstehenden Prozedur unterworfen. Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,43 gesammelt und zur Trockne eingedampft. Es wurde 0,78 g rohes Pulver erhalten.



   Das Pulver wurde in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgelöst und in einer Säule aus Sephadex G 10 unter Verwendung von destilliertem Wasser entwickelt. Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden fraktioniert und einer Dünnschichtchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser   (4:1:2    Volumenverhältnis), wie vorstehend angegeben, unterworfen. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,43 wurden gesammelt, eingeengt und lyophilisiert. Es wurden 82 mg weisse   745-       Amino-5-carboxyvaleramidoS7-methoxy-345-methyl-1,3,4-thia-      diazel-2-ylpthiomethyl-A    3-cephem4-carbonsäure erhalten.



  Beispiel 4
Durch Anwendung des gleichen Verfahrens, wie im Beispiel 1 angegeben, jedoch unter Verwendung einer Lösung von bis   (5-Carboxymethylthio-1 ,3,4-ffliadiazol-2-yl)disulfid;herge-    stellt durch Auflösen des Disulfids in wasserhaltigem Methanol und Sterilisation durch Filtration mittels Milliporefilter in diesem Beispiel anstelle der Lösung   von5-Mercapto-1 ,3,4-thiadia-    zol-2-thioessigsäure, hergestellt in Wasser unter Verwendung wässeriger Natriumhydroxidlösung und Sterilisation bei hohem Druck, wurde 23 g Rohpulver der hergestellten Verbindung I erhalten.

  Durch Reinigen des Produktes, wie im Beispiel 1 angegeben, wurde etwa 45 mg   7-(5-Amino-5-carboxyvalera-       mido 35-carboxymethylthio- 1 ,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-7-      methoxy-h    3-cephem4-carbonsäure (hergestellte Verbindung I) erhalten.

 

  Beispiel 5
Durch Anwendung des gleichen Verfahrens, wie im Beispiel 2 angegeben, jedoch unter Verwendung einer Lösung von   bis( 1 -Methyl- 1 H-tetrazol-5-yl)disulfid,    hergestellt durch Auflösen des Disulfids in Wasser enthaltendem Methanol und Sterilisation durch Filtration mittels Milliporefilter in diesem Beispiel anstelle einer Lösung von   1-Methyl-5-mercapto-lH-tetrazol,    hergestellt durch Auflösen des Tetrazols in Wasser unter Verwendung einer wässerigen Natriumhydroxidlösung und Sterilisation bei hohem Druck, wurde etwa 26 g des rohen Pulvers der hergestellten Verbindung II erhalten.

  Durch Reinigen des Produktes, wie im Beispiel 2 angegeben, wurde etwa 37 mg   745-        Amino-5-carboxyvaleramido)-3(1 -methyl-1 H-tetrazol-5-yl > thio      methyl-7-methoxy-h    3-cephem4-carbonsäure (hergestellte Verbindung II) erhalten.



  Beispiel 6
Durch Anwenden des gleichen Verfahrens wie im Beispiel 3 angegeben, wurde durch Einsetzen einer Lösung von bis (5-Me   thyl-1 ,3,4-thiadiazol-2-yl)disulfid,    hergestellt durch Auflösen des Disulfids in wasserhaltigem Methanol, und Sterilistion durch Filtration mittels Milliparfilter in diesem Beispiel anstelle der Lösung von   2-Mercapto-5-methyl-1,3,4-thiadiazol,    hergestellt in Wasser unter Verwendung einer wässerigen Natriumhydroxidlösung und Sterilisation bei hohem Druck, etwa 19 g rohes Pulver der hergestellten Verbindung III erhalten. Durch Reinigen des Produktes, wie im Beispiel 3 angegeben, wurde etwa 50 mg    7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido7-methoxy-35-methyl-1,36-      thiadiazol-2-yl)thiomethyl-h    3-cephem4-carbonsäure (hergestellte Verbindung III) erhalten.



  Beispiel 7
Herstellung von   7-(5-Amino-5-5-carboxyvaleramido)-7-me-      thoxy-341,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-h    3-cephem4-carbonsäure IV.



   Ein Kulturmedium, welches 1%   Stärke, 1%      Glukose, 1,5%      Sojabohnenmehl, 0,5%      Hefeextrakt, 0,1%    Dikaliumhydrogen   phosphat, 0,05%    Magnesiumsulfat und 0,3% Natriumchlorid enthielt, wurde in 500 ml Sakaguchiflaschen mit je 100 ml gefüllt, 20 Minuten bei 120   "C    sterilisiert und mit dem Streptomyces oganonensis Y-G19Z-Stamm beimpft. Anschliessend wurde 48 Stunden bei 30   "C    kultiviert. Ein weiteres vorstehendes Kulturmedium wurde in Zweiliter-Sakaguchiflaschen mit jeweils 400 ml gefüllt und 20 Minuten bei 120   "C    sterilisiert. Dann wurde mit 2-3% der Kulturbrühe, die gemäss dem vorstehenden Verfahren hergestellt wurde, angeimpft.

  Es wurde 24 Stunden bei 30   "C    kultiviert, um eine Animpfkultur zu erhalten.



   Separat wurden 60 Liter eines Kulturmediums, das 7%   Stärke, 2%      Glutenmehl, 2%      Sojabohnenmehl, 0,8%    Glycerin, 0,1%   Casaminosäure, 0,01%    Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid in zwei 100 Liter Fermentoren, zusammen mit 10 ml Adecanol als Entschäumungsmittel gefüllt und 30 Minuten bei 120   "C    sterilisiert. Dann wurde mit 800   mlder    Animpfkultur beimpft.



