CA2478572A1 - Variants de kallikrein-2 et kallikrein-3 humaines et leurs utilisations - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne le domaine de la biologie, de la génétique et de la médecine. Elle concerne notamment de nouvelles méthodes pour la détection, la caractérisation et/ou le traitement de pathologies cancéreuses , notamment du cancer de la prostate. L'invention concerne également des méthodes pour l'identification ou le criblage de composés actifs dans ces pathologies. L'invention concerne également les composés, gènes, cellules, plasmides ou compositions utiles pour la mise en .oelig.uvre des méthodes évoquées ci-dessus. L'invention décrit notamment le rôle de variants de la kallikréine-2 humaine et de la kallikréine-3 humaine, aussi connue sous le n om de PSA, dans ces pathologies et leurs utilisations comme cibles thérapeutiques, diagnostiques ou expérimentales.

Description

Variants de kallikrein-2 et kallikrein-3 humaines et leurs utilisations La présente invention concerne le domaine de la biologie, de la génétique et de la médecine. Elle concerne notamment de nouvelles séquences nucléotidiques associées à des événements d'épissage alternatif des gènes correspondant à
l'antigène PSA (antigène spécifique de la prostate ou KLK3) et à la kallikréine- 2 (KLK2). L'invention concerne également des méthodes pour la détection de la présence ou pour la détermination du niveau d'expression de ces acides nucléiques ou des protéines correspondantes dans des échantillons biologiques, ainsi que des méthodes de sélection de molécules capables de moduler leur activité ou leur expression.
L'invention est particulièrement adaptée au dépistage, au prognostique, à la classification ou au suivi de cancers, notamment de la prostate et notamment dans la différentiation entre le cancer de la prostate et l'hyperplasie bénigne de la prostate (BPH), ainsi qu'au développement de nouvelles approches thérapeutiques de ces maladies.
Les kallikréines correspondent à un groupe de protéines dont l'activité
protéasique permet la modification post-traductionnelle de précurseurs protéiques vers des formes biologiquement actives. Certains membres de cette famille, la kallikréine-3, aussi connue sous la dénomination de PSA («
prostate-specific antigen » ou antigène spécifique de la prostate), et plus récemment, la kallikréine-2 sont considérés comme les meilleurs marqueurs disponibles utilisables dans la détection, le diagnostique et le suivi du cancer de la prostate.
L'utilisation de tests mesurant la quantité de PSA dans le sang a permis de diagnostiquer un nombre croissant de patients atteints de cancer de la prostate (Pca). Cependant, comme la PSA est également produite par les cellules épithéliales prostatiques non cancéreuses, il est souvent difficile de différencier les patients atteints de cancers de la prostate de ceux présentant un symptôme bénin hyperplasique (BPH). Dans le sérum, la PSA existe sous forme libre, non complexée et sous forme complexée, notamment à l'alpha-antichymotrypsine.

2 La mesure de ces différentes formes et de leurs rapports permet d'améliorer le facteur différentiateur entre Pca et BPH.
L'épissage alternatif constitue un mécanisme de régulation de l'expression des gènes permettant de générer de la diversité fonctionnelle à partir d'une information génétique limitée. Ce mécanisme, fortement régulé, peut subir des altérations au cours du développement de pathologies humaines. Ainsi, la dérégulation de la machinerie d'épissage dans les cancers peut permettre l'expression d'isoformes ou de variants spécifiquement exprimés dans certaines tumeurs humaines. Ces isoformes pourront avoir un rôle fonctionnel déterminant dans le développement ou le maintien de l'état pathologique. L'expression spécifique de telles isoformes constitue un événement de choix pour une approche rationnelle et ciblée de développement de médicaments et/ou de méthodes de diagnostique. Une technologie de profilage de l'expression génétique (DATAS) a été récemment développée pour identifier de façon systématique les gènes et, à l'intérieur de ces gènes, les domaines susceptibles d'étre altérés par épissage alternatif (W099/46403).
La présente invention décrit à présent de nouveaux événements génétiques liés à des épissages alternatifs des gènes PSA et KLK2 dans des tissus prostatiques. La présente invention découle notamment de la construction d'un répertoire des altérations d'épissage associées à des tissus tumoraux de la prostate, et de l'identifications d'altérations structurales dans les gènes PSA et KLKZ ou dans les ARNm correspondants. La présente invention fournit ainsi de nouvelles approches thérapeutiques et diagnostiques des cancers, notamment du cancer de la prostate.
Plus particulièrement, une analyse qualitative différentielle a été effectuée à
partir d'ARN extraits d'échantillons de tissus prostatiques provenant de zones tumorale et non tumorale de patients atteints de carcinomes de la prostate.
Cette analyse a été effectuée par criblage différentiel qualitatif grâce à la mise en oeuvre de la technique DATAS (décrite dans la demande n° W099/46403)

3 qui présente des avantages inégalés. L'application de la technologie DATAS sur des ARNs issus de tissus prostatiques tumoraux et non-tumoraux a permis d'isoler divers fragments d'ADNc dérivés des ARNm de la kalikreine 2 et de la kalikreine 3 (PSA) humaines. Ces résultats ont ensuite permis d'identifier un certain nombre d'ADNc révélateurs d'événements liés à des épissages alternatifs.
La présente invention décrit donc des événements moléculaires originaux qui peuvent aboutir à l'expression spécifique d'isoformes ou de variants de KLK3 (PSA) et de KLK2 dans les tissus prostatiques et plus spécifiquement dans les tissus cancéreux ou les tissus associés à une hyperplasie bénigne (BPH). La présente invention fournit des données moléculaires qui justifient l'utilisation d'un ou de plusieurs de ces variants comme cibles thérapeutiques et diagnostiques nouvelles et utilisables avantageusement dans le diagnostic et le traitement des cancers et notamment du cancer de la prostate.
Un premier aspect de la présente demande concerne donc des variants de PSA
et KLK2 humains, notamment des variants d'épissage. L'invention concerne les acides nucléiques correspondant à ces variants ou aux altérations spécifiques qu'ils présentent, ainsi que les protéines (ou polypeptides ou domaines protéiques) codés.
Un autre aspect de la présente demande concerne des méthodes et outils pour détecter la présence de ces variants ou altérations dans des échantillons biologiques (sang, plasma, urine, sérum, salive, biopsies ou cultures cellulaires, etc.), ou pour déterminer leurs) quantités) ou proportions) respective(s). De tels outils comprennent notamment des sondes ou amorces nucléiques, des anticorps ou autres ligands spécifiques, des kits, supports, puces, etc. Les méthodes de détection peuvent inclure les méthodes d'hybridation, de PCR, de chromatographie, d'immunologie, etc. Ces méthodes sont particulièrement adaptées à la détection, la caractérisation, le suivi de la progression ou de

4 l'efficacité d'un traitement de cancers, notamment du cancer de la prostate, ou à
la détermination d'une prédisposition.
Un autre aspect de la présente demande concerne des outils et méthodes pour la production de composés actifs sur les variants décrits, c'est-à-dire capables de moduler leur expression ou leur activité. Ces outils et méthodes incluent notamment des acides nucléiques, des vecteurs, des cellules recombinantes (ou préparations dérivées de telles cellules), des tests de liaison, etc.
L'invention vise également les composés ainsi identifiés ou produits, des compositions pharmaceutiques les contenant, ainsi que leurs utilisations thérapeutiques.
La présente invention est ainsi applicable au diagnostic et au développement de stratégies thérapeutiques de cancers, notamment de la prostate.
Variants de KLK2 et KLK3 Un premier aspect de la présente demande concerne donc des variants de KLK-2 et KLK-3 (PSA), ou des altérations génétiques particulières affectant ces gènes (ou les ARN ou protéines correspondants). Un objet plus particulier de l'invention concerne des acides nucléiques correspondant à ces variants de PSA et KLK2 humains ou aux altérations spécifiques qu'ils présentent, ainsi que les protéines (ou polypeptides ou domaines protéiques) codées.
Un certain nombre d'isoformes des gènes KLK2 et KLK3 ont été décrites dans l'art antérieur.
K-LM correspond à la rétention totale de l'intron 1 de KLK2 (numéro d'accés Genbank : AF336106) (David et.al (2002)). David et.al précisent que l'expression de l'ARN messager de K-LM est restreinte à l'épithelium prostatique et que la protéine K-LM peut étre détéctée par immunohistochimie dans les cellules épithéliales sécrétrices (malgré aucune donnée indiquant la spécificité
de l'anticorps utilisé). Aucune donnée indique la présence de K-LM dans des sérums humains. K-LM semble ëtre détécté dans deux échantillons de fluides seminaux et dans un échantillon de tissus correspondants à des hyperplasies bénignes de la prostate. La forme endogène de K-LM n'a pu être détéctée dans des lignées prostatiques (avec ou sans stimulation androgénique). Aucun

5 résultat n'est montré concernant une expression préférentielle ou différentielle de K-LM dans des tissus ou sérums issus de patients atteints d'un cancer de la prostate.
Un variant de KLK2 utilisant un site alternatif entre l'exon 4 et l'exon 5 correspondant ainsi à une phase ouverte de lecture de 669 paires de bases au lieu de 783 a été décrit (numéro d'accés Genbank : S39329) (Riegman et.al (1991 )).
Trois variants possédant des régions 3'UTR plus importantes ont été décrites (Liu et.al (1999)) (numéro d'accés Genbank : AF188745-7). Un de ces variants aurait une phase ouverte de lecture équivalente à KLK2 sauvage, un deuxième variant aurait une phase ouverte de lecture correspondant à celle du variant décrit précédemment (Riegman et.al (1991 )). Un de ces variants présente une délétion de 13 nucléotides entre l'exon 3 et l'exon 4 codant ainsi pour une protéine tronquée de 97 acides aminés dans sa partie carboxy-terminale. Les auteurs présentent quelques données d'expression par RT-PCR mais n'offrent aucun résultat concernant la ou les protéines correspondantes.
PSA-LM correspond à la rétention totale de l'intron 1 de PSA (David et.al (2002)) (numéro d'accés Genbank : AF335477, AF335478, AJ459784). David et.al précisent que l'expression de l'ARN messager de PSA-LM est restreinte à
l'épithelium prostatique et que la protéine PSA-LM peut ëtre détéctée par immunohistochimie dans les cellules épithéliales sécrétrices. Aucune donnée indique la présence de PSA-LM dans des sérums humains, fluides seminaux ou tissus correspondants à des hyperplasies bénignes de la prostate. La forme endogène de PSA-LM n'a pu être détéctée dans des lignées prostatiques (avec ou sans stimulation androgénique). Aucun résultat n'est montré concernant une

6 expression préférentielle ou différentielle de PSA-LM dans des tissus ou sérums issus de patients atteints d'un cancer de la prostate.
Un variant de PSA possédant une délétion de 129 nucléotide dans l'exon 3 a été décrit (Tanaka et.al (2000)), appelé également PSA-RP3 (Heuzé-Vourc'h et.al (2003)). Tanaka et.al présente des données qualitatives d'expression de ce variant par RT-PCR dans des tissus prostatiques malins et bénins. L'expression de la protéine correspondante n'a pas été caractérisée.
Deux variants de PSA, correspondant à une rétention totale de l'intron 3 (PA
424) et à une rétention partielle des derniers 442 nucléotides de l'intron 4 (PA
525) ont été décrits (numéros d'accés Genbank : M21896, M21897) (Riegman et.al (1988)). PA 424 pourrait se traduire en une protéine mature de 156 acides aminés. Les 16 derniers acides aminés seraient différents de PSA sauvage. PA
525 pourrait se traduire en une protéine mature de 214 acides aminés. Les 28 derniers acides aminés seraient différents de PSA sauvage. Riegman et.al présentent aucune donnée complémentaire d'expression différentiatrice des ARNs messagers ou des protéines.
PA 424 et PA 525 décrits ci-dessus sont très proches de PSA-RP1 et PSA-RP2 qui ont été isolés ultérieurement (numéros d'accés Genbank : AJ310937, AJ310938) (Heuzé et.al (1999) ; Heuzé-Vourc'h et.al (2001 )). Bien que des lignées cellulaires de type COS transfectées avec les cDNAs de PSA-RP1 et de PSA-RP2 peuvent exprimer et sécréter les protéines correspondantes, Heuzé
et.al ne montrent aucun résultat démontrant l'expression des protéines PSA-RP1 et PSA-RP2 endogènes dans des tissus prostatiques.
Un autre groupe (Meng et.al (2002)) a caractérisé l'expression de l'ARN
messager de PSA-RP1 par Northern et hybridization in situ. Aucune différence d'expression n'a pu étre observée entre des tissus microdissectés sains et tumoraux. Un anticorps spécifique de PSA-RP1 a permis de détecter par immunohistochimie l'expression de la protéine PSA-RP1 dans le cytoplasme

7 des cellules épithélilales à partir de coupes de tissus prostatiques sains et tumoraux.
Un variant de PSA correspondant à une rétention de la partie 5' de l'intron 4, PSA-RPS, a été soumis à Genbank (numéro d'accés : AJ512346) Un variant de PSA comportant une délétion dans l'exon 3, PSA-RP4, a été
soumis à Genbank ( numéro d'accés : AJ459782).
La présente demande décrit maintenant l'existence de formes différentes des gènes PSA et KLK2, et leur corrélation à des situations pathologiques. Ces isoformes ont été identifiées à partir d'échantillons tumoraux. La description des ADNc et des protéineslpolypeptides codés par ces ADNc est indiquée ci-dessous. Les séquences complètes sont fournies dans la Liste de Séquences annexée à la présente demande. Les caractéristiques principales des variants spécifiques selon l'invention sont décrites dans les exemples.
Un premier objet de l'invention concerne des acides nucléiques comprenant la séquence des variants de PSA et KLK2 décrits dans la présente demande, ou une partie spécifique de celle-ci.
Un autre objet de l'invention concerne des acides nucléiques spécifiques des altérations génétiques portées par les variants de PSA et KLKZ décrits dans la présente demande. De tels acides nucléiques peuvent être notamment complémentaires de régions mutées, de domaines introniques retenus ou de jonctions nouvellement créées par des délétions.
Un autre objet de l'invention concerne un acide nucléique comprenant tout ou partie d'une séquence dérivée des ARNs messagers (ou des ADNc) de KLK2-EHT002 à KLK2-EHT011 et de PSA-EHT001 à PSA-EHT027 ou de KLK2-EHTb

8 à KLK2-EHTI et de PSA-EHTa à PSA-EHTu ou toute combinaison de ces variants ainsi que leurs utilisations pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic, de détection ou de suivi de cancers, notamment du cancer de la prostate et plus particulièrement de la forme bénigne de ce dernier, BPH.
Un autre objet de l'invention réside dans tout acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend une séquence choisie parmi a) les séquences SEQ ID NOs : 1 à 49, b) un variant des séquences SEQ ID NOs : 1 à 49 résultant de la dégénérescence du code génétique, c) le brin complémentaire des séquences SEQ ID NOs : 1 à 49, et d) un fragment spécifique des séquences a) à c).
Le terme fragment ou partie « spécifique » désigne un fragment caractéristique des variants considérés, typiquement un fragment portant au moins une altération génétique caractéristique des variants considérés. De tels fragments spécifiques se distinguent donc de la séquence sauvage par la présence d'une caractéristique structurale propre (e.g., mutation, nouvelle jonction, rétention d'intron, délétion d'une séquence, codon stop, nouvelle séquence résultant d'un décalage du cadre de lecture, etc.) résultant d'un événement d'altération mis en évidence par les demandeurs chez des patients. Cette caractéristique structurale propre est également désignée par l'expression « séquence cible ».
Des fragments spécifiques selon l'invention comprennent donc au moins une séquence cible telle que définie ci-avant. Des fragments préférés comportent au moins 5 nucléotides consécutifs de la séquence considérée, de préférence au moins 8, plus préférentiellement au moins 12. Des fragments peuvent comprendre jusqu'à 50, 75 ou 100 nucléotides, voire plus.
Au sens de l'invention, les acides nucléiques peuvent étre des ADN, choisis de préférence parmi les ADNc et les ADNg, ou des ARN. II peut s'agir d'acides nucléiques synthétiques ou semi-synthétiques, de fragments PCR, d'oligonucléotides, de régions double- ou simple-brin, etc. Les acides nucléiques

9 peuvent être produits par synthèse, par voie recombinante, par clonage, par assemblages) génétique(s), mutagénèse, etc., ou une combinaison de ces techniques.
Les acides nucléiques peuvent être utilisés pour produire un variant de PSA ou KLK-2 de l'invention in vitro, ex vivo, in vivo ou dans un système de transcription acellulaire. Ils peuvent également être utilisés pour la fabrication de molécules antisens ou interférentes (RNAi), capables de réduire l'expression ou la traduction des ARNm correspondants dans une cellule. Ils peuvent aussi servir à la production de sondes, notamment marquées, permettant par des réactions d'hybridation de mettre en évidence de manière spécifique la présence d'une forme mutée de PSA ou KLK-2 de l'invention dans un échantillon. Ils peuvent encore servir à la production d'amorces nucléiques, utiles à l'amplification d'un variant de PSA ou KLK-2 (ou d'une séquence cible d'un tel variant) dans un échantillon, notamment dans un but de dépistage ou de diagnostic.
A cet égard, un autre objet de l'invention concerne une sonde nucléique caractérisée en ce qu'elle permet la détection d'un acide nucléique tel que défini ci-avant, typiquement par hybridation sélective à partir d'une population d'acides nucléiques test. Généralement, la sonde comprend la séquence d'un acide nucléique tel que défini ci-avant ou une partie (spécifique) de la séquence d'un tel acide nucléique. La partie spécifique est préférentiellement caractéristique d'un variant tel que décrit ci-avant, notamment une partie contenant une altération associée au cancer de la prostate. Elle comprend typiquement de 10 à
1000 nucléotides, de préférence de 50 à 800, et est généralement simple-brin.
Un exemple particulier de sonde est représenté par un oligonucléotide spécifique et complémentaire d'une région au moins d'un acide nucléique tel que défini ci-avant. L'oligonucléotide est typiquement simple-brin, et comporte généralement de 10 à 100 bases. Des exemples spécifiques d'oligonucléotides de l'invention sont fournis dans le Tableau 1. Les oligonucléotides et/ou les sondes nucléiques selon l'invention peuvent ëtre marquées, par exemple au moyen de marqueurs radioactifs, enzymatiques, fluorescents, luminescents, etc.

10 PCT/FR03/00833 Un autre objet de l'invention concerne une amorce nucléique, permettant l'amplification (sélective) d'un acide nucléique tel que défini ci-avant ou d'une partie (spécifique) d'un tel acide nucléique. La partie amplifiée comporte 5 préférentiellement une altération caractéristique d'un des variants décrits cl-avant, notamment d'une altération associée au cancer de la prostate. Une amorce selon l'invention est typiquement simple-brin, et avantageusement composée de 3 à 50 bases, de préférence de 3 à 40 et encore plus préférentiellement de 3 à 35 bases. Une amorce particulière est complémentaire 10 d'une région au moins du gène PSA ou KLK-2, ou de l'ARN correspondant.
Un mode de réalisation préféré réside dans une amorce constituée d'un acide nucléique simple-brin comprenant de 3 à 50 nucléotides complémentaires d'une partie au moins de l'une des séquences SEQ ID NOs : 1 à 49 ou de leur brin complémentaire. Des exemples de telles amorces nucléiques sont fournies dans la section expérimentale.
L'invention concerne également un couple d'amorces comprenant une séquence sens et une séquence inverse, caractérisé en ce que les amorces de ladite paire s'hybrident avec une région d'un acide nucléique tel que défini cl-avant et permettent l'amplification d'au moins une portion de cet acide nucléique.
Des couples d'amorces particuliers selon l'invention sont fournis dans le Tableau 2.
Un autre objet de la présente demande concerne tout vecteur comprenant un acide nucléique tel que défini ci-avant. II peut s'agir de plasmides, cosmides, épisomes, chromosomes artificiels, virus, phages, etc. On peut citer divers plasmides commerciaux tels que pUC, pcDNA, pBR, etc. Parmi les vecteurs viraux, on peut citer les rétrovirus, adénovirus, AAV, herpès virus, etc.

11 Un autre objet de l'invention concerne les cellules recombinantes comprenant un acide nucléique ou un vecteur tels que définis ci-avant. Les cellules peuvent être procaryotes ou eucaryotes. Parmi les cellules procaryotes on peut citer notamment les bactéries telles que E. coli. Parmi les cellules eucaryotes, on peut mentionner les cellules de levure ou les cellules de mammifères, d'insectes ou de plantes. II peut s'agir de cultures primaires ou de lignées. On peut citer les cellules COS, CHO, 3T3, HeLa, etc.
Un autre objet de l'invention concerne une composition comprenant un acide nucléique tel que défini ci-avant immobilisé sur un support. L'invention concerne notamment des compositions comprenant une pluralité d'acides nucléiques en mélange, sous forme soluble ou immobilisée à un support, la composition comprenant au moins un acide nucléique tel que défini ci-avant.
Un autre objet de l'invention concerne un (produit comprenant un) support sur lequel un ou plusieurs acides nucléiques tels que définis ci-avant sont immobilisés. Le support peut âtre solide, plan ou non, régulier ou non, comme par exemple du nylon, verre, plastique, métal, fibre, céramique, silice, polymère, etc., ou tout autre matériau compatible. Les acides nucléique sont préférentiellement immobilisés par une extrémité, dans des conditions laissant la molécule accessible pour une réaction d'hybridation. Les acides nucléiques peuvent être arrangés de manière précise sur le support, et déposés en plusieurs exemplaires.
Dans une variante particulière, on utilise un ou plusieurs oligonucléotides spécifiques pour caractériser chaque évènement d'épissage alternatif (voir figure 9). On peut notamment utiliser un oligonucléotide spécifique d'un exon éliminé, permettant la quantification de la forme longue, et/ou un oligonucléotide spécifique de l'un des exons adjacents non impliqué dans l'épissage, permettant de quantifier les formes longues et courtes de l'ARN, et/ou un ou plusieurs (e.g.
trois) oligonucléotides spécifiques des jonctions, dont l'un est spécifique de la nouvelle séquence générée après épissage, permettant de quantifier la forme

12 épissée. II est entendu que d'autres combinaisons d'oligonucléotides peuvent étre envisagées, notamment l'emploi d'un seul ou de deux oligonucléotides seulement. Concernant plus précisément les oligonucléotides de jonction, ils sont idéalement centrés sur les jonctions, même si des oligonucléotides décalés sur la jonction peuvent également étre mis en oeuvre. Avantageusement, on utilise des oligonucléotides ne présentant pas de structures secondaires qui pourraient interférer avec leur capacité d'hybridation. D'une manière générale, il est préférable d'avoir sur la puce un profil thermodynamique homogène pour l'ensemble des oligos générés, à savoir le Tm (65°C) et la longueur (24-mers). Par ailleurs, au cours de leur synthèse, les oligonucléotides peuvent étre modifiés en 5' par un groupement NH2-C6 favorisant leur flexibilité et permettant d'établir une liaison covalente avec le polymère constituant le revétement du support.
Un autre objet de l'invention concerne un (produit comprenant un) support sur lequel une ou plusieurs cellules recombinantes telles que définies ci-avant sont immobilisées ou cultivées. Le support peut étre solide, plan ou non, régulier ou non, comme par exemple du nylon, verre, plastique, métal, fibre, céramique, silice, polymère, etc., ou tout autre matériau compatible. Les cellules sont par exemple réparties dans des puits d'une microplaque ou immobilisées dans un gel ou sur un support adapté.
L'invention concerne également les peptides et séquences protéiques codés par tout ou partie des isoformes KLK2-EHT002 à KLK2-EHT011 et PSA-EHT001 à
PSA-EHT027 , ou KLK2-EHTb à KLK2-EHTI et PSA-EHTa à PSA-EHTu notamment celles décrites parmi les séquences SEQ ID NO : 50 à 167 ainsi que leurs utilisations pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic, de détection ou de suivi de cancers, notamment du cancer de la prostate et plus particulièrement de la forme bénigne de ce dernier, BPH.

