FR2837215A1

FR2837215A1 - Variants de kallikrein-2 et kallikrein-3 humaines et leurs utilisations

Info

Publication number: FR2837215A1
Application number: FR0203186A
Authority: FR
Inventors: Laurent Bracco; Brigitta Brinkmann; Fanny Coignard
Original assignee: ExonHit Therapeutics SA
Current assignee: ExonHit Therapeutics SA
Priority date: 2002-03-14
Filing date: 2002-03-14
Publication date: 2003-09-19

Abstract

La présente invention conceme le domaine de la biologie, de la génétique et de la médecine. Elle conceme notamment de nouvelles méthodes pour la détection, la caractérisation et/ ou le traitement de pathologies cancéreuses, notamment du cancer de la prostate. L'invention concerne également des méthodes pour l'identification ou le criblage de composés actifs dans ces pathologies. L'invention concerne également les composés, gènes, cellules, plasmides ou compositions utiles pour la mise en oeuvre des méthodes évoquées ci-dessus. L'invention décrit notamment le rôle de variants de la kallikréine-2 humaine et de la kallikréine-3 humaine, aussi connue sous le nom de PSA, dans ces pathologies et leurs utilisations comme cibles thérapeutiques, diagnostiques ou expérimentales.

Description

Variants de kallikrein-2 et kallikrein-3 humaines et leurs utilisations La présente invention concerne le domaine de la biologie, de la génétique et de la médecine. Elle concerne notamment de nouvelles séquences nucléotidiques associées à des événements d'épissage alternatif des gènes correspondant à l'antigène PSA (antigène spécifique de la prostate ou KLK3) et à la kallikréine- 2 (KLK2). L'invention concerne également des méthodes pour la détection de la présence ou pour la détermination du niveau d'expression de ces acides nucléiques ou des protéines correspondantes dans des échantillons biologiques, ainsi que des méthodes de sélection de molécules capables de moduler leur activité ou leur expression.

L'invention est particulièrement adaptée au dépistage ou au suivi de cancers, notamment de la prostate et notamment dans la différentiation entre le cancer de la prostate et l'hyperplasie bénigne de la prostate (BPH), ainsi qu'au développement de nouvelles approches thérapeutiques de ces maladies.

Les kallikréines correspondent à un groupe de protéines dont l'activité protéasique permet la modification post-traductionnelle de précurseurs protéiques vers des formes biologiquement actives. Certains membres de cette famille, la kallikréine-3, aussi connue sous la dénomination de PSA ( prostatespecific antigen ou antigène spécifique de la prostate), et plus récemment, la kallikréine-2 sont considérés comme les meilleurs marqueurs disponibles utilisables dans la détection, le diagnostique et le suivi du cancer de la prostate.

L'utilisation de tests mesurant la quantité de PSA dans le sang a permis de diagnostiquer un nombre croissant de patients atteints de cancer de la prostate (Pca). Cependant, comme la PSA est également produite par les cellules épithéliales prostatiques non cancéreuses, il est souvent difficile de différencier les patients atteints de cancers de la prostate de ceux présentant un symptôme bénin hyperplasique (BPH). Dans le sérum, la PSA existe sous forme libre, non complexée et sous forme complexée, notamment à l'alpha-antichymotrypsine. La

mesure de ces différentes formes et de leurs rapports permet d'améliorer le facteur différentiateur entre Pca et BPH.

L'épissage alternatif constitue un mécanisme de régulation de l'expression des gènes permettant de générer de la diversité fonctionnelle à partir d'une information génétique limitée. Ce mécanisme, fortement régulé, peut subir des altérations au cours du développement de pathologies humaines. Ainsi, la dérégulation de la machinerie d'épissage dans les cancers peut permettre l'expression d'isoformes ou de variants spécifiquement exprimés dans certaines tumeurs humaines. Ces isoformes pourront avoir un rôle fonctionnel déterminant dans le développement ou le maintien de l'état pathologique. L'expression spécifique de telles isoformes constitue un événement de choix pour une approche rationnelle et ciblée de développement de médicaments et/ou de méthodes de diagnostique. Une technologie de profilage de l'expression génétique (DATAS) a été récemment développée pour identifier de façon systématique les gènes et, à l'intérieur de ces gènes, les domaines susceptibles d'être altérés par épissage alternatif (W099/46403).

La présente invention décrit à présent de nouveaux événements génétiques liés à des épissages alternatifs des gènes PSA et KLK2 dans des tissus prostatiques.

La présente invention découle notamment de la construction d'un répertoire des altérations d'épissage associées à des tissus tumoraux de la prostate, et de l'identifications d'altérations structurales dans les gènes PSA et KLK2 ou dans les ARNm correspondants. La présente invention fournit ainsi de nouvelles approches thérapeutiques et diagnostiques des cancers, notamment du cancer de la prostate.

