Verfahren und Vorrichtung zur Analyse von Peptiden
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Analyse von im Eluat einer Chro matographie-S äule enthaltenen Peptiden durch Weiterleiten des aus der Säule ausströmenden Eluates in Form eines Flüssigkeitsstroms und Analyse des Flüssigkeitsstroms.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu entwickeln, mit denen derartige Analysen kontinuierlich und automatisch durchgeführt werden können.
Ausgehend von dem eingangs beschriebenen Verfahren besteht dazu die Erfindung darin, dass man die kontinuierlich aus der Säule in Form eines Eluats aus fliessenden Peptide durch Behandlung mit einem alkalischen Mittel unter Erwärmung hydrolysiert und die kontinuierlich hydrolysierten Peptide als Flüssigkeitsstrom durch ein Analysiergerät leitet und kontinuierlich analysiert.
Bei einer Vorrichtung zur Ausübung dieses Verfahrens, enthaltend eine Chromatographie-Säule, eine über eine Pumpe an die Chromatographie-Säule angeschlossene Röhre und eine mit der Pumpe verbundene Einrichtung für eine kolorimetrische quantitative Analyse ist die Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass die Röhre durch ein Heizbad führt, eine Zuleitung für ein Hydrolysiermittel vorgesehen ist und die Pumpe über weitere Transportröhren derart sowohl an die Zuleitung für das Hydrolysiermittel als auch an die Eingangsseite der Röhre im Heizbad angeschlossen ist, dass das die Peptide enthaltende Eluat und das Hydrolysiermittel zur Röhre im Heizbad geleitet werden, und dass die Einrichtung zur kolorimetrischen Analyse an die Ausgangsseite der Röhre im Heizbad angeschlossen ist.
Die Erfindung wird im folgenden in Verbindung mit der Zeichnung an einem Ausführungsbeispiel beschrieben.
Gemäss der Zeichnung enthält die Vorrichtung eine Chromatographie-Säule 10, deren oberem Ende mit Hilfe einer Kolbenpumpe 14 eine Wasch- oder Pufferflüssigkeit zugeführt wird. Diese wird von einem einen veränderbaren Konzentrationsgradienten herstellenden Gerät 12 geliefert, das bereits in der US-Patentschrift 3 137 480 vorgeschlagen worden ist und mehrere Kammern 34 enthält, die an ihren unteren Enden miteinander in Verbindung stehen und mit unterschiedlich konzentrierter Pufferflüssigkeit gefüllt sind. Die Pufferflüssigkeit strömt von der einen Kammer zur nächstenIKam- mer, wobei sich die Konzentration während des Strömens fortschreitend ändert, und durch eine Auslassöffnung 36 am Boden des Gerätes, von wo aus sie durch Transportröhren 38 und 40 zum oberen Ende der Säule 10 gepumpt wird.
Während die Pufferflüssigkeit in der Kammer 10 abwärts strömt, werden die vor Beginn des Trennvorgangs in bekannter Weise im Harz der Säule adsorbierten Peptide kontinuierlich durch eine Auslassöffnung 42 am unteren Ende der Säule abgegeben und zu einer Pumpenröhre 44 einer Pumpe 46 weitergeleitet. Zur Zuführung von Natriumhydroxyd oder eines anderen Alkalis zwecks Hydrolyse der Peptide enthält die Pumpe 46 eine Pumpenröhre 48.
Die Pumpe enthält ferner eine Pumpenröhre 50, mittels der Stickstoff in demjenigen Rohrverzweigungsglied 52 in den Elüssigkeitsstrom eingeleitet wird, in dem auch das Natriumhydroxyd mit der die Peptide enthaltenden Strömung zusammengeführt wird. Vom Stickstoff wird die Flüssigkeit in Schübe unterteilt, so dass der in eine Transportröhre 54 geleitete Strom aus Flüssigkeitsschüben besteht, die durch Stickstoffeinschlüsse voneinander getrennt sind. Zur Unterteilung der Strömung wird anstelle alkalifreier Luft deshalb Stickstoff verwendet, weil bei seiner Verwendung stärkere Alkalis Anwendung finden können, wobei nur ein geringer oder vernachlässigbarer schädigender Einfluss auf die für Al kalis empfindlichen Aminosäuren zu beobachten ist, während gleichzeitig die Hydrolyseausbeute beträchtlich gesteigert wird.