13 Un objet particulier de la présente demande concerne un polypeptide comprenant tout ou une partie spécifique d'une séquence choisie parmi SEQ ID
NOs : 50 à 167. Des polypeptides particuliers sont composés ou comprennent une séquence ou une partie de séquence créée par l'altération du gène ou du messager correspondant. Au sens de l'invention, le terme « partie » désigne préférentiellement au moins 5 résidus contigus, de préférence au moins 8, plus préférentiellement au moins 10, encore plus préférentiellement au moins 15.
Comme expliqué ci-avant, les altération d'épissage du gène PSA ou KLK-2 conduisent à la production de protéines mutées, comprenant des séquences nouvellement créées (séquences cibles). II peut s'agir de séquences nouvelles (e.g., traduction décalée, insertions), de jonctions nouvelles, etc. Des peptides particuliers de l'invention correspondent ou comprennent tout ou une partie spécifique des séquences SEQ ID Nos : 53, 56, 59, 62, 65, 67 (résidus 146-150), 70, 71, 73, 76, 79, 81, 93, 95, 98, 106, 108, 110, 112, 117, 119 (résidus 66-70 ou 74-79), 121 (résidus 117-121 ), 123 (résidus 25-29, 51-55 ou 105-111 ), 126, 131, 133, 134, 135 (résidus 64-68) et 155.
Un autre objet de l'invention concerne un (produit comprenant un) support sur lequel un ou plusieurs polypeptides tels que définis ci-avant sont immobilisés.
Le support peut étre solide, plan ou non, régulier ou non, comme par exemple du nylon, verre, plastique, métal, fibre, céramique, silice, polymère, etc., ou tout autre matériau compatible. Les polypeptides sont préférentiellement immobilisés par une extrémité, dans des conditions laissant la molécule accessible pour une réaction d'interaction avec un ligand spécifique, tel qu'un anticorps. Les polypeptides peuvent étre arrangés de manière précise sur le support, et déposés en plusieurs exemplaires.
Des techniques d'immobilisation de matériels (tels que acides nucléiques, polypeptides, anticorps, etc.) sur des supports ont été décrites dans la littérature, et notamment dans les demandes ou brevets n° EP619 321, W091108307, US4,925,785 et GB2,197,720.

14 Ligands saécifiaues L'invention concerne par ailleurs des ligands spécifiques, de préférence peptidiques, en particulier des anticorps (polyclonaux, monoclonaux) et leurs fragments, spécifiques des régions peptidiques caractéristiques des protéines codées par KLK2-EHT002-011 et de PSA-EHT001-027 ou par KLK2-EHTb à
KLK2-EHTI et PSA-EHTa à PSA-EHTu (codées par les domaines introniques retenus ou par les jonctions spécifiquement créées) et leurs utilisations pour la détection, le diagnostique ou le suivi de cancers et notamment du cancer de la prostate. En particulier, il pourra s'agir de diagnostiquer la forme BPH et de la différencier du carcinome de la prostate.
A cet égard, un autre objet de l'invention concerne tout anticorps capable de se lier, de préférence de manière sélective, à un polypeptide tel que défini ci-dessus. L'anticorps peut ëtre polyclonal ou monoclonal. II peut également s'agir de fragments et dérivés d'anticorps présentant substantiellement la méme spécificité antigénique, en particulier des fragments d'anticorps (e.g., Fab, Fab'2, CDRs), d'anticorps humanisés, polyfonctionnels, monocaténaires (ScFv), etc. Les anticorps peuvent être produits à l'aide de méthodes conventionnelles, comprenant l'immunisation d'un animal et la récupération de son sérum (polyclonal) ou de cellules spléniques (de manière à produire des hybridomes par fusion avec des lignées cellulaires appropriées).
Des méthodes de production d'anticorps polyclonaux à partir d'espèces variées sont décrites dans l'art antérieur. Typiquement, l'antigène est combiné avec un adjuvant (e. g., Freund's adjuvant) et administré à un animal, typiquement par injection sous-cutanée. Des injections répétées peuvent étre réalisées. Les échantillons sanguins sont collectés et l'immunoglobuline ou le sérum sont séparés. Les méthodes classiques de production d'anticorps monoclonaux comprennent l'immunisation d'un animal avec un antigène, suivie de la récupération des cellules spléniques qui sont ensuite fusionnées avec des cellules immortalisées, telles que des cellules de myélome. Les hybridomes résultant produisent des anticorps monoclonaux et peuvent être sélectionnés par dilutions limites de manière à isoler les clones individuels. Les fragments Fab ou F(ab')2 peuvent être produits par digestion à l'aide d'une protéase selon 5 les techniques conventionnelles.
L'invention concerne également une méthode de production d'anticorps, comprenant l'injection d'un polypeptide tel que défini ci-avant ou d'un fragment immunogène de ce dernier à un animal non humain et la récupération des 10 anticorps ou des cellules productrices d'anticorps. Les anticorps préférés sont des anticorps spécifiques des isoformes de PSA et KLK-2 décrites dans la présente demande, et essentiellement non-spécifique des formes sauvages.
L'invention concerne des hybridomes produisant les anticorps monoclonaux

15 décrits ci-dessus et leur utilisation pour produire lesdits anticorps.
Les anticorps peuvent être couplés à des fragments hétérologues telles que des toxines, des marqueurs, des médicaments ou tout autre agent thérapeutique, de façon covalente ou non, soit directement, soit par l'intermédiaire d'agents de couplage. Les marqueurs peuvent être choisis parmi les radio-marqueurs, des enzymes, des agents fluorescents, des particules magnétiques, etc.
Les anticorps de l'invention peuvent être utilisés comme agents de criblage ou pour détecter ou quantifier la présence ou la quantité d'isoformes de PSA ou KLK-2 dans des échantillons collectés à partir d'un sujet, typiquement, un fluide biologique provenant d'un mammifère, par exemple d'un être humain.
Un autre objet de l'invention concerne un (produit comprenant un) support sur lequel un ou plusieurs anticorps (ou fragments ou dérivés) tels que définis ci-avant sont immobilisés. Le support peut être solide, plan ou non, régulier ou non, comme par exemple du nylon, verre, plastique, métal, fibre, céramique, silice, polymère, etc., ou tout autre matériau compatible. Les anticorps sont

16 préférentiellement immobilisés par une extrémité, dans des conditions laissant la molécule accessible pour une réaction d'interaction avec un antigène spécifique. Les anticorps peuvent étre arrangés de manière précise sur le support, et déposés en plusieurs exemplaires.
Méthodes de détection/diaetnostic La présente demande décrit également de nouveaux procédés de détection d'une pathologie ou d'une prédisposition à une pathologie chez un sujet, comprenant la détermination de la présence, dans un échantillon dudit sujet, d'un acide nucléique, ou d'une altération génétique ou d'une protéine ou polypeptide tels que définis ci-avant.
La détermination peut être réalisée par différentes techniques, telles que séquençage, hybridation et/ou amplification sélectives. Des méthodes utilisables pour déterminer la présence de protéines sont basées par exemple sur des réactions immuno-enzymatiques, telles que ELISA, RIA, EIA, etc. Des techniques utilisables pour déterminer la présence de gènes ou d'ARN altérés sont par exemple la PCR, la RT-PCR, la réaction de ligation en chaîne (LCR), la technique de PCE ou TMA (« Transcriptional Mediated Amplification »), la migration sur gel, l'électrophorèse, notamment la DGGE (« denaturing gel gradient electrophoresis »), etc.
Dans le cas où une étape d'amplification est réalisée, celle-ci met préférentiellement en oeuvre une amorce ou un couple d'amorces tel que défini ci-avant.
Un objet particulier de l'invention concerne l'utilisation d'acides nucléiques complémentaires et spécifiques de fragments des gènes ou des messagers de KLK2-EHT002-011 et de PSA-EHT001-027 ou de KLK2-EHTb à KLK2-EHTI et de PSA-EHTa à PSA-EHTu (e.g., domaines introniques retenus, jonctions

17 spécifiquement crées, mutations particulières, etc.) pour la détection de cancers, notamment du cancer de la prostate, et plus particulièrement de sa forme bénigne, BPH. Cette détection pourra en particulier s'effectuer grâce à des puces à ADN ou à la mise en oeuvre d'une PCR à partir de fluides biologiques tels que du sang (le sérum notamment ou a partir de cellules épithéliales circulantes purifiées), des urines, du fluide séminal, etc.
L'invention réside également dans la mise au point et l'utilisation de tests immunologiques contenant un ou plusieurs anticorps tels que décrits ci-dessus ou fragments de ces derniers. Ces tests permettent de détecter et/ou mesurer individuellement un variant à l'aide d'un anticorps spécifique, plusieurs variants, en parallèle, grâce aux anticorps spécifiques appropriés, ou un ou plusieurs rapports entre les isoformes telles que décrites ci-dessus ou entre lesdites isoformes et d'autres formes décrites pour kallikreine-2 et PSA.
Une méthode particulière comprend la mise en contact d'un échantillon provenant d'un sujet avec une sonde telle que définie ci-avant, et la mise en évidence d'une hybridation.
Une autre méthode particulière comprend la mise en contact d'un échantillon provenant d'un sujet avec une amorce ou une paire d'amorces telles que définies ci-avant, et la mise en évidence d'un produit d'amplification.
Une autre méthode particulière comprend la mise en contact d'un échantillon provenant d'un sujet avec un anticorps tel que défini ci-avant, et la mise en évidence d'un complexe antigène-anticorps.
Typiquement, des plusieurs tests sont réalisés en parallèle, à partir de plusieurs échantillons etlou en utilisant plusieurs sondes, amorces et/ou anticorps.
Ainsi, dans un mode particulier, le procédé de l'invention comprend la détermination, en parallèle, de la présence de plusieurs variants ou altérations génétiques tels que décrits ci-avant dans un échantillon d'un patient. Les procédés selon

18 l'invention peuvent étre mis en oeuvre à partir d'échantillons biologiques variés, notamment de fluides biologiques (e.g., sang, plasma, urine, sérum, salive, etc.), de biopsies de tissus ou de cultures cellulaires, par exemple et, plus généralement, à partir de tout échantillon susceptible de contenir des acides nucléiques ou des protéines (ou polypeptides). L'échantillon biologique peut étre traité avant la mise en oeuvre du procédé, pour faciliter ou permettre l'accessibilité des polypeptides ou acides nucléiques qu'il contient.
L'échantillon peut également étre purifié, centrifugé, fixé, etc., éventuellement congelé ou conservé avant usage.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un procédé de détection de la présence d'une forme altérée de KLK-2 ou KLK-3 chez un sujet, comprenant la mise en contact, in vitro ou ex vivo, d'un échantillon dudit sujet avec une sonde, une amorce ou un ligand spécifique tels que définis ci-avant et la détermination de la formation d'un hybride, d'un produit d'amplification ou d'un complexe, respectivement, la dite formation étant indicative de la présence d'une forme altérée.
Un autre objet de l'invention réside dans un kit utilisable pour la mise en oeuvre d'un procédé tel que défini ci-avant comprenant i. un couple d'amorces ou une sonde ou un anticorps tels que définis ci-avant, et ü. les réactifs nécessaires à l'amplification ou à une réaction d'hybridation ou immunologique.
L'invention réside également dans la mise au point d'une méthode permettant de détecter et/ou de mesurer des partenaires spécifiques d'un ou de plusieurs de ces variants par ajout de l'un ou de plusieurs de ces variants ou de leurs fragments dans des fluides biologiques à tester, tels que du sang (sérum notamment), des urines ou du fluide séminal.

19 Criblage de composés actifs Les variants spécifiques de KLK2 et de KLK3 selon l'invention ont été
identifiés et isolés à partir de sujets pathologiques et représentent donc des cibles thérapeutiques particulièrement intéressantes pour le traitement des cancers et notamment du cancer de la prostate.
A cet égard, un objet particulier de l'invention réside dans des méthodes de sélection, d'identification, de caractérisation, d'optimisation ou de production de composés actifs, comprenant une étape de détermination de la capacité d'un composé test à moduler l'expression ou l'activité d'un polypeptide tel que défini ci-avant.
Les composés sont plus particulièrement sélectionnés sur la base de leur capacité à moduler la synthèse d'un polypeptide tel que défini ci-avant (c'est-à-dire notamment la production ou la maturation des ARNs correspondants, ou leur traduction) ou l'activité d'un tel polypeptide (c'est-à-dire notamment leur maturation, transport, ou leur interaction avec des cibles intra- ou extra-cellulaires).
Dans une variante de réalisation, la méthode comprend la mise en contact in vitro ou ex vivo d'un composé test avec un polypeptide tel que défini ci-avant ou un acide nucléique codant un tel polypeptide (e.g., gène, ADNc, ARN), et la sélection des composés se liant audit polypeptide ou acide nucléique. La liaison au polypeptide au gène ou à l'ARN correspondant peut être mesurée par différentes techniques, telles que le déplacement d'un ligand marqué, la migration sur gel, l'électrophorèse, etc. Elle peut être réalisée in vitro, par exemple en utilisant le polypeptide ou l'acide nucléique immobilisé sur un support.
Dans une autre variante de réalisation, la méthode comprend la mise en contact in vitro ou ex vivo d'un composé test avec une cellule exprimant un polypeptide tel que défini ci-avant, et la sélection ou l'identification de composés modulant l'expression ou l'activité dudit polypeptide. La modulation de l'expression peut étre déterminée par dosage des ARN ou des protéines, ou au moyen d'un système rapporteur.

Les cellules utilisées peuvent être toute cellule compatible, notamment des cellules eucaryotes ou procaryotes telles que mentionnées plus haut. On utilise typiquement une cellule modifiée pour exprimer ladite molécule, notamment des cellules recombinantes. De telles cellules recombinantes peuvent être 10 préparées par introduction d'un acide nucléique recombinant exprimant le polypeptide, ou d'un vecteur comprenant celui-ci. De telles cellules recombinantes constituent des objets particuliers de l'invention.
Le procédé peut être mis en oeuvre pour sélectionner ou identifier un activateur 15 ou un inhibiteur de l'expression ou de l'activité de l'antigène spécifique de la PSA ou de KLK-2. Les procédés de sélection peuvent être réalisés en différents formats, comme par exemple en plaques multi-puits, en testant en parallèle de multiples composés candidats.

20 Dans un mode de réalisation particulier, le composé est un acide nucléique anti-sens, capable d'inhiber l'expression des variants décrits. L'acide nucléique anti-sens peut comprendre tout ou partie de séquences spécifiques des variants décrits. L'anti-sens peut notamment comprendre une région complémentaire de la forme d'épissage identifiée (e.g., d'une séquence cible), et inhiber (ou réduire) sa traduction en protéine.
Selon un autre mode de réalisation, le composé est un composé chimique, d'origine naturelle ou synthétique, notamment une molécule organique ou inorganique, d'origine végétale, bactérienne, virale, animale, eucaryote, synthétique ou semi-synthétique, capable de moduler l'expression ou l'activité
de l'un ou de plusieurs des variants décrits ci-dessus.

21 On préfère des composés spécifiques, c'est-à-dire capables de moduler l'expression ou l'activité des variants, sans affecter significativement l'expression ou l'activité des formes sauvages.
Les composés ainsi identifiés sont utilisables pour la préparation d'une composition destinée au traitement du cancer de la prostate.
Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé capable de moduler, i.e. de stimuler, d'inhiber ou de réduire, l'expression d'un ou de plusieurs variants tels que décrits ci-dessus, pour la préparation d'une composition destinée au traitement des cancers et notamment du cancer de la prostate.
Dans le contexte de l'invention, le terme « traitement » désigne le traitement préventif, curatif ou palliatif, ainsi que la prise en charge des patients (réduction de la souffrance, amélioration de la durée de vie, ralentissement de la progression de la maladie), etc. Le traitement peut en outre être réalisé en combinaison avec d'autres agents actifs.
Un autre objet de l'invention concernent des méthodes de sélection, d'identification, ou de caractérisation de composés actifs utilisables dans le cadre de la préparation de compositions destinées au traitement de pathologies cancéreuses, comprenant la mise en contact d'un ou de plusieurs composés tests avec des extraits cellulaires exprimant les protéines décrites dans la présente invention, ou avec lesdites protéines purifiées.
L'invention porte également sur un procédé de production d'un médicament pour le traitement de cancers, notamment du cancer de la prostate, comprenant (i) la sélection de composés actifs selon les procédés ci-dessus et (ü) le conditionnement dudit composé ou d'un analogue fonctionnel de celui-ci en présence d'un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique. L'analogue fonctionnel est typiquement un composé dérivé du composé actif identifié, par

22 modification chimique, notamment dans le but d'améliorer son activité ou sa pharmaco-cinétique, ou dans le but de reauire sa zoxicne. ~ anaw~uc fonctionnel peut étre une « pro-drogue » du composé identifié. Des techniques de préparation d'analogues fonctionnels sont bien connues de l'homme du métier, par exemple la modélisation moléculaire, le couplage de groupes NO, etc. Le procédé peut à cet égard comprendre une étape intermédiaire de synthèse du composé sélectionné ou de l'analogue fonctionnel de celui-ci.
Le véhicule ou excipient acceptable sur le plan pharmaceutique peut étre choisi parmi des solutés tampons, solvants, liants, stabilisants, émulsifiants, etc.
Des solutés tampons ou diluant sont notamment le dicalcium phosphate, sulfate de calcium, lactose, cellulose, kaolin, mannitol, chlorure de sodium, amidon, sucre en poudre et hydroxy propyl methyl cellulose (HPMC) (pour libération retard).
Des liants sont par exemple l'amidon, la gélatine et des solutés de remplissage comme le sucrose, glucose, dextrose, lactose, etc. Des gommes naturelles ou synthétiques peuvent aussi être utilisées, comme notamment l'alginate, la carboxymethylcellulose, la méthylcellulose, la polyvinyl pyrrolidone, etc.
D'autres excipients sont par exemple la cellulose et du stéarate de magnésium. Des agents stabilisants peuvent étre incorporés aux formulations, comme par exemple des polysaccharides (acacia, agar, acide alginique, gomme guar et tragacanth, la chitine ou ses dérivés et des éthers de cellulose. Des solvants ou solutés sont par exemple la solution Ringer, l'eau, l'eau distillée, des tampons phosphates, des solutions salines phosphatées, et autres fluides conventionnels.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de ligands cytotoxiques spécifiques d'un ou de plusieurs variants tels que décrits ci-dessus localisés à la surFace des cellules cancéreuses et en particulier des cellules cancéreuses prostatiques.
D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent ëtre considérés comme illustratifs et non

23 limitatifs. Ces exemples indiquent clairement que les isoformes identifiées peuvent s'exprimer dans des systèmes biologiques tant au niveau de l'ARN
qu'au niveau protéique dans les tissus et sérums.
LEGENDE DES TABLEAUX ET FIGURES
Tableau 1 : Séquence des oligonucléotides spécifiques (SEQ ID NOs : 168-220). Colonne 1 : Nom de l'oligonucléotide. Colonne 2: Séquence de l'oligonucléotide. Colonne 3 : SEQ ID NO des oligonucléotides revendiqués.
Tableau 2 : Couples d'amorces utilisés pour l'amplification des isoformes de PSA et de KLK2.
Tableau 3 : Valeurs des signaux de fluorescence obtenues par hybridation à
partir de tissus humains (Clontech) d'un micro-array regroupant des oligonucléotides dont les oligonucléotides SEQ ID NOs : 168-220. Colonne 1 Nom de l'oligonucléotide. Colonne 2: SEQ ID NO. Colonne 3-4: Valeurs correspondant à prostate/coeur. Colonne 5-6: Valeurs correspondant à
prostate/rein. Colonne 7-8 : Valeurs correspondant à prostatelprostate.
Colonne 9-10 : Valeurs correspondant à prostate/petit intestin. Le signe #N/A indique que la valeur était inférieure à deux fois le bruits de fonds.
Tableau 4 : Valeurs des signaux de fluorescence obtenues par hybridation à
partir de lignées cellulaires d'un micro-array regroupant des oligonucléotides dont les oligonucléotides SEQ ID NOs : 168-220. Colonne 1 : Nom de l'oligonucléotide. Colonne 2 : SEQ ID NO. Colonne 3-4: Valeurs correspondant à Mda2b/BT549. Colonne 5-6 : Valeurs correspondant à Mda2b/MCF7. Colonne 7-8: Valeurs correspondant à Mda2b/Mda231. Colonne 9-10: Valeurs correspondant à Mda2b/T47D. Le signe #N/A indique que la valeur était inférieure à deux fois le bruits de fonds.