Plus particulièrement, une analyse qualitative différentielle a été effectuée à partir d'ARN extraits d'échantillons de tissus prostatiques provenant de zones tumorale et non tumorale de patients atteints de carcinomes de la prostate. Cette analyse a été effectuée par criblage différentiel qualitatif grâce à la mise en #uvre de la technique DATAS (décrite dans la demande n W099/46403) qui présente des

avantages inégalés. L'application de la technologie DATAS sur des ARNs issus de tissus prostatiques tumoraux et non-tumoraux a permis d'isoler divers fragments d'ADNc dérivés des ARNm de la kalikreine 2 et de la kalikreine 3 (PSA) humaines. Ces résultats ont ensuite permis d'identifier un certain nombre d'ADNc révélateurs d'événements liés à des épissages alternatifs.

La présente invention décrit donc des événements moléculaires originaux qui peuvent aboutir à l'expression spécifique d'isoformes ou de variants de KLK3 (PSA) et de KLK2 dans les tissus prostatiques et plus spécifiquement dans les tissus cancéreux ou les tissus associés à une hyperplasie bénigne (BPH).. La présente invention fournit des données moléculaires qui justifient l'utilisation d'un ou de plusieurs de ces variants comme cibles thérapeutiques et diagnostiques nouvelles et utilisables avantageusement dans le diagnostic et le traitement des cancers et notamment du cancer de la prostate.

Un premier aspect de la présente demande concerne donc des variants de PSA et KLK2 humains, notamment des variants d'épissage, . L'invention concerne les acides nucléiques correspondant à ces variants ou aux altérations spécifiques qu'ils présentent, ainsi que les protéines (ou polypeptides ou domaines protéiques) codés.

Un autre aspect de la présente demande concerne des méthodes et outils pour détecter la présence de ces variants ou altérations dans des échantillons biologiques (sang, plasma, urine, sérum, salive, biopsies ou cultures cellulaires, etc. ), ou pour déterminer leur(s) quantité (s) ou proportion (s) De tels outils comprennent notamment des sondes ou amorces nucléiques, des anticorps ou autres ligands spécifiques, des kits, supports, puces, etc. Les méthodes de détection peuvent inclure les méthodes d'hybridation, de PCR, de chromatographie, d'immunologie, etc. Ces méthodes sont particulièrement adaptées à la détection, la caractérisation, le suivi de la progression ou de l'efficacité d'un traitement de cancers, notamment du cancer de la prostate, ou à la détermination d'une prédisposition.

Un autre aspect de la présente demande concerne des outils et méthodes pour la production de composés actifs sur les variants décrits, c'est-à-dire capables de moduler leur expression ou leur activité. Ces outils et méthodes incluent notamment des acides nucléiques, des vecteurs, des cellules recombinantes (ou préparations dérivées de telles cellules), des tests de liaison, etc.

La présente invention est ainsi applicable au diagnostic et au développement de stratégies thérapeutiques de cancers, notamment de la prostate.

Variants de KLK2 et KLK3 Un premier aspect de la présente demande concerne donc des variants de KLK- 2 et KLK-3 (PSA), ou des altérations génétiques particulières affectant ces gènes (ou les ARN ou protéines correspondants). Un objet plus particulier de l'invention concerne des acides nucléiques correspondant à ces variants de PSA et KLK2 humains ou aux altérations spécifiques qu'ils présentent, ainsi que les protéines (ou polypeptides ou domaines protéiques) codées.

Un certain nombre d'isoformes des gènes KLK2 et KLK3 ont été décrites dans l'art antérieur. Ces isoformes correspondent toutes à la rétention totale d'un intron (David et.al (2002), Riegman et.al (1988), Riegman et.al (1991), Liu et.al (1999), Heuze et.al (1999), Tanaka et.al (2000)). La présente demande décrit maintenant l'existence de formes différentes des gènes PSA et KLK2, et leur corrélation à des situations pathologiques.

Ces isoformes ont été identifiées à partir d'échantillons tumoraux. La description des ADNc et des protéines/polypeptides codés par ces ADNc est indiquée cidessous. Les séquences complètes sont fournies dans la Liste de Séquences annexée à la présente demande.

Variants de KLK2: La numérotation des nucléotides se réfère au numéro d'accession de Genbank M18157 sauf autre précision. La protéine de référence est la KLK2 munie de son peptide signal.

KLK2-EHTa (SEQ ID NO : 1) : Cette isoforme présente une délétion de l'exon 2. Cette isoforme KLK2-EHTa code pour une protéine comprenant 34 acides aminés supplémentaires au-delà du résidu thréonine numéro 15 (KLK2-EHTa1, SEQ ID NO :32). Ces 34 acides aminés peuvent être clivés pour former la séquence KLK2-EHTa2, SEQ ID NO 33.

