Verfahren zur Herstellung des Wirkstoffes aus Hydrierungsprodukten des Taehysterins. Die Hydrierungsprodukte des Tachy- sterins enthalten einen Wirkstoff, der die typischen Giftwirkungen anormal hoher Vi- tamin-D-Dosen an Mäusen hervorruft, also offenbar auf den Blutkalkspiegel der Tiere einwirkt. Jedoch gelang es bisher nicht, diesen Wirkstoff von den Begleitstoffen in genügender Reinheit abzutrennen.
Gegenstand der Erfindung ist ein Ver fahren zur Herstellung des Wirkstoffes aus Hydrierungsprodukten des Tachysterin, wel ches dadurch gekennzeichnet ist, dass man rohe Hydrierungsprodukte tachysterinhalti- ger Gemische fraktioniert, indem man den Wirkstoff in einen Ester mit einer niederen Fettsäure überführt, den Ester durch Kri stallisation reinigt und schliesslich wieder verseift, und dass man, z.
B. vor oder nach der Veresterung oder Verseifung Verunreini- bungen durch Chromatographieren abtrennt, wobei eine den Wirkstoff enthaltende Frak tion mit geringer Adsorptionsneigung ge bildet wird. Windhaus, v.
Werder und Lüttringhaus (Annalen der Chemie, Band 499, Seite 198) haben bei der Reduktion von Tachysterin mit Natrium und Propylalkohol ein Hydrie- rungsprodukte enthaltendes Stoffgemisch er halten, das, ohne antirachitisch wirksam zu sein, die typischen Giftwirkungen anormal hoher Vitamin-D-Dosen an Mäusen hervor zubringen vermag.
Nach dem Verfahren des D. R. P. 624231 kommt man zu Hydrierungsprodukten mit konstanten Eigenschaften, wenn man das kristallisierte Tachysteryl-3,5-dinitro-4-me- thyl-l-benzoat einer reduzierenden Versei fung unterwirft. Bei diesem Verfahren ist die Stufe des überaus luftempfindlichen Tachysterins ausgeschaltet. Das hierdurch erhaltene Produkt ist durch eine spezifische .
Drehung in Alkohol von -f- 20 , sowie durch ein Absorptionsspektrum im Ultraviolett ge kennzeichnet, das neben einem Haupt maximum bei 250 mu weitere Maxima bei 242 und 261 mu aufweist. Bei der weiteren Untersuchung der Hy- drierungsprodukte des Tachysterins konnte v. Werder (über Sterine, Gallensäuren und verwandte Naturstoffe von Hans Lettre und H.
H. Inhoffen, Seite 299; siehe auch Zeit schrift für physiologische Chemie, Band 233 [193ä], Seite 224) zeigen, dass mit Natrium und Alkohol reduziertes Tachysterin zu etwa 20 bis 3030' aus dem sogenannten Di- hy drov itamin I besteht. Dihy drov itamin I zeigt im Ultraviolett keine Absorption ober halb von 240 m,ce und übt auf den Serum kalkspiegel des Blutes keinen Einfluss aus.
Dasselbe Dihy drovitamin I lässt sich auch aus den Produkten, die man nach D. R.. P. 624231 herstellt, gewinnen. Damit ist ge zeigt, dass das nach Windaus und Mitarbei tern sowie das gemäss D. R.. P. 624231 er hältliche hydrierte Tachysterin uneinheitlich sein muss.
Nach dem Verfahren der Erfindung ge langt es erstmalig, den reinen kristallisierten ZVirkstoff aus dem Gemisch der rohen Ily- drierungsprodukte tachysterinhaltiger Aus gangsmaterialien zu isolieren.
Man kann von einem nach Windaus, v. Werder und Lüttringhaus bezw. nach D. R. P. 624231 gewonnenem hydrierten Tachysterin oder von einem an Tachysterin reichen Bestrahlungsprodukt des Ergosterins (z. B. in benzolischer Lösung zu<B>80%</B> mit b1agnesiumfunkenlicht umgewandeltes Ergo sterin), das man als solches mit Natrium und Alkohol reduziert, ausgehen.