24 Tableau 5 : Valeurs des signaux de fluorescence obtenues par hybridation à
partir de tissus bénins et tumoraux issus de patients atteints de cancer de la prostate d'un micro-array regroupant des oligonucléotides dont les oligonucléotides SEQ ID NOs : 168-220. Colonne 1 : Nom de l'oligonucléotide.
Colonne 2: SEQ ID NO. Colonne 3-4: Valeurs correspondant au tissu tumoral/tissu bénin du patient 15068. Colonne 5-6 : Valeurs correspondant au tissu tumoral/tissu bénin du patient 9648. Colonne 7-8 : Valeurs correspondant au tissu tumoral/tissu bénin du patient 8827. Colonne 9-10: Valeurs correspondant au tissu tumoral/tissu bénin du patient 10063. Le signe #N/A
indique que la valeur était inférieure à deux fois le bruits de fonds.
Figure 1 : Disposition des oligonucléotides spécifiques. Des oligonucléotides matérialisés par des rectangles sont conçus pour s'hybrider de façon spécifique à des événements d'épissage : rétention d'intron, délétion d'exon, utilisation de sites cryptiques 3' et 5'.
Figure 2: Disposition d'oligonucléotides spécifiques. Cinq oligonucléotides matérialisés par un trait peuvent être conçus pour analyser l'expression d'une forme longue matérialisée par 3 exons et d'une forme courte matérialisée par 2 exons.
Figure 3 : Marquage des formes longues et courtes synthétiques. Des ARNs synthétiques sont produits à partir de plasmides linéarisés exprimant les cDNAs correspondants. Les ARNs de la forme longue sont marqués à l'aide de cyanine 3, les ARNs de la forme courte sont marqués à l'aide de cyanine 5.
Figure 4 : Démonstration de la spécificité d'hybridation des oligonucléotides.
Cinq oligonucléotides ont été utilisés pour différencier les formes longues des formes courtes mélangées à quantités égales. Deux exemples sont présentés, Bene A et gene B.

Figure 5 : Mesures quantitatives de rapports entre formes longues et formes courtes. Le pourcentage de forme longue (wt) a été établi à : 0, 20, 40, 60, et 100 % (3 exemples sont présentés, gene A, B et C).
5 Figure 6: Spécificité du micro-array à oligonucléotides PSA et KLK2. Les oligonucléotides spécifiques de PSA sont révélés par les isoformes de PSA
marquées à la cyanine 3. Les oligonucléotides spécifiques de KLK2 sont révélés par les isoformes de KLK2 marquées à la cyanine 5.
10 Figure 7 : Schéma de l'amplification linéaire d'ARN.
Figure 8 : Exemple d'hybridation de la lame PSA / KLK2 à l'aide de sondes provenant de tissus tumoraux et sains d'un méme patient.
15 Figure 9 : Mesure de l'expression différentielle de certaines isoformes de PSA et de KLK2 via l'analyse des oligonucléotides discriminants correspondants entre tissus tumoraux et tissus sains au sein de mémes patients. Colonne 1 : nature de l'isoforme, colonne 2 : oligonucléotide discriminant correspondant, colonne à 6 : log2 (rapport expression tumorale l expression normale).
Figure 10 : Mesure de l'expression différentielle de certaines isoformes de PSA
et de KLK2 via l'analyse des oligonucléotides discriminants correspondants entre lignée cellulaire de cancer de la prostate (Mda-2b et LNCap) et lignée cellulaire de cancer du sein (T47D). Colonne 1 : nature de l'isoforme, colonne 2: oligonucléotide discriminant correspondant, colonne 3,4: log2 (rapport expression lignée prostate / expression lignée sein). Les isoformes surexprimées de façon relative dans la lignée prostate sont indiquées en orange. Les isoformes surexprimées de façon relative dans la lignée sein sont indiquées en bleu.
Figure 11 : Mesure de l'expression différentielle de certaines isoformes de PSA
et de KLK2 via l'analyse des oligonucléotides discriminants correspondants entre différents tissus humains. Colonne 1 : nature de l'isoforme, colonne 2 oligonucléotide discriminant correspondant, colonne 3, 4, 5 et 6 : log2 (rapport expression tissu prostate / tissus coeur, rein, petit intestin et prostate respectivement). Les isoformes surexprimées de façon relative dans le tissu prostate sont indiquées en orange. Les isoformes surexprimées de façon relative dans les autres tissus sont indiquées en bleu.
Figure 12 : Illustration graphique des signaux de fluorescence obtenus pour certaines isoformes avec des tissus normaux.
Figure 13: Amplifications par PCR à l'aide d'oligonucléotides amorces spécifiques de trois isoformes de PSA . A)PSA-EHT003 B) PSA-EHT023 et C) Figure 14: Annotations de trois anticorps polyclonaux produits. Cette figure regroupe les informations concernant les anticorps SE3962, SE3963, SE4101 produits, les épitopes choisis, les peptides synthétisés, le couplage à la KLH
utilisé et les isoformes susceptibles d'être reconnues par ces anticorps.
Figure 15 : Titres des trois anticorps par tests ELISA.
Détermination des titres de SE3962 en A), SE3963 en B) et SE4101 en C).
PPI : sérums préimmuns PP : sérums issus de la première récolte GP : sérums issus de la deuxième récolte Figure 16 : Résultats de « western blots » avec l'anticorps EHT-SE3962 à
partir de sérums à faible taux de PSA totale en A), à taux moyens de PSA totale en B), à taux élevés de PSA total en C). Deux bandes correspondant à des poids moléculaires attendus pour KLK2-EHT004 et KLK2-EHT006 sont observées. Le déplacement des signaux avec des doses croissantes de l'épitope synthétique spécifique (de 1 à 50 ~.g) non observé avec une forte dose de peptide non spécifique à 250 ~,g démontre la spécificité de cet anticorps.

Figure 17 : Résultats de « western blots » avec l'anticorps EHT-SE3963 à
partir de tissus prostatiques. Une bande correspondant à un poids moléculaire attendu pour PSA-EHT021 est observée. Deux autres bandes de plus haut poids moléculaires sont également révélées.
EXEMPLES

L'analyse qualitative différentielle a été effectuée à partir d'ARN poly adénylés (poly A+) extraits d'échantillons tumoraux et normaux prostatiques. Les ARN
poly A+ sont préparés selon des techniques connues de l'homme de métier. II
peut s'agir en particulier d'un traitement au moyen d'agents chaotropiques tels que le thiocyanate de guanidium suivi d'une extraction des ARN totaux au moyen de solvants (phénol, chloroforme par exemple). De telles méthodes sont bien connues de l'homme du métier (voir Maniatis et al., Chomczynsli et al., Anal. Biochem. 162 (1987) 156), et peuvent être aisément mises en oeuvre en utilisant des kits disponibles dans le commerce. A partir de ces ARN totaux, les ARN poly A+ sont préparés selon des méthodes classiques connues de l'homme de métier et décrites dans les kits commerciaux.
Ces ARN poly A+ servent de matrice à des réactions de transcription inverse à
l'aide de transcriptases inverses. Des transcriptases inverses dépourvues d'activité RNase H sont avantageusement utilisées. Elles permettent d'obtenir des brins d'ADN complémentaire de tailles supérieures à ceux obtenus à l'aide de transcriptases inverses classiques. De telles préparations de transcriptases inverses sans activité RNase H sont disponibles commercialement.
Conformément à la technique DATAS, pour chaque point de la cinétique des hybridations d'ARNm (C) avec des ADNc (T) et des hybridations réciproques d'ARNm (T) avec des ADNc (C) sont réalisées.

Ces hétéroduplexes ARNm/ADNc sont ensuite purifiés selon les protocoles prévus par la technique DATAS.
Les séquences d'ARN non appariées avec un ADN complémentaire sont libérées de ces hétéroduplex sous l'action de la RNase H, cette enzyme dégradant les séquences d'ARN appariées. Ces séquences non appariées représentent les différences qualitatives qui existent entre des ARN par ailleurs homologues entre eux. Ces différences qualitatives peuvent être localisées n'importe où sur la séquence des ARN, aussi bien en 5' ou en 3' qu'à
l'intérieur de la séquence et notamment à l'intérieur de la séquence codante. Selon leur localisation, ces séquences peuvent étre non seulement des modifications d'épissage mais également des conséquences de translocations ou de délétions.
Les séquences d'ARN représentant les différences qualitatives sont ensuite clonées selon les techniques connues de l'homme de métier et notamment celles décrites dans le brevet relatif à la technologie DATAS.
Ces séquences sont regroupées au sein de banques de ADNc qui constituent des banques qualitatives différentielles. Une de ces banques contient les exons et les introns spécifiques de la situation saine ; les autres banques contiennent les évènements d'épissage caractéristiques des conditions pathologiques.
Les fragments issus des gènes humains de KLK2 et de KLK3 proviennent de ces banques.
Quatre échantillons tumoraux ont été mélangés pour former un « pool » tumoral.
Ce pool d'ARN a été traité à la Dnase à l'aide du kit « DNA free » de la société
Ambion (n° cat. 1906).
Cet ARN est ensuite reverse-transcrit à l'aide de la transcriptase inverse du kit « High capacity cDNA Archive » de la société Aplied Biosystems (n° cat.
4322171 ).
L'ADNc ainsi produit sert de matrice pour des réactions de PCR afin d'amplifier spécifiquement différentes régions d'ARNs messagers dérivés de la kallikreine-et de la kallikreine-3 humaines selon le protocole suivant Tampon Invitrogen 10X : 2pl DNTPs 2mM: 2pL

MgCl2 50mM: 0.6pL

Primer amont 10pM: 0.4pL

Primer aval 10pM: 0.4pL

Taq polymerase : 0.2NL

H20: 13.4pL

cDNA 1 pL

Volume final : 19pL
Selon le programme de cycles suivant:
94C 3min 94C 30sec ) 55C 1 min ) 35 cycles 72C 3min ) 72C 6min Les oligonucléotides utilisés comme amorces de PCR sont les suivants Pour KLK2 212 KLK2-7-S tgggaagaagaacaacgagca 213 KLK2-7-AS tttagggaatcagagaactggcc 214 KLK2-8-S agctcaatgtgtgtgcatgtgag 215 KLK2-8-AS aaaggatgcgggaagtcaga 5 216 KLK2-9-S cagcataattcacccattc 217 KLK2-9-AS tctacctgttcactgctgcttcc 218 KLK2-10-S ggagtgacgatgaggatgacc gtcagttcagtgatcagaatgac gctacagctgaaaccagcc 10 221 KLK2-12-S ccactacagagccctcactcca aatgcttctcacactcccagc 249 klk2 startCCTGTGTCAGCATGTGGGACC

250 klk2 stop TGGGACAGGGGCACTCAGGG

251 klk2e spe cctgggggtatagttgccactat Pour PSA

200 PSA-7-S tcccagagaccttgatgctt 201 PSA-7-AS gtttgcaggttggtggctg 202 PSA-8-S gtcccggttgtcttcctcac 203 PSA-8-AS gacccatttgttgtctcaggc 204 PSA-9-S ctgaacacacgcacgggat 205 PSA-9-AS ccaaagcccttccttttctca 206 PSA-10-S ttggaaacccacgccaaa 207 PSA-10-AS cctcagagtggctcagctgtag 208 PSA-11-S tgactccctcaaggcaataggtta 209 PSA-11-AS tgtttgctcactcccaccttct 210 PSA-12-S tgctggacagaagcaggaca 211 PSA-12-AS atcatcactccctccacatcc 247 PSA start GGAGAGCTGTGTCACCATGTGG

248 PSA stop ATAGGGGTGCTCAGGGGTTGG

Les produits amplifiés sont ensuite clonés dans le système « Topo » de la société Invitrogen (n° cat. K4600) selon le protocole fourni. Les produits de ligation sont transformés dans des cellules « Top 10 » compétentes. Les colonies sont identifiées sur milieu agar/LB supplémenté d'ampicilline.
Les ADNc présents dans ces colonies sont amplifiés de façon individuelle par amplification PCR à l'aide d'amorces Sp6 et T7 selon le protocole suivant Primer T7 1 OpM : 2pL
Primer Sp6 10pM 2pL
MgCl2 50mM: 1.2pL

DNTPs 2mM: 4pL

Tampon 10x 4pL

Taq polymerase: 0.2pL

H20: 25.6pL

Colonie : 1 pL

vol final 40pL
selon le programme de cycles suivant:

94°C 5min 94°C 30sec) 55°C 30sec) 30cycles 72°C 1 min) 72°C 5min Les produits d'amplification sont ensuite purifiés par P100 pour ëtre séquencés à l'aide du kit « Big Dye Terminator » de la société Applied Biosystems selon le protocole fourni par ce fournisseur. Les réactions de séquence sont analysées à
l'aide d'un séquenceur 3100 d'Applied Biosystems. Le tableau 2 représente les différents ADNc ainsi que les couples d'oligonucléotides amorces utilisés pour leur obtention et permettant leur amplification dans un échantillon.
B - IDENTIFICATION ET DESCRIPTION DES VARIANTS
Variants de KLK2 La numérotation des nucléotides se réfère au numéro d'accession de Genbank M18157 sauf autre précision. La protéine de référence est la KLK2 munie de son peptide signal.
Les séquences KLK2-EHT002 à KLK2-EHT011 (SEQ ID NO: 1 à 7) correspondent à des séquences comportant une phase ouverte de lecture avec un codon d'initiation et de terminaison de la traduction.
Les séquences KLK2-EHTb à KLK2-EHTI (SEQ ID NO : 8 à 15 ) correspondent à des séquences exprimées de type « ESTs » pouvant comporter une, deux ou trois phases de lecture avec ou non un codon d'initiation ou de terminaison de la traduction.
KLK2-EHT002 (SEQ ID NO : 1 ) Cette isoforme présente i) une rétention partielle d'une partie 5' de l'intron 2 (nt 1935-2020) et ü) une utilisation de deux sites cryptiques d'épissage dans la partie 3' de l'exon 3 (nt 3728) et la partie 5' de l'exon4 (nt 3937). Ces deux événements correspondent à des sites d'épissage consensuels. Cette isoforme KLK2-EHT002 possède un codon stop après l'exon 2 et code ainsi pour une protéine tronquée après le résidu n° 69 (KLK2-EHT002prota / SEQ ID NO :
50 ).
54 acides aminés peuvent être clivés pour former la séquence KLK2-EHT002protb / SEQ ID N0:51 . On peut remarquer que les nucléotides correspondant aux positions Genbank (M18157) 1821 et 3581 dans SEQ ID
NO :1 correspondent à C et A alors que la référence Genbank indique T et G
respectivement. Ces différences peuvent s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à ces positions, par des erreurs dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure des mutations introduites par la polymerase. Ces deux changements n'affectent pas la séquence protéique traduite.
KLK2-EHT003 (SEQ ID NO : 2) Cette isoforme présente i) une délétion totale de l'exon 2 et ü) une rétention d'une partie 5' de l'intron 4 (nt 4061-4097). Ces deux événements correspondent à des sites d'épissage consensuels. Cette isoforme KLK2-EHT003 code pour une protéine comprenant 34 acides aminés supplémentaires au-delà du résidu thréonine numéro 15 (KLK2-EHT003prota / SEQ ID NO : 52 ).
Ces 34 acides aminés peuvent être clivés pour former la séquence KLK2-EHT003protb / SEQ ID NO: 53 . On peut remarquer que les nucléotides correspondant aux positions Genbank (M18157) 3774 et 5486 dans SEQ ID
NO :2 correspondent à C et T alors que la référence Genbank indique T et G
respectivement. Ces différences peuvent s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à ces positions, par des erreurs dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure des mutations introduites par la polymerase. Ces deux changements n'affectent pas la séquence protéique traduite.
KLK2-EHT004 (SEQ ID NO : 3) Cette isoforme présente une délétion totale de l'exon 3. Cette isoforme KLK2-EHT004 code pour une protéine comprenant 70 acides aminés supplémentaires au-delà du résidu thréonine numéro 15 (KLK2-EHT004prota / SEQ ID NO : 54 ).

Ces 70 acides aminés peuvent étre clivés pour former la séquence KLK2-EHT003protb l SEQ ID NO : 55. Les 16 derniers acides aminés sont nouveaux et pourraient présenter un ou des épitopes spécifiques de cette isoforme, KLK2-EHT004protc / SEQ ID NO: 56 . On peut remarquer que le nucléotide correspondant à la position Genbank (M18157) 4097 dans SEQ ID N0:3 correspont à A alors que la référence Genbank indique G. Cette différence peut s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à cette position, par des erreurs dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure des mutations introduites par la polymerase. Ce changement n'affecte pas la séquence protéique traduite.
KLK2-EHT006 (SEQ ID NO :4 ) Cette isoforme présente une utilisation de deux sites cryptiques d'épissage dans la partie 3' de l'exon 3 (nt 3728) et la partie 5' de l'exon4 (nt 3937). Cet événement correspond à des sites d'épissage consensuels. Cette isoforme KLK2-EHT006 code pour une protéine de 149 acides aminés (KLK2-EHT006prota / SEQ ID NO : 57 ). 134 acides aminés peuvent être clivés pour former la séquence KLK2-EHT006protb / SEQ ID NO 58. Les 12 derniers acides aminés sont nouveaux et pourraient présenter un ou des épitopes spécifiques de cette isoforme, KLK2-EHT006protc / SEQ ID NO : 59 . On peut remarquer que le nucléotide correspondant à la position Genbank (M18157) 3689 dans SEQ ID NO :4 correspond à T alors que la référence Genbank indique C. Cette différence peut s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à cette position, par des erreurs dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure des mutations introduites par la polymerase. Ce changement n'affecte pas la séquence protéique traduite.
KLK2-EHT007 (SEQ ID NO : 5) KLK2-EHT007 présente une rétention de la partie 5' de l'intron 4. Cette isoforme KLK2-EHT007 code pour une protéine de 224 acides aminés (KLK2-EHT007prota / SEQ ID NO : 60). 209 acides aminés peuvent être clivés pour former la séquence KLK2-EHT007protb / SEQ ID NO : 61 . Les 14 derniers acides aminés sont nouveaux et pourraient présenter un ou des épitopes spécifiques de cette isoforme, KLK2-EHT007protc / SEQ ID NO : 62 KLK2-EHT009 (SEQ ID NO : 6) 5 KLK2-EHT009 présente i) une délétion d'une séquence dans l'exon 3 (nt 3671-3793) et ü) l'utilisation d'un site cryptique d'épissage dans la partie 5' de l'exon 4 (nt 3937) (site d'épissage consensuel). Cette isoforme KLK2-EHT009 code pour une protéine de 123 acides aminés (KLK2-EHT009prota / SEQ ID NO : 63 ). 108 acides aminés peuvent étre clivés pour former la séquence KLK2-10 EHT009protb / SEQ ID NO : 64 . Les 5 derniers acides aminés sont nouveaux et pourraient participer à un ou des épitopes spécifiques de cette isoforme, KLK2-EHT009protc / SEQ ID NO : 65 .
KLK2-EHT011 (SEQ ID NO : 7) 15 Cette isoforme présente une utilisation d'un site cryptique d'épissage dans la partie 5' de l'exon4 (nt 4041 ). Cet événement correspond à des sites d'épissage consensuels. Cette isoforme KLK2-EHT011 code pour une protéine de 165 acides aminés (KLK2-EHT011 prota / SEQ ID NO : 66 ). 150 acides aminés peuvent étre clivés pour former la séquence KLK2-EHT011 protb / SEQ ID NO
20 67 . Le dernier acide aminé remplace un résidu phenylalanine en résidu tryptophane et pourrait participer à un épitope spécifique de cette isoforme.
KLK2-EHTb (SEQ ID NO : 8) Cette isoforme présente une rétention d'une partie 5' de l'intron 1 suivi d'une

25 délétion comprise entre les positions 701 et 1058 inclues. Cette isoforme EHTb code pour une protéine comprenant 104 acides aminés supplémentaires au-delà du résidu thréonine numéro 15 (KLK2-EHTb1, SEQ ID NO :68). Ces 104 acides aminés peuvent être clivés pour former la séquence KLK2-EHTb2, SEQ ID NO :69. Les 59 derniers acides aminés (KLK2-EHTb3, SEQ ID NO :70) 30 représentent une nouvelle séquence par rapport à une isoforme déjà décrite, K-LM (David et.al, (2002)). On peut remarquer que les nucléotides en position 97, 214, 249 de SEQ ID NO :8 correspondent à G, C, T alors que la référence genbank indique C, T, C respectivement. Ces différences peuvent s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à ces positions, par des erreurs dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure des mutations introduites par la polymerase. Les mutation 97, 214 n'affectent pas la séquence protéique traduite. La mutation 249 transforme un résidu sérine en résidu phenylalanine.
On peut également remarquer que les nucléotides 1192-1199, GAAGAACA de la référence genbank sont remplacés par les nucléotides 303-306, AAAC dans SEQ ID NO :8. Les quinze derniers acides aminés de KLK2-EHTb1 remplacent ainsi une séquence ouverte comprenant les 17 acides aminés composant KLK2-EHTb4, SEQ ID NO :71.
KLK2-EHTc (SEQ ID NO : 9) Cette isoforme utilise un site cryptique dans l'intron 1 qui occupe la position 1157. Cette isoforme KLK2-EHTc code pour une protéine comprenant en outre 6 acides aminés au-delà du résidu thréonine numéro 15 (KLK2-EHTc1, SEQ ID
NO :72). Ces 6 acides aminés peuvent être clivés pour former la séquence KLK2-EHTc2, SEQ ID NO :73. On peut remarquer que les nucléotides 1192-1199, GAAGAACA de la référence genbank sont remplacés par les nucléotides 71-74, AAAC dans SEQ ID NO :9. Ce changement intervient après un codon stop.
KLK2-EHTd (SEQ ID NO : 10) Cette isoforme présente une rétention d'une partie 5' de l'intron 1 suivi d'une délétion comprise entre les positions 657 et 1209 inclues. Cette isoforme KLK2-EHTd code pour une protéine comprenant au moins 41 acides aminés supplémentaires au-delà du résidu thréonine numéro 15 (KLK2-EHTd1, SEQ ID
NO :74). Ces 41 acides aminés supplémentaires peuvent étre clivés pour former la séquence KLK2-EHTd2, SEQ ID N0:75. Les 11 derniers acides aminés supplémentaires (KLK2-EHTd3, SEQ ID N0:76) représentent une nouvelle séquence par rapport à une isoforme déjà décrite, K-LM (David et.al, 2002). ).
La séquence prédite par continuation de la traduction dans l'intron 1 produit une protéine de 83 acides aminés après clivage : KLK2-EHTd4, SEQ ID NO :77.