Beispielsweise kann man eine wässrige Lösung mit 16 bis 20 Volumprozent Natriumhydroxyd verwenden. Von der Transportröhre 54 wird der Strom durch eine Mischspule 56 in eine Transportröhre 58 ge leitet, die in einem Heizbad 60 angeordnet ist, in dem die Peptide unter Erwärmung auf eine Temperatur von etwa 950 mit dem Alkali umgesetzt werden.
Die Transportröhre im Heizbad hat bei geradliniger Ausbreitung eine grosse Länge, z. B. etwa 36,5 m. Aus Raumersparnisgründen ist sie jedoch in dem Gefäss mit der Heizflüssigkeit wie eine Spule gewickelt. Sie hat einen Innendurchmesser von vorzugsweise etwa 2,16 mm und besteht aus einem fluorhaltigen Kunststoff, der z. B. unter dem Namen Teflon im Handel ist.
Eine solche Transportröhre ist selbst bei erhöhten Temperaturen gegen Alkalien widerstandsfähig. Wegen der hydrophoben Natur des TefIons treten in der Transportröhre im Heizbad jedoch unerwünschte Druckschwankungen bzw. Druckstösse auf. Um diese zu vermeiden und eine wirksame Hydrolyse der Peptide während des Durchstroms durch das Heizbad zu gewährleisten, wird der Druck in der Transportröhre 58 dadurch gesteuert bzw. werden die Druckschwankungen dadurch verhindert, dass stromaufwärts von der Hochdruckseite der Transportröhre 58 eine Entlüftungsöffnung 62 vorgesehen ist. Die Entlüftungsöffnung besteht z. B. aus einer Kapillare aus Polyvinylchlorid. Obwohl die Länge und der Innendurchmesser der Röhre etwas schwanken können, wird eine Länge von etwa 15,2 cm und ein Innendurchmesser von etwa 0,13 mm bevorzugt.
Damit keine Peptide vergeudet werden, ist die Entlüftungskapillare 62 vor dem Rohrverzweigungsglied 52 an die Alkalizuleitung angeschlossen.
Die Ausgangsseite der Transportröhre 58 ist über eine Transportröhre 64 an einen Pumpenschlauch 66 angeschlossen. Es ist zu beachten, dass der Strom sowohl in die Transportröhre 58 gepumpt als auch aus ihr herausgepumpt wird, und zwar wird der unterteilte Strom, der die Peptide und das Alkali enthält, in das Heizbad 60 gepumpt, in dem die Hydrolyse der Peptide bei einer Temperatur von 95 C stattfindet, während die hydrolysierten Peptide aus dem Heizbad abgepumpt werden, wobei gleichzeitig nachfolgende Peptide durch die Auslassöffnung 42 der Chromatographie-Säule in die Pumpenröhre 44 nachströmen. Nach der Hydrolyse werden die Peptide kontinuierlich in ein automatisches Analysiergerät gepumpt, das z. B. aus der US Patentschrift 3 074 784 bekannt ist.
Es enthält eine Pumpe 46', die ein Teil der Pumpe 46 oder auch eine gesonderte Pumpe mit zusammendrückbaren Schläuchen sein kann. Bei der oder den Pumpe(n) 46, 46' kann es sich um eine Dosierpumpe(n) handeln, die aus der US-Patentschrift 2 935 028 bekannt ist (sind). Eine solche Pumpe enthält eine Andrückplatte P und mehrere elastisch verformbare Schläuche, die von Quetschwalzen R gleichzeitig und in Längsrichtung fortschreitend zusammengepresst werden, wie durch Kreise innerhalb des Umrisses der Andrückplatte P angedeutet ist.
Die hydrolysierten Peptide werden kontinuierlich durch einen Pumpenschlauch 66 und Transportröhren 68 und 70 zu einem Pumpenschlauch 72 befördert. In den Transportröhren 68 und 70 ist eine Entlüftungsöffnung vorgesehen, damit die Stickstoffeinschlüsse aus der Strömung entfernt werden können, bevor der Strom in den Pumpenschlauch 72 gelangt. Ein Entlüftungsrohr 74 endet oberhalb eines Punktes 76, an dem die Transportröhren 68 und 70 verbunden sind, so dass der Stickstoff in dem Rohr 74 hochsteigt und in die Atmosphäre gelangt, während die Flüssigkeitsschübe am Punkt 76 vorbei in die Transportröhre 70 strömen und innerhalb eines zusammenhängenden verdichteten Eilüssigkeits- stroms in den Pumpenschlauch 72 eintreten.