In der Chemie der Bestrahlungsprodukte des Ergosterins (zu denen das Tachysterin gehört) hat man oft vor dem Problem ge standen, Substanzgemische über ihre Ester zu reinigen. Es haben sich dabei aber die sonst für solche Aufgaben vielfach herangezogenen Ester niederer Fettsäuren nicht bewährt; vielmehr haben sich für dieses Arbeitsgebiet Dinitrobenzoesäureester und Allophansäure- ester in gewisser -\Veise als .,spezifisch ge eignet" erwiesen.
Bei dem Versuch der Rei- nigung der Hydrierungsprodukte des Ta- chy sterins versagen jedoch diese Ester. Mit 3,5-Dinitrobenzoesäure erhält man kein cha- rakteristisches Derivat, und bei der Herstel lung der Allophansäureester gelingt es nur, den Allophansäureester des Dihydrovita- mins I abzuscheiden.
Der Wirkstoff bleibt, wie sich zeigte, jedoch in einer Mischung mit andern Verunreinigungen zurück, aus der er nicht zur Kristallisation gebracht werden konnte. Es erscheint sehr auffällig, dass man bei der Behandlung der Hydrierungsprodukte des Tachy sterins - wenigstens von einem gewissen Reinigungsgrad an - mit den auf naheliegenden Arbeitsgebieten versagenden Mitteln der Acylierung mit niederen Fett säuren zu gut kristallisierten Estern gelangt.
Ferner hat man bei der chromatographi- schen Adsorption im allgemeinen die Beobach tung gemacht, dass eine das Licht absor bierende Verbindung stärker am Adsorptions- mittel festgehalten wird, als eine lichtdurch lässige Verbindung.
Bei den Hy drierungs- produkten des Tachysterins findet man aber höchst auffälligerweise das Gegenteil: der nach der Erfindung zu gewinnende Wirk stoff mit starker UV-Absorption findet sich in den Fraktionen mit geringer Adsorptions- neigung, während die in dem normalerweise untersuchten UV-Gebiet bis 220 my keine Absorption zeigenden Verunreinigungen des Wirkstoffes von den Adsorptionsmitteln, wie Aluminiumoxyd, kräftig festgehalten werden.
Die beste Ausführungsform der Erfin dung besteht darin, zuerst die Chromatogra- phierung des Rohproduktes vorzunehmen und die Reinigung über die Ester daran anzu schliessen. Zur Bestimmung des Gehaltes an dem gewünschten Wirkstoff in den einzel nen, beim erfindungsgemässen Verfahren auf tretenden Fraktionen benutzt man vorteil haft die Messung der optischen Drehung oder der UV-Absorption.
Der Wirkstoff dreht die Ebene des polarisierten Lichtes stark nach rechts und besitzt im Ultravioletten eine kräftige Absorptionsbande bei etwa 251 m,u mit Nebenbanden bei etwa 242 und 261 my.
Als Adsorptionsmittel haben sich die Oxyde des Aluminiums und einiger Metalle aus der Erdalkaligruppe bewährt. Zur Aus führung des erfindungsgemässen Verfahrens geht man z. B. folgendermassen vor: Das Ausgangsmaterial wird in einem Kohlen wasserstoff gelöst (besonders empfehlenswert sind Benzine mit einem Siedepunkt zwischen 50 und 80 ), und diese Lösung durch eine mehrfach unterteilte Säule des Adsorptions- mittels (z. B. Aluminiumoxyd standardisiert nach Brockmann) filtriert.
Darauf wird das Chromatogramm mit dem zehnfachen Volu men an reinem Lösungsmittel nachgewaschen. Das wirksame Prinzip des Dihydrotachy- sterins findet sich im Filtrat und in den un tersten Abschnitten der Säule. Zur Elution der einzelnen Fraktionen aus dem Adsorbat eignen sich z. B. Gemische von Äther und Methanol.