KLK2-EHTb (SEQ ID NO : 2) : Cette isoforme présente une rétention d'une partie 5' de l'intron 1 suivi d'une délétion comprise entre les positions 701 et 1058 inclues. Cette isoforme KLK2EHTb code pour une protéine comprenant 104 acides aminés supplémentaires au-delà du résidu thréonine numéro 15 (KLK2-EHTb1, SEQ ID NO :34). Ces 104 acides aminés peuvent être clivés pour former la séquence KLK2-EHTb2, SEQ ID N0:35. Les 59 derniers acides aminés (KLK2-EHTb3, SEQ ID N0:36) représentent une nouvelle séquence par rapport à une isoforme déjà décrite, KLM (David et.al, (2002)). On peut remarquer que les nucléotides en position 97, 214,249 de SEQ ID NO :2 correspondent à G, C, T alors que la référence genbank indique C, T, C respectivement. Ces différences peuvent s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à ces positions, par des erreurs dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure des mutations introduites par la polymerase. Les mutation 97,214 n'affectent pas la séquence protéique traduite. La mutation 249 transforme un résidu sérine en résidu phenylalanine.

On peut également remarquer que les nucléotides 1192-1199, GAAGAACA de la référence genbank sont remplacés par les nucléotides 303-306, AAAC dans SEQ ID NO :2. Les quinze derniers acides aminés de KLK2-EHTb1 remplacent ainsi une séquence ouverte comprenant les 17 acides aminés composant KLK2EHTb4, SEQ ID NO :37.

KLK2-EHTc (SEQ ID NO : 3) : Cette isoforme utilise un site cryptique dans l'intron 1 qui occupe la position 1157.

Cette isoforme KLK2-EHTc code pour une protéine comprenant en outre 6 acides aminés au-delà du résidu thréonine numéro 15 (KLK2-EHTc1, SEQ ID NO : 38).

Ces 6 acides aminés peuvent être clivés pour former la séquence KLK2-EHTc2, SEQ ID NO : 39. On peut remarquer que les nucléotides 1192-1199, GAAGAACA de la référence genbank sont remplacés par les nucléotides 71-74, AAAC dans SEQ ID NO : 3. Ce changement intervient après un codon stop.

KLK2-EHTd (SEQ ID NO :4 ) : Cette isoforme présente une rétention d'une partie 5' de l'intron 1 suivi d'une délétion comprise entre les positions 657 et 1209 inclues. Cette isoforme KLK2EHTd code pour une protéine comprenant au moins 41 acides aminés supplémentaires au-delà du résidu thréonine numéro 15 (KLK2-EHTd1, SEQ ID NO : 40). Ces 41 acides aminés supplémentaires peuvent être clivés pour former la séquence KLK2-EHTd2, SEQ ID N0:41. Les 11 derniers acides aminés supplémentaires (KLK2-EHTd3, SEQ ID NO :42) représentent une nouvelle séquence par rapport à une isoforme déjà décrite, K-LM (David et.al, 2002).). La séquence prédite par continuation de la traduction dans l'intron 1 produit une protéine de 83 acides aminés après clivage : KLK2-EHTd4, SEQ ID NO : 43.

KLK2-EHTe (SEQ ID NO : 5) : KLK2-EHTe présente une séquence inconnue de 140 nucléotides comprise entre un exon 2 tronqué en 3' et l'exon 3. Cette isoforme KLK2-EHTe code pour une protéine comprenant en outre 19 acides aminés au-delà du résidu glycine occupant la position numéro 52 (KLK2-EHTe1, SEQ ID NO :44). Ces 19 acides aminés représentent la séquence KLK2-EHTe2, SEQ ID NO : 45.

KLK2-EHTf (SEQ ID NO : 6) : Cette isoforme utilise deux sites cryptiques, le premier dans la partie 3' de l'exon 2 (position 1876), le second dans l'intron 2 (position 3349). Cette isoforme KLK2EHTf code pour une protéine comprenant en outre 57 acides aminés compris

entre les résidus histidine en position 49 et asparagine en position 70 (KLK2EHTf1, SEQ ID NO :46). Ces 57 acides aminés représentent la séquence KLK2EHTf2, SEQ ID NO : 47. On peut remarquer que le nucléotide en position 269 de SEQ ID NO :6 correspond à C, alors que la référence genbank indique T. Cette différence peut s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à cette position , par une erreur dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure une mutation introduite par la polymerase. La mutation 269 transforme un résidu phenylalanine en résidu leucine.

KLK2-EHTg (SEQ ID NO : 7) : Cette isoforme utilise un site cryptique dans l'intron 4 (position 4097). Cette isoforme KLK2-EHTg code pour une protéine comprenant l'une des trois phases de lecture correspondant à KLK2-EHTg1 (SEQ ID NO :48), KLK2-EHTg2 (SEQ ID NO : 49) ou KLK2-EHTg3 (SEQ ID NO :50). On peut remarquer que les nucléotides en position 104,292 de SEQ ID NO : 7 correspondent à C, C, alors que la référence genbank indique T, T. D'autre part, le nucléotide G en position 5484 de la référence genbank n'est pas présent. Ces différences peuvent s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à ces positions,, par des erreurs dans la séquence référencée , bien que l'on ne peut exclure des mutations introduites par la polymerase. Ces mutations se trouvent après les codons stop situés dans les trois phases de lecture.