  Es wurde 24 Stunden bei 30   "C    kultiviert. Dann wurde eine Lösung von 2-Mercapto-1,3,4-thiadiazol, hergestellt durch Auflösen des Thiadiazols in Wasser unter Verwendung einer wässerigen Natriumhydroxidlösung und Sterilisation unter hohem Druck, zu der Kulturbrühe hinzugefügt, so dass die Konzentration des Thiadiazols 0,05% betrug. Der Ansatz wurde dann 90 Stunden weiter kultiviert.



   Nach vollständiger Kultivierung wurde die Kulturbrühe auf pH 2,0 eingestellt und unter Rühren mit Radiolite als Filterhilfsmittel versetzt. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer Filterpresse filtriert und die Filtrate wurden vereinigt, wodurch etwa 100 Liter des Filtratgemischs erhalten wurden.



   Das Filtrat wurde auf pH 3,0 eingestellt, durch eine 12 Liter Amberlite XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit 30 Liter Wasser gewaschen. Es wurde mit 30 Liter wässeriger 50%iger Acetonlösung eluiert. Die Eluate wurden bis auf 5,5 Liter eingeengt. Das Konzentrat wurde auf pH 3,5 eingestellt und durch eine 3 Liter Amberlite IRA-68   (CL-Typ > Säule    gegeben. Die Säule wurde mit 6 Liter Wasser gewaschen. Eluiert wurde mit einer wässerigen Lösung (von pH 7,2), die 1 M Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat enthielt. Es wurden etwa 5 Liter einer Lösung, die antimikrobiell aktives Material enthielt, erhalten.



  Die Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt, durch eine Einliter Amberlite XAD-2-Säule gegeben und mit Wasser gewaschen.



  Es wurden etwa 400 ml wässerige Lösung, die das antimikrobiell aktive Material enthielt, gewonnen. Die Lösung wurde   lyo-    philisiert. Unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol :   Essigsäure: Wasser (4:1 :2    Volumenverhältnis) wurde der gebildete Rückstand einer Säulenchromatographie unterworfen unter Verwendung mikrokristalliner Cellulose (Avicel) und mit dem Lösungsmittelgemisch der gleichen vorstehenden Zusammensetzung präpariert. Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden fraktioniert, tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel gebracht, entwickelt unter Verwendung eines Lösungsmittelgemischs aus Isopropanol: n-butanol :   Essigsäure : Wasser (21:3:7:9    im Volumenverhältnis).

  Dann wurde eine Pyridinlösung von 0,25% Ninhydrin aufgesprüht und durch Erwärmen die Anfärbung entwickelt.



  Hierauf wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,39 gesammelt und im Vakuum bei 45-50   "C    zur Trockne eingedampft.



  Der Produktrückstand wurde einer Säulenchromatographie mit mikrokristalliner Cellulose (Avicel) unterworfen und mit einem Lösungsmittelgemisch aus   Acetonitril : Wasser (7:3    Volumenverhältnis) präpariert. Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden ebenfalls einer Dünnschichtchromatographie mit Avicel SF wie in dem vorstehenden Verfahren unterworfen. Die Fraktionen mit dem RF-Wert 0,39 wurden gesammelt, im Vakuum zur Trockne eingedampft. Es wurde 0,92 g rohes Pulver erhalten.



  Das rohe Pulver wurde in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgelöst und dann einer Säulenchromatographie unter Verwendung von Amberlite CG-50 (H-Typ) mit destilliertem Wasser unterworfen, und die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden gesammelt, konzentriert und lyophilisiert. Der Rückstand wurde in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgelöst und in einer Säule aus Sephedex G 10 unter Verwendung von destilliertem Wasser entwickelt. Die antimikrobielle Aktivität jeder Fraktion wurde geprüft Die effektiven Fraktionen wurden einer Dünnschichtchromatographie unter Verwendung eines Gemisches aus   n-Butanol:Essigsäure:Wasser      (4:1:2    Volumenverhältnis), wie vorstehend beschrieben, unterzogen.



  Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,38 gesammelt, konzentriert und lyophilisiert. Es wurden weisse    745-Amino-5-carboxyvaleramidok7-methoxy-341,3,4-thiadiazol-      -2-yl)thiomethyl-h    3-cephem4-carbonsäure erhalten.



  Beispiel 8 a) Ein Kulturmedium, welches   1%      Stärke, 1%      Glukose, 1,5%      Sojabohnenmehl,0,5%    Hefeextrakt, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat,   0,05%    Magnesiumsulfat und 0,3% Natriumchlorid enthielt, wurde in 500-ml-Sakaguchiflaschen in einer Menge von je 100 ml gefüllt Jede Flasche wurde 20 Minuten bei 120   "C    sterilisiert. Jedes Medium wurde mit Streptomyces oganonensis   Y-G1 9Z-Stamm    beimpft und 48 Stunden bei 30   "C    kultiviert.



   Das Kulturmedium wurde ausserdem in Zweiliter-Sakaguchiflaschen in einer Menge von jeweils 400 ml gefüllt und 20 Minuten bei 120   "C    sterilisiert. Der Ansatz wurde mit 2-3% der Kulturbrühe, die wie vorstehend hergestellt wurde, beimpft und 24 Stunden bei 30   "C    kultiviert. Es wurde so eine Animpfkultur erhalten.



   Separat wurden 60 Liter eines Kulturmediums, welches 7%   Stärke, 2%      Glutenmehl, 2%      Sojabohnenmehl, 0,8%    Glycerin,   0,1 %      Casaminosäure, 0,01 %    Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid in zwei 100-Liter-Fermentoren zusammen mit je 10 ml Adecanol als Antischaummittel versetzt, sterilisiert während 30 Minuten bei 120   "C.    Es wurde mit 800 ml der Animpfkultur, die gemäss der vorstehenden Vorschrift hergestellt worden war, beimpft. Es wurde 24 Stunden bei 30   "C    kultiviert. 

  Dann wurde eine Lösung von   5-Mercapto-1-methyl-1H-tetrazol,    hergestellt aus einer wässerigen Natriumhydroxidlösung und Sterilisation bei hohem Druck, zu der Kulturbrühe so hinzugegeben, dass die Konzentration des Tetrazols 0,05% betrug. Die Kultivierung wurde noch 90 Stunden ausgeführt.



