DE1523071A1

DE1523071A1 - Verfahren und Geraet zur Hydrolyse und chromatographischen Analyse von Peptiden

Info

Publication number: DE1523071A1
Application number: DE19641523071
Authority: DE
Inventors: Catracas George N
Original assignee: Technicon Chromatography Corp
Current assignee: Technicon Chromatography Corp
Priority date: 1963-10-08
Filing date: 1964-09-30
Publication date: 1969-04-03
Also published as: SE316929B; CH469978A; DE1523071B2; GB1051309A; US3334969A; BE654083A

Description

Technicon Chromatography Corp., Chauncey, N.Y., TJSA

Verfahren und Gerät zur Hydrolyse und ohromatographiseben Analyse von Peptiden.

Die Erfindung "bezieht sich auf die Hydrolyse und quantitative Chromatographieehe Analyse von Peptiden.

Hauptziel der Erfindung ist ein Verfahren und ein Apparat für die ununterbrochene, automatische Hydrolyse von Peptiden, die aus einer chromatographischen Säule abgegeben werden, und für die automatischer quantitative Analyse der hydrolisierten Peptide.

Gemäß der Erfindung werden die Peptide, die der Reihe nach als ausgewaschene Flüssigkeiten von einer ohromatographischen Säule abgegeben werdet,während des Trennvorgangs selbsttätig einer alkalischen Hydrolyse unterzogen, worauf die Analyse der hydrolysierten Peptide In einem zusammenhängenden, selbsttätigen Vorgang folgt«

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Diese und weitere Ziele der Erfindung seien in Verbindung mit der beigefügten Figur näher erläutert, die das Verfahren und teilweise schemaiisch das Gerät gemäß der Erfindung

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veranschaulichto

Gemäß den Figuren enthält das Gerät eine chromatographische " Säule 10, an deren oberem Ende eine auswaschende Flüssigkeit von einem einen veränderbaren ilüsaigkeitsgradienten herstellenden Gerät 12 mit Hilfe einer Förderpumpe H mit" ' Zylinder und Kolben zugeführt wird« Das Gerät 12, das einen veränderbaren Flüssigkeitsgradienten herstellt, ist bereits anderweitig vorgeschlagen worden. Es enhält mehrere Kammern 34 # die an ihren unteren Enden miteinander in Verbindung stehen und die auswaschende Flüssigkeit oder eine Pufferflüssigkeit unterschiedlicher Konzentration enflialten. Die Pufferflüeaigkeit fließt von der einen Kammer zur nächsten Kammer und durch einen Auslaß 36 am Boden des Gerätes heraus, von wo aus sie zum oberen Ende der Säule 10 hin über Röhren 38 und 40 gepumpt wird.

Während die Pufferflüssigkeit in der Kammer 10 abwärts fließt, ψ werden die zuvor im Harz der Säule adsorbierten Peptide nacheinander durch einen Auslaß 42 am unteren Ende der Säule abgegeben und fließen vor Beginn des frennvorgangs zu einer Pumpenruhre 44 einer Pumpe 46» Zur Zuführung von Natriumhydroxid oder eines anderen Alkalis zwecks Hydrolyse der Peptide tnthält die Pumpe 46 außerdem eine Pumpenröhre 48.

Die Pumpe enthält außerdem eine Pumpenröhre 50, über die Stioketoff an eine* Höhrenveriweigung 52, an der dae Hatrium-

BAD ORIGINAL

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hydroxid in die die Peptide enthaltende Strömung eingeführt wird, in die ?lUesigkeitB8tröaung eingebracht wird. Vom Stickstoff wird die Flüssigkeit in Schübe unterteilt, so daß die in eine Röhre 54 eintretende Strömung aus PllfeeigkeitsBehüben besteht, die voneinander durch Stickstoffeinsohlüsse getrennt sind* Zur Unterteilung der Strömung wird deshalb Stickstoff anstelle alkalifreier Luft angewendet,." weil er wie man herausgefunden hat, die Anwendung eines stärkeren Alkalis bei einem geringen oder vernaohläseigbaren schädigenden Einfluß auf die für das Alkali empfindliohen Aminosäuren zuläßt, wodurch der Anteil der Hydrolyse beträchtlich gesteigert wird. Beispielsweise kann man 16 bis 20 Volumprozent Natriumhydroxid in einer Wasserlösung anwenden. Ton der Röhre 54 wird die Strömung durch eine Miβchapule 56 in eine Röhre 58 eines Heisbades 60 geleitet, in dem die Peptide der Wirkung des Alkalis und der Wärme unterworfen werden und eine Temperatur von 95⁰C aufrechterhalten wird·