KLK2-EHTh (SEQ ID NO : 8) : Cette isoforme utilise deux sites cryptiques dans la partie 3' de l'exon 3 (en position 3728) et dans la partie 5' de l'exon 4 (en position 3937). Cette isoforme KLK2-EHTh code pour une protéine comprenant en outre 12 acides aminés audelà du résidu lysine numéro 137 (KLK2-EHTh1, SEQ ID NO :51). Ces 12 acides aminés représentent la séquence KLK2-EHTh2, SEQ ID NO : 52.

KLK2-EHTi (SEQ ID NO :9 ) : Cette isoforme utilise un site cryptique dans la partie 5' de l'exon 4 (en position 3937). Cette isoforme KLK2-EHTi code pour une protéine tronquée après le

résidu glutamine occupant la position 164 (KLK2-EHTi1, SEQ ID N0:53). On peut remarquer que le nucléotide en position 253 de SEQ ID NO : 9 correspond à G, alors que la référence genbank indique A. Cette différence peut s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à cette position, par une erreur dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure une mutation introduite par la polymerase. Cette mutation n'affecte pas la séquence protéique traduite car elle se trouve située après un codon stop.

KLK2-EHTj (SEQ ID NO :10) : Cette isoforme présente une délétion dans l'intron 2 entre les positions 2473 et 3001. KLK2-EHTj code pour une protéine comprenant l'une des deux phases de lectures correspondant à la KLK2-EHTj1 (SEQ ID NO :54), ou KLK2-EHTj2 (SEQ ID NO :55).

KLK2-EHTk (SEQ ID NO : 11) :
Cette isoforme utilise deux sites cryptiques, le premier situé dans l'intron 4 en position 5049 et le deuxième dans l'exon 5 en position 5469. KLK2-EHTk code pour une protéine comprenant l'une des deux phases de lecture correspondant à KLK2-EHTk1 (SEQ ID NO :56) ou KLK2-EHTk2 (SEQ ID NO :57).

KLK2-EHTI (SEQ ID NO :12 ) : Cette isoforme utilise un site cryptique dans l'intron 2 en position 2991. Cette isoforme code pour une protéine comprenant l'une des trois phases de lecture correspondant à KLK2-EHTI1 (SEQ ID NO :58), KLK2-EHTI2 (SEQ ID NO :59) ou KLK2-EHTI3 (SEQ ID NO :60).

Variants de PSA (ou KLK3) : La numérotation des nucléotides se réfère au numéro d'accession de Genbank M27274 sauf autre précision. La protéine de référence est la PSA munie de son peptide signal.

PSA-EHTa (SEQ ID NO :13 ) :

Cette isoforme présente une rétention de 91 nucléotides de la partie 5' de l'intron 1 suivie d'une délétion des 152 nucléotides suivants (pour retrouver ensuite l'intron 1). Cette isoforme PSA-EHTa code pour une protéine de 90 acides aminés (PSA-EHTa1, SEQ ID N0:61) dont les 75 derniers acides aminés peuvent être clivés (PSA-EHTa2, SEQ ID NO :62), représentant une information différente par rapport à PSA et dont les 44 derniers acides aminés (PSA-EHTa3, SEQ ID NO :63) représentent une information nouvelle par rapport à une rétention totale de l'intron 1 déjà décrite (David et.al, (2002)). Q remplace P en position 26 des 74 derniers acides aminés. On peut remarquer que les nucléotides en position 90 et 234 de SEQ ID NO :13 correspondent à A, C, alors que la référence genbank indique C et T. D'autre part, les nucléotides G et C en position 243 et 293 différent également par rapport à la référence genbank . Cependant, ces deux nucléotides correspondent effectivement à une séquence génomique publiée ( numéro d'accès Genbank : NT~011190 ). Ces différences peuvent s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à ces positions, par des erreurs dans la séquence référencée , bien que l'on ne peut exclure des mutations introduite par la polymerase. Ainsi, un résidu glutamine a remplacé le résidu proline (mutation 90), et un résidu thréonine a remplacé un résidu isoleucine (mutation 234).

PSA-EHTc (SEQ ID NO :14 ) : Cette isoforme présente une délétion de 123 nucléotides à l'intérieur de l'exon 3.

Cette isoforme PSA-EHTc code pour une protéine présentant une délétion de 41 acides aminés dans l'exon 3 (PSA-EHTc1, SEQ ID N0:64). Un nouveau domaine est créé entre le résidu serine 118 et le résidu isoleucine 160.