   Nachdem die Kultivierung vollständig war, wurde die Kulturbrühe auf pH 2,0 eingestellt und mit Radiolite als Filterhilfs  mittel unter Rühren vermischt. Das Gemisch wurde mit einer Filterpresse filtriert, und die erhaltenen Filtrate wurden vereinigt. Es wurden 100 Liter Filtratgemisch mit einem Gehalt an 100 mcg/ml an   745-Amino-5-carboxyvaleramidof7-methoxy-3-      (1 -methyl-1 H-tetrazol-5-yl)thiomethyl-A    3-cephem4-carbonsäure erhalten.



   b) Das Filtrat wurde auf pH 3,0 eingestellt und durch eine   1 2-Liter-Amberlite-XAD-2-Säule    gegeben. Die Säule wurde mit 30 Liter Wasser gewaschen und mit 30 Liter wässerigem   50%igem    Aceton eluiert. Das Eluat wurde bis auf 5,5 Liter eingeengt. Das Konzentrat wurde auf pH 7,5 unter Verwendung wässeriger Natriumhydroxidlösung eingestellt und die hergestellte Verbindung isoliert.



  Beispiel 9
Herstellung von   745-Amino-5-carboxyvaleramido);341-me-    thyl-l   H-tetrazol-5-yl)thiomethyl-7-methoxy-h      3-cephem-4 car-    bonsäure.



   Ein Kulturmedium, welches   1%    Stärke, 1%   Glucose, 1,5%      Sojabohnenmehl,0,5%    Hefeextrakt,   0,1%    Dikaliumhydrogen   phosphat, 0,05%    Magnesiumsulfat und   0,3%    Natriumchlorid enthielt, wurde in 500-ml-Sakaguchiflaschen in jeweils einer Menge von 100 ml eingefüllt. Jedes Medium wurde 20 Minuten bei 120   "C    sterilisiert. Das sterile Kulturmedium wurde mit dem Streptomyces oganonensis Y-G19Z-Stamm beimpft Es wurde 48 Stunden bei 30   "C    kultiviert. Das vorstehend hergestellte Kulturmedium wurde auch in 2-Liter-Sakaguchiflaschen in einer Menge von jeweils 400 ml eingefüllt.

  Nach dem Sterilisieren des Mediums für 20 Minuten bei 120   "C    wurde das Kulturmedium mit der im vorstehenden Verfahren erhaltenen Kulturbrühe in einer Menge von 2-3% beimpft. Es wurde 24 Stunden bei 30   "C    kultiviert, um eine Animpfkultur zu erhalten.



   Separat wurden 60 Liter eines Kulturmediums, welches 7%   Stärke, 2%      Glutenmehl, 2%      Sojabohnenmehl,0,8%    Glycerin,   0,1 %      Casaminosäure, 0,01 %    Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid enthielt, in 200-Liter-Fermentoren zusammen mit je 10 ml Adecanol als Entschäumungsmittel eingefüllt. Jedes Kulturmedium wurde für 30 Minuten bei 120   "C    sterilisiert. Es wurde mit 800 ml der nach der vorstehenden Arbeitsweise hergestellten Animpfkultur beimpft. Dann wurde zu jedem Fermentor eine Lösung von   1-Methyl-5-mercapto-1    H-tetrazol, hergestellt durch Auflösen in wässeriger Natriumhydroxidlösung und Sterilisieren unter hohem Druck, so dass der Gehalt   0,05%    betrug.



  Dann wurde die Kulturbrühe 90 Stunden weiter kultiviert.



   Nach beendeter Kultivierung wurde die Kulturbrühe auf pH 2,0 eingestellt und mit Radiolite als Filterhilfsmittel unter Rüh ren vermischt. Das Gemisch wurde durch eine Filterpresse fil triert, und die Filtrate wurden zu etwa 100 Liter Filtratgemisch vereinigt.



   Das Gemisch wurde auf pH 3,0 durch die Zugabe von wäs seriger Natriumhydroxidlösung eingestellt. Dann wurde es durch eine 12-Liter-Amberlite-XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit 30 Liter Wasser gewaschen. Es wurde mit 30 Liter wässerigem 50%igem Aceton eluiert. Das Eluat wurde bis auf
5,5 Liter eingeengt. Das Konzentrat wurde auf pH 3,5 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt und durch eine   3-Liter-Amberlite-IRA-68ACI-TyppSäule    gegeben. Die Säule wurde mit 6 Liter Wasser gewaschen und mit wässeriger Lösung (pH 7,2), die 1 n Natriumnitrat und 0,1 M
Natriumacetat enthielt, eluiert. Es wurden etwa 5 Liter Lösung, die ein antimikrobiell aktives Material enthielt, gewonnen. Die
Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt, und sie wurde durch eine    l-Liter-Amberlite-XAD-2-Säule    gegeben.

  Die Säule wurde mit
Wasser gewaschen. Es wurde mit wässerigem   50%igem    Aceton eluiert.



   Es wurde etwa 400 ml wässerige Lösung mit antimikrobiell aktivem Material erhalten, welches lyophilisiert wurde. Es wurden etwa 54 g rohes Pulver erhalten. Das rohe Pulver wurde einer Säulenchromatographie unterworfen. Es wurden hierzu 800 ml DEAE Sephadex A-25 (Essigsäure-Typ) verwendet und mit einer kleinen Menge 0,5 M Ammoniumbromid-Essigsäurepufferlösung gefüllt. Es wurden die effektiven Fraktionen isoliert. Die so gesammelten antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden durch eine 500-ml-Amberlite-XAD-2-Säule gegeben.



  Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit wässerigem   25 %igem    Aceton eluiert. Das Eluat wurde dann im Vakuum zur Trockene eingedampft. Das getrocknete Produkt wurde einer Säulenchromatographie mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol:Wasser (7:3 im Volumenverhältnis) mittels mikrokristalliner Cellulose (Avicel) unterworfen. Die Säule war mit dem Lösungsmittelgemisch der vorstehend angegebenen Zusammensetzung gefüllt. Die Fraktionen mit antimikrobieller Aktivität wurden tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF aufgetragen und mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol :Essigsäure :Wasser   (6:1,5:2,5    im Volumenverhältnis) entwickelt.



   Eine Pyridinlösung von 0,25% Ninhydrin wurde aufgesprüht, und die Anfärbung wurde durch Erwärmen entwickelt.



  Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,31 wurden gesammelt, im Vakuum bei 45-50   "C    zur Trockene eingedampft und einer Säulenchromatographie mit mikrokristalliner Cellulose (Avicel) unterworfen. Die Säule enthielt ein Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol :n-Butanol :Essigsäure :Wasser   (21:3:7:9    im Volumenverhältnis). Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden dann ausgewählt und einer Dünnschichtchromatographie mit Avicel SF unterworfen. Hierbei wurde das gleiche vorstehende Verfahren angewendet. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,39 wurden gesammelt und im Vakuum zur Trockene eingedampft.



   Das getrocknete Produkt wurde in eine Chromatographiesäule mit mikrokristalliner Cellulose gegeben.



   Es wurde ein Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol:Essigsäure:Wasser (6:1,5:2,5 im Volumenverhältnis) verwendet, um eine Reinigung der effektiven Komponente zu erzielen. Die gereinigten aktiven Fraktionen wurden durch Konzentration getrocknet, in einer kleinen Menge destilliertem Wasser gelöst und in einer Säule mit Sephadex G 10 unter Verwendung von destilliertem Wasser entwickelt. Die antimikrobielle Aktivität jeder Fraktion wurde geprüft, und die effektiven Fraktionen wurden ausgewählt und einer Dünnschichtchromatographie unterworfen, wie dies vorstehend erläutert wurde.



   Es wurde ein Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol:Essig   säure:Wasser    (6:1,5:2,5 im Volumenverhältnis) verwendet. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,31 wurden gesammelt, konzentriert und lyophilisiert. Es wurde etwa 60 mg weisse   745-Amino-      5-carboxyvaleramidot3-( I-methyl-l    H-tetrazol-5-yl)thiomethyl   7-methoxy-h      3-cephem4-carbonsäure    erhalten.



  Beispiel 10
Herstellung von   7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido > 7-me-      thoxy-3 < 5-methyl-l ,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-A    3-cephem4carbonsäure.



   Ein Kulturmedium, welches   1 %    Stärke, 1%   Glukose, 1,5%      Sojabohnenmehl, 0,5%    Hefeextrakt, 0,1% Dikaliumhydrogen   phosphat, 0,05%    Magnesiumsulfat und   0,3%    Natriumchlorid enthielt, wurde in 500-ml-Sakaguchiflaschen in einer Menge von jeweils 100 ml eingefüllt. Jedes Medium wurde 20 Minuten bei 120   "C    sterilisiert. Das Kulturmedium wurde dann mit dem Streptomyces oganonensis   Y-G1 9Z-Stamm    beimpft. Anschliessend wurde 48 Stunden bei 30   "C    kultiviert.

 

   Das vorstehende Kulturmedium wurde in 2-Liter-Sakaguchiflaschen in einer Menge von jeweils 400 ml eingefüllt und 20 Minuten bei 120   "C    sterilisiert.



   Dann wurde mit 2-3% Kulturbrühe, gemäss dem vorstehenden Verfahren erhalten, angeimpft. Es wurde 24 Stunden bei 30   "C    kultiviert, um eine Animpfkultur zu erhalten.



   Separat wurden 60 Liter eines Kulturmediums, welches 7%      Stärke, 2%      Glutenmehl, 2%      Sojabohnenmehl, 0,8%    Glycerin,    0,1 %      Casaminosäure,0,01 %    Ferrisulfat und 55 g Natriumhydro xid enthielt, in 200-Liter-Fermentoren zusammen mit 10 ml
Adecanol gefüllt und 30 Minuten bei 120   "C    sterilisiert. Dann wurde mit 800 ml Animpfkultur, hergestellt nach dem vorste henden Verfahren, geimpft. Es wurde 24 Stunden bei 30   "C    kul tiviert. In jeden Fermentor wurde eine Lösung von 2-Mercapto    5-methyl-1 ,3,4-thiadiazol,    hergestellt mit wässeriger Natriumhy droxidlösung und Sterilisieren bei hohem Druck, hinzugegeben so dass ihr Gehalt   0,05%    der Kulturbrühe betrug.

  Die Kultivie rung wurde 90 Stunden fortgesetzt.



   Nach vollständiger Kultivierung wurde die Kulturbrühe auf pH 2,0 eingestellt. Radiolite wurde als Filterhilfsmittel unter
Rühren zugesetzt. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer Filterpresse filtriert. Die Filtrate wurden vereinigt und ergaben etwa 100 Liter Filtratgemisch.



   Das Filtrat wurde auf pH 3,0 durch die Zugabe von wässeri ger Natriumhydroxidlösung eingestellt. Die Lösung wurde durch eine   12-Liter-Amberlite;XAD-2-Säule    gegeben. Die Säule wurde mit 30 Liter Wasser gewaschen und mit 30 Liter wässeri gem 50%igem Aceton eluiert. Das Eluat wird konzentriert bis zu 5,5 Liter, auf pH 3,5 mit verdünnter wässeriger Chlorwasser stoffsäurelösung eingestellt und in eine 3-Liter-Amberlite-IRA    68-(C1-Typ)Säule    gefüllt. Die Säule wurde mit 6 Liter Wasser gewaschen und mit einer wässerigen Lösung (pH 7,2), die 1 M
Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat enthielt, eluiert. Es wurden etwa 5 Liter einer Lösung, die antimikrobiell aktives
Material enthielt, gewonnen. Die so erhaltene Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt und in eine 1-Liter-Amberlite-XAD-2
Säule eingefüllt.