Sie Röhre im Heisbad hat eine beträchtliche Länge von e.B* etwa 120 PuB (36,5 m), wenn sie gradlinig gemessen ist, obgleich sie aus Raumereparnisgründen wie eine Spule in einem Gefäß mit der Heieflüssigkeit aufgewickelt ist. Sie Röhre 58 hat einen Innendurchmesser τοη vorzugeweiae 0,085 Zoll (2,16 mm) und. besteht aus einem fluorierten Kohlenwasserstoff, der B.B. unter dem Hamen "Teflon" im Handel ist. Diese Röhre ist selbst bei erhöhten f emperaturen gegen Alkalien widerstandsfähig, aber wegen der WaeserabstoBung des

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Teflons treten In der Bohre unerwünschte Druckeohwankungen und Stöde auf» Um dieee unerwünschten Druckeohwankungen und flüesigkeitsstöfle in der Rühre des Heizbades, in dem eine wirksame alkali β ehe Hydrolyse der Peptide während dee Durohr fluesea erfolgt, eu verhindern» wird der Druck des Mediums in der Rühre 58 gesteuert; die Stöße werden dadurch verhindert, da8 auf der Hoohdruokeeite der Heiebadröhre 58 eine Entlüftungeröhre 62 vorgesehen 1st. Die ,Entlüftung hesteht aus einer Kapillarrohre, die aus Polyvinylchlorid hergestellt 1st. Während die Länge und der Innendurchmesser der Rühre etwas schwanken können, betragen die bevorzugte Länge 6 Zoll (15,2 cm) und ihr Innendurchmesser 0,005 Zoll (0,127 mm) Damit keine Peptide vergeudet werden, ist die Entlüftungsröhre 62 vor der Yereweigungestelle 52 an die Alkalieufuhrleitung angeschlossen, .in der das Alkali für die Peptide mit dem Stickstoff, der die Strömung in Schübe «erteilt, sur Röhre 54 strömt.

Der AuslaB der Rühre 58 ist über eine Röhre 64 an eine Pumpenröhre 66 angeschlossen} wie bemerkt sei , wird das Medium in die Röhre 58 hinein- und aus ihr herausgepumpt· Die unterteilte Strömung, die die Peptide und dae Alkall enthält, wird in das HeisBad gepumpt, in dem die Hydrolyse der Peptide bei einer Temperatur von 95⁰C stattfindet; die hydrolysierten Peptide werden aus dem Helebad gepumpt, während gleichseitig nachfolgend Peptlden vom Auslas 42 der ohromatographlsehen Säule In die Pumpenröhre 44 gelangen.

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Nach, der Hydrolyse werden die. Peptide der Reihe nach in ein selbsttätiges Analysiergerät gepumpt, das z.B. in der US-Patentschrift 3 074 784 beschrieben ist. Das Gerät enthält eine Pumpe 46', die ein Seil der Pumpe 46 oder auch eine gesonderte Pumpe mit zusammendrüokbaren Röhren sein kann· Die Pumpe 46 oder 46' ist eine Dosierpumpe und z.B. in der US-Patentschrift 2 935 020 vom 3. Mai 1960 erläutert. Kurs zusammengefaßt, enthält eine solche Pumpe eine Platte P und mehrere elastisch zusammendrüokbare Röhren, die auf

ihrer Länge fortschreitend gleichzeitig von Drückrollen R zusammengepreßt werden, wie durch Kreise innerhalb des Umrisses der Platte P angegeben 1st«

Die hydrolysieren Peptide werden der Reihe nach Über die Pumpenröhre 66 und Rühren 68 und 70 su einer Pumpenröhre 72 befördert. In den Röhren 68 und 70 ist eine Sntlüftungeröhre eingeschaltet, damit die Stickstoffeinsohlüsse aus der Strömung austreten können, bevor diese in die Pumpenröhre 72 gelangt· Die Entlüftungsröhre 74 liegt oberhalb I eines Punktes 76, an dem die Röhren 68 und 70 verbunden sind, so daß der Stickstoff in der Entlüftungsröhre 74 hoohstelgt und in die Atmosphäre gelangt, während die flüssigkeitsschttbe am Punkt 76 vorbei in die Röhre 70 eintreten und zu einer zusammenhängenden Flüssigkeitsströmung verdichtet werden, die in die Pumpenröhre 72 eintritt·