PSA-EHTd (SEQ ID NO : 15) : Cette isoforme présente une délétion des 9 derniers nucléotides de l'exon 2 et des 243 premiers nucléotides de l'exon 3. Cette isoforme PSA-EHTd code pour une protéine présentant une délétion de 84 acides aminés (PSA-EHTd1, SEQ ID NO : 65). Un nouveau domaine est crée entre le résidu cystéine 66 et le résidu thréonine 151.

PSA-EHTe (SEQ ID NO : 16) : Cette isoforme présente une délétion des 129 premiers nucléotides de l'exon 3.

Cette isoforme PSA-EHTe code pour une protéine présentant une délétion de 43 acides aminés (PSA-EHTe1, SEQ ID NO :66). Une nouvelle jonction est créée entre le résidu asparagine numéro 69 transformé en résidu lysine et le résidu proline numéro 113. On peut remarquer que le nucléotide en position 154 de SEQ ID NO :16 correspond à A, alors que la référence genbank indique C. Cette différence peut s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à cette position, par une erreur dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure une mutation introduite par la polymerase. Cette mutation remplace un résidu leucine par un résidu isoleucine.

PSA-EHTf (SEQ ID NO : 17) : Cette isoforme présente une rétention de l'intron 3 délété de 105 nucléotides (2420-2526). Cette isoforme PSA-EHTf code pour une protéine tronquée après le résidu asparagine numéro 69 lequel est substitué par résidu lysine (PSA-EHTfl, SEQ ID NO : 67). On peut remarquer que le nucléotide en position 56 de SEQ ID N0:17 correspond à G, alors que la référence genbank indique A. Cette différence peut s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à cette position, par une erreur dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure une mutation introduite par la polymerase. Cette mutation remplace un résidu histidine en résidu arginine.

PSA-EHTg (SEQ ID NO :18 ) : Cette isoforme résulte de l'utilisation d'un site cryptique d'épissage au sein de l'intron 2 (en position 2426). Cette isoforme PSA-EHTg code pour une protéine se terminant par 15 acides aminés supplémentaires au-delà du résidu arginine 68 (PSA-EHTg1, SEQ ID NO :68). Les 15 nouveaux acides aminés représentent la séquence PSA-EHTg2, SEQ ID NO :69.

PSA-EHTh (SEQ ID NO : 19) :

Cette isoforme résulte de l'utilisation d'un site cryptique d'épissage au sein de l'intron 4 (en position 5472). Cette isoforme PSA-EHTh code pour une protéine comprenant l'une des deux phases de lecture correspondant à PSA-EHTh1 (SEQ ID NO :70) ou PSA-EHTh2 (SEQ ID NO:71). On peut remarquer que les nucléotides en position 79,199 et 258 de SEQ ID NO :19 correspondent à C, C et G, alors que la référence genbank indique T, T et A. Ces différences peuvent s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à ces positions, par des erreurs dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure une mutation introduite par la polymerase.

PSA-EHTj (SEQ ID NO : 20) : Cette isoforme résulte de l'utilisation d'un site cryptique d'épissage au sein de l'intron 4 (en position 5257). Cette isoforme PSA-EHTj code pour une protéine comprenant l'une des trois phases de lecture correspondant à PSA-EHTj1 (SEQ ID NO :72), PSA-EHTj2 (SEQ ID NO :73) ou PSA-EHTj3 (SEQ ID NO :74) PSA-EHTk (SEQ ID NO : 21) :
Cette isoforme présente une rétention de la partie 3' de l'intron 3, puis une rétention d'un intron 4 tronqué (entre positions 4337 et 5516). Cette isoforme code pour une protéine comprenant l'une des trois phases de lecture correspondant à PSA-EHTk1 (SEQ ID NO :75), PSA-EHTk2 (SEQ ID NO :76), ou PSA-EHTk3 (SEQ ID NO :77).

PSA-EHTI (SEQ ID NO : 22) :
Cette isoforme utilise un site cryptique dans l'exon 4 en position 4274 et un autre site cryptique dans l'intron 4 en position 4538. On peut remarquer que le nucléotide en position 79 de SEQ ID NO :22 correspond à C, alors que la référence genbank indique T. Cette différence peut s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à cette position, par une erreur dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure une mutation introduite par la polymerase. PSA-EHTI code pour une protéine comprenant l'une des trois phases de lecture correspondant à PSA-EHTI1 (SEQ ID NO :78), PSA-EHTI2

(SEQ ID NO :79) ou PSA-EHTI3 (SEQ ID NO :80). Dans PSA-EHTI3, cette mutation remplace un résidu isoleucine en résidu threonine.

PSA-EHTm (SEQ ID NO : 23) : Cette isoforme présente une rétention d'un intron 1 tronqué (entre 1214 et 1755).