  Die Säule wurde mit 50%igem wässerigem Aceton eluiert. Es wurden etwa 400 ml wässerige Lösung, die das antimikrobielle Material enthielt, gewonnen. Die Lösung wurde lyophilisiert. Das Produkt wurde einer Säulenchromatographie mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol:Essigsäure:Wasser   (4:1:2    im Volumenverhältnis) unter Verwendung von mikrokristalliner Cellulose (Avicel) und einer Füllung mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch, wie vorstehend angegeben, unterworfen. Die erhaltenen antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF aufgetragen, und es wurde mit einem Lösungsmittelgemisch   Isopropanol :n-Butanol :Essigsäure:Wasser      (21:3:7:9    im Volumenverhältnis) entwickelt.

  Mit einer Pyridinlösung von   0,25%    Ninhydrin wurde besprüht, um durch Erwärmen anzufärben. Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,43 gesammelt und zur Trockene unter vermindertem Druck bei 45-50   "C    eingedampft. Das erhaltene Produkt wurde der Säulenchromatographie mit mikrokristalliner Cellulose (Avicel), gefüllt mit einem Lösungsmittelgemisch aus Acetonitril:Wasser (7:3 im Volumenverhältnis) unterworfen. Die erhaltenen antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden einer Dünnschichtchromatographie auf Avicel SF, wie bei der vorstehenden Arbeitsweise, unterworfen. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,43 wurden gesammelt und zur Trockene unter vermindertem Druck   einige.   



  dampft. Es wurden 0,78 g eines rohen Pulvers erhalten.



   Das Produkt wurde in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgelöst und in einer Säule aus Sephadex G 10 unter Verwendung von destilliertem Wasser entwickelt. Die antimikrobielle Aktivität jeder Fraktion wurde geprüft. Die effektiven Fraktionen wurden einer Dünnschichtchromatographie, wie vorstehend angegeben, unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol:Essigsäure:Wasser   (4:1:2    im Volumenverhältnis) unterworfen. Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,43 gesammelt, eingeengt und lyophilisiert. Es wurde 82 mg weisse   745-Amino-5-carboxyvaleramidop7-me-      thoxy-345-methyl-1,3,4-thiadiazol-2-ylpthiomethyl-h    3-cephem4-carbonsäure erhalten.



  Beispiel 11 Herstellung von   745-Amino-5-carboxyvaleramidof345-carbo-      xymethylthio-1,3,4-thiadiazol-2-ylpthiomethyl-7-methoxy-d    3-cephem-4-carbonsäure.



   Ein Kulturmedium, welches   1%    Stärke, 1%   Glukose, 1,5%      Sojabohnenmehl, 0,5%      Hefeextrakt,0,1 %    Dikaliumhydrogen   phosphat, 0,05%    Magnesiumsulfat und   0,3%    Natriumchlorid enthielt, wurde in eine 500-ml-Sakaguchiflasche mit jeweils 100 ml gefüllt und 20 Minuten bei 120   "C    sterilisiert. Jedes Kulturmedium wurde dann mit dem Streptomyces oganonensis Y-G19Z-Stamm beimpft. Es wurde anschliessend 48 Stunden bei 30   "C    kultiviert. Ein weiteres vorstehendes Kulturmedium wurde in 2000-ml-Sakaguchiflaschen jeweils mit 400 ml gefüllt, und jedes Kulturmedium wurde 20 Minuten bei 120   "C    sterilisiert.

  Dann wurde mit 2-3% der Kulturbrühe, hergestellt nach dem vorstehenden Verfahren, beimpft und anschliessend 24 Stunden bei 30   "C    kultiviert, um eine Animpfkultur zu erhalten.



   Separat wurden 60 Liter eines Kulturmediums, welches   7%      Stärke, 2%      Glutenmehl, 2%      Sojabohnenmehl, 0,8%    Glycerin,   0,1 %      Casaminosäure,0,01    Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid enthielt, in 200-Liter-Fermentoren zusammen mit 10 ml Adecanol als Entschäumungsmittel gefüllt Jedes Medium wurde 30 Minuten bei 120   "C    sterilisiert und mit 800 ml der Animpfkultur, hergestellt nach dem vorstehenden Verfahren, geimpft. Anschliessend wurde 24 Stunden bei 30   "C    kultiviert.



  Dann wurde in jeden Fermentator eine Lösung von bis(5-Carb   oxymethylthio-1,3,4-thiadiazol-2-yl)-disulfid,    hergestellt durch Auflösen des Disulfids in wasserhaltigem Methanol, und Sterilisieren durch Filtration unter Verwendung eines Millipore-Filters, in einer solchen Menge zugefügt, dass der Gehalt   0,05%    in der Kulturbrühe betrug. Die Kultivierung wurde 90 Stunden durchgeführt. Nach beendeter Kultivierung wurde die Kulturbrühe auf pH 2,0 eingestellt und mit Radiolite als Filterhilfsmittel unter Rühren versetzt. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer Filterpresse filtriert. Die Filtrate wurden vereinigt Es wurden etwa 100 Liter eines Filtratgemisches erhalten. Das Filtrat wurde auf pH 3,0 durch die Zugabe einer wässerigen Natriumhydroxidlösung eingestellt. Es wurde die Lösung in eine 12-Liter-Amberlite-XAD-2-Säule eingefüllt.