In dem Analysiergerät werden die hydrolysierten Peptide kolorimetrisch analysiert. Zur kolorimetrischen Analyse werden die Peptide dadurch vorbereitet, dass sie mit einer Flüssigkeit vermischt werden, die ein Verdünnungsmittel, z. B. Methylglykoläther (Handelsname: Cellosolve ), und ein Färbmittel, z. B. Ninhydrin in Gegenwart von Hydrindantin als Reduktionsmittel, enthält. Diese Flüssigkeit wird vorzugsweise im voraus gemischt und von einem undurchsichtigen Behälter aus (nicht gezeigt) einem Pumpenschlauch 75 zugeleitet, der mit der Einlassöffnung einer Mischspule 76' verbunden ist. Eine neutralisierende Säure, z. B. Essigsäure, mit der das restliche Alkali neutralisiert wird, das während der Hydrolyse im Heizbad 60 nicht vollkommen verbraucht ist, wird über einen Pumpenschlauch 78 zugeführt.
Durch einen Pumpenschlauch 80 wird zur Unterteilung des Flüssigkeitsstroms Stickstoff zugeführt. Die Essigsäure wird mit den hydrolysierten Peptiden in einem Rohrverzweigungsglied 82 zusammengeführt, bevor in einemRohrverzweigungsglied 84 dasFärbmittel zugesetzt wird, damit die Neutralisierung vor dessen Zugabe erfolgt. Anschliessend wird der unterteilte Flüssigkeitsstrom durch die Mischspule 76' in eine Transportröhre 86 eines Heizbades 88 geleitet, dessen Temperatur 95 "C beträgt. An die Auslassöffnung der Transportröhre ist eine Kühlschlange 90 angeschlossen, deren Auslassöffnung durch eine Transportröhre 92 mit der Einlassöffnung 96 einer Kolorimeterdurchflusszelle 94 verbunden ist.
Nach Durchströmen der Durchflusszelle wird der Strom durch deren Auslassöffnung 98 verworfen. An die Transportröhre 92 ist vor der Einlassöffnung 96 der Durchflusszelle mittels eines Rohrverzweigungsgliedes 103 eine Transportröhre 100 angeschlossen, die mit einem Pumpenschlauch 101 verbunden ist, so dass die Sfickstoffeinschlüsse aus dem Strom entfernt werden können, bevor dieser in die Durchflusszelle gelangt. Dabei werden sowohl die Stickstoffeinschlüsse als auch eine kleine Flüssigkeitsmenge aus der Transportröhre 92 abgesaugt, so dass nur Flüssigkeiten in die Durchflusszelle einströmen. Einer Lichtquelle 102 sind mehrere Linsen zugeordnet, durch die ein Lichtbündel in Längsrichtung durch die Durchflusszelle und die in ihr strömende Flüssigkeit geleitet wird.
Mit einem Detektor 104, auf den der Lichtstrahl nach dem Durchgang durch die Flüssigkeit in der Durchflusszelle trifft, wird ein Regi striergerät 106 gesteuert.
Der durch die Pumpenschläuche 50 bzw. 80 zur Unterteilung des Flüssigkeitsstroms eingeführte Stickstoff übt gleichzeitig eine Reinigungswirkung aus, weil durch den Strom der Stickstoffeinschlüsse alle Teilchen entfernt werden, die an den Innenwänden der Transportröhren haften bleiben und sich dort zusammenballen.
Anstatt mit der Transportröhre 92 kann die Transportröhre 100 auch mit der Auslassöffnung 98 der Durchflusszelle verbunden sein. Die Gasblasen können dann unmittelbar vom oberen Ende des Rohrverzweigungsgliedes 103 in einen Ausguss geleitet werden.
IDie Durchmesser der Pumpenschläuche vor dem Heizbad 58 und des Pumpenschlauchs 66 sind derart gewählt, dass der im Heizbad befindliche Strom unter einem Druck in Förderrichtung steht und eine kleine Menge Flüssigkeit ununterbrochen an der Entlüftungs öffnung 62 ausströmt.
Obgleich nur ein Kolorimeter mit dem zugehörigen Registriergerät dargestellt ist, können die für die kolorimetrische Analyse vorbehandelten hydrolysierten Peptide auch durch mehrere Kolorimeter geleitet werden, die mit unterschiedlichen Wellenlängen arbeiten und aus der US-Patentschrift 3 074 784 bekannt sind.