Die durch ihre verstärkte Ultra violettabsorption bezw. spezifische Drehung gekennzeichneten, an Wirkstoff reichen Frak tionen werden vereinigt und können gege benenfalls noch einmal einer chromatographi- schen Aufteihmg unterworfen werden. Auch bei der erneuten Aufteilung des bereits an gereicherten Materials zeigt sich die gleiche Erscheinung, dass nämlich das wirksame Prinzip weniger stark adsorbiert wird als seine Begleiter.
Um zu isolierbaren kristalli- sierten Präparaten zu gelangen, verwandelt man dann die weitgehend angereicherten Prä parate, z. B. durch Behandlung mit Säure anhydriden in Pyridinlösung bei Raum temperatur, in niedere Fettsäureester. Die rohen Ester kann man, wenn eine direkte Kristallisation nicht zu erzielen ist, ebenfalls chromatographieren, wobei Verunreinigun gen von dem Adsorptionsmittel festgehalten werden, während sich die gereinigten Ester im Filtrat finden.
Esterfraktionen von ge wisser Reinheit kristallisieren, wie Versuche ergaben, nach Entfernung des Lösungsmittels und Aufbewahrung des Rückstandes bei etwa 0 . Die Kristalle können durch Über schichten mit einem Lösungsmittel, z. B. niedrigsiedendem Petroläther, von anhaften dem 01 befreit und durch Umkristallisieren aus Methanol weiter gereinigt werden. Der n-Buttersäureester des Wirkstoffes scheidet sich z.
B. aus der heissgesättigten Lösung in Methylalkohol in farblosen Nadeln vom Schmelzpunkt 62 bis<B>631</B> ab. Die Werte für den Extinktionskoeffizienten E i /m sind für die Wellenlänge = 242 mu 720, für # = 251 mu 840, für A. = 261 mu 540.
Der n-Propionsäureester kristallisiert aus Methanol in farblosen verfilzten Nadeln, die bei 97 bis 98 C schmelzen und auf die For mel C31H,o0, passende Analysenwerte lie fern. Die spezifische Drehung in Chloroform beträgt -[- 37 , wenn die zwei Stunden im Hochvakuum bei 56 getrocknete Substanz in 2%iger Lösung gemessen wird.
Das Ab sorptionsspektrum des Propionates im Ultra violett ist durch 3 Maxima bei 242 mu und 261 mu gekennzeichnet. Die Werte für den Extinktionskoeffizienten E i /0 betragen für die Wellenlänge = 242 mu 750, für a = 251 mlc 860, für 2 = 261 my 750.
Das aus Methanol in farblosen, derben Kristallen herauskommende Acetylderivat schmilzt bei 108 bis <B>110'</B> C. Die Analysen stimmen auf die Formel C3oH4802. Die spe zifische Drehung in Chloroform beträgt 32,8 unter den beim Propionat erwähn ten Messbedingungen. Das Absorptionsspek trum im Ultraviolett weist 3 Maxima bei den Wellenlängen 242 mu, 251 mu und 261 my auf.
Die Werte für den Egtinktionskoeffi- zienten E i 9m betragen für die Wellenlänge A = 242 mu 780, für # = 251 mu 910, für 7 = 261 my 600. Aus diesen Estern wird der reine kri stallisierte Wirkstoff durch Verseifung (z. B.
mit methylalkoholischer Lauge) gewonnen. Er ist leicht löslich in den meisten organi schen Lösungsmitteln; aus 90%igem Me thanol kristallisiert er in farblosen Nadeln, die zwischen 125 und 127 C schmelzen. Der Wert für [a]D in Chlorofoim beträgt 97 . Charakteristische Farbreaktionen einer 1 % igen Chloroformlösung sind fol gende.
Mit Antimontrichlorid: zunächst keine, nach langem Stehen: tiefhimbeerrote Farbe. Nach Liebermann-Burchard: Rostbraun, schnell in grün umschlagend.
Nach Salkowski : Säure blutrot.