PSA-EHTm code pour une protéine comprenant l'une des trois phases de lecture correspondant à PSA-EHTm1 (SEQ ID NO :81), PSA-EHTm2 (SEQ ID NO :82) ou PSA-EHTm3 (SEQ ID NO :83).

PSA-EHTn (SEQ ID NO : 24) : Cette isoforme présente une rétention d'un intron 1 tronqué (entre 1366 et 1736). PSA-EHTn code pour une protéine comprenant l'une des trois phases de lecture correspondant à PSA-EHTn1 (SEQ ID NO :84), PSA-EHTn2 (SEQ ID NO :85) ou PSA-EHTn3 (SEQ ID NO :86).

PSA-EHTo (SEQ ID NO : 25) : Cette isoforme résulte de l'utilisation d'un site cryptique d'épissage dans l'intron 1 (en position 1202). Cette isoforme PSA-EHTo code pour une protéine comprenant 12 acides aminés supplémentaires au-delà du résidu Isoleucine occupant la position 15 (PSA-EHTo1, SEQ ID NO :87). Ces 12 acides aminés représentent la séquence PSA-EHTo2 (SEQ ID NO : 88) et peuvent être libérés après clivage.

PSA-EHTp (SEQ ID NO : 26) : Cette isoforme résulte de l'utilisation d'un site cryptique d'épissage dans l'intron 1 (en position 1240). PSA-EHTp peut coder pour une protéine comprenant 27 acides aminés supplémentaires au-delà du résidu isoleucine occupant la position 15 (PSA-EHTp1, SEQ ID N0:89). Ces 27 acides aminés représentant la séquence PSA-EHTp2 (SEQ ID NO : 90) peuvent être libérés après clivage.

PSA-EHTq (SEQ ID NO : 27) : Cette isoforme présente une rétention d'un intron 2 tronqué (entre positions 2740 et 3167). PSA-EHTq code pour une protéine comprenant l'une des deux phases

de lecture correspondant à PSA-EHTq1 (SEQ ID NO :91), ou PSA-EHTq2 (SEQ ID NO :92).

PSA-EHTr (SEQ ID NO: 28): Cette isoforme présente une rétention d'un intron 2 tronqué (entre positions 2589 et 3199). PSA-EHTr code pour une protéine comprenant l'une des trois phases de lecture correspondant à PSA-EHTr1 (SEQ ID NO :93), PSA-EHTr2 (SEQ ID NO :94) ou PSA-EHTr3 (SEQ ID NO :95).

PSA-EHTs (SEQ ID NO :29 ) : Cette isoforme présente une rétention d'un intron 4 tronqué (entre positions 4516 et 4889). On peut remarquer que les nucléotides en position 54, 93 et 201- 208 de SEQ ID NO :29 correspondent à C, A et TGCCGCTG, alors que la référence genbank indique T, G et AG--GTGT. Ces différences peuvent s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à ces positions, par des erreurs dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure une mutation introduite par la polymerase. Cette isoforme code pour une protéine comprenant l'une des deux phases de lecture correspondant à PSA-EHTs1 (SEQ ID N0:96) ou PSA-EHTs2 (SEQ ID N0:97). La mutation en position 54 remplace dans PSA-EHTs1 un résidu leucine en résidu proline.

PSA-EHTt (SEQ ID NO : 30) : Cette isoforme présente une rétention d'un intron 4 tronqué (entre positions 4727 et 5111). On peut remarquer que les nucléotides en position 137 et 239 de SEQ ID NO : 30 correspondent à G et A, alors que la référence genbank indique A et G. Ces différences peuvent s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à ces positions, par des erreurs dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure une mutation introduite par la polymerase. Cette isoforme code pour une protéine comprenant l'une des deux phases de lecture correspondant à PSAEHTt1 (SEQ ID NO :98) ou PSA-EHTt2 (SEQ ID NO :99).

PSA-EHTu (SEQ ID NO : 31) :

Cette isoforme résulte de l'utilisation d'un site cryptique dans l'intron 4 (en position 5056). On peut remarquer que le nucléotide en position 48 de SEQ ID NO :31 correspond à T, alors que la référence genbank indique C. Cette différence peut s'expliquer par l'existence d'un polymorphisme à cette position, par une erreur dans la séquence référencée, bien que l'on ne peut exclure une mutation introduite par la polymérase. PSA-EHTu code pour une protéine comprenant l'une des trois phases de lecture correspondant à PSA-EHTu1 (SEQ ID NO :100), PSA-EHTu2 (SEQ ID NO :101) ou PSA-EHTu3 (SEQ ID NO :102).

La mutation 48 remplace le résidu alanine en résidu valine dans PSA-EHTu2.

Un premier objet de l'invention concerne des acides nucléiques comprenant la séquence des variants de PSA et KLK-2 décrits ci-avant.

Un autre objet de l'invention concerne des acides nucléiques spécifiques des altérations génétiques portées par les variants de PSA et KLK-2 décrits ci-avant.