  Die Säule wurde mit 30 Liter Wasser gewaschen und mit 30 Liter wässerigem 50%igem Aceton eluiert. Das Eluat wurde bis auf 5,5   Liter    eingeengt. Nach Entfernung der gebildeten unlöslichen Anteile wurde Wasser zu dem Konzentrat hinzugefügt, um 10 Liter Lösung zu erhalten. Die Lösung wurde auf pH 3,5 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt, durch eine   3-Liter-Amberlite-IRA-68-(CI-Typ)-Säule    gegeben. Die Säule wurde mit 6 Liter Wasser gewaschen und mit einer wässerigen Lösung (pH 7,2), die 1 M Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat enthielt, eluiert. Es wurde etwa 5 Liter Lösung erhalten, die antimikrobiell aktives Material enthielt. Die Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt, in eine 1-Liter-Amberlite XAD-2-Säule gefüllt. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit wässerigem 50%igem Aceton eluiert.

  Es wurde etwa 400 ml wässerige Lösung, die antimikrobiell aktives Material enthielt, erhalten. Durch Lyophilisieren der wässerigen Lösung wurde etwa 23 g rohes Pulver erhalten. Dann wurde 23 g des rohen Pulvers einer Säulenchromatographie unter Verwendung von 800 ml DEAE-Sephadex A-25 (Essigsäure-Typ), gefüllt mit einer kleinen Menge 0,5 M Ammoniumbromid-Essigsäurepufferlösung, unterworfen, um die effektiven Komponenten abzutrennen. Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden gesammelt und in eine 500-ml-Amberlite-XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen. Es wurde mit wässerigem   25%igem    Aceton eluiert. Das Eluat wurde zur Trockene im Vakuum eingedampft. 

  Das Produkt wurde einer Säulenchromatographie mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol:Wasser (7:3 im Volumenverhältnis) unter Verwendung mikrokristalliner Cellulose (Avicel) unterworfen, wobei  das Lösungsmittelgemisch verwendet wurde, das die gleiche Zusammensetzung wie bei der vorstehenden Fraktionierung der antimikrobiell aktiven Fraktionen hatte. Die so erhaltenen Fraktionen wurden tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF aufgetragen und mit einem Lösungsmittelgemisch aus   Isopropanol:n-Butanol:Essigsäure:Wasser      (21:3:7:9    im Volumenverhältnis) entwickelt. Dann wurde eine Pyridinlösung von   0,25%    Ninhydrin aufgesprüht und die Anfärbung durch Erhitzen entwickelt. Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,39 gesammelt, zur Trockene unter vermindertem Druck eingedampft.

  Der Rückstand wurde einer Säulenchromatographie, mit mikrokristalliner Cellulose (Avicel) gefüllt, unterworfen. Es wurde ein Lösungsmittelgemisch aus   Isopropanol:n-Butanol:Essigsäure :Wasser      (21:3:7:9    im Volumenverhältnis) verwendet. Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden gesammelt und einer Dünnschichtchromatographie auf einer Avicel-SF-Platte unterworfen. Das Lösungsmittelgemisch hatte die gleiche Zusammensetzung wie das vorstehende Gemisch. Es wurde hierbei, wie vorstehend schon beschrieben, verfahren. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,39 wurden gesammelt und im Vakuum zur Trockene eingedampft.



   Das Konzentrat wurde mittels Säulenchromatographie unter Verwendung mikrokristalliner Cellulose und eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol :Essigsäure :Wasser (6:1,5:2,5 im Volumenverhältnis) gereinigt. Die gereinigten aktiven Fraktionen wurden im Vakuum zur Trockene eingedampft.



  Der Rückstand wurde in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgenommen und mit einer Säule aus Sephadex   G-10    unter Verwendung von destilliertem Wasser entwickelt. Die antimikrobielle Aktivität jeder Fraktion wurde geprüft. Die effektiven Fraktionen wurden einer Dünnschichtchromatographie, wie vorstehend angegeben, unterworfen. Es wurde ein Lösungsmittelgemisch aus   n-Butanol:Essigsäure:Wasser    (6:1,5:2,5 im Volumenverhältnis) verwendet. Die Fraktionen mit einem Rf-Wert 0,32 wurden gesammelt, konzentriert und lyophilisiert. Es wurden etwa 45 mg weisse   745-Amino-5-carboxy-      valeramidof345-carboxymethylthio-1,3,4-thiadiazol-2-yl)thio-      methyl-7-methoxyA      3-cephem4-carbonsäure    erhalten.



  Beispiel 12 Herstellung von   7-(5-Amino-5-carboxyvaleramidot7-methoxy      3(1 1 ,3,4-thiadiazol-2-ylhiomethyl-A 3-cephem-4-carbonsäure.   



   Ein Kulturmedium, welches   1%    Stärke, 1%   Glukose, 1,5%      Sojabohnenmehl, 0,5%      Hefeextrakt,0,1%    Dikalimhydrogen   phosphat,0,05%    Magnesiumsulfat und 0,3% Natriumchlorid enthielt, wurde in 500-ml-Sakaguchiflaschen mit jeweils 100 ml gefüllt und 20 Minuten bei 120   "C    sterilisiert. Dann wurde jedes Kulturmedium mit dem Streptomyces oganonensis   Y-Gl9Z-    Stamm beimpft. Anschliessend wurde 48 Stunden bei 30   "C    kultiviert. Ein weiteres vorstehendes Kulturmedium wurde in 2-Liter-Sakaguchiflaschen mit jeweils 400 ml gefüllt und 20 Minuten bei 120   OC    sterilisiert. Jedes Kulturmedium wurde mit der Kulturbrühe beimpft, die vorstehend hergestellt worden ist.



  Es wurde 24 Stunden bei 30   "C    kultiviert, um eine Animpfkultur zu erhalten. Separat wurden 60 Liter Kulturmedium, die 7%   Stärke, 2%      Glutenmehl, 2%      Sojabohnenmehl, 0,8%    Glycerin, 0,1 %   Casaminosäure, 0,01 %    Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid enthielt, in 200-Liter-Fermentoren zusammen mit 10 ml Adecanol als Entschäumungsmittel gefüllt und 30 Minuten bei 120   "C    sterilisiert. Jedes Kulturmedium wurde dann mit 800 ml der Animpfkultur beimpft und anschliessend 24 Stunden bei 30   "C    kultiviert.