KLK2-EHTe (SEQ ID NO : 11 ) KLK2-EHTe présente une séquence inconnue de 140 nucléotides comprise entre un exon 2 tronqué en 3' et l'exon 3. Cette isoforme KLK2-EHTe code pour une protéine comprenant en outre 19 acides aminés au-delà du résidu glycine occupant la position numéro 52 (KLK2-EHTe1, SEQ ID NO :78). Ces 19 acides aminés représentent la séquence KLK2-EHTe2, SEQ ID NO :79.
KLK2-EHTf (SEQ ID NO : 12) Cette isoforme utilise deux sites cryptiques, le premier dans la partie 3' de l'exon 2 (position 1876), le second dans l'intron 2 (position 3349). Cette isoforme KLK2-EHTf code pour une protéine comprenant en outre 57 acides aminés compris entre les résidus histidine en position 49 et asparagine en position (KLK2-EHTf1, SEQ ID NO :80). Ces 57 acides aminés représentent la séquence KLK2-EHTf2, SEQ ID NO :81. On peut remarquer que le nucléotide en position 269 de SEQ ID NO :12 correspond à C, alors que la référence genbank indique T. Cette différence peut s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à
cette position , par une erreur dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure une mutation introduite par la polymerase. La mutation 269 transforme un résidu phenylalanine en résidu leucine.
KLK2-EHTj (SEQ ID NO :13) Cette isoforme présente une délétion dans l'intron 2 entre les positions 2473 et 3001. KLK2-EHTj code pour une protéine comprenant l'une des deux phases de lectures correspondant à la KLK2-EHTj1 (SEQ ID N0:82), ou KLK2-EHTj2 (SEQ ID NO :83).
KLK2-EHTk (SEQ ID NO : 14) Cette isoforme utilise deux sites cryptiques, le premier situé dans l'intron 4 en position 5049 et le deuxième dans l'exon 5 en position 5469. KLK2-EHTk code pour une protéine comprenant l'une des deux phases de lecture correspondant à KLK2-EHTk1 (SEQ ID NO :84) ou KLK2-EHTk2 (SEQ ID NO :85).

KLK2-EHTI (SEQ ID NO :15) Cette isoforme utilise un site cryptique dans l'intron 2 en position 2991.
Cette isoforme code pour une protéine comprenant l'une des trois phases de lecture correspondant à KLK2-EHTI1 (SEQ ID NO :86), KLK2-EHTI2 (SEQ ID NO :87) ou KLK2-EHTI3 (SEQ ID NO :88).
Variants de PSA (ou KLK3) La numérotation des nucléotides se réfère au numéro d'accession de Genbank M27274 sauf autre précision. La protéine de référence est la PSA munie de son peptide signal.
Les séquences PSA-EHT001 à PSA-EHT027 (SEQ ID NO: 16 à 34 ) correspondent à des séquences comportant une phase ouverte de lecture avec un codon d'initiation et de terminaison de la traduction.
Les séquences PSA-EHTa à PSA-EHTu (SEQ ID NO : 35 à 49) correspondent à des séquences exprimées de type « ESTs » pouvant comporter une, deux ou trois phases de lecture avec ou non un codon d'initiation ou de terminaison de la traduction.
PSA-EHT001 (SEQ ID NO :16) Cette isoforme présente une rétention d'un fragment délété de l'intron 1 (nt 811 puis 971-1272). Cette isoforme PSA-EHT001 code pour une protéine de 51 acides aminés (PSA-EHT001 prota / SEQ ID NO : 89 ). 36 acides aminés peuvent être clivés pour former la séquence PSA-EHT001 protb / SEQ ID NO
90 . On peut remarquer que le nucléotide correspondant à la position Genbank (M27274) 738 dans SEQ ID N0:16 correspond à G alors que la référence Genbank indique T. Cette différence peut s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à cette position, par des erreurs dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure des mutations introduites par la polymerase. Ce changement remplace un résidu tryptophane par un résidu glycine.

PSA-EHT003 (SEQ ID NO :17) Cette isoforme présente une rétention d'un fragment délété de l'intron 1 (nt 874 puis 920-1272). Cette isoforme PSA-EHT003 code pour une protéine de 89 acides aminés (PSA-EHT003prota / SEQ ID NO : 91 ). 74 acides aminés peuvent ëtre clivés pour former la séquence PSA-EHT003protb / SEQ ID NO
92 . Les 20 derniers acides (PSA-EHT003protc / SEQ ID NO : 93) représentent une information nouvelle par rapport à une isoforme déjà décrite comprenant une rétention totale de l'intron 1 PSA-EHT004 (SEQ ID NO : 18) Cette isoforme utilise un site cryptique d'épisage 3' situé dans l'intron 1 en position 1142 (site consensuel) Cette isoforme PSA-EHT004 code pour une protéine de 47 acides aminés (PSA-EHT004prota / SEQ ID NO : 94 ). 32 acides aminés peuvent étre clivés pour former la séquence PSA-EHT004protb / SEQ
IDN0:95 .
PSA-EHT005 (SEQ ID NO : 19) Cette isoforme présente une rétention d'un fragment délété de l'intron 1 (nt 792 puis 1149-1272). Cette isoforme PSA-EHT005 code pour une protéine de 68 acides aminés (PSA-EHT005prota / SEQ ID NO : 96). 53 acides aminés peuvent ëtre clivés pour former la séquence PSA-EHT005protb / SEQ ID NO
97. Les 28 derniers acides (PSA-EHT005protc / SEQ ID NO : 98 ) représentent une information nouvelle par rapport à une isoforme déjà décrite comprenant une rétention totale de l'intron 1 PSA-EHT007 (SEQ ID NO : 20) Cette isoforme utilise un site cryptique d'épisage 5' situé dans l'exon 1 en position 693 et un site cryptique 3' situé dans l'intron 1 en position 1149 Cette isoforme PSA-EHT007 code pour une protéine de 23 acides aminés (PSA-EHT007prota / SEQ ID NO : 99 ).

PSA-EHT008 (SEQ ID NO :21 ) Cette isoforme utilise un site cryptique d'épisage 3' situé dans l'intron 1 en position 1202 (site consensuel) Cette isoforme PSA-EHT008 code pour une protéine de 27 acides aminés (PSA-EHT008prota / SEQ ID NO : 100 ). 12 5 acides aminés peuvent étre clivés pour former la séquence PSA-EHT008protb l SEQ ID NO : 101 . On peut remarquer que le nucléotide correspondant à la position Genbank (M27274) 679 dans SEQ ID NO :21 correspond à T alors que la référence Genbank indique G. Cette différence peut s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à cette position, par des erreurs dans la 10 séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure des mutations introduites par la polymerase. Ce changement remplace un résidu tryptophane par un résidu leucine.
PSA-EHT009 (SEQ ID NO : 22) 15 Cette isoforme présente une rétention d'un fragment délété de l'intron 2 (nt 2119-2447 puis 2988-3226). Cette isoforme PSA-EHT009 code pour une protéine de 69 acides aminés (PSA-EHT009prota / SEQ ID NO: 102). 54 acides aminés peuvent être clivés pour former la séquence PSA-EHT009protb /
SEQ ID NO : 103 . On peut remarquer que le nucléotide correspondant à la 20 position Genbank (M27274) 1966 dans SEQ ID NO :22 correspond à A alors que la référence Genbank indique G. Cette différence peut s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à cette position, par des erreurs dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure des mutations introduites par la polymerase. Ce changement ne modifie pas la séquence protéique.
25 D'autres mutations ponctuelles sont identifiées après le codon stop.
PSA-EHT012 (SEQ ID NO : 23) Cette isoforme utilise un site cryptique d'épisage 3' situé dans l'intron 2 en position 2426 (site consensuel) Cette isoforme PSA-EHT012 code pour une 30 protéine de 83 acides aminés (PSA-EHT012prota / SEQ ID NO: 104). 68 acides aminés peuvent étre clivés pour former la séquence PSA-EHT004protb /
SEQ ID NO : 105. Les 14 derniers acides aminés (PSA-EHT012protc l SEQ ID

NO : 106) représentent une information nouvelle par rapport à PSA de type sauvage et sont ainsi susceptibles d'inclure un ou des épitoges spécifiques de cette isoforme. On peut remarquer que les nucléotides correspondant aux positions Genbank (M27274) 1966 et 2459 dans SEQ ID NO :23 correspondent à A et A alors que la référence Genbank indique G et G respectivement. Ces différences peuvent s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à ces positions, par des erreurs dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure des mutations introduites par la polymerase. Ces deux changements n'affectent pas la séquence protéique traduite.
PSA-EHT013 (SEQ ID NO : 24) Cette isoforme utilise un site cryptique d'épisage 3' situé dans l'intron 1 en position 1945 (site consensuel) Cette isoforme PSA-EHT013 code pour une protéine de 75 acides aminés (PSA-EHT013prota / SEQ ID NO: 107). 60 acides aminés peuvent étre clivés pour former la séquence PSA-EHT013protb /
SEQ ID NO : 103 . Ces 60 acides aminés représentent une information nouvelle par rapport à PSA de type sauvage ef sont ainsi susceptibles d'inclure un ou des épitoges spécifiques de cette isoforme.
PSA-EHT015 (SEQ ID NO :25) Cette isoforme utilise un site cryptique d'épisage 5' situé dans l'exon 1 en position 703 et un site cryptique 3' situé dans l'exon 2 en position 2030 Cette isoforme PSA-EHT015 code pour une protéine de 41 acides aminés (PSA-EHT015prota / SEQ ID NO: 109). Les 30 derniers acides aminés (PSA-EHT015protb / SEQ ID NO : 110) représentent une information nouvelle par rapport à PSA de type sauvage et sont ainsi susceptibles d'inclure un ou des épitoges spécifiques de cette isoforme. On peut remarquer que le nucléotide correspondant à la position Genbank (M27274) 2094 dans SEQ ID N0:25 correspont à C alors que la référence Genbank indique T. Cette différence peut s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à cette position, par des erreurs dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure des mutations introduites par la polymerase. Ce changement remplace un résidu sérine par un résidu proline.
PSA-EHT016 (SEQ ID NO : 26) Cette isoforme utilise un site cryptique d'épisage 3' situé dans l'exon 2 en position 2053 (site consensuel) Cette isoforme PSA-EHT016 code pour une protéine de 39 acides aminés (PSA-EHT016prota / SEQ ID NO : 111 ). 24 acides aminés peuvent être clivés pour former la séquence PSA-EHT016protb /
SEQ ID NO : 112 . Ces 24 acides aminés représentent une information nouvelle par rapport à PSA de type sauvage et sont ainsi susceptibles d'inclure un ou des épitopes spécifiques de cette isoforme.
PSA-EHT018 (SEQ ID NO : 27) Cette isoforme présente une rétention d'un fragment délété de l'intron 2 (nt 2119-2588 puis 3114-3226). Cette isoforme PSA-EHT018 code pour une protéine de 69 acides aminés (PSA-EHT018prota / SEQ ID NO: 113). 54 acides aminés peuvent être clivés pour former la séquence PSA-EHT018protb /
SEQ ID NO : 114 . On peut remarquer que le nucléotide correspondant à la position Genbank (M27274) 2545 dans SEQ ID NO :27 correspond à T alors que la référence Genbank indique A. Cette différence peut s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à cette position, par des erreurs dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure des mutations introduites par la polymerase. Ce changement ne modifie pas la séquence protéique.
PSA-EHT019 (SEQ ID NO : 28) Cette isoforme présente une délétion d'un fragment situé dans l'exon 3 (nucléotide 3828-3933). Cette isoforme PSA-EHT019 code pour une protéine de 100 acides aminés (PSA-EHT019prota / SEQ ID NO : 115). 85 acides aminés peuvent être clivés pour former la séquence PSA-EHT019protb / SEQ ID NO
116. Les 6 derniers acides aminés (PSA-EHT019protc / SEQ ID NO : 117) représentent une information nouvelle par rapport à PSA de type sauvage et sont ainsi susceptibles d'inclure un ou des épitopes spécifiques de cette isoforme. On peut remarquer que les nucléotides correspondant aux positions Genbank (M27274) 3786 et 3943 dans SEQ ID NO :28 correspondent à T et à A
alors que la référence Genbank indiquent C et C respectivement. Ces différences peuvent s'expliquer par l'existence de polymorphismes à ces positions, par des erreurs dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure des mutations introduites par la polymerase. Le premier changement ne modifie pas la séquence protéique. Le deuxième remplace un résidu sérine par un résidu arginine.
PSA-EHT021 (SEQ ID NO : 29) Cette isoforme utilise un site cryptique d'épisage 3' situé dans l'exon 3 en position 3885 (site consensuel) et présente également une délétion dans la partie 3' de l'exon 3 (nucléotides 3903-4025). Cette isoforme PSA-EHT021 code donc pour une protéine de 177 acides aminés (PSA-EHT021 prota / SEQ ID
NO : 118). 162 acides aminés peuvent être clivés pour former la séquence PSA-EHT021 protb / SEQ ID NO : 119 . Les nouvelles jonctions créées autour des résidus 69 et 76 représentent une information nouvelle par rapport à PSA
de type sauvage et sont ainsi susceptibles d'inclure un ou des épitopes spécifiques de cette isoforme. On peut remarquer que le nucléotide correspondant à la position Genbank (M27274) 1966 dans SEQ ID NO :29 correspond à A alors que la référence Genbank indique G. Cette différence peut s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à cette position, par des erreurs dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure des mutations introduites par la polymerase. Ce changement ne modifie pas la séquence protéique.
PSA-EHT022 (SEQ ID NO : 30) Cette isoforme présente une délétion dans la partie 3' de l'exon 3 (nucléotides 3903-4025). Cette isoforme PSA-EHT022 code donc pour une protéine de 220 acides aminés (PSA-EHT022prota / SEQ ID NO : 120). 205 acides aminés peuvent étre clivés pour former la séquence PSA-EHT022protb / SEQ ID NO
121 . La nouvelle jonction créée autour du résidu 119 représente une information nouvelle par rapport à PSA de type sauvage et est ainsi susceptible d'inclure un ou des épitopes spécifiques de cette isoforme. On peut remarquer que le nucléotide correspondant à la position Genbank (M27274) 1966 dans SEQ ID NO :30 correspond à A alors que la référence Genbank indique G.
Cette différence peut s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à cette position, par des erreurs dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure des mutations introduites par la polymerase. Ce changement ne modifie pas la séquence protéique.
PSA-EHT022 (SEQ ID NO : 30) correspond à un variant de PSA soumis à
Genbank le 24 Octobre 2002 (numéro d'accés : AJ459782).
PSA-EHT023 (SEQ ID NO :31 ) Cette isoforme comprend une délétion d'un fragment de l'exon 2 (nucléotides 1990-2040), l'utilisation d'un site cryptique en 3' de l'exon 3 en position (site consensuel) et une rétention d'un fragment 5' de l'intron 3 (nucléotides 4043-4060) (site consensuel). Cette isoforme code pour une protéine de 207 acides aminés (PSA-EHT023prota /SEQ ID NO: 122). 192 acides aminés peuvent être clivés pour former la séquence PSA-EHT023protb / SEQ ID NO
123. Les nouvelles jonctions créées autour des résidus 27, 53 et dans la région 105-111 représentent une information nouvelle par rapport à PSA de type sauvage et sont ainsi susceptibles d'inclure un ou des épitopes spécifiques de cette isoforme. On peut remarquer que les nucléotides correspondant aux positions Genbank (M27274) 2060 et 5731 dans SEQ ID NO :31 correspondent à G et à G alors que la référence Genbank indiquent T et T respectivement. Ces différences peuvent s'expliquer par l'existence de polymorphismes à ces positions, par des erreurs dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure des mutations introduites par la polymerase. Le premier changement remplace un résidu cystéine par un résidu glycine. Le deuxième ne modifie pas la séquence protéique..
PSA-EHT025 (SEQ ID NO : 32) Cette isoforme correspond à la délétion de l'exon 3. Cette isoforme code pour une protéine de 85 acides aminés (PSA-EHT025prota / SEQ ID NO : 124). 70 acides aminés peuvent être clivés pour former la séquence PSA-EHT025protb /
SEQ ID NO : 125. Les 16 derniers acides aminés (PSA-EHT025protc / SEQ ID
5 NO : 126) représentent une information nouvelle par rapport à PSA de type sauvage et sont ainsi susceptibles d'inclure un ou des épitopes spécifiques de cette isoforme. On peut remarquer que les nucléotides correspondant aux positions Genbank (M27274) 2118-4186 et 5791 dans SEQ ID N0:32 correspondent à G et à G alors que la référence Genbank indiquent AT et C
10 respectivement. Ces différences peuvent s'expliquer par l'existence de polymorphismes à ces positions, par des erreurs dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure des mutations introduites par la polymerase. La concordance des sites 3' de l'exon 2 et 5' de l'exon 4 suggère une mutation introduite par la polymerase dans cette région. Le dernier changement ne 15 modifie pas la séquence protéique.
PSA-EHT026 (SEQ ID NO : 33) Cette isoforme présente une délétion d'un fragment situé dans l'exon 3 (nucléotide 3781-4025). Cette isoforme PSA-EHT026 code pour une protéine de 20 78 acides aminés (PSA-EHT026prota / SEQ ID NO : 127). 63 acides aminés peuvent étre clivés pour former la séquence PSA-EHT026protb / SEQ ID NO
128 .
PSA-EHT027 (SEQ ID NO : 34) 25 Cette isoforme utilise un site cryptique d'épissage situé en 5' dans l'exon 3 en position 3780 et une délétion de l'exon 4 Cette isoforme PSA-EHT027 code pour une protéine de 144 acides aminés (PSA-EHT027prota / SEQ ID NO : 129 ). 129 acides aminés peuvent être clivés pour former la séquence PSA-EHT027protb / SEQ ID NO: 130 . Les 67 derniers acides aminés (PSA-30 EHT027protc / SEQ ID NO : 131 ) représentent une information nouvelle par rapport à PSA de type sauvage et sont ainsi susceptibles d'inclure un ou des épitopes spécifiques de cette isoforme. On peut remarquer que le nucléotide correspondant à la position Genbank (M27274) 1966 dans SEQ ID N0:34 correspond à A alors que la référence Genbank indique G. Cette différence peut s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à cette position, par des erreurs dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure des mutations introduites par la polymerase. Ce changement ne modifie pas la séquence protéique.
PSA-EHTa (SEQ ID NO :35) Cette isoforme présente une rétention de 91 nucléotides de la partie 5' de l'intron 1 suivie d'une délétion des 152 nucléotides suivants (pour retrouver ensuite l'intron 1 ). Cette isoforme PSA-EHTa code pour une protéine de 90 acides aminés (PSA-EHTa1, SEQ ID N0:132) dont les 75 derniers acides aminés peuvent être clivés (PSA-EHTa2, SEQ ID NO :133), représentant une information différente par rapport à PSA et dont les 44 derniers acides aminés (PSA-EHTa3, SEQ ID N0:134) représentent une information nouvelle par rapport à une rétention totale de l'intron 1 déjà décrite (David et.al, (2002)). Q
remplace P en position 26 des 74 derniers acides aminés. On peut remarquer que les nucléotides en position 90 et 234 de SEQ ID NO :35 correspondent à A, C, alors que la référence genbank indique C et T. D'autre part, les nucléotides G et C en position 243 et 293 différent également par rapport à la référence genbank . Cependant, ces deux nucléotides correspondent effectivement à une séquence génomique _publiée ( numéro d'accés Genbank : NT 011190 ). Ces différences peuvent s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à ces positions, par des erreurs dans la séquence référencée , bien que l'on ne peut exclure des mutations introduite par la polymerase. Ainsi, un résidu glutamine a remplacé le résidu proline (mutation 90), et un résidu thréonine a remplacé un résidu isoleucine (mutation 234).
PSA-EHTd (SEQ ID NO : 36) Cette isoforme présente une délétion des 9 derniers nucléotides de l'exon 2 et des 243 premiers nucléotides de l'exon 3. Cette isoforme PSA-EHTd code pour une protéine présentant une délétion de 84 acides aminés (PSA-EHTd1, SEQ