Die Substanz ist Träger der charakteristi schen L'ltraviolettabsorption der rohen Di- hy drotachysterinpräparate. Die Werte für den Extinktionskoeffizienten E 1 "m betragen für die Wellenlänge :i = 242 m,cc 870. für 2. = 251 m,!c 1010. für ? = 261 m, 650. Die Analysenwerte passen auf die For mel C,2qH"0.
Der Stoff hat eine stärkere Wirkung auf den Blutkalkspiegel, als sie bisher an Be strahlungsprodukten des Ergosterins und deren Abkömmlingen beobachtet worden ist. Der an der Maus ermittelte Giftgrenzwert liegt bei etwa 10 y. Die antirachitische Wirk samkeit ist gering, eine Tagesdosis von 5 y hat sich im Schutzversuch an der Ratte als wirksam erwiesen. Niedrigere Dosen sind un wirksam. <I>Beispiel 1:</I> Eine Lösung von<B>1227</B> g eines hydrier ten Tachy Sterins (hergestellt nach Liebigs Ann. 499, Seite 198 oder nach D. R. P.
624231) in 1270 cm' Normalbenzin wird durch eine aus 5 gleichen Teilen von je 430 g Aluminiumoxyd (standardisiert nach Brock mann) zusammengesetzte Säule von 91 cm Gesamtlänge und 56 mm Durchmesser fil triert, die man zuvor mit 1750 cm' Normal benzin angefeuchtet hat. Man arbeitet zweckmäBigerweise unter Zuhilfenahme eines schwachen Vakuums und wäscht mit 13 Li tern Normalbenzin nach. Die Fraktionen der Säule werden in der Reihenfolge von oben nach unten mit 1 bis 5 beziffert, sie \werden einzeln mit einer Mischung gleicher Volum- teile Äther und Methanol eluiert. Fraktion 6 ist das von der Säule nicht adsorbierte Fil- trat.
Die erzielte Aufteilung ergibt sich aus folgender Tabelle: Fraktion 1. 18,60 g [a] D in Äther = +<B>9,3'</B> Fraktion 2. 21,60 g [a] D in Äther = + 7,9- Fraktion 3. 22,55g [a]DinAther=+ 7,4 Fraktion 4. 24,00 g [a] D in Äther<B>=</B> + 13,7 Fraktion 5. 23,21 g [a] D in Äther = + 29,9 Fraktion 6. 15,59 g [a] D in Äther = -#- 55;7 .
Der Wirkstoff befindet sich zum über wiegenden Teil in den Fraktionen 5 und 6, deren spezifische Drehung besonders hoch ist.
Das Material aus der Fraktion 5 wird in 232 ein' Normalbenzin gelöst, und diese Lösung durch eine Säule von 33 cm Länge und 40 mm Durchmesser filtriert, die aus 5 gleichen Teilen von je 77 g Aluminium oxyd (standardisiert nach Brockmann) zu sammengesetzt und mit 300 cm' Normal benzin angefeuchtet ist. Das Chromatogramm wird durch Nachwaschen mit 3500 cm' Nor malbenzin entwickelt.
Die einzelnen Frak tionen werden in der gleichen Reihenfolge wie oben numeriert und mit Äther-Methanol- Gemisch eluiert: Fraktion 1.<B>3,259</B> [a] D in Äther= + <B>20,9'</B> Fraktion 2. 3,75 g [a] D in Äther<B>=</B> +<B>20,5'</B> Fraktion 3. 4,10 g [a] D in Äther = + 21,0 Fraktion 4. 4,30 g [a] D in Äther = + 22.3 Fraktion 5. 4,07 g [a] D in Äther = + 41,8 Fraktion 6. 2,88 g [a] D in Äther = + 55,9 .
Die Fraktionen 1, 2, 3 und 4 enthalten den Wirkstoff etwa in der gleichen Konzen tration wie das Ausgangsmaterial für diese Fraktionierung und werden bei einem neuen Ansatz wieder mitverarbeitet.