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. ■ "in dem Analysiergerät werden die hydrolysieren Peptide kolorimetrisch analysiert, wie aneohließend kur* erläutert eei. Die Peptide werden für die kolorimetrisch« Analyse dadurch vorbehandelt, daß aie mit einer flüssigkeit vermischt werden, die ein Verdünnungsmittel, s.B. Methylglykoläther (Handelsnamens"Celloeolve) und ein farbreagenamittel enthält, für daa Hinhydrin in Gegenwart von Hydrinda*in ale Reduktionsmittel gewählt let. Diese flüssigkeit

^ wird vorzugsweise im voraus gemischt und Ton einem undurchsichtigen Behälter aus (nicht geneigt) einer Pumpenröhre 75 zugeführt, die mit/dem Einlaß einer Mieohapule 76* verbunden ist· Eine neutralisierende Säure, s.B. Essigsäure, wird Über eine Ptimpenröhre 78 zugeführt, die das restliche Alkali neutralisiert, das während der Hydrolyse im Beisbmd 60 nicht vollkommen verbraucht ist· Über «ine Pumpenröhre 80 wird Stickstoff zur unterbrechung des flüssigkeitsströmung herangeführt. Xn die hydrolysieren Peptide wird die Essigsäure vor einer Verzweigungsstelle 84 an einer Yexv

* eweigungsstelle 82 eingeführt, damit die leutralisierung erfolgt, bevor das Parbreagenemittel den Peptiden am Einlad der Hlsohspule 76' zugeführt wird· Die «erteilte Pltteslgkeitsströmung wird von der Misohepule 76·· aus einer Röhre 86 eines Heiebades 88 zugeführt, deseen-temperatur 95 0 beträgt. Der Auslaß der HeiBbadröhre ist an einer Kühlschlange 90 angeschlossen, deren Aue laß über eine Höhre 92 an einem Binlafl 96 einer Kolorimeterdurohflufiselle 94 liegt. Ton dieser wird die flüssigkeit an einem AuslaJ ^8 abgegeben.

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An die Röhre 92 ist Tor des Einlaß 96 der Durohflußzelle eine Rühre 100 angeschlossen, die mit einer Pumpenröhre 101 verbunden ist, so daS die Stickäoffeinsohlüsae oder -blasen, die in die Strömung über die Punpenröhre 80 eingeführt eind, aus der Strömung entfernt werden» bevor diese in die Durohflußzelle eintritt· Die Stickstoffblasen und eine kleine Hüssigkeitsmenge werden aus der Rühre 92 angesaugt, so daß nur Flüssigkeiten in die DurohfluSzelle gelangen. Einer lichtquelle 102 sind mehrere Linsen augeord- * net» die das Idcht in Längsrichtung der Durohflußzelle durch die strömende Flüssigkeit lenken· Ein Detektor 104, der das nach dem Durchgang durch die Plttssigkeit die Durohflußzelle verlassende Licht empfängt, steuert ein Registriergerät 106· Der durch die Pumpenröhre 50 tosw· 80 surJtTnter« brechung der Flüssigkeitsströmung eingeführte Stickstoff übt eine Reinigungswirkung aus, weil die Stickstoffeineohlüsse oder -^blasen die fglichen entfernen, die an den Innenwänden der Röhren haften und sich dort susanmenballen.

Anstatt des Anschlusses der Bohre 100 an die Rühre 92 kann die Rühre 100 auch mit dem Auslaß 98 der Durchfluß zelle verbunden sein· Die Gasblasen kunnen auch unmittelbar vom oberen Bnde einer Abzweigstelle 103 in einen Ausguß geführt werden, wenn die Rühre 100 von der Pumpe gelöst ist.

Der Durchmesser der Pumpenröhre vor dem Heisbad 58 und der Durchmesser der Röhre 66 sind derart gewählt, daß das im

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Heizbad befindliche Medium unter einen zwangeläufigen Druck steht und eine kleine Menge der flüssigkeit ununterbrochen aus der Bntlüftungsröhre 62 hinausetrömt.