ID NO :135). Un nouveau domaine est crée entre le résidu cystéine 66 et le résidu thréonine 151.
PSA-EHTf (SEQ ID NO : 37) Cette isoforme présente une rétention de l'intron 3 délété de 105 nucléotides (2420-2526). Cette isoforme PSA-EHTf code pour une protéine tronquée après le résidu asparagine numéro 69 lequel est substitué par résidu lysine (PSA-EHTf1, SEQ ID NO :136). On peut remarquer que le nucléotide en position 56 de SEQ ID NO :37 correspond à G, alors que la référence genbank indique A.
Cette différence peut s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à cette position, par une erreur dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure une mutation introduite par la polymerase. Cette mutation remplace un résidu histidine en résidu arginine.
PSA-EHTh (SEQ ID NO : 38) Cette isoforme résulte de l'utilisation d'un site cryptique d'épissage au sein de l'intron 4 (en position 5472). Cette isoforme PSA-EHTh code pour une protéine comprenant l'une des deux phases de lecture correspondant à PSA-EHTh1 (SEQ ID NO :137) ou PSA-EHTh2 (SEQ ID NO :138). On peut remarquer que les nucléotides en position 79, 199 et 258 de SEQ ID NO :38 correspondent à
C, C et G, alors que la référence genbank indique T, T et A. Ces différences peuvent s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à ces positions, par des erreurs dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure une mutation introduite par la polymerase.
PSA-EHTj (SEQ ID NO : 39) Cette isoforme résulte de l'utilisation d'un site cryptique d'épissage au sein de l'intron 4 (en position 5257). Cette isoforme PSA-EHTj code pour une protéine comprenant l'une des trois phases de lecture correspondant à PSA-EHTj1 (SEQ
ID NO :139), PSA-EHTj2 (SEQ ID NO :140) ou PSA-EHTj3 (SEQ ID NO :141 ) PSA-EHTk (SEQ ID NO : 40) Cette isoforme présente une rétention de la partie 3' de l'intron 3, puis une rétention d'un intron 4 tronqué (entre positions 4337 et 5516). Cette isoforme code pour une protéine comprenant l'une des trois phases de lecture correspondant à PSA-EHTk1 (SEQ ID N0:142), PSA-EHTk2 (SEQ ID
NO :143), ou PSA-EHTk3 (SEQ ID NO :144).
PSA-EHTI (SEQ ID NO : 41 ) Cette isoforme utilise un site cryptique dans l'exon 4 en position 4274 et un autre site cryptique dans l'intron 4 en position 4538. On peut remarquer que le nucléotide en position 79 de SEQ ID NO :41 correspond à C, alors que la référence genbank indique T. Cette différence peut s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à cette position, par une erreur dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure une mutation introduite par la polymerase. PSA-EHTI code pour une proteine comprenant l'une des trois phases de lecture correspondant à PSA-EHTI1 (SEQ ID NO :145), PSA-EHTI2 (SEQ ID NO :146) ou PSA-EHTI3 (SEQ ID NO :147). Dans PSA-EHTI3, cette mutation remplace un résidu isoleucine en résidu threonine.
PSA-EHTm (SEQ ID NO : 42) Cette isoforme présente une rétention d'un intron 1 tronqué (entre 1214 et 1755). PSA-EHTm code pour une protéine comprenant l'une des trois phases de lecture correspondant à PSA-EHTm1 (SEQ ID NO :148), PSA-EHTm2 (SEQ
ID NO :149) ou PSA-EHTm3 (SEQ ID NO :150).
PSA-EHTn (SEQ ID NO : 43) Cette isoforme présente une rétention d'un intron 1 tronqué (entre 1366 et 1736). PSA-EHTn code pour une protéine comprenant l'une des trois phases de lecture correspondant à PSA-EHTn1 (SEQ ID NO :151 ), PSA-EHTn2 (SEQ
ID NO :152) ou PSA-EHTn3 (SEQ ID NO :153).
PSA-EHTp (SEQ ID NO : 44) Cette isoforme résulte de l'utilisation d'un site cryptique d'épissage dans l'intron 1 (en position 1240). PSA-EHTp peut coder pour une protéine comprenant 27 acides aminés supplémentaires au-delà du résidu isoleucine occupant la position 15 (PSA-EHTp1, SEQ ID NO :154). Ces 27 acides aminés représentant la séquence PSA-EHTp2 (SEQ ID NO :155) peuvent étre libérés après clivage.
PSA-EHTq (SEQ ID NO : 45) Cette isoforme présente une rétention d'un intron 2 tronqué (entre positions 2740 et 3167). PSA-EHTq code pour une protéine comprenant l'une des deux phases de lecture correspondant à PSA-EHTq1 (SEQ ID NO :156), ou PSA-EHTq2 (SEQ ID NO :157).
PSA-EHTr (SEQ ID NO : 46) Cette isoforme présente une rétention d'un intron 2 tronqué (entre positions 2589 et 3199). PSA-EHTr code pour une protéine comprenant l'une des trois phases de lecture correspondant à PSA-EHTr1 (SEQ ID NO :158), PSA-EHTr2 (SEQ ID NO :159) ou PSA-EHTr3 (SEQ ID NO :160).
PSA-EHTs (SEQ ID NO :47 ) Cette isoforme présente une rétention d'un intron 4 tronqué (entre positions 4516 et 4889). On peut remarquer que les nucléotides en position 54, 93 et 201-208 de SEQ ID NO :47 correspondent à C, A et TGCCGCTG, alors que la référence genbank indique T, G et AG--GTGT. Ces différences peuvent s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à ces positions, par des erreurs dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure une mutation introduite par la polymerase. Cette isoforme code pour une protéine comprenant l'une des deux phases de lecture correspondant à PSA-EHTs1 (SEQ ID
NO :161 ) ou PSA-EHTs2 (SEQ ID NO :162). La mutation en position 54 remplace dans PSA-EHTs1 un résidu leucine en résidu proline.
PSA-EHTt (SEQ ID NO : 48) Cette isoforme présente une rétention d'un intron 4 tronqué (entre positions 4727 et 5111 ). On peut remarquer que les nucléotides en position 137 et 239 de SEQ ID NO :48 correspondent à G et A, alors que la référence genbank indique A et G. Ces différences peuvent s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme 5 à ces positions, par des erreurs dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure une mutation introduite par la polymerase. Cette isoforme code pour une protéine comprenant l'une des deux phases de lecture correspondant à PSA-EHTt1 (SEQ ID NO :163) ou PSA-EHTt2 (SEQ ID NO :164).
10 PSA-EHTu (SEQ ID NO : 49) Cette isoforme résulte de l'utilisation d'un site cryptique dans l'intron 4 (en position 5056). On peut remarquer que le nucléotide en position 48 de SEQ ID
NO:49 correspond à T, alors que la référence genbank indique C. Cette différence peut s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à cette position, 15 par une erreur dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure une mutation introduite par la polymérase. PSA-EHTu code pour une protéine comprenant l'une des trois phases de lecture correspondant à PSA-EHTu1 (SEQ ID N0:165), PSA-EHTu2 (SEQ ID N0:166) ou PSA-EHTu3 (SEQ ID
NO :167). La mutation 48 remplace le résidu alanine en résidu valine dans 20 PSA-EHTu2.
C - VALIDATION DE L'EXPRESSION DES ISOFORMES DE PSA ET DE KLK2 PAR L'UTILISATION D'UN MICRO-ARRAY COMPORTANT DES

L'expression des variants de PSA et de KLK2 décrits dans cette invention a été
établie à l'aide d'un micro-array comportant des oligonucléotides capables de s'hybrider de façon spécifique avec ces variants. Sur la base de leurs 30 séquences, les variants d'épissage de PSA et klk2 proviennent d'évènements de natures difFérentes (Figure 1 ).

~ « exon skipping » : l'oligonucléotide spécifique (e.g., discriminant) est dessiné pour étre complémentaire de la séquence créée par la jonction exon1-exon3 ~ rétention d'introns : l'oligonucléotide spécifique est localisé dans la séquence de l'intron.
~ dans le cas d'une utilisation alternative de sites d'épissage en 5' ou 3', l'oligonucléotide discriminant est dessiné pour étre complémentaire de (i.e., placé sur) l'une ou l'autre de ces nouvelles jonctions.
~ des oligonucléotides dans les exons et sur les jonctions des formes sauvages de klk2 et PSA sont aussi générés.
C1 - Description du micro-array à oligonucléotides de jonction.
Cette étude a consisté à générer 149 oligonucléotides de 24 à 25 mers. Leurs séquences sont jointes en documents annexe (Tableau 1 ). Les oligonucléotides « discriminants », complémentaires des jonctions spécifiques créeés par les variants décrits sont revendiqués (SEQ ID NO : 168 à SEQ ID NO : 220).
5 oligonucléotides ont été utilisés pour caractériser chaque évènement d'épissage alternatif (voir figure 2). Un oligonucléotide est spécifique de l'exon éliminé et permet la quantification de la forme longue. Un second oligonucléotide est spécifique de l'un des exons adjacents non impliqué dans l'épissage et permet de quantifier les formes longues et courtes de l'ARN.
Enfin, trois oligonucléotides sont spécifiques des jonctions ; parmi eux, l'un est spécifique de la nouvelle séquence générée après épissage et permet de quantifier la forme épissée. II est entendu que d'autres combinaisons d'oligonucléotides peuvent être envisagées, notamment l'emploi d'un seul ou de deux oligonucléotides seulement.
Concernant le design des oligonucléotides, étant donné que les sondes o sont plus courtes que les sondes produits PCR classiquement utilisées, il est nécessaire de vérifier que ces sondes n'hybrident pas de manière aspécifique d'autres gènes que celui pour lequels elles ont été dessinées. De plus, il est indispensable d'assurer que les oligonuclèotides ne présentent pas de structures secondaires qui pourraient interférer avec leur capacité
d'hybridation.
D'un manière générale, il est préférable d'avoir sur la puce un profil thermodynamique homogène pour l'ensemble des oligos générés, à savoir le Tm (65°C) et la longueur (24-25 mers). Au cours de leur synthèse, les oligonucléotides sont par ailleurs modifiés en 5' par un groupement NHZ-C6 favorisant leur flexibilité et permettant d'établir une liaison covalente avec le polymère constituant le revêtement de la lame de verre.
Concernant plus précisément les oligonucléotides de jonction, ils sont idéalement centrés sur les jonctions, mais nous avons considéré également les possibilités d'oligonucléotides décalés sur la jonction.
En terme de logiciel de design d'oligonucléotides, nous avons sélectionné le logiciel Primer Finder.
Les critères que nous avons sélectionnés sont les suivants - %GC : 40% à 60% pour les 24-mers et les 30-mers, 30% à 60% pour les 40 mers.
- Concentrations en oligonucléotides : 50 nM
- Concentrations en sels : 50 mM
- Ignorer les oligonucléotides ayant des tendances à former des structures secondaires en « épingles à cheveux » ou ayant des possibilités de s'autodimériser.
Dans le but de valider notre technologie, nous avons dans un premier temps travaillé avec des isoformes clonées (cf. figure 3). Les plasmides contenant les isoformes longues et courtes ont été linéarisés avant transcription in vitro.
Le milieu réactionnel contient de l'aminoallyl-UTP qui interagit chimiquement avec le fluorochrome. Nous avons choisi de marquer les isoformes longues en Cy3 et les isoformes courtes en CyS. L'ARN présentant de nombreuses structures secondaires qui géneraient l'hybridation, il a été imaginé d'introduire dans le protocole une étape de fragmentation chimique. Après purification les isoformes ont été mélangées puis hybridées sur lame de verre (3D Link, Mororola ou Codelink, Amersham).
La figure 4 représente les résultats obtenus sur deux des clones correspondant à des gènes différents. Cette expérience a été réalisée dans le but vérifier la spécificité d'hybridation de nos oligonucléotides. Pour cela, nous avons amplifié
de l'ARN de drosophile par transcription in vitro dans lequel nous avons introduit un exogène control d'Arabidopsis thaliana qui nous servira à calibrer le scanner au moment de la lecture des lames.
Les isoformes marquées (5ng par isoformes) sont ensuite diluées dans le cRNA
de drosophile qui crée un environnement complexe nous permettant de vérifier la spécificité de l'hybridation sachant que l'ARN de drosophile ne contient pas la séquence permettant l'hybridation de la cible (analyse bioinformatique). Après hybridation, la lame a été lue dans les 2 canaux, celui de la Cy3 et de la CyS.
L'intensité de fluorescence est mesuré sur chaque spot et les valeurs sont normalisées par le calcul de la médiane.
Chaque oligonucléotide est spotté en quadruplet. Les oligonucléotides correspondant à l'exon 2, aux jonctions 1-2 et 2-3 ont été dessinés pour n'hybrider que la forme longue, c'est pourquoi ils apparaissent en rouge sur l'image générée par QuantArray. Les oligonucléotides spécifiques de la jonction 1-3 sont supposés n'hybrider que les formes courtes, ils apparaissent effectivement en vert. Puisqu'on a utilisé un mélange équimolaire d'isoformes longues et courtes, la superposition des deux images donne des spots oranges.
(Des expériences similaires ont été réalisées pour déterminer la sensibilité
de notre puce en diluant les isoformes jusque 26 pg).
De cette expérience nous pouvons voir que après normalisation 50% de l'hybridation est due à la forme longue si l'on se base sur l'exon commun.
Entre 90% et 100% de l'hybridation est due à la forme longue sur l'exon 2, les jonctions 1-2 et 2-3. Moins de 7% de l'hybridation est due à la forme longue sur la jonction 1-3.

Ces expériences ont permis de valider le design des oligos et la spécificité
des hybridations. Ce fort degré de spécificité est crucial si l'on veut utiliser cet outil pour quantifier les isoformes.
Les résultats précédents ont été obtenus en utilisant un mélange équimolaire d'isoformes longues et courtes. L'étape suivante a donc été de montrer que l'outil est quantitatif (figure 5) ; pour cela nous avons fait varier dans nos échantillons la quantité de formes longues de 0% à 100% par tranches de 20%
(axe des abscisses) en marquant les formes longues et les formes courtes avec des fluorochromes différents.
Nous avons après normalisation des intensités de fluorescence, mesuré le % de formes longues sur la base des valeurs obtenues sur l'exon commun que nous avons reportées sur l'axe des ordonnées. Comme en témoigne le graphe, les valeurs mesurées sont très proches des valeurs théoriques.
De l'ensemble de ces études, nous pouvons prévoir d'utiliser l'outil qu'est l'oligoarray dans le but de définir qualitativement et quantitativement l'expression d'exons épissés ou de rétention d'introns.
149 oligonucléotides de 24 et e 25 mers ont été conçus pour réaliser le micro-array. Ces oligonucléotides ont été repris à une concentration de 25 uM dans un tampon Phosphate de Sodium 150 mM. Les oligonucléotides ont ensuite été
déposés sur lames de verre (Codelink , Amersham), puis ces lames sont incubées dans une chambre saturante en NaCI pendant 16h. Les sites réactifs non utilisés seront ensuite bloqués en utilisant une solution d'éthanolamine mM, Tris 0.1 M, SDS 0.1 % à pH 9, elles sont ensuite lavées dans une solution à
4xSSC/0.1 %SDS.
Les cibles sont hybridées dans le tampon 5X SSC, 0.1 % SDS, 0.1 mg/ml ADN
de sperme de saumon, à une température de 50°C pendant 16h. Elles sont ensuite lavées en augmentant la stringence des bains 4X SSC pour éliminer le cover slip 2X SSC / 0.1 % SDS pendant 5min à 50°C

0.2X SSC pendant 5 minutes à température ambiante 0.1X SSC pendant 5 minutes à température ambiante C2 - Détermination de la capacité d'hybridation des oligonucléotides La capacité d'hybridation et la spécificité d'hybridation d'oligonucléotides discriminants entre PSA et klk2 ont été vérifiées. Pour cela, nous avons poolé
plusieurs isoformes correspondant à klk2 que l'on a marqué à la cyanine 5 et plusieurs isoformes de PSA qui ont été marquées à la cyanine 3 (figure 6). Les 10 cRNA ont ensuite été cohybridés sur une même lame qui est lue dans les 2 canaux et lorsque l'on superpose les 2 images, il apparaît qu'il n'y a pas d'hybridation croisée entre les oligonucléotides PSA et klk2 à l'exception d'un oligo déposé en quadruplet qui a été redessiné.
15 C3 - Etudes d'échantillons tumoraux et sains de patients Puisque la quantité de matériel biologique dont nous disposons le plus souvent est insuffisante, nous avons eu recours à une amplification d'ARN (figure 7).
La première étape consiste à reverser de l'ARNm en présence d'oligodT grâce à la 20 Superscript II. La RnaseH va dégrader l'ARN ayant servi de matrice et laisser des amorces qui seront utilisées par la DNA polymérase I pour la synthèse du second brin d'ADNc. Les fragments synthétisés seront assemblés par la DNA
ligase. A l'issue de cette étape , on se retrouve avec une structure d'ADN
double brin qui sera reconnue par la T7 DNA polymérase, elle va amplifier le 25 brin correspondant à la séquence du messager et synthétiser des molécules de cRNA qui s'hybrideront aux sondes de séquence complémentaire (sens du mRNA).
Pour chaque patient, 8ug de cibles correspondant aux échantillons tumoraux et sains et marqués à l'aide de 2 fluorochromes différents ont été cohybridés sur 30 une même lame. Les intensités de fluorescence ont été mesurées dans les 2 canaux et normalisées selon la méthode de l'intensité globale dans un logiciel d'analyse de fluorescence sur lame de verre (GeneTrafFic).

La figure 8 représente la superposition des deux images obtenues pour l'un des patients.
Pour les 3 autres patients analysés nous pouvons faire des remarques similaires : la qualité du signal de fluorescence est bonne, les intensités sont supérieures à 1500 en général.
Concernant les échantillons tumoraux et bénins provenant des 4 patients, l'analyse des signaux a démontré que certaines isoformes étaient exprimées différentiellement parmi plusieurs patients (Figure 9).
C4 - Etudes de lignées de cancer de la prostate et de cancer du sein Des expériences ont consisté à comparer les profils d'expression d'isoformes PSA et de KLK22 entre des lignées de cancer de la prostate et de cancer du sein.
Pour cela, nous avons amplifié de l'ARN de deux lignées de cancer de la prostate (Mda2b et LnCAP) et de 4 lignées de cancer du sein (Mda231, T47D, Mcf7 et BT549).
Nous avons ensuite cohybridé chaque lignée de cancer de la prostate avec les différentes lignées de cancer du sein après avoir marqué les lignées Mda2b et LnCAP à la Cyanine 3 et les lignées de cancer du sein à la Cyanine 5.
Les lames ont été lues dans les 2 canaux et les intensités de fluorescence ont été normalisées dans GeneTraffic selon la méthode d'intensité globale. Nous avons scindé l'étude en deux groupes d'hybridations en fonction de la lignée prostatique.
Nous avons ensuite identifié une liste d'oligonucléotides discriminants dont l'expression est dérégulée dans au moins une des hybridations au sein d'un méme groupe d'hybridation. Nous avons sélectionné les oligos pour lesquels un ratio inférieur à 0.66 ou supérieur à 1.5 a été calculé (soit -0.58<Mean log2 ratio>0.58). Nous avons choisi de présenter les résultats des l'analyses Mda2b vs T47D et LnCAP vs T47D pour lesquels nous avons observé l'expression différentielle la plus importante et affectant le plus grand nombre d'oligonucléotides discriminants.

Une expression différentielle de 15 isoformes parmi lesquelles 3 sont surexprimées dans les lignées issues de cancer de la prostate par rapport à
une lignée issue de cancer du sein à savoir PSA-EHT019, PSA-EHTj et PSA-EHTI a pu être observée. Les 12 autres sont sous-exprimées dans le cancer de prostate (Figure 10).
C5 - Etudes de tissus Des expériences ont consisté à vérifier la spécificité tissulaire de l'expression des isoformes de PSA et de KLK2. Pour cela nous avons choisi 4 tissus : la prostate, le coeur, le rein, et l'intestin. Nous avons amplifié les ARN de ces tissus et nous avons co-hybridé l'ARNc de la prostate marqué à la Cyanine 3 avec les ARNc des autres tissus marqués à la Cyanine 5. Nous avons aussi co hybridé l'ARNc de prostate marqué à la Cyanine 3 avec de ARNc de prostate marqué à la Cyanine 5.
Les lames ont été lues dans les 2 canaux et les intensités de fluorescence ont été normalisées dans GeneTraffic selon la méthode d'intensité globale.
Nous avons ensuite identifié une liste d'oligonucléotides discriminant dont l'expression est dérégulée dans au moins une des hybridations au sein du groupe d'hybridation regroupant ces 4 hybridations. Nous avons sélectionné les oligonucléotides pour lesquels un ratio inférieur à 0.66 ou supérieur à 1.5 a été
calculé (soit -0.58<Mean log2 ratio>0.58).
II a ainsi été mis en évidence une expression dérégulée de plusieurs isoformes de PSA et de KLK2 en fonction du tissu sain testé ( prostate, coeur, petit intestin, rein). Ce sont : PSA-EHT003, PSA-EHT005, PSA-EHT013, klk2-EHTb, klk2 EHTd, klk2-EHTj klk2-EHTf et PSA-EHTI, PSA-EHT019 et klk2-EHTe (figure 11 et 12).
C6 - Récapitulation des signaux d'hybridation obtenus Les tableaux 3, 4 et 5 regroupent les signaux d'hybridation obtenus sur le micro-array à oligonucléotides à partir de tissus sains (tableau 3), de lignées cellulaires (tableau 4) et de tissus provenant de patients atteints de cancer de la prostate (tableau 5). Les valeurs supérieures à deux fois la valeur du bruit de fonds représentant une hybridation significative sont indiquées. Les valeurs inférieures à deux fois le bruits de fonds sont représentées par #NA. II
apparaît alors que tous les oligonucléotides discriminants sauf les oligonucléotides SEQ
ID NO : 184, 215 et 220 produisent des signaux significatifs dans au moins un des systèmes étudiés. L'expression des isoformes décrites dans la présente invention est donc confirmée par cette approche. II convient également de noter que l'isoforme PSA-EHT 023 qui est associée à l'oligonucléotide SEQ ID NO
184 a pu être detectée par une approche PCR plus sensible (voir chapître D
suivant).
En conclusion, il apparaît que la majorité des isoformes décrites dans cette invention soient effectivement exprimées dans un des modèles étudiés. Des expressions tissulaires spécifiques et tumorales spécifiques ont également été
mises en évidence.
D - VALIDATION DE L'EXPRESSION DES ISOFORMES
DE PSA ET DE KLK2 PAR PCR.
Une technique de PCR de jonction a été utilisée afin de révéler l'existence de certaines isoformes. Le principe repose sur l'amplification spécifique des isoformes grâce à des oligonucléotides désignés spécifiquement sur la nouvelle jonction résultant de fépissage alternatif déjà décrit. Ces amplifications sont réalisées sur des ARN issus des zones bénignes et des zones tumorales des prostates des mêmes patients, ainsi que sur des contrôles plasmidiques.
Les résultats des amplifications par PCR sont présentés en figure 13. La flèche représente la bande de la taille attendue. On recherche une amplification spécifique des isoformes dans les pools T et N , avec un contrôle wt négatif, c'est à dire aucune amplification spécifique de la taille de l'isoforme sur le plasmide sauvage. Le plasmide avec l'isoforme clonée sert de contrôle positif d'amplification.
isoformes Fi ure conclusions #

PSA-EHT003 A Amplicon de taille et de squence attendues pour le plasmide PSA-003.

Amplification aspcifique sur le plasmide wt, ne correspondant pas la taille de l'isoforme recherche.

Amplification positive sur les 2 pools, uniquement la taille attendue de l'isoforme.

PSA-EHT023 B Amplicon de taille et de squence attendues pour le plasmide PSA-023.

Amplification aspcifique sur le plasmide wt, ne correspondant pas la taille de l'isoforme recherche.

Amplification positive sur les 2 pools, la taille attendue de l'isoforme mais aussi la taille obtenue avec le plasmide wt.

PSA-EHT012 C Amplification aspcifique sur le plasmide wt, ne correspondant pas la taille de l'isoforme recherche.

Amplification positive sur les 2 pools, la taille attendue de l'isoforme.