De tels acides nucléiques peuvent être notamment complémentaires de régions mutées, de domaines introniques retenus ou de jonctions nouvellement créées par des délétions.

Un autre objet de l'invention concerne un acide nucléique comprenant tout ou partie d'une séquence dérivée des ARNs messagers (ou des ADNc) de KLK2EHTa à KLK2-EHTI et de PSA-EHTa à PSA-EHTu ou toute combinaison de ces variants ainsi que leurs utilisations pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic, de détection ou de suivi de cancers, notamment du cancer de la prostate et plus particulièrement de la forme bénigne de ce dernier, BPH.

Un autre objet de l'invention réside dans tout acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend une séquence choisie parmi : a) les séquences SEQ ID NOs : 1 à 31, b) un variant des séquences SEQ ID NOs : 1 à 31 résultant de la dégénérescence du code génétique,

c) le brin complémentaire des séquences SEQ ID NOs : 1 à 31, et d) un fragment spécifique des séquences a) à c).

Le terme fragment spécifique désigne un fragment caractéristique des variants considérés, typiquement un fragment portant au moins une altération génétique (e. g., mutation, nouvelle jonction, rétention d'intron, etc.) caractéristique des variants considérés. De tels fragments spécifiques se distinguent donc de la séquence sauvage.

Au sens de l'invention, les acides nucléiques peuvent être des ADN, choisis de préférence parmi les ADNc et les ADNg, ou des ARN. Il peut s'agir d'acides nucléiques synthétiques ou semi-synthétiques, de fragments PCR, d'oligonucléotides, de régions double- ou simple-brin, etc.

Un autre objet de l'invention concerne une sonde nucléique caractérisée en ce qu'elle permet la détection d'un acide nucléique tel que défini ci-avant, typiquement par hybridation sélective à partir d'une population d'acides nucléiques test. Généralement, la sonde comprend la séquence d'un acide nucléique tel que défini ci-avant ou une partie (spécifique) de la séquence d'un tel acide nucléique. La partie spécifique est préférentiellement caractéristique d'un variant tel que décrit ci-avant, notamment une partie contenant une altération associée au cancer de la prostate. Elle comprend typiquement de 20 à 1000 nucléotides, de préférence de 50 à 800, et est généralement simple-brin. Un exemple particulier de sonde est représenté par un oligonucléotide spécifique et complémentaire d'une région au moins d'un acide nucléique tel que défini ciavant. L'oligonucléotide est typiquement simple-brin, et comporte généralement de 10 à 100 bases. Les oligonucléotides et/ou les sondes nucléiques selon l'invention peuvent être marquées, par exemple au moyen de marqueurs radioactifs, enzymatiques, fluorescents, luminescents, etc.

Un autre objet de l'invention concerne une amorce nucléique, permettant l'amplification (sélective) d'un acide nucléique tel que défini ci-avant ou d'une

partie (spécifique) d'un tel acide nucléique. La partie amplifiée comporte préférentiellement une altération caractéristique d'un des variants décrits ciavant, notamment d'une altération associée au cancer de la prostate. Une amorce selon l'invention est typiquement simple-brin, et avantageusement composée de 3 à 50 bases, de préférence de 3 à 40 et encore plus préférentiellement de 3 à 35 bases. Une amorce particulière est complémentaire d'une région au moins du gène PSA ou KLK-2, ou de l'ARN correspondant.

Un mode de réalisation préféré réside dans une amorce constituée d'un acide nucléique simple-brin comprenant de 3 à 50 nucléotides complémentaires d'une partie au moins de l'une des séquences SEQ ID NOs : 1 à 31 ou de leur brin complémentaire. Une telle amorce est typiquement choisie parmi les séquences SEQ ID NOs: 103 à 131.

L'invention concerne également un couple d'amorces comprenant une séquence sens et une séquence inverse, caractérisé en ce que les amorces de ladite paire s'hybrident avec une région d'un acide nucléique tel que défini ci-avant et permettent l'amplification d'au moins une portion spécifique de cet acide nucléique.

Des couples d'amorces particuliers selon l'invention sont fournis dans le Tableau 1.

Un autre objet de la présente demande concerne tout vecteur comprenant un acide nucléique tel que défini ci-avant. Il peut s'agir de plasmides, cosmides, épisomes, chromosomes artificiels, virus, phages, etc. On peut citer divers plasmides commerciaux tels que pUC, pcDNA, pBR, etc. Parmi les vecteurs viraux, on peut citer les rétrovirus, adénovirus, AAV, herpès virus, etc.

Un autre objet de l'invention concerne les cellules recombinantes comprenant un acide nucléique ou un vecteur tels que définis ci-avant. Les cellules peuvent être procaryotes ou eucaryotes. Parmi les cellules procaryotes on peut citer

notamment les bactéries telles que E. coli. Parmi les cellules eucaryotes, on peut mentionner les cellules de levure ou les cellules de mammifères, d'insectes ou de plantes. Il peut s'agir de cultures primaires ou de lignées. On peut citer les cellules COS, CHO, 3T3, HeLa, etc.