  Dann wurde eine Lösung von   2-Mercapto-1,3,4-    thiadiazol, hergestellt mit wässeriger Natriumhydroxidlösung und Sterilisieren bei hohem Druck, zu jedem Fermentor in einer solchen Menge gegeben, dass der Gehalt 0,05% in der Kulturbrühe betrug.



   Dann wurde die Kultivierung 90 Stunden fortgesetzt. Nach vollständiger Kultivierung wurde die Kulturbrühe auf pH 2,0 eingestellt und mit Radiolite als Filterhilfsmittel unter Rühren vermischt. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer Filterpresse filtriert. Die Filtrate wurden vereinigt, und es wurden etwa 100 Liter Filtratgemisch erhalten. Das Filtrat wurde durch Zugabe einer wässerigen Natriumhydroxidlösung auf pH 3,0 eingestellt und in eine   12-Liter-Amberlite-XAD-2-Säule    gefüllt. Die Säule wurde mit 30 Liter Wasser gewaschen und mit 30 Liter wässerigem   500/obigem    Aceton eluiert. Das Eluat wurde auf 5,5 Liter eingeengt, auf pH 3,5 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäure eingestellt und dann in eine   3-Lter-Amberlite-lRA-68Cl-Typ)Säule    gegeben. Die Säule wurde mit 6 Liter Wasser gewaschen.

  Eluiert wurde mit einer wässerigen Lösung (pH 7,2), die 1 M Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat enthielt. Es wurden 5 Liter Lösung, die antimikrobiell aktives Material enthält, gewonnen. Die Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt, in eine 1-Liter-Amberlite-XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit   50%igem    Aceton eluiert. Es wurden etwa 400 ml wässerige Lösung, die antimikrobiell aktives Material enthielt, welches lyophilisiert wurde, erhalten.



   Das erhaltene Produkt wurde einer Säulenchromatographie mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol:Essig   säure:Wasser (4:1:2    im Volumenverhältnis) unter Verwendung mikrokristalliner Cellulose (Avicel) als Füllung unterworfen, wobei das Lösungsmittelgemisch mit der gleichen vorstehend angegebenen Zusammensetzung Anwendung fand, um die antimikrobiell aktiven Fraktionen auszuwählen.



   Die Fraktionen wurden tropfenweise auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF aufgetragen, und es wurde mit einem Lösungsmittelgemisch aus   Isopropanol:n-Butanol :Essig-    säure:Wasser   (21:3:7:9)    entwickelt. Eine Pyridinlösung von   0,25%    Ninhydrin wurde aufgesprüht, und durch Erwärmen wurde angefärbt. Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf Wert 0,39 gesammelt, unter vermindertem Druck zur Trockene bei 45-50   "C    eingedampft. Dann wurden die Fraktionen einer Dünnschichtchromatographie mit Avicel SF in der vorstehend beschriebenen Weise unterworfen, um die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,39 zu sammeln. Die Fraktionen wurden zur Trockene eingedampft, wobei 0,92 rohes Pulver erhalten wurde.

  Das Pulver wurde in einer kleinen Menge von destilliertem Wasser aufgelöst und einer Säulenchromatographie mit destilliertem Wasser unter Verwendung von Amberlite CG-50 (H-Typ) unterworfen, um die antimikrobiell aktiven Fraktionen auszuwählen. Die Fraktionen wurden dann konzentriert und lyophilisiert. Das Produkt wurde in einer kleinen Menge aus destilliertem Wasser aufgelöst und in einer Säule aus Sephadex G-10 unter Verwendung von destilliertem Wasser entwickelt. Die antimikrobielle Aktivität jeder Fraktion wurde geprüft. Die effektiven Fraktionen wurden einer Dünnschichtchromatographie in der schon vorstehend erläuterten Weise unterworfen. Es wurde ein Lösungsmittelgemisch aus   n-Butanol:Essigsäure:Wasser      (4:1:2    im Volumenverhältnis) verwendet, um die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,38 zu sammeln. 

  Die Fraktionen wurden eingeengt und lyophilisiert, und dabei wurden 75 mg weisse    745-Amino-5-carboxyvaleramidof7-methoxy-341,3,4-thiadiazol-      -2-yl > thiomethyl-A    3-cephem4-carbonsäure erhalten.



   Arzneimittel, welche Verbindungen der Formel A enthalten, können, wie nachstehend angegeben, hergestellt werden: a) Trocken gefüllte Kapseln mit 120 mg   7 < 5-Amino-5-carb-      oxyvaleramidof7-methoxy-341-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiome-    thyl-A   3-cephem4-carbonsäure    pro Kapsel   745-Amino-5-carboxyvaleramidof7-methoxy-341-    120 mg methyl-1 H-tetrazol-5-yl)thiomethyl A 3-cephem-4-carbonsäure Laktose 20 mg Magnesiumstearat 5 mg Kapsel Nr.3 145 mg  
7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-( 1-methyl1   H-tetrazol-5-yl)thiomethyl-h    3-cephem-4-carbonsäure wurde zu einem Pulver Nr.60 verrieben, und dazu wurden Laktose und Magnesiumstearat durch ein Siebtuch Nr.60 gegeben.

  Die vereinigten Ingredientien wurden 10 Minuten zusammen gemischt und dann in trockene Gelatinekapseln Nr.3 abgefüllt.



  b) Tabletten mit 150 mg   7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-      methoxy-3-( 1    -methyl-1   H-tetrazol-5-yl)thiomethyl-h    3-cephem4carbonsäure pro Tablette   745-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(1 -    150 mg methyl-1 H-tetrazol-5-yl)thiomethyl A 3-cephem4-carbonsäure Dicalciumphosphat J.P. 115 mg Magnesiumstearat 3 mg Laktose J.P.   39 mg   
Die aktive Komponente wird mit dem Dicalciumphosphat und der Laktose gemischt. Das Gemisch wird mit   15%iger   
Kornstärkepaste (4 mg) granuliert und grob gesiebt, bei 40   "C    getrocknet und erneut durch ein Sieb Nr. 16 gesiebt. 