En conclusion, cette technique permet également de mettre en évidence la présence de certaines isoformes dans les tissus prostatiques. D'une sensibilité
accrue par rapport au micro-array, l'approche PCR a notamment révélé
l'expression de PSA-EHT012.
E - PRODUCTION D'ANTICORPS ET EXPRESSION DES PROTEINES
Afin de déterminer l'existence de protéines encodées par certains des variants décrits dans la présente invention, des anticorps polyclonaux spécifiques de certaines des isoformes ont été produits. Ces anticorps ont été utilisés dans des « western-blots » afin de détecter l'expression des protéines correspondantes.
Production d'anticorps et expression des protéines.
5 Tous les peptides et les anticorps ont été produits par la société
Eurogentec (Belgique). 20-30 milligrammes des peptides correspondant aux séquences décrites dans la figure 14 ont été synthétisés par chimie Fmoc avec une pureté
supérieure à 70%. Pour provoquer une réponse immune, la KLH a été couplée à 5 milligrammes de chaque peptide par l'utilisation de MBS (m-10 maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester) ou de glutaraldehyde.
Deux lapins (SPF New Zealand white rabbits) ont été immunisés avec 200 microgrammes de peptide couplé. La première injection a été effectuée avec de l'adjuvant de Freunds complet alors que les injections successives ont été
effectuées en adjuvant de Freunds incomplet. Un protocole standard a été
15 utilisé comportant des injections aux jours 0, 14, 28 et 56 et des collections de sérums aux jours 0, 38 et 66. Le saignement final a eu lieu au jour 87.
L'évolution du titre dans les sérums a été effectuée par test ELISA (figure 15).
Les antigènes, peptides synthétiques ou KLH ont été appliqués dans les puits des plaques ELISA (100 nanogramme dans du PBS à 4°C pendant 16 heures).
20 Après saturation (BSA 1 mg/ml à 25°C pendant 2 heures), des dilutions successives de sérums (préimmuns : PPI, de la première récolte : PP et de la deuxième récolte : GP) ont été incubées à 25°C pendant 2 heures. Le système HRP / OPD a été utilisé pour révéler la fixation des anticorps par mesure de la densité optique à 492 nm. Les titres obtenus vis à vis des épitopes selectionnés 25 sont satisfaisants.
Analyse par "Western Blots".
Les extraits protéiques ont été préparé à partir de tissus et de lignées cellulaires à l'aide d'un tampon de lyse (Tris 50 mM pH=7.5, EGTA 5 mM, NaCI 150 mM, 30 Triton 1 %, NaF 50 mM, inhibiteurs de protéases (Roche)). Les extraits ont été
quantifiés par la méthode de Bradford. Pour les tissus, 20 microgrammes d'extraits ont été déposés sur gel de poly-acrylamide-SDS, Pour les sérums, 15 microlitres d'une dilution de sérum non purifié au cinquantième ou d'une dilution de sérum purifié (kit Aurum BioRad n° 732-6701 ) au huitième ont été
utilisés.
Après electrophorése dénaturante, les protéines séparées sont transférrées sur membrane PVDF. Les variants de PSA et de KLK2 sont ensuite détectés par incubation de la membrane avec un anticorps polyclonal produit spécifiquement (cf chapitre précédent). Après lavage, la membrane est incubée avec un anticorps secondaire anti-immunoglobulin marqué à la peroxidase HRP (dilution 1/5000). Les bandes sont ensuite visualisées par détection ECL (Amersham).
Anticorps EHT- SE3962 Cet anticorps a été généré à parir d'un épitope commun aux variants KLK2-EHT004, et KLK2-EHT006. Les tailles attendues pour ces deux variants sont de 17 kD (KLK2-EHT006) et de10 kD (KLK2-EHT004). Deux bandes migrant aux tailles attendues peuvent être observées à partir de sérums (Figure 16).L'anticorps semble reconnaitre ces bandes spécifiquement car il peut étre déplacé par des doses croissantes de peptides synthétiques correspondant à
l'épitope choisi (figure 16D). On peut observer une hétérogénéité selon les échantillons de sérums. On n'observe pas de corrélation évidente avec le taux de PSA total (figure 16 A), B) et C)) Anticorps EHT-SE3963 Cet anticorps a été généré contre un épitope de jonction correspondant à PSA-EHT021 (taille attendue 20 kD). Trois bandes de poids moléculaires d'environ 22, 25 et 40 kD sont observées à partir de tissus prostatiques (figure 17). La bande de plus faible poids moléculaire pourrait correspondre à PSA-EHT021. La bande à 25 kD pourrait correspondre à un variant déjà décrit et présentant un des deux événement d'épissage associé à PSA-EHT021 (Tanaka et al, 2000).

REFERENCES
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Young et.al (1992) Biochemistry 31, 818-824.

Nom S uence 5' - 3' SEQ fD NO:

PSA-exon1- wt GTTGTCTTCCTCACCCTGTCCGTG

PSA-exon2- wt AGTGCGAGAAGCATTCCCAACCCT

PSA-exon2bis- wt AGGTGCTTGTGGCCTCTCGTGGCA

PSA-exon3- wt ACGATATGAGCCTCCTGAAGAATC

PSA-exon4- wt CTTGACCCCAAAGAAACTTCAGTG

PSA-exon5- wt AATGGTGTGCTTCAAGGTATCACG

PSA-'ctex1-2-wt TGACGTGGATTGGCGCTGCGCCCC

PSA-ctex2-3-wt CTGCATCAGGAACAAAAGCGTGAT

PSA-'ctex3-4- wt AACCAGAGGAGTTCTTGACCCCAA

PSA-'ctex4-5-wt AGCACCTGCTCGGGTGATTCTGGG

PSA-ct-ex-int1wt TGACGTGGATTGGTGAGAGGGGCC

PSA-'ct-ex-int2wt CCCCCTCTGCAGGCGCTGCGCCCC

PSA-'ct-ex-int3wt CTGCATCAGGAAGTGAGTAGGGGC

PSA-ct-ex-int4wt CTTCCTCCCCAGCAAAAGCGTGAT

PSA-ct-ex-int5wt AACCAGAGGAGTGTACGCCTGGGC

PSA-ct-ex-int6wt CCTGGCCCGTAGTCTTGACCCCAA

PSA-'ct-ex-int7wt AGCACCTGCTCGGTGAGTCATCCC

PSA-'ct-ex-int8wt TTTTACCCTTAGGGTGATTCTGGG

PSA-intron 1 CTCTTTTCTGTCTCTCCCAGCCCC

PSA-intron 2 AGAGAGGGAAAGTTCTGGTTCAGG

PSA-intron 2bis GGGAGCGAAGTGGAGGATACAACC

PSA-intron 4 CCGTGTCTCATCTCATTCCCTCCT

PSA-001-int-int CCAGCACCCCAGCTCCCAGCTGCT 168 PSA-001-int3' CCAACCCTATCCCAGAGACCT T
GA

PSA-001-int3'bis AGGATACCCAGATGCCAACCAGAC

PSA-003-int-int CCATACCCCCAGCCCCTCCCACTT 169 PSA-003-int3' GCCCCTCAATCCTATCACAGTCTA

PSA-004-'ctex1-intGTGACGTGGATTGCTGTGAGTGTC 170 PSA-004intron1 GACACCTCCTTCTTCCTAGCCAGG

PSA-005-'ct-int1-int1AGGCTCTTTCCCCCCAACCCTATC 171 PSA-008-'ctex1-intGTGACGTGGATTGGATACCCAGAT 172 PSA-009-'ct-fnt2-int2TCCGCCTCTTATTCCATTCTTTCT 173 PSA-009-int3' GAGGCGCAGAGAAGGAGTGGTTCC

PSA-009-int3'bis GAGACACAGAGAAGGGCTGGTTCC

PSA-010=xt-ex1-ex2TGACGTGGATTGGTGCTGCACCCC

PSA-0012=ctex2-int2GCATCAGGAATCTCCATATCCCCC 174 PSA-012-int3' TCACCTGTGCCTTCTCCCTACTGA

PSA-013 ct-intl-ex1TGACGTGGATTGCACCCCCTCTGC 175 PSA-013-int3' GGCATTTTCCCCAGGATAACCTCT

PSA-014-int3' GGACTGGGGGAGAGAGGGAAAGTT

PSA-015-ex1-ex2 GTCTTCCTCACCCTGAGCTTGTGG 176 PSA-015-ex1-ex2bisCTTCCTCACCCTGAGCTTGTGGCC 177 PSA-016-ex1-ex2 TGACGTGGATTGGGCAGTCTGCGG 178 PSA-018-'ct-int2-int2GAGAAAAGAAAGGACCCTGGGGAG 179 PSA-018-'ct-ex1-ex2TGACGTGGATTGGAGCTGCGCCCC

PSA-018-int3' GAAGTGGAGGATACAACCTTGGGC

PSA-019-ex3 CAGTCTGTTTCATCCTGAAGACAC

PSA-019-'ct-ex4-5 AGCACCTGCTGGGGTGATTCTGGG

PSA-019-'ct-ex3 ATTTCAGGTCAGCCTGCCGAGATC 180 PSA-020=ct-ex3 CTGCATCAGGAAGCCAGGTGATGA

PSA-020-'xt-ex4-ex5AGCACCTGCTAGGGTGATTCTGGG

PSA-020-ex3 GTGATGACTCCAGCCACGACCTCA

PSA-021=ct-ex3 CTGCATCAGGAAGCCAGGTGATGA 181 PSA-021-'ct-ex3-2 GTGATGACTCCAGCATTGAACCAG 182 PSA-022-ex3 TGATGACTCCAGCATTGAACCAGA

PSA-023-'ct-ex2 GTTCGGATTGTCTCTCGTGGCAG 183 PSA-023-'ct-ex5 AATGGGGTGCTTCAAGGTATCACG

PSA-023-'ct-in3-ex4CTGGGCCAGATGTCTTGACCCCAA 184 PSA-025-'ct-ex2-ex4TGCATCAGGAATCTTGACCCCAAAG 185 PSA-026-'ct-ex3 TTGCTGGGTCAGCATTGAACCAGA 186 PSA-027-'ct-ex3-ex5ATCTTGCTGGGTCGGGTGATTCTG 187 PSA-027-'ct-ex3-ex5bisCTTGCTGGGTCGGGTGATTCTGGG 188 PSA-001= ct-int1 CCAGCACCCCAGCTCCCTGCTCCC

PSA-d=ct-ex2-ex3 CTGCCCACTGCACCTGCTACGCCT 189 PSA-d-exon3 GGGGCAGCATTGAACCAGAGGAGT

PSA-f-'ct-int5' TTGGTAACTGGCTTCGGTTGTGTC

PSA-f 'ct-int2 CCCTCTCTTCTCTGTCTCACCTGTG 190 PSA- -ct-ex2-int2 CTGCATCAGGAATCTCCATATCTC

PSA- -ct-ex2-int2bisGCATCAGGAATCTCCATATCTCCC

PSA-h=ct-ex4-int4 AGACCTGCTCGGAGCTGGACGCT 191 PSA-h-'ct3' GGAACTGCTATCTGTTATCTGCCTG

PSA-h-exon5bis TGTCTGTAATGGTGTGCTTCAAGG

PSA-'=ct-ex4-int4 AAGCACCTGCTCGTGGGTCATTCT 192 PSA-k=ct-ex4-int4 CACCTGCTCGGTGAGTCATCCCTA 193 PSA-k= ct-int4 GAGTCATCCCTACCCCTCTGTTGG

PSA-I-'ct-ex4-int4AGAAGGTGACCAAGTTCAGCACAC 194 PSA-I-'ct-int3' AGGAACAGGGACCACAACACAGAA

PSA-m-int1-5' GATGCTTGGCCTCCCAATCTTGCC

PSA-m-'ct-int1 ACCCAGATGCCACCAGCCACCAAG 195 PSA-n-int1-5' GCCAACCAGACACCTCCTTCTTCC

PSA-n= ct-i nt1 C C T TAGGAAAAACAT GAAG 196 CG T C T

PSA- -'ct-ex1-int1GTGACGTGGATTGCCAGGCTATCT 197 PSA- -ct-int5' CCAACTGGTGAAACCCCATCTCTA

PSA- -'ct-int2 AAAATTAGCCAGGCTACCTACCCA 198 PSA-r-'ct-int2 CCCTGAGAAAAGCCGCATCTACAG 199 PSA-r-'ct-int3' CATCTACAGCTGAGCCACTCTGAG

PSA-s-'ct-int4 GGTTATTCTTACAGCAGAGAGGAGG 200 PSA-s= ct-int3' GAGTCAGGAACTGTGGATGGTGCT

PSA-t=ct-int5' TGGGACATAGCAGTGAACAGACAG

PSA-t-'ct-int4 GCTCTCAGGGAGGGCAGCAGGGAT 201 PSA-u=ct-int4-ex5 GGCCTGGCTCAGGGTGATTCTGGG 202 KLK-2-exon1-wt GTTCTCTCCATCGCCTTGTCTGTG

KLK-2-exon2-wt AGTGTGAGAAGCATTCCCAACCCT

KLK-2-exon2bis-wt GTACAGTCATGGATGGGCACACTG

KLK-2-exon3-wt CTGAAGCATCAAAGCCTTAGACCAG

KLK-2-exon4-wt CCAGGAGTCTTCAGTGTGTGAGCC

KLK-2-exon5-wt CACTTGTCTGTAATGGGGTGCTTC

KLK2-'ctex1-2-wt TGGGGTGCACTGGTGCCGTGCCCC

KLK2-'ctex2-3- ATTGCCTAAAGAAGAATAGCCAGG
wt KLK2-'ctex3-4- AACCAGAGGAGTTCTTGCGCCCCA
wt KLK2-ctex4-5-wt AGACACTTGTGGGGGTGATTCTGG

KLK2-intron1-wt ACAGTTCAGCCCAGACAATGTGCC

KLK2-intron2-wt AGACACAGGGAGGGCTGGTTTCAG

KLK2-intron3-wt AGCCCAGTTTTTCTCTGACCCATA

KLK2-intron4-wt GGGAAGCAGCAGTGAACAGGTAGA

KLK2-'ct-ex-int1wtTGGGGTGCACTGGTGAGATTGGGG

KLK2-ct-ex-int2wt CCCCCTCCGCAGGTGCCGTGCCCC

KLK2-'ct-ex-int3wtTTGCCTAAAGAAGTAAGTAGGACC

KLK2-ct-ex-int4wt CTTCCTCCCCAGGAATAGCCAGGT

KLK2-'ct-ex-int6wtTCTGACCCATAGTCTTGCGCCCCA

KLK2-'ct-ex-int7wtGACACTTGTGGGGTGAGTCATCCC

KLK2-ct-ex-int8wt CTTTACCCTTAGGGTGATTCTGGG

KLK2-002-'ct-int2-ex3TCACTTCTCAGGAATAGCCAGGTC 203 KLK2-002=ct-ex3-ex4GATGTTGTGAAGGAGTCTTCAGTG 204 KLK2-002-ex4 AGCCTCCATCTCCTGTCCAATGAC

KLK2-003-exon5 CACTTGTCTGTAATGGTGTGCTTC

KLK2-003= ct-ex1-ex3TGGGGTGCACTGGAATAGCCAGGT 205 KLK2-003= ct-int4-ex5CTGGAGGGGAAAGGGTGATTCTGG 206 KLK2-004=ct-ex2-ex4TTGCCTAAAGAATCTTGCGCCCCA 207 KLK2-004-int4 AACATCTGGAGGGGAAAAGTGAGT

KLK2-005-int4 AACATCTGGAGGGGAAAGGTGAGT

KLK2-008-ex4 ATCCTCCATCTCCTGTCCAATGAC

KLK2-008-'ct-ex3-ex4GAACCAGAGGAGTGAGTCTTCAGC

KLK2-009-'ct-ex3-ex4GAACCAGAGGAGTGAGTCTTCAGT 208 KLK2-009=ct-ex3 TGAAGACTCCAGCATCGAACCAGA 209 KLK2-009-ex4 CTTCAGTGTGTGAGCCTCCATCTC

KLK2-011-'ct-ex3-ex4AACCAGAGGAGTGGTAAAGACACT 210 KLK2-011=ct-ex4-int4AGACACTTGTGGGGTGAGTCATCC

KLK2-a-exon3 ATGAGCCTTCTGAAGCATCAAAGC

KLK2-a-exon3bis CCCACACCCGCTCTACAATATGAG

KLK2-b-'ct-int1 CTGACTCTTCCCCGCG~1GGCTATCT 211 KLK2-b-'ct-int3' ACTCTTTGCCCCAGACCCGTCATT

KLK2-c= ct-int1 '~GGGGTGCACTGACCCGTCATTCA 212 KLK2-d=ct-int5' GCGGGTTCTGACTCTTATGCTGAA

KLK2-d= ct-int1 CAGCCTCGTCCCCCCAACCACAAC 213 KLK2-e-ex2 CAGTCATGGATGGGCACACTGTGG

KLK2-e-ex2-140nt? '~AGTGGAACCCTGCTATCTGCCGA 214 KLK2-e=ct-140nt?-ex3TTTTCTCAGGAATAGCCAGGTCTG 215 KLK2-f-'ct-ex2-int2GA2'GGGCACACTCCTGTTTTCTAA 216 KLK2-f=ct3' CCTTTCCCCATTTTCTCTCTCCTC

KLK2- -ex5 CACTTGTCTGTAATGGGTGCTTCA

KLK2- -int4 AGTCATCCCTACTCCCAACATCTG

KLK2-h= ct3' GAGTCTTCAGTGTGTGAGCCTCCA

KLK2-h= ct3'bis GTCCAATGACATGTGTGCTAGAGC

KLK2-i-ex4 ACAGGTGGTAAAGACACTTGTGGG

KLK2- -'ct-int3' CTGCTACT CCACACT CCT CAGATG

KLK2-= ct-int2 ACATCCCTCCACCCTCATGCCTCT 217 KLK2-k-'ct-int5' AGTCTCTCCCCTCCACTCCATTCT 218 KLK2-k-'ct-int5'-6nt-ex5CCTGCCGATGGCCCACTTGTCTGT 219 KLK2-I=ct-int2-ex3CCCCAGCTGCAGGAATAGCCAGGT 220 Isoformes Couple d'oligonuclotides KLK2-EHTb 163/213 KLK2-EHTc 163/213 KLK2-EHTd 163/213 KLK2-EHTe 167/172 KLK2-EHTf 167/172 KLK2-EHT' 214/215 KLK2-EHTk 218/170 PSA-EHTa 175/203 PSA-EHTd 179/178 PSA-EHTf 179/205 PSA-EHTh 181/182 PSA-EHT' 181 /182 PSA-EHTk 181 /182 PSA-EHTm 200/201 PSA-EHTn 200/201 PSA-EHTr 204/207 PSA-EHTs 208/211 PSA-EHTt 208/211 PSA-EHTu 210/182 Ç
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SÉQUENCE LISTING
<110> Exonhit Therapeutics <120> Variants de kallikrein-2 et kallikrein-3 humaines et leurs utilisations <130> B0132W0 <150> FR0203186 <151> 2002-03-14 <150> FR0210975 <151> 2002-09-05 <160> 220 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 550 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 1 cctgtgtcag catgtgggac ctggttctct ccatcgcctt gtctgtgggg tgcactggtg 60 ccgtgcccct catccagtct cggattgtgg gaggctggga gtgcgagaag cattcccaac 120 cctggcaggt ggctgtgtac agtcatggat gggcacactg tgggggtgtc ctggtgcacc 180 cccagtgggt gctcacagct gcccattgcc taaagaagta agtaggaccc tgggatctgg 240 ggagggaatg gctgtgtccc acaggaataa cagcgggatg cttcccccag ggtcacttct 300 caggaatagc caggtctggc tgggtcggca caacctgttt gagcctgaag acacaggcca 360 aagggtccct gtcagccaca gcttcccaca cccgctctac aatatgagcc ttctgaagca 420 tcaaagcctt agaccagatg aagactccag ccatgacctc atgctgcttc gcctgtcaga 480 gcctgccaag atcacagatg ttgtgaagga gtcttcagtg tgtgagcctc catctcctgt 540 ccaatgacat 550 <2l0> 2 <211> 688 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 2 cctgtgtcag catgtgggac ctggttctct ccatcgcctt gtctgtgggg tgcactggaa 60 tagccaggtc tggctgggtc gccacaacct gtttgagcct gaagacacag gccagagggt 120 ccctgtcagc cacagcttcc cacacccgct ctacaatatg agccttctga agcatcaaag 180 ccttagacca gatgaagact ccagccatga cctcatgctg ctccgcctgt cagagcotgc 240 caagatcaca gatgttgtga aggtcctggg cctgcccacc caggagccag cactggggac 300 cacctgccacgcctcaggctggggcagcatcgaaccagaggagttcttgcgccccaggag 360 tcttcagtgtgtgagcctccatctcctgtccaatgacatgt~gtgctagagcttactctga 420 gaaggtgacagagttcatgttgtgtgctgggctctggacaggtggtaaagacacttgtgg 480 ggtgagtcatccctactcccaacatctggaggggaaagggtgattctgggggtccacttg 540 tctgtaatggtgtgcttcaaggtatcacatcatggggccctgagccatgtgccctgcctg 600 aaaagcctgctgtgtacaccaaggtggtgcattaccggaagtggatcaaggacaccatcg 660 cagccaacccctgagtgcccctgtccca 688 <210> 3 <211> 436 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 3 cctgtgtcag catgtgggac ctggttctct ccatcgcctt gtctgtgggg tgcactggtg 60 ccgtgcccct catccagtct cggattgtgg gaggctggga gtgtgagaag cattcccaac 120 cctggcaggt ggctgtgtac agtcatggat gggcacactg tgggggtgtc ctggtgcacc 180 cccagtgggt gctcacagct gcccattgcc taaagaatct tgcgccccag gagtcttcag 240 tgtgtgagcc tccatctcct gtccaatgac atgtgtgcta gagcttactc tgagaaggtg 300 acagagttca tgttgtgtgc tgggctctgg acaggtggta aagacacttg tggggtgagt 360 catccctact cccaacatct ggaggggaaa agtgagtgaa gaccctaatt ctgggctgca 420 atctgaaagc taacca 436 <210> 4 <211> 476 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400>

cctgtgtcagcatgtgggacctggttctctccatcgccttgtctgtggggtgcactggtg 60 ccgtgcccctcatccagtctcggattgtgggaggctgggagtgtgagaagcattcccaac 120 cctggcaggtggctgtgtacagtcatggatgggcacactgtgggggtgtcctggtgcacc 180 cccagtgggtgctcacagctgcccattgcctaaagaagaatagccaggtctggctgggtc 240 ggcacaacctgtttgagcctgaagacacaggccagagggtccctgtcagccacagcttcc 300 cacacccgctctacaatatgagccttctgaagcatcaaagccttagaccagatgaagact 360 ccagccatgacctcatgctgcttcgcctgtcagagcctgccaagatcacagatgttgtga 420 aggagtcttcagtgtgtgagcctccatctcctgtccaatgacatgtgtgctagagc 476 <210>