Die Fraktionen 6 aus der ersten Auf teilung, sowie 5 und 6 aus der zweiten Auf teilung werden vereinigt (22,54 g), in 135 cm' Pyridin gelöst und mit 45 cm' Essigsäure- anhy drid versetzt. Nach dreitägiger Auf bewahrung bei Raumtemperatur wird unter Kühlung Wasser zugesetzt, wobei sich das Acetat als teilweise kristallisiertes öl ab scheidet. Nach einigen Stunden werden unter Kühlung mit Eiswasser 1350 cm' 5 % ige Salzsäure eingerührt.
Schliesslich wird in Äther aufgenommen. Die vereinigten Äther auszüge werden mit 2%iger Natronlauge und mit Wasser gewaschen, getrocknet, filtriert, eingeengt und im Vakuum abgezogen. Der Rückstand im Gewicht von 24,5 g wird in 245 cm' Normalbenzin gelöst und durch eine Säule von dreimal 136 g Aluminiumoxyd (standardisiert nach Brockmann) filtriert.
Danach wird mit 3675 cm' Normalbenzin nachgewaschen. 20,3 g des Materials gehen in die Fraktion 4 (Filtrat) über und kristal lisieren nach Entfernung des Lösungsmittels bei einer Temperatur um<B>0'.</B> Durch Über schichten mit niedrig siedendem Petroläther wird die Kristallausscheidung vermehrt, während das anhaftende 01 in Lösung geht, Die Kristalle werden abgesaugt, mit einem Gemisch gleicher Volumteile Petroläther und Methanol gewaschen und getrocknet. Die Ausbeute von 8 g kann durch nochmalige ehromatographische Aufteilung des in der Mutterlauge verbliebenen Materials, wobei wiederum die Fraktion Filtrat kristallisiert, vermehrt werden.
Das Rohprodukt wird durch Umkristallisieren aus Methanol ge reinigt. Aus diesem Lösungsmittel scheidet sich das reine Acetat des Wirkstoffes in farblosen, derben Kristallen ab, die bei 108 bis<B>110'</B> schmelzen und auf die Formel C?oH"02 passende Analysenwerte liefern. Der Wert für (aID in Chloroform liegt bei -f- 32,8 (2%ige Lösung). Das Absorptions spektrum im Ultraviolett ist in der Beschrei bung näher charakterisiert.
14 g reines Acetat werden mit 1400 cm' 5%iger methylalkoholischer Kalilauge zwei Stunden unter Rückfluss gekocht. Die Lösung wird im Vakuum auf das halbe Volumen eingeengt und nach Zusatz von 3 Litern Wasser erschöpfend ausgeäthert. Die ver einigten Ätherlösungen werden mit Wasser gewaschen, getrocknet, filtriert und ein geengt. Der Rest des Lösungsmittels wird im Vakuum entfernt. Der farblose kristallisierte Rückstand wird zweimal aus 90%igem Me thanol umkristallisiert, wobei 7,7 g reiner Wirkstoff in farblosen Nadeln vom Schmelz- Punkt 125 bis 127 erhalten werden.
Der reine Alkohol liefert auf die Formel C2811460 stimmende Analysenwerte, seine spezifische Drehung in Chloroform ist -/- 97 . Die Werte für den Extinktionskoeffizienten E ;<B>cm</B> sind in der Beschreibung genannt. Der reine Wirkstoff besitzt eine geringe antirachitische Wirksamkeit und hat einen ausgesprochenen Einfluss auf den Serum kalkspiegel im Sinne einer Erhöhung des selben. Der an der Maus ermittelte Gift grenzwert beträgt etwa 10 y.
<I>Beispiel 2:</I> Ergosterin wird in benzolischer Lösung mit Magnesiumfunkenlicht zu<B>80%</B> um gewandelt, und das ergosterinfreie Bestrah lungsprodukt in üblicher Weise mit Natrium und Alkohol reduziert.
153 g dieses Materials werden in 1530 cm' Äther Petrolei DAB 6 gelöst und durch eine aus 5 gleichen Teilen von je 450 g Alumi niumoxyd, standardisiert nach Broekmann, zusammengesetzte und mit 1,75 Liter Petrol- äther angefeuchtete Säule von 56 mm Durch messer filtriert. Das Chromatogramm wird durch Nachwaschen mit 15,3 Litern Petrol- äther entwickelt.