  Das Magnesiumstearat wird hinzugefügt, und das Gemisch wird in Tabletten mit annähernd 0,8 cm Durchmesser gepresst c) Parenterale Lösung mit 500 mg 7-(5-Amino-5-carboxyvaler    amido)-7-methoxy-3-(1 -methyl-1    H-tetrazol-5-yl)-thiomethyl    A 3-cephem4-carbonsäure    pro Ampulle   7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-( 1 -    500 mg methyl-1 H-tetrazol-5-yl)thiomethyl A 3-cephem-4-carbonsäure
Die aktive Verbindung (50,0 g) wird in 150 ml steriles Wasser für Injektionszwecke gegeben. Die erhaltene Lösung wird auf pH 8,0 durch Zugabe von verdünnter Natriumhydroxidlösung eingestellt. Das Volumen der Lösung wird auf 200 ml aufgefüllt. Die Lösung wird in 100 Ampullen abgefüllt, lyophilisiert und verschmolzen. 

Claims (5)

1. PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von 7-Methoxycephalosporinderivaten mit der Formel (A) EMI1.1 worin R2 eine Stickstoff als Ringheteroatom enthaltende heterocyclische Gruppe darstellt und M bedeutet ein Wasserstoffatom, Alkalimetall, Erdalkalimetall, Schwermetall oder Basen die quaternäres Salz oder Aminsalz bilden, dadurch gekennzeichnet, dass Streptomyces oganonensis ATCC 31167 in einem Kulturmedium gezüchtet wird, welches Nährstoffe mit dem Zusatz eines heterocyclischen Thiols mit der Formel R2SH, worin R2 die vorstehend genannte Bedeutung hat, oder eines Salzes des heterocyclischen Thiols oder eine Verbindung mit der Formel R2-S-S-R2, worin R2 die gleiche schon genannte Bedeutung hat, enthält.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R2 eine 1-Methyl-1 H-tetrazol-5-ylgruppe ist und M ein Wasserstoffatom darstellt.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R2 eine 5-Carboxymethylthio-1 ,3,4thiadiazol-2-ylgruppe und M ein Wasserstoffatom darstellt.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R2 eine 5-Methyl-1,3,4-thiadiazol-2-ylgruppe und M ein Wasserstoffatom darstellt.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R2 eine 1 ,3,4-Thiadiazol-2-ylgruppe und M ein Wasserstoffatom ist.

   Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 7-Methoxycephalosporinderivaten mit der Formel (A) EMI1.2 worin R2 eine Stickstoff als Ringheteroatom enthaltende hete rocyclische Gruppe darstellt und M bedeutet ein Wasserstoff atom, Alkalimetall, Erdalkalimetall, Schwermetall oder Basen, die quaternäres Salz oder Aminsalz bilden, dadurch gekenn zeichnet, dass Streptomyces oganonensis ATCC 31167 in einem Kulturmedium gezüchtet wird, welches Nährstoffe mit dem Zusatz eines heteroyclischen Thiols mit der Formel R2SH, worin R2 die vorstehend genannte Bedeutung hat, oder eines Salzes des heterocyclischen Thiols oder eine Verbindung mit der Formel R2-S-S-R2, worin R2 die gleiche schon genannte Bedeutung hat, enthält.

   Als stickstoffhaltige heterocyclische Gruppe, die durch R2 in der vorstehenden allgemeinen Formel angezeigt wird, werden zur Verdeutlichung genannt: eine Carboxymethylthio-1,3thiadiazol-2-yl-Gruppe, eine 1 -Methyl-1 H-tetrazol-5-yl-Gruppe, eine 5-Methyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl-Gruppe, eine 1 ,3,4-Thiadia- zol-2-yl-Gruppe usw.

   Der durch M dargestellte kationische Rest, der das Salz des Cephalosporins bildet, bedeutet einen anorganischen Rest oder einen organischen Rest. Als anorganischer Rest wird ein Alkalimetall, wie Natrium, Kalium usw.; ein Erkalkalimetall, wie Calcium, Magnesium, Barium usw.; sowie ein Schwermetall, wie Eisen, Kupfer, Zink usw. verwendet; als organischen Rest dienen Basen, die quaternäre Salze oder Aminsalze bilden, zum Beispiel Triäthylamin, Diäthanolamin, Piperidin, Morpholin usw.

   Praktische Beispiele für Verbindungen dieser Erfindung sind 745-Amino-5-carboxyvaleramidof345-carboxymethylthio- 1 ,3,4thiadiazol-2-yl > thiomethylj-methoxy-A 3-cephem4-carbonsäure, 75-Amino-5-carboxyvaleramido > 3-(1-methy1-1 H- tetrazol-5-yl)thiomethyl-7-methoxy-h 3-cephem4-carbonsäure, 745-Amino-5-carboxyvaleramidof7-methoxy:345-methyl-1,3,4- thiadiazol-2-yl)thiomethyl-A 3-cephem4-carbonsäure, 745- Amino-5-carboxyvaleramidof7-methoxy-341 ,3,4-thiadiazol-2yl)thiomethyl- A3-cephem4-carbonsäure, sowie die Salze dieser Verbindungen.

   Einige 7-Methoxy-3-heterocyclothiomethylcephalosporine sind in der GB-PS 1 321 412 (1970) als durch chemische Synthese erhältliche Verbindungen beschrieben, jedoch sind in dieser britischen Patentschrift keine praktischen physikalischen und chemischen Eigenschaften dieser Verbindungen angegeben. **WARNUNG** Ende CLMS Feld konnte Anfang DESC uberlappen**.