<211>

<212>
DNA

<213> sapiens Homo <400>

cctgtgtcagcatgtgggacctggttctctccatcgccttgtctgtggggtgcactggtg 60 ccgtgcccctcatccagtctcggattgtgggaggctgggagtgtgagaagcattcccaac 120 cctggcaggtggctgtgtacagtcatggatgggcacactgtgggggtgtcctggtgcacc 180 cccagtgggtgctcacagctgcccattgcctaaagaagaatagccaggtctggctgggtc 240 ggcacaacctgtttgagcctgaagacacaggccagagggtccctgtcagccacagcttcc 300 cacacccgctctacaatatgagccttctgaagcatcaaagccttagaccagatgaagact 360 ccagccatgacctcatgctgctccgcctgtcagagcctgccaagatcacagatgttgtga 420 aggtcctgggcctgcccacccaggagccagcactggggaccacctgctacgcctcaggct 480 ggggcagcatcgaaccagaggagttcttgcgccccaggagtcttcagtgtgtgagcctcc 540 atctcctgtccaatgacatgtgtgctagagcttactctgagaaggtgacagagttcatgt 600 tgtgtgctgggctctggacaggtggtaaagacacttgtggggtgagtcatccctactccc 660 aacatctggaggggaaaggtgagtgaagaccctaattctgggctgcaatctgaaagctaa 720 cca 723 <210> 6 <211> 409 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 6 cctgtgtcag catgtgggac ctggttctct ccatcgcctt gtctgtgggg tgcactggtg 60 ccgtgcccct catccagtct cggattgtgg gaggctggga gtgtgagaag cattcccaac 120 cctggcaggt ggctgtgtac agtcatggat gggcacactg tgggggtgtc ctggtgcacc 180 cccagtgggt gctcacagct gcccattgcc taaagaagaa tagccaggtc tggctgggtc 240 ggcacaacct gtttgagcct gaagacacag gccagagggt ccctgtcagc cacagcttcc 300 cacagccgct ctacaatatg agccttctga agcatcaaag ccttagacca gatgaagact 360 ccagcatcga accagaggag tgagtcttca gtgtgtgagc ctccatctc 409 <210> 7 <211> 595 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 7 gcatgtggga cctggttctc tccatcgcct tgtctgtggg gtgcactggt gccgtgcccc 60 tcatccagtc tcggattgtg ggaggctggg agtgtgagaa gcattcccaa ccctggcagg 120 tggctgtgta cagtcatgga tgggcacact gtgggggtgt cctggtgcac ccccagtggg 180 tgctcacagc tgcccattgc ctaaagaaga atagccaggt ctggctgggt cggcacaacc 240 tgtttgagcctgaagacacaggccagagggtccctgtcagccacagcttcccacacccgc300 tctacaatatgagccttctgaagcatcaaagccttagaccagatgaagactccagccatg360 acctcatgctgctccgcctgtcagagcctgccaagatcacagatgttgtgaaggtcctgg420 gcctgcccacccaggagccagcactggggaccacctgctacgcctcaggctggggcagca480 tcgaaccagaggagtggtaaagacacttgtggggtgagtcatccctactcccaacatctg540 gaggggaaaggtgagtgaagaccctaattctgggctgcaatctgaaagctaacca 595 <210> 8 <211> 350 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400>

ggttctctccatcgccttgtctgtggggtgcactggtgagattggggggataaaggaagg60 ggggcgggttctgactcttatgctgaagcccttttcgtcccacccagtgccccagcctcg120 tcccttcagcccacagttcagcccagacaatgtgcccctgactcttccccccgaggctat180 ctggcctgagacaacaaatgctgcctcccaccccgagtctggcactgggactttcagaac240 tcctcctttcctgactctttgccccagacccgtcattcaatggctagctttttccatggg300 aaaaacacga gcacccccaa ccacaacggc cagttctctg attccctaaa 350 <210> 9 <211> 118 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 9 ggttctctcc atcgccttgt ctgtggggtg cactgacccg tcattcaatg gctagctttt 60 tccatgggaa aaacacgagc acccccaacc acaacggcca gttctctgat tccctaaa 118 <210> 10 <211> 159 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 10 ggttctctcc atcgccttgt ctgtggggtg cactggtgag attgggggga taaaggaagg 60 ggggcgggtt ctgactctta tgctgaagcc cttttcctcc cacccagtgc cccagcctcg 120 tccccccaac cacaacggcc agttctctga ttccctaaa 159 <210> 11 <211> 293 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 11 cagtcatgga tgggcacact gtgggggtgc tttggagccc ccccagcggg gccgtacaca 60 ccatgcaccc tggccgtacc gaaactagtg gaaccctgct atctgccgag ctagaggcat 120 agctcgacta ttctatagtg gcaactatac ccccaggttt ttttctcagg aatagccagg 180 tctggctggg tcggcacaac ctgtttgagc ctgaagacac aggccagagg gtccctgtca 240 gccacagctt cccacacccg ctctacaata tgagccttct gaagcatcaa agc 293 <210> 12 <211> 313 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 12 cagtcatgga tgggcacact cctgttttct aactcactgt ctgtatttca ccacgactat 60 atctccccga cccctgtgct tttctcactg tttctttttc ttccctttgg agtctccctt 120 atcctcccct gccccatcta cctttcccca ttttctctct cctcatgcat ccaccccctt 180 cctccccagg aatagccagg tctggctggg tcggcacaac ctgtttgagc ctgaagacac 240 aggccagagg gtccctgtca gccacagcct cccacacccg ctctacaata tgagccttct 300 gaagcatcaa agc 313 <210> 13 <211> 211 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 13 agctcaatgt gtgtgcatgt gagggggtgc ctgtcattgc acagcactct ctgcaggaca 60 tCCCtCCdCC C'tCatgCCtC tCCtCCtCCC CCtgCtaCtC CdC3CtCCt C agatgCCCCC 120 gtggcctccc tcctttttct ctcccacact gtatcacccc tggcttcctc tctgctgttt 180 ctccttctct ctctgacttc ccgcatcctt t 211 <210> 14 <211> 216 <2l2> DNA
<213> Homo sapiens <400> 14 ggagtgacga tgaggatgac ctgggggtgg ctccaggcat tgtccccacc tgggccctca 60 cccagcctcc ctcacaggct cctggccctc agtctctccc ctccactcca ttctccacct 120 acccacagtg ggtcattctg atcactgaac tgaccatgcc agccctgccg atggcccact 180 tgtctgtaat ggggtgcttc aaggtatcac atcatg 216 <210> 15 <211> 159 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 15 ccactacaga gccctcactc cagccccagc tgcaggaata gccaggtctg gctgggtcgg 60 cacaacctgt ttgagcctga agacacaggc cagagggtcc ctgtcagcca cagcttccca 120 cacccgctct acaatatgag ccttctgaag catcaaagc 159 <210> 16 <2l1> 455 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400>

ggagagctgtgtcaccatgtgggtcccggttgtcttcctcaccctgtccgtgacgtggat60 tggtgagaggggccatggtgggggggatgcaggagagggagccatccctgactgtcaagc120 tgaggctctttgccccccaacccagcaccccagctcccagctgctttactaaaggggaag180 ttcctgggcatctccgtgtttctctttgtggggctcaaaacctccaaggacctctctcaa240 tgccattggttccttggaccgtatcactggtccatctcctgagcccctcaatcctatcac300 agtctactgacttttcccattcagctgtgagtgtccaaccctatcccagagaccttgatg360 cttggcctcccaatcttgccctaggatacccagatgccaaccagacacctccttcttcct420 agccaggctatctggcctgagacaacaaatgggtc 455 <210> 17 <211> 444 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400>

ggagagctgtgtcaccatgtgggtcccggttgtcttcctcaccctgtccgtgacgtggat60 tggtgagaggggccatggttggggggatgcaggagagggagccagccctgactgtcaagc120 tgaggctctttcccccccaacccagcaccccagcccagacagggagctgggctcttttct180 gtctctcccagccccactccaagcccatacccccagcccctcccacttaccccagaactt240 tctccccattgcccagccagctccctgctcccagctgctttactaaaggggaagttcctg300 ggcatctccgtgtttctctttgtggggctcaaaacctccaaggacctctctcaatgccat360 tggttccttg gaccgtatca ctggtccatc tcctgagccc ctcaatccta tcacagtcta 420 ctgacttttc ccattcagct gtga 444 <210> 18 <211> 193 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 18 ggagagctgt gtcaccatgt gggtcccggt tgtcttcctc accctgtccg tgacgtggat 60 tgctgtgagt gtccaaccct atcccagaga ccttgatgct tggcctccca atcttgccct 120 aggataccca gatgccaacc agacacctcc ttcttcctag ccaggctatc tggcctgaga 180 caacaaatgg gtc 193 <210> 19 <21l> 256 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 19 ggagagctgt gtcaccatgt gggtcccggt tgtcttcctc accctgtccg tgacgtggat 60 tggtgagagg ggccatggtt ggggggatgc aggagaggga gccagccctg actgtcaagc 120 tgaggctctt tccccccaac cctatcccag agaccttgat gcttggcctc ccaatcttgc 180 cctaggatac ccagatgcca accagacacc tccttcttcc tagccaggct atctggcctg 240 agacaacaaa tgggtc 256 <210> 20 <211> 159 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 20 ggagagctgt gtcaccatgt gggtcccggt tgtcttcccc aaccctatcc cagagacctt 60 gatgcttggc ctcccaatct tgccctagga tacccagatg ccaaccagac acctccttct 120 tcctagccag gctatctggc ctgagacaac aaatgggtc 159 <210> 21 <211> 133 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 21 ggagagctgt gtcaccatgt tggtcccggt tgtcttcctc accctgtccg tgacgtggat 60 tggataccca gatgccaacc agacacctcc ttcttcctag ccaggctatc tggcctgaga 120 ô
caacaaatgg gtc 133 <210> 22 <211> 767 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400>

ggagagctgtgtcaccatgtgggtcccggttgtcttcctcaccctgtccgtgacgtggat 60 tggtgctgcacccctcatcctgtctcggattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattc 120 ccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggt l80 gcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgcatcaggaagtgagtaggggcctgggg 240 tctggggagcaggtgtctgtgtcccagagaaataacagctgggcattttccccaggataa 300 cctctaaggccagccttgggactgggggagagagggaaagttctggttcaggtcacatgg 360 ggaggcagggttggggctggaccaccctccccatggctgcctgggtctccatctgtgtcc 420 ctctatgtctctttgtgtcgctttcattatgtctcttggtaactggcttcggttgtgtct 480 tttcgtgggactattatgttgttttttttcctctcttctctgtcttcagtatccatatct 540 ccgcctcttattccattctttcttcaggacatccctcctctcttgggaggcgcagagaag 600 gagtggttcc agctggagct gggaggggca attgagggag gaggaaggag aagggggaag 660 gaaaacaggg tatgggggaa aggaccctgg ggagggaagt ggaggatgca tccttgggcc 720 tgcaggccag gctgcctacc cacttggaaa cccacgccaa agccgca 767 <210> 23 <211> 394 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400>

ggagatgtgtcaccatgtgggtcccggttgtcttcctcaccctgtccgtgacgtggattg 60 gtgctgcacccctcatcctgtctcggattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattccc 120 aaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggtgc 180 acccccagtgggtcctcacagctgcccactgcatcaggaatctccatatccccccctctc 240 tctgtccttctctagtccctctctagccagtgtgtctcaccctgtatctctctgccaggc 300 tctgtctctcggtctctgtctcacctgtgccttctccctactgagcacacgcatgggatg 360 ggcctggggg gaccctgaga aaaggaaggg cttt 394 <210> 24 <211> 328 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 24 ggagagctgt gtcaccatgt gggtcccggt tgtcttcctc accctgtccg tgacgtggat 60 tgcaccccct ctgcaggcgc tgcgcccctc atcctgtctc ggattgtggg aggctgggag 120 tgcgagaagc attcccaacc ctggcaggtg cttgtggcct ctcgtggcag ggcagtctgc 180 ggcggtgttc tggtgcaccc ccagtgggtc ctcacagctg cccactgcat caggaagtga 240 gtaggggcct ggggtctggg gagcaggtgt ctgtgtccca gaggaataac agctgggcat 300 tttccccagg ataacctcta aggccagc 328 <210> 25 <211> 226 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 25 ggagagctgt gtcaccatgt gggtcccggt tgtcttcctc accctgagct tgtggcctct 60 cgtggcaggg cagtctgcgg cggtgttctg gtgcaccccc agtgggtccc cacagctgcc 120 cactgcatca ggaagtgagt aggggcctgg ggtctgggga gcaggtgtct gtgtcccaga 180 ggaataacag ctgggcattt tccccaggat aacctctaag gccagc 226 <210> 26 <211> 220 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 26 ggagagctgt gtcaccatgt gggtcccggt tgtcttcctc accctgtccg tgacgtggat 60 tgggcagtct gcggcggtgt tctggtgcac ccccagtggg tcctcacagc tgcccactgc 120 atcaggaagt gagtaggggc ctggggtctg gggagcaggt gtctgtgtcc cagaggaata 180 acagctgggc attttcccca ggataacctc taaggccagc 220 <2l0> 27 <211> 805 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400>

ggagagctgtgtcaccatgtgggtcccggttgtcttcctcaccctgtccgtgacgtggat60 tggagctgcgcccctcatcctgtctcggattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattc120 ccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggt180 gcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgcatcaggaagtgagtaggggcctgggg240 tctggggagcaggtgtctgtgtcccagaggaataacagctgggcattttccccaggataa300 cctctaaggccagccttgggactgggggagagagggaaagttctggttcaggtcacatgg360 ggaggcagggttggggctggaccaccctccccatggctgcctgggtctccatctgtgtcc420 ctctatgtctctttgtgtcgctttcattatgtctcttggtaactggcttcggttgtgtct480 ctccgtgtgactattttgttctctctctccctctcttctctgtcttcagtctccatatct540 ccccctctctctgtccttctctggtccctctctagccagtgtgtctcaccctgtatctct600 ctgccaggctctgtctctcggtctctgtctcacctgtgccttctcccttctgaacacacg660 cacgggatgggcctggggggaccctgagaaaagaaaggaccctggggagcgaagtggagg720 atacaaccttgggcctgcaggccaggctacctacccacttggaaacccacgccaaagccg780 catctacagctgagccactctgagg 805 <210> 28 <211> 684 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400>

ggagagctgtgtcaccatgtgggtcccggttgtcttcctcaccctgtccgtgacgtggat60 tggcgctgcgcccctcatcctgtctcggattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattc120 ccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggt180 gcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgcatcaggaacaaaagcgtgatcttgct240 gggtcggcacagtctgtttcatcctgaagacacaggccaggtatttcaggtcagcctgcc300 gagatcacggatgctgtgaaggtcatggacctgcccacccaggagccagcactggggacc360 acctgctacgcctcaggctggggcagcattgaaccagaggagttcttgatgccaaagaaa420 cttcagcgtgtggatctccatgttatttgcaatgacgtgtgtgcgcaagttcagcctcag480 aaggtgatcaagttcatacggtgtgctggacgctggacagcgggcaaaagcacctgctgg540 ggtgattttgggggagcgcttgtctgtaatggtgtggttcaaggtatcatgtcatggtgc600 agtgatccatctatcctagccgaaaggagttgcctgtccaccaaggtggtgcattaccgg660 aagtggatcaaggacaggcatcgt 684 <210> 29 <2l1> 560 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 29 ggagagctgt gtcaccatgt gggtcccggt tgtcttcctc accctgtccg tgacgtggat 60 tggtgctgca cccctcatcc tgtctcggat tgtgggaggc tgggagtgcg agaagcattc 120 ccaaccctgg caggtgcttg tggcctctcg tggcagggca gtctgcggcg gtgttctggt 180 gcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgcatcaggaagccaggtgatgactccag 240 cattgaaccagaggagttcttgaccccaaagaaacttcagtgtgtggacctccatgttat 300 ttccaatgacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaaggtgaccaagttcatgctgtgtgc 360 tggacgctggacagggggcaaaagcacctgctcgggtgattttgggggcccacttgtctg 420 taatggtgtgcttcaaggtatcacgtcatggggcagtgaaccatctatcctgcccgaaag 480 gccttccctgtacaccaaggtggtgcattaccggaagtggatcaaggacaccatcgtggc 540 caacccctga gcacccatat 560 <210>

<211>

<212>
DNA

<2l3>
Homo sapiens <400>

ggagagctgtgtcaccatgtgggtcccggttgtcttcctcaccctgtccgtgacgtggat 60 tggtgctgcacccctcatcctgtctcggattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattc 120 ccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggt 180 gcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgcatcaggaacaaaagcgtgatcttgct 240 gggtcggcacagcctgtttcatcctgaagacacaggccaggtatttcaggtcagccacag 300 cttcccacacccgctctacgatatgagcctcctgaagaatcgattcctcaggccaggtga 360 tgactccagcattgaaccagaggagttcttgaccccaaagaaacttcagtgtgtggacct 420 ccatgttatttccaatgacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaaggtgaccaagttcat 480 gctgtgtgctggacgctggacagggggcaaaagcacctgctcgggtgattctgggggccc 540 a 541 <210> 31 <211> 525 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400>

tcctgtgtcagcatgtgggtcccggttgtcttcctcaccctgtccgtgacgtggattggc60 gctgcgcccctcatcctgtctcggattgtctctcgtggcagggcagtcggcggcggtgtt120 ctggtgcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgcatcaggaagccaggtgatgac180 tccagccacgacctcatgctgctccgcctgtcagagcctgccgagatcacggatgctgtg240 aaggtcatggacctgcccacccaggagccagcactggggaccacctgctacgcctcaggc300 tggggcagcattgaaccagaggagtgtacgcctgggccagatgtcttgaccccaaagaaa360 cttcagtgtg tggacctcca tgttatttcc aatgacgtgt gtgcgcaagt tcaccctcag 420 aaggtgacca agttcatgct gtgtgctgga cgctggacag ggggcaaaag cacctgctcg 480 ggtgattctg ggggcccact tgtctgtaat ggggtgcttc aaggt 525 <210> 32 <211> 524 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400>

ggagagctgtgtcaccatgtgggtcccggttgtcttcctcaccctgtccgtgacgtggat60 tggcgctgcgcccctcatcctgtctcggattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattc120 ccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggtl80 gcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgcatcaggagcttgaccccaaagaaact240 tcagtgtgtggacctccatgttatttccaatgacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaa300 ggtgaccaagttcatgctgtgtgctggacgctggacagggggcaaaagcacctgctgggg360 tgattctgggggcccacttgtctgtaatggtgtgcttcaaggtatcacgtcatggggcag420 tgaaccatgtgccctgcccgaaaggccttcgctgtacaccaaggtggtgcattaccggaa480 gtggatcaaggacaccatcgtggccaacccctgagcacccctat 524 <210> 33 <211> 430 <212> DNA
<2l3> Homo sapiens <400> 33 ggagagctgtgtcaccatgtgggtcccggttgtcttcctcaccctgtccgtgacgtggat60 tggcgctgcgcccctcatcctgtctcggattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattc120 ccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggt180 gcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgcatcaggaacaaaagcgtgatcttgct240 gggtcagcattgaaccagaggagttcttgaccccaaagaaacttcagtgtgtggacctcc300 atgttatttccaatgacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaaggtgaccaagttcatgc360 tgtgtgctggacgctggacagggggcaaaagcacctgctggggtgattctgggggcccac420 ctgtctgtaa 430 <210> 34 <211> 290 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 34 ggagagctgt gtcaccatgt gggtcccggt tgtcttcctc accctgtccg tgacgtggat 60 tggtgctgca cccctcatcc tgtctcggat tgtgggaggc tgggagtgcg agaagcattc 120 ccaaccctgg caggtgcttg tggcctctcg tggcagggca gtctgcggcg gtgttctggt 180 gcacccccag tgggtcctca cagctgccca ctgcatcagg aacaaaagcg tgatcttgct 240 gggtcgggtg attctggggg cccacttgtc tgtaatggtg tgcttcaagg 290 <210> 35 <211> 414 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 35 cgtgacgtggattggtgagaggggccatggttggggggatgcaggagagggagccagccc 60 tgactgtcaagctgaggctctttccccccaaacccagcaccccagctccctgctcccagc 120 tgctttactaaaggggaagttcctgggcatctccgtgtttctctttgtggggctcaaaac 180 ctccaaggacctctctcaatgccattggttccttggaccgtatcactggtccacctcctg 240 aggccctcaatcctatcacagtctactgacttttcccattcagctgtgagtgcccaaccc 300 tatcccagagaccttgatgcttggcctcccaatcttgccctaggatacccagatgccaac 360 cagacacctccttcttcctagccaggctatctggcctgagacaacaaatgggtc 414 <210> 36 <211> 201 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 36 tggcaggtgc ttgtggcctc tcgtggcagg gcagtctgcg gcggtgttct ggtgcacccc 60 cagtgggtcc tcacagctgc ccactgcacc tgctacgcct caggctgggg cagcattgaa 120 ccagaggagt tcttgacccc aaagaaactt cagtgtgtgg acctccatgt tatttccaat 180 gacgtgtgtg cgcaagttca c 201 <210> 37 <211> 475 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 37 tggcaggtgc ttgtggcctc tctcgtggca gggcagtctg cggcggtgtt ctggtgcgcc 60 cccagtgggt cctcacagct gcccactgca tcaggaagtg agtaggggcc tggggtctgg 120 ggagcaggtg tctgtgtccc agaggaataa cagctgggca ttttccccag gataacctct 180 aaggccagcc ttgggactgg gggagagagg gaaagttctg gttcaggtca catggggagg 240 cagggttggg gctggaccac cctccccatg gctgcctggg tctccatctg tgtccctcta 300 tgtctctttg tgtcgctttc attatgtctc ttggtaactg gcttcggttg tgtctctccg 360 tgtgactatt ttgttctctc tctccctctc ttctctgtct cacctgtgcc ttctctcttc 420 tgaacacacg cacgggatgg gcctgggggg accctgagaa aaggaagggc tttgg 475 <210> 38 <211> 444 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400>

gtccagcccacaacagtgtttttgcctggcccgtagtcttgaccccaaagaaacttcagt60 gtgtggacctccatgttacttccaatgacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaaggtga120 ccaagttcatgctgtgtgctggacgctggacagggggcaaaagcacctgctcggagctgg180 accctgaagtcccttccccaccggccaggactggagcccctacccctctgttggaatccc240 tgcccaccttcttctgggagtcggctctggagacatttctctcttcttccaaagctggga300 actgctatctgttatctgcctgtccaggtctgaaagataggattgcccaggcagaaactg360 ggactgacctatctcactctctccctgcttttacccttagggtgattctgggggcccact420 tgtctgtaatggtgtgcttcaagg 444 <210>