Die einzelnen Fraktionen der Säule werden mit Äther-Methanolgemisch eluiert, die Bezeichnung ist Nr. 1 bis 5 in der Reihenfolge von oben nach unten. Das durch die Säule gelaufene Filtrat ist die Fraktion 6. Die gewichtsmässige Aufteilung ergibt sich aus folgender Tabelle: Fraktion 1. 18,9 g Fraktion 2. 22,2 g Fraktion 3. 20,7 g Fraktion 4. 22,2 g Fraktion 5. 22,0 g Fraktion 6. 45,5 g.
Die Absorptionsspektren von 0,02% ixen und 0,005%igen ätherischen Lösungen der einzelnen Fraktionen werden in den Schicht dicken von 1 bis 12 Millimetern gemessen, wobei sich ergibt, dass nur die Fraktion 6 nennenswerte Mengen der charakteristisch im kurzwelligen Ultraviolett absorbierenden Substanz enthält. Sehr wenig von diesem Produkt enthalten die Mittelfraktionen 2 bis 5, etwas mehr die Fraktion 1. Fraktion 6 wird ganz analog einer erneuten chromato- graphischen Aufteilung unterworfen.
Die von 0,005 7o igen ätherischen Lösungen aufgenom menen Spektren zeigen, dass sich das wirk same Material nunmehr überwiegend in den Fraktionen 5 und 6 befindet. (Bezeichnung der Fraktionen wie oben.) Das Material aus diesen beiden Fraktio nen wird ein drittes Mal chromatographisch aufgeteilt, wonach sich das im Ultraviolett stark absorbierende Material in den Frak tionen 4, 5 und 6 findet.
Die letztgenannten Fraktionen werden vereinigt i8,2 g), in 50 cm' Pyridin gelöst und mit 16 cm' Propionsäureanhydrill ver setzt. Nach dreitägiger Aufbewahrung bei Raumtemperatur werden unter Rühren und Kühlen mit. Eiswasser 500 ein' 5 öige Salz säure eingetropft.
Nach mehrstündigem Rühren bei Raumtemperatur wird erschöp fend ausgeä.thert, die vereinigten Xtherlösun- gen mit 2 % iger Natronlauge entsäuert, mit Wasser gewaschen, getrocknet, filtriert, ein geengt und im Vakuum abgezogen. Der Rückstand im Gewicht von<B>9,2</B> g wird in 92 cm' Normalbenzin gelöst und durch eine Säule von dreimal 51g Magnesiumoxy d fil triert. Nachgewaschen wird mit 1840 cm' Normalbenzin.
Der Hauptanteil des Materials (5,75 g) befindet sich in der Fraktion 4 (Filtrat), die nach Entfernung des Lösungs mittels und längerer Aufbewahrung bei etwa 0 zu kristallisieren beginnt. Das Material wird mit niedrig siedendem Petroläther be deckt. Nach 24-stündiger Aufbewahrung bei Raumtemperatur werden die Kristalle ab gesaugt, mit einer Mischung gleicher Raum teile Petroläther und Methanol gewaschen und getrocknet. Ausbeute 1 g. Der Ester wird durch Umkristallisieren aus Methanol gereinigt.
Das reine Propionat kristallisiert aus Methanol in farblosen verfilzten Nadeln, die bei 97 bis 98 schmelzen und bei der Elementaranalyse auf die Formel C31H5o0z passende Werte liefern. Die spezifische Drehung in Chloroform ist = + 37 , das Absorptionsspektrum im Ultraviolett ist im vorangehenden Teil der Beschreibung cha rakterisiert.
Der reine Propionsäureester wird in der gleichen Weise, wie es im Beispiel 1 für das Acetat angegeben ist, durch Kochen mit methylalkoholischer Kalilauge verseift, und das Reaktionsprodukt aus 90 % igem Me thanol umkristallisiert, wobei der reine Wirkstoff mit den im Beispiel 1 angegebenen Eigenschaften erhalten wird.