Obgleich nur ein Kolorimeter mit den eugehörigen Registriergerät dargestellt ist, können die hydrolysieren Peptide, die für die kolorimetrisch· Analyse vorbehandelt sind, auch duroh mehrere Kolorimeter befördert werden, dl· bei unterschied· Hohen Wellenlängen arbeiten, wie bereite in der US-Patentschrift 3 074 784 erläutert 1st.

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Claims

Patentansprüohe

1. Yerfahren eur ohromtfographlsehen Ina Iy β β γοη Peptlden, die ί£β$Λ0Τ au» einer ohroaatographiechen ftäule auege-Va-βοη*Β*η; flttseiglceit vorhanden sind, dadurch g β k · η ill 1 ohm t , daß die Peptide fturchi Beharid-* lung mit einen alkalischen Rssgensmlttsl und duroh Wärme hydrollelert werden, während βIe na^oÄeinander imlt de* aue der chromatographleohen Säule (10) auefewaeohenen flüenigkeit abgegeben werden, worauf eie unonterbroohen der q^antitat Iren Analyse unterworfen werde«.

2· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g β ^ kenntelchnet , daß die Hydrolyse der Peptide daduroh erfolgt, daß aufeinanderfolgend die Peptide, die mit dem alkalischen Reagenamlttel veralecht sind, als Strö mung duroh eine alkallbeetändlge Bohre X58} von beträcht»

'· '~^:'.*'■■"■■·■ ■$ lieher Längs Innerhalb eines Belebades (W befördert wer

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3· Terfahren nach Anspruoh 1, daduroh gekennsslohnet , daß die Hydrolyse der Peptide daduroh erfolgt, daß aufeinanderfolgend die Peptide, die mit dem alkalleohen Reagensmlttel rermisoht sind, als Strömung duroh sine Röhre (58) aus einem fluorierten Kohlenwasserstoff Ton beträchtlicher Länge Innerhalb eines Heizbades (60) befördert werden.

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ORlGlNAL INSPECTED

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4· Verfahren' nach Anepruoh 1, daduroh g · Kennseiohnet » daß die Hydrolyse der *epilde daduroh erfolgt, daß aufeinanderfolgend die Peptide» die mit dem alkalischen Reagenzmittel vermischt sind» als Strömung durch eine Röhre (58)aus fluorierte« Kohlenwasserstoff von beträchtlicher Länge Innerhalb eines BeIsbadee (60) befördert werden, während übermäßige Drucketöße in der Röhre mit Hilfe einer Sntltiftungsröhre (62) verhindert werden, die rlt der Röhre C58) aus fluoriertem Kohlen» wasserstoff auf der Hoohdruckaeite der Röhre (58) in Verbindung steht.

5· Gerät zur Chromatographiechen Analyse von Peptiden naoh Anepruoh 1, daduroh gekennse lohnet, daß von einer ununterbrochen arbeitenden Vorrichtung (46,60) die in einer ausgewaschenen Flüssigkeit enthaltenene Peptide hydrolyeierbar sind, die aus der Säule (1O) während des Trennvorgangs abgebbar sind, daß die der Hydrolyse dienende Vorrichtung (46,60) ein Heisbad (60) mit efaer Röhre (58) durch die die peptidehaltige ausgewaschene flüssigkeit und ein Reagensmlttel zur Hydrolyse der Peptide beförderbar sind, und die gegen das hydrolysierende Reagensmittel widerstandsfähig ist, und eine Pumpvorrichtung (46) mit Röhren (44,48,50) enhält, von der dieselzbadrtfhre (58) mit dem Reagensmittel und der ρeptidehaltigen flüssigkeit versorgbar ist, und daß gleichseitig während der Strömung der flüssigkeit aus dem Heisbad (60) von einer Vorrichtung (94, 102, 104, 106) die hydrolysierten Peptide kolorimetrisch

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prüfbar und auantitativ analyelerbar eind.

6· Gerät naoh Anspruch 5ι d a d u r ο h g e k e η η ~ ■ •lohnet, daß die Heisbadröhre (58) eine beträoht-Xl oh β Lttnge aufweist und aus fluoriertem Kohlenwasserstoff besteht.

7. Gerät naoh Anepruoh 6, da duroh < g e k e η a Belohnet , daß die Röhre (4-8) duroh die das «u hydrolyeierende Reagensmlttel der Heiabadröhre (58) zuführ bar 1st, mit einer Entliiftungsruhre (62) versehen 1st» von der ein Ubermäeiger Druckstoß der Flüssigkeit in der Röhre (58) des Heisbädea verhinderbar let.

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