<211>

<212>
DNA

<213> sapiens Homo <400>

gtccagcccacaacagtgtttttgcctggcccgtagtcttgaccccaaagaaacttcagt60 gtgtggacctccatgttatttccaatgacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaaggtga120 ccaagttcatgctgtgtgctggacgctggacagggggcaaaagcacctgctcgtgggtca180 ttctgatcaccgtactgaccatgccagccctgccgatggtcctccatggctccctagtgc240 cctggagaggaggtgtctagtcaaagagtactcctggaaggtggcctctgtgaggagcca300 cggggacagcatcctgcagatggtcctggcccttgtcccaccgacctgtctacaaggact360 gtcctcgtggaccctcccctctgcacaggagctggaccctgaagtcccttccctaccggc420 caggactggagcccctacccctctgttggaatccctgcccaccttcttctggaagtcggc480 tctggagacatttctctcttcttccaaagctgggaactgctatctgttatctgcctgtcc540 aggtctgaaagataggattgcccaggcagaaactgggactgacctatctcactctctccc600 tgcttttacccttagggtgattctgggggcccacttgtctgtaatggtgtgcttcaagg 659 <210> 40 <211> 409 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400>

gtccagcccacaacagtgtttttgcctggcccgtagtcttgaccccaaagaaacttcagt60 gtgtggacctccatgttatttccaatgacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaaggtga120 ccaagttcatgctgtgtgctggacgctggacagggggcaaaagcacctgctcggtgagtc180 atccctacccctctgttggaatccctgcccaccttcttctggaagtcggctctggagaca240 tttctctcttcttccaaagctgggaactgctatctgttatctgcctgtccaggtctgaaa300 gataggattgcccaggcagaaactgggactgacctatctcactctctccctgcttttacc360 cttagggtgattctgggggcccacttgtctgtaatggtgtgcttcaagg 409 <210> 41 <211> 378 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 41 gtccagccca caacagtgtt tttgcctggc ccgtagtctt gaccccaaag aaacttcagt 60 gtgtggacct ccatgttact tccaatgacg tgtgtgcgca agttcaccct cagaaggtga 120 ccaagttcag cacacggtta ctaggcacct gctatgcacc cagcactgcc ctagagcctg 180 ggacatagca gtgaacagac agagagcagc ccctcccttc tgtagccccc aagccagtga 240 ggggcacagg caggaacagg gaccacaaca cagaaaagct ggagggtgtc aggaggtgat 300 caggctctcg gggagggaga aggggtgggg agtgtgactg ggaggagaca tcctgcagaa 360 ggtgggagtg agcaaaca 378 <210> 42 <211> 76 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 42 tcccagagac cttgatgctt ggcctcccaa tcttgcccta ggatacccag atgccaccag 60 ccaccaacct gcaaac 76 <210> 43 <211> 247 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 43 tcccagagac cttgatgctt ggcctcccaa tcttgcccta ggatacccag atgccaacca 60 gacacctcct tcttcctagc caggctatct ggcctgagac aacaaatggg tccctcagtc 120 tggcaatggg actctgagaa ctcctcattc cctgactctt agccccagac tcttcattca 180 gtggcccaca ttttccttag gaaaaacatg aagcctctcc accagcacca gccaccaacc 240 tgcaaac 247 <210> 44 <211> 73 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 44 gtcccggttg tcttcctcac cctgtccgtg acgtggattg ccaggctatc tggcctgaga 60 caacaaatgg gtc 73 <210> 45 <211> 255 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 45 ctgaacacacgcacgggatgggcctggggggaccctgagaaaaggaaggg ctttggctgg~0 gcgcggtggctcacacctgtaatcccagcactttgggaggccaaggcagg tagatcacct120 gaggtcaggagttcgagaccagcctggccaactggtgaaaccccatctct actaaaaata180 caaaaaattagccaggctacctacccacttggaaacccacgccaaagccg catctacagc240 tgagccactctgagg 255 <210> 46 <2l1> 70 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 46 gaacacacgc acgggatggg cctgggggga ccctgagaaa agccgcatct acagctgagc 60 cactctgagg 70 <210> 47 <211> 286 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 47 tgactccctc aaggcaatag gttattctta cagcagagag gaggttgcct ggccggagtg 60 aaggatcggg gcagggtgcg agagggaaga aaagacccct cctgcagggc ctcacctggg 120 ccacaggagg acactgcttt tcctctgagg agtcaggaac tgtggatggt gctggacaga 180 agcaggacag ggcctggctc tgccgctgcc agaggctgcc gctggcctcc ctatgggatc 240 agactgcagg gagggagggc agcagggatg tggagggagt gatgat 286 <210> 48 <211> 273 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 48 tgactccctc aaggcaatag gttattctta cagcacaact catctgttcc tgcgttcagc 60 acacggttac taggcacctg ctatgcaccc agcactgccc tagagcctgg gacatagcag 120 tgaacagaca gagagcggcc cctcccttct gtagccccca agccagtgag gggcacaggc 180 aggaacaggg accacaacac agaaaagctg gagggtgtca ggaggtgatc aggctctcag 240 ggagggcagc agggatgtgg agggagtgat gat 273 <210> 49 <211> 77 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 49 tgctggacag aagcaggaca gggcctggct cagggtgatt ctgggggtcc acttgtctgt 60 aatggtgtgc ttcaagg 77 <210> 50 <211> 69 <212> PRT
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<213> Homo sapiens <400> 57 Met Trp Asp Leu Val Leu Ser Ile Ala Leu Ser Val G1y Cys Thr Gly Ala Val Pro Leu Ile Gln Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala His Cys Gly Gly Val Leu Va1 His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln Arg Va1 Pro Val Ser His Ser Phe Pro His Pro Leu Tyr Asn Met Ser Leu Leu Lys His Gln Ser Leu Arg Pro Asp Glu Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Lys Ile Thr Asp Val Val Lys Glu Ser Ser Val Cys Glu Pro Pro Ser Pro Val Gln <210> 58 <211> 134 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 58 Gly Ala Val Pro Leu Ile Gln Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala His Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln Arg Val Pro Val Ser His Ser Phe Pro His Pro Leu Tyr Asn Met Ser Leu Leu Lys His Gln Ser Leu Arg Pro Asp Glu Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Lys Ile Thr Asp Val Val Lys Glu Ser Ser Val Cys Glu Pro Pro Ser Pro Val Gln <210> 59 <211> 12 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 59 Glu Ser Ser Val Cys G1u Pro Pro Ser Pro Val Gln <210> 60 <211> 224 <212> PRT
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<213> Homo sapiens <400> 61 Gly Ala Val Pro Leu Ile Gln Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala His Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln Arg Val Pro Val Ser His Ser Phe Pro His Pro Leu Tyr Asn Met Ser Leu Leu Lys His Gln Ser Leu Arg Pro Asp Glu Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser 100 105 l10 Glu Pro Ala Lys Ile Thr Asp Val Val Lys Val Leu Gly Leu Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr A1a Ser Gly Trp G1y Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Arg Pro Arg Ser Leu Gln Cys Val Ser Leu His Leu Leu Ser Asn Asp Met Cys Ala Arg Ala Tyr Ser Glu Lys 165 l70 175 Val Thr Glu Phe Met Leu Cys Ala Gly Leu Trp Thr Gly Gly Lys Asp Thr Cys Gly Val Ser His Pro Tyr Ser Gln His Leu Glu Gly Lys Gly Glu <210> 62 <211> 14 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 62 Val Ser His Pro Tyr Ser G1n His Leu Glu Gly Lys Gly Glu <210> 63 <211> 123 <212> PRT
<213> Homo sapïens <400> 63 Met Trp Asp Leu Val Leu Ser Tle Ala Leu Ser Va1 Gly Cys Thr Gly Ala Val Pro Leu Ile Gln Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Ala Val Tyr Ser Hïs Gly Trp Ala His Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe Glu Pro Glu Asp Thr Gly G1n Arg Val Pro Val Ser His Ser Phe Pro G1n Pro Leu Tyr Asn Met Ser Leu Leu Lys His Gln Ser Leu Arg Pro Asp Glu Asp Ser Ser Ile Glu Pro Glu Glu <210> 64 <2l1> 108 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 64 Gly Ala Val Pro Leu Ile Gln Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala His Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln Arg Val Pro Val Ser His Ser Phe Pro Gln Pro Leu Tyr Asn Met Ser Leu Leu Lys His Gln Ser Leu Arg Pro Asp Glu Asp Ser Ser Ile Glu Pro Glu Glu <210> 65 <211> 5 <212> PRT
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<213> Homo sapiens <400> 66 Met Trp Asp Leu Va1 Leu Ser Ile Ala Leu Ser Val G1y Cys Thr Gly Ala Val Pro Leu Ile Gln Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala His Cys Gly Gly Val Leu Va1 His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln Arg Val Pro Val Ser His Ser Phe Pro His Pro Leu Tyr Asn Met Ser Leu Leu Lys His Gln Ser Leu Arg

26 Pro Asp Glu Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Lys Ile Thr Asp Val Val Lys Val Leu Gly Leu Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Glu Trp <210> 67 <211> 150 <212> PRT
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27 Ile Glu Pro Glu Glu Trp <210> 68 <211> 119 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 68 Met Trp Asp Leu Val Leu Ser Ile Ala Leu Ser Val Gly Cys Thr Gly Glu Ile Gly Gly Ile Lys Glu Gly Gly Arg Val Leu Thr Leu Met Leu Lys Pro Phe Ser Ser His Pro Val Pro Gln Pro Arg Pro Phe Ser Pro G1n Phe Ser Pro Asp Asn Val Pro Leu Thr Leu Pro Pro Glu Ala Ile Trp Gln Lys Thr Thr Asn Ala Ala Ser His Pro Glu Ser Gly Thr Gly Thr Phe Arg Thr Pro Pro Phe Leu Thr Leu Cys Pro Arg Pro Val Ile Gln Trp Leu Ala Phe Ser Met Gly Lys Thr Arg Ala Pro Pro Thr Thr 100 105 1l0 Thr Ala Ser Ser Leu Ile Pro <210> 69 <211> 104 <212> PRT
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28 Ile Trp Gln Lys Thr Thr Asn Ala Ala Ser His Pro G1u Ser Gly Thr Gly Thr Phe Arg Thr Pro Pro Phe Leu Thr Leu Cys Pro Arg Pro Va1 Ile Gln Trp Leu Ala Phe Ser Met Gly Lys Thr Arg Ala Pro Pro Thr Thr Thr Ala Ser Ser Leu Ile Pro <210> 70 <211> 59 <212> PRT
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29 Met Trp Asp Leu Val Leu Ser Ile Ala Leu Ser Val Gly Cys Thr Asp Pro Ser Phe Asn Gly <210> 73 <211> 6 <212> PRT
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<213> Homo sapïens <400> 78 Met Trp Asp Leu Val Leu Ser Ile Ala Leu Ser Val Gly Cys Thr Gly Ala Val Pro Leu Ile Gln Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala His Cys Gly Gly Ala Leu Glu Pro Pro Gln Arg Gly Arg Thr His His Ala Pro Trp Pro Tyr Arg Asn <210> 79 <211> 19 <212> PRT
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<213> Homo sapiens <400> 81 Ser Cys Phe Leu Thr His Cys Leu Tyr Phe Thr Thr Thr Ile Ser Pro Arg Pro Leu Cys Phe Ser His Cys Phe Phe Phe Phe Pro Leu Glu Ser Pro Leu Ser Ser Pro Ala Pro Ser Thr Phe Pro His Phe Leu Ser Pro His A1a Ser Thr Pro Phe Leu Pro Arg <210> 82 <211> 70 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 82 Ser Ser Met Cys Val His Val Arg Gly Cys Leu Ser Leu His Ser Thr Leu Cys Arg Thr Ser Leu His Pro His Ala Ser Pro Pro Pro Pro Ala Thr Pro His Ser Ser Asp Ala Pro Val Ala Ser Leu Leu Phe Leu Ser His Thr Val Ser Pro Leu Ala Ser Ser Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Arg Ile Leu <210> 83 <211> 69 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 83 Leu Asn Val Cys Ala Cys Glu Gly Val Pro Val Ile Ala Gln His Ser Leu Gln Asp 21e Pro Pro Pro Ser Cys Leu Ser Ser Ser Pro Cys Tyr Ser Thr Leu Leu Arg Cys Pro Arg Gly Leu Pro Pro Phe Ser Leu Pro His Cys Ile Thr Pro Gly Phe Leu Ser Ala Val Ser Pro Ser Leu Ser Asp Phe Pro His Pro <210> 84 <211> 46 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 84 Gly Val Thr Met Arg Met Thr Trp G1y Trp Leu Gln Ala Leu Ser Pro Pro Gly Pro Ser Pro Ser Leu Pro His Arg Leu Leu Ala Leu Ser Leu Ser Pro Pro Leu His Ser Pro Pro Thr His Ser Gly Ser Phe <210> 85 <211> 71 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 85 ' Ser Asp Asp Glu Asp Asp Leu Gly Val Ala Pro Gly Ile Val Pro Thr Trp Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Gln Ala Pro G1y Pro Gln Ser Leu Pro Ser Thr Pro Phe Ser Thr Tyr Pro Gln Trp Val Ile Leu Ile Thr Glu Leu Thr Met Pro Ala Leu Pro Met Ala His Leu Ser Val Met Gly Cys Phe Lys Val Ser His His <210> 86 <211> 53 <212> PRT
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<213> Homo sapiens <400> 118 Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg G1y Arg Ala Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Arg Lys Pro Gly Asp Asp Ser Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr Cys Ser Gly Asp l15 120 125 Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu G1n Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Ser Ile Leu Pro Glu Arg Pro Ser Leu Tyr Thr Lys Val Va1 His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile Val Ala Asn Pro <210> 119 <211> 162 <212> PRT
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<213> Homo sapiens <400> 128 Gly Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Va1 Ala Ser Arg Gly Arg A1a Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Gln His <210> 129 <211> 144 <212> PRT
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<213> Homo sapiens <400> 156 Leu Asn Thr Arg Thr Gly Trp Ala Trp Gly Asp Pro Glu Lys Arg Lys 1 5 l0 15 Gly Phe Gly Trp Ala Arg Trp Leu Thr Pro Va1 Ile Pro Ala Leu Trp Glu Ala Lys Ala Gly Arg Ser Pro Glu Val Arg Ser Ser Arg Pro Ala Trp Pro Thr Gly Glu Thr Pro Ser Leu Leu Lys Ile Gln Lys Ile Ser Gln Ala Thr Tyr Pro Leu Gly Asn Pro Arg Gln Ser Arg Ile Tyr Ser <210> 157 <211> 11 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 157 Glu His Thr His Gly Met Gly Leu Gly Gly Pro <210> l58 <211> 11 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 158 Glu His Thr His Gly Met G1y Leu Gly G1y Pro <210> 159 <211> 18 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 159 Asn Thr Arg Thr Gly Trp Ala Trp Gly Asp Pro Glu Lys Ser Arg Ile Tyr Ser <210> 160 <211> 21 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 160 Thr His Ala Arg Asp Gly Pro G1y Gly Thr Leu Arg Lys Ala Ala Ser Thr Ala Glu Pro Leu <210> 161 <211> 19 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 161 Asp Ser Leu Lys Ala Ile Gly Tyr Ser Tyr Ser Arg Glu Glu Val Ala Trp Pro Glu <210> l62 <211> 5 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 162 Thr Pro Ser Arg Gln <210> 163 <211> 23 <212> PRT
<213> Homo sapïens <400> 163 Asp Ser Leu Lys Ala Ile Gly Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr His Leu Phe Leu Arg Ser Ala His Gly Tyr <210> 164 <211> 5 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 164 Thr Pro Ser Arg Gln <210> 165 <211> 25 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 165 Cys Trp Thr Glu Ala Gly Gln Gly Leu Ala Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln <210> 166 <211> 25 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 166 Ala Gly Gln Lys Gln Asp Arg Ala Trp Leu Arg Va1 Ile Leu Gly Val His Leu Ser Val Met Val Cys Phe Lys <210> 167 <211> 11 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 167 Leu Asp Arg Ser Arg Thr Gly Pro G1y Ser Gly <210> 168 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 168 ccagcacccc agctcccagc tgct 24 <210> 169 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 169 ccataccccc agcccctccc actt 24 <210> 170 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 170 gtgacgtgga ttgctgtgag tgtc 24 <210> 171 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 171 aggctctttc cccccaaccc tatc 24 <210> 172 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 172 gtgacgtgga ttggataccc agat 24 <210> 173 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 173 tcegcctctt attccattct ttct 24 <210> 174 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 174 gcatcaggaa tctccatatc cccc 24 <210> 175 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 175 tgacgtggat tgcaccccct ctgc 24 <2l0> 176 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 176 gtcttcctca ccctgagctt gtgg 24 <210> 177 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 177 cttcctcacc ctgagcttgt ggcc 24 <2l0> 178 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 178 tgacgtggat tgggcagtct gcgg 24 <210> 179 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 179 gagaaaagaa aggaccctgg ggag 24 <210> 180 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 180 atttcaggtc agcctgccga gatc 24 <210> 181 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 181 ctgcatcagg aagccaggtg atga 24 <210> 182 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 182 gtgatgactc cagcattgaa ccag 24 <210> 183 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 183 gtctcggatt gtctctcgtg gcag 24 <210> 184 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 184 ctgggccaga tgtcttgacc ccaa 24 <210> 185 <211> 25 <2l2> DNA
<213> Homo sapiens <400> 185 tgcatcagga atcttgaccc caaag 25 <210> 186 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 186 ttgctgggtc agcattgaac caga 24 <210> 187 <211> 24 <212> DNA

<213> Homo sapiens <400> 187 atcttgctgg gtcgggtgat tctg 24 <210> 188 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 188 cttgctgggt cgggtgattc tggg 24 <210> 189 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 189 ctgcccactg cacctgctac gcct 24 <210> 190 <211> 25 <212> DNA
<2l3> Homo sapiens <400> 190 ccctctcttc tctgtctcac ctgtg 25 <210> 191 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 191 agcacctgct cggagctgga ccct 24 <210> 192 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 192 aagcacctgc tcgtgggtca ttct 24 <210> 193 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 193 cacctgctcg gtgagtcatc ccta 24 <210> 194 7~
<211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 194 agaaggtgac caagttcagc acac 24 <210> 195 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 195 acccagatgc caccagccac caac 24 <210> 196 <21l> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 196 ccttaggaaa aacatgaagc ctct 24 <210> 197 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 197 gtgacgtgga ttgccaggct atct 24 <210> 198 <211> 24 <2l2> DNA
<213> Homo sapiens <400> 198 aaaattagcc aggctaccta ccca 24 <210> 199 <2l1> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 199 ccctgagaaa agccgcatct acag 24 <210> 200 <211> 25 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 200 ggttattctt acagcagaga ggagg 25 <210> 201 <211> 24 <2l2> DNA
<213> Homo sapiens <400> 201 gctctcaggg agggcagcag ggat 24 <210> 202 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 202 ggcctggctc agggtgattc tggg 24 <210> 203 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 203 tcacttctca ggaatagcca ggtc 24 <210> 204 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 204 gatgttgtga aggagtcttc agtg 24 <210> 205 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 205 tggggtgcac tggaatagcc aggt 24 <210> 206 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 206 ctggagggga aagggtgatt ctgg 24 <210> 207 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 207 ttgcctaaag aatcttgcgc ccca 24 <210> 208 ' <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 208 gaaccagagg agtgagtctt cagt 24 <210> 209 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 209 tgaagactcc agcatcgaac calta 24 <210> 210 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 210 aaccagagga gtggtaaaga cact 24 <210> 211 <211> 25 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 211 ctgactcttc cccccgaggc tatct 25 <210> 212 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 212 tggggtgcac tgacccgtca ttca 24 <210> 213 <211> 24 <212> DNA
<2l3> Homo sapiens <400> 213 cagcctcgtc cccccaacca caac 24 <210> 214 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 214 tagtggaacc ctgctatctg ccga 24 <210> 215 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 215 ttttctcagg aatagccagg tctg 24 <210> 216 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 216 gatgggcaca ctcctgtttt ctaa 24 <210> 217 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 217 acatccctcc accctcatgc ctct 24 <210> 218 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 218 agtctctccc ctccactcca ttct 24 <210> 219 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 219 cctgccgatg gcccacttgt ctgt 24 <210> 220 <211> 24 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 220 ccccagctgc aggaatagcc aggt 24

Claims (24)

REVENDICATIONS

1.Acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend une séquence choisie parmi:
a) les séquences SEQ ID NOs : 1 à 49, b) un variant des séquences SEQ ID NOs: 1 à 49 résultant de la dégénérescence du code génétique, c) le brin complémentaire des séquences SEQ ID NOs : 1 à 49, et d) un fragment spécifique des séquences a) à c).

2. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un ADN, choisi de préférence parmi les ADNc et les ADNg, ou d'un ARN.

3. Polypeptide codé par un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications précédentes, de préférence choisi parmi un polypeptide comprenant tout ou une partie spécifique d'une séquence choisie parmi SEQ ID Nos : 50 à 167.

4. Protéine choisie parmi les variants KLK2-EHT002 à KLK2-EHT011 et PSA-EHT001 à PSA-EHT027 ou de KLK2-EHTb à KLK2-EHTI et de PSA-EHTa à PSA-EHTu de séquence SEQ ID Nos : 50 à 167, respectivement.

5. Sonde nucléique caractérisée en ce qu'elle permet la détection par hybridation sélective d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 2.

6. Sonde selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à
2.

7. Sonde selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle comprend de 20 à 1000 nucléotides, de préférence de 50 à 800.

8. Amorce, caractérisée en ce qu'elle permet l'amplification sélective d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 2.

9. Amorce selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est composée de 3 à 50 bases, de préférence de 3 à 40 et encore plus préférentiellement de 3 à 35 bases.

10. Amorce selon l'une des revendications 8 ou 9, caractérisée en ce qu'elle est complémentaire d'une région au moins du gène codant pour l'antigène spécifique de PSA ou de celui codant pour KLK-2 portant une mutation impliquée dans un cancer.

11. Amorce selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'un acide nucléique simple-brin comprenant de 3 à 50 nucléotides complémentaires d'une partie au moins de l'une des séquences SEQ ID NO : 1 à 49 ou de leur brin complémentaire.

12. Couple d'amorces comprenant une séquence sens et une séquence inverse, caractérisé en ce que les amorces de ladite paire s'hybrident avec une région d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 2 et permettent l'amplification d'au moins une portion de cet acide nucléique.

13. Anticorps, caractérisé en ce qu'il est spécifique d'une protéine ou d'un polypeptide selon les revendications 3 ou 4.

14. Anticorps selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polyclonal, d'un monoclonal ou d'un dérivé de ceux-ci.

15. Procédé de détection d'une pathologie ou d'une prédisposition à une pathologie chez un sujet, comprenant la détermination de la présence, dans un échantillon dudit sujet, d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 2 ou d'une protéine ou polypeptide selon les revendications 3 et 4.

16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la détermination est réalisée par séquençage, hybridation et/ou amplification sélectives.

17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'amplification est réalisée en utilisant un couple d'amorces selon la revendication 12.

18. Kit utilisable pour la mise en oeuvre d'un procédé tel que défini dans les revendications 15 à 17 comprenant - un couple d'amorces selon la revendication 12 ou une sonde selon l'une des revendications 5 à 7 ou un anticorps selon l'une des revendications 13 et 14, et - les réactifs nécessaires à l'amplification ou à une réaction d'hybridation ou immunologique.

19. Méthode de sélection ou d'identification de composés actifs, comprenant la mise en contact in vitro ou ex vivo d'un composé test avec une cellule exprimant un polypeptide selon la revendication 3, et la sélection ou l'identification de composés modulant l'expression ou l'activité dudit polypeptide.

20. Méthode selon la revendication 19, caractérisée en ce qu'elle comprend la sélection des composés se liant audit polypeptide.

21. Méthode selon la revendication 19, caractérisée en ce qu'elle comprend la sélection des composés modulant l'expression du dit polypeptide.

22. Vecteur comprenant un acide nucléique selon la revendication 1 ou 2.

23. Cellule recombinant comprenant un vecteur selon la revendication 22.

24. Produit comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1, 2, 5, 6 et 7, un vecteur selon la revendication 22, un polypeptide selon la revendication 3 ou 4 ou un anticorps selon la revendication 13 ou 14 immobilisé sur un support.