Un autre objet de l'invention concerne un (produit comprenant un) support sur lequel un ou plusieurs acides nucléiques tels que définis ci-avant sont immobilisés. Le support peut être solide, plan ou non, régulier ou non, comme par exemple du nylon, verre, plastique, etc., ou tout autre matériau compatible.

Les acides nucléique sont préférentiellement immobilisés par une extrémité, dans des conditions laissant la molécule accessible pour une réaction d'hybridation.

Les acides nucléiques peuvent être arrangés de manière précise sur le support, et déposés en plusieurs exemplaires.

Un autre objet de l'invention concerne un (produit comprenant un) support sur lequel une ou plusieurs cellules recombinantes telles que définies ci-avant sont immobilisées ou cultivées. Le support peut être solide, plan ou non, régulier ou non, comme par exemple du nylon, verre, plastique, etc., ou tout autre matériau compatible. Les cellules sont par exemple réparties dans des puits d'une microplaque ou immobilisées dans un gel ou sur un support adapté.

L'invention concerne également les peptides et séquences protéiques codés par tout ou partie des isoformes KLK2-EHTa à KLK2-EHTI et PSA-EHTa à PSAEHTu, notamment celles décrites parmi les séquences SEQ ID NOs : 32 à 102, ainsi que leurs utilisations pour la mise en #uvre d'une méthode de diagnostic, de détection ou de suivi de cancers, notamment du cancer de la prostate et plus particulièrement de la forme bénigne de ce dernier, BPH.

Un objet particulier de la présente demande concerne un polypeptide comprenant tout ou une partie spécifique d'une séquence choisie parmi SEQ ID NOs : 32 à 102. Des polypeptides particuliers sont composés ou comprennent une séquence ou une partie de séquence créée par l'altération du gène ou du messager

correspondant. Au sens de l'invention, le terme partie désigne préférentiellement au moins 5 résidus contigus, de préférence au moins 8, plus préférentiellement au moins 10, encore plus préférentiellement au moins 15.

Un autre objet de l'invention concerne un (produit comprenant un) support sur lequel un ou plusieurs polypeptides tels que définis ci-avant sont immobilisés. Le support peut être solide, plan ou non, régulier ou non, comme par exemple du nylon, verre, plastique, etc., ou tout autre matériau compatible. Les polypeptides sont préférentiellement immobilisés par une extrémité, dans des conditions laissant la molécule accessible pour une réaction d'interaction avec un ligand spécifique, tel qu'un anticorps. Les polypeptides peuvent être arrangés de manière précise sur le support, et déposés en plusieurs exemplaires.

Des techniques d'immobilisation de matériels (tels que acides nucléiques, polypeptides, anticorps, etc. ) sur des supports ont été décrites dans la littérature, et notamment dans les demandes ou brevets n EP619 321, W091/08307, US4,925,785 et GB2,197,720.

Ligands spécifiques L'invention concerne par ailleurs des ligands spécifiques, de préférence peptidiques, en particulier des anticorps (polyclonaux, monoclonaux) et leurs fragments, spécifiques des régions peptidiques caractéristiques des protéines codées par KLK2-EHTa-1 et de PSA-EHTa-u (codées par les domaines introniques retenus ou par les jonctions spécifiquement créées) et leurs utilisations pour la détection, le diagnostique ou le suivi de cancers et notamment du cancer de la prostate. En particulier, il pourra s'agir de diagnostiquer la forme BPH et de la différencier du carcinome de la prostate.

A cet égard, un autre objet de l'invention concerne tout anticorps spécifique d'un polypeptide tel que défini ci-dessus, c'est-à-dire capable de se lier, de préférence

de manière sélective, à un tel polypeptide. L'anticorps peut être polyclonal ou monoclonal. Il peut également s'agir de fragments et dérivés d'anticorps présentant substantiellement la même spécificité antigénique, en particulier des fragments d'anticorps (e. g., Fab, Fab'2, CDRs), d'anticorps humanisés, polyfonctionnels, monocaténaires (ScFv), etc. Les anticorps peuvent être produits à l'aide de méthodes conventionnelles, comprenant l'immunisation d'un animal et la récupération de son sérum (polyclonal) ou de cellules spléniques (de manière à produire des hybridomes par fusion avec des lignées cellulaires appropriées).

Des méthodes de production d'anticorps polyclonaux à partir d'espèces variées sont décrites dans l'art antérieur. Typiquement, l'antigène est combiné avec un adjuvant (e. g., Freund's adjuvant) et administré à un animal, typiquement par injection sous-cutanée. Des injections répétées peuvent être réalisées. Les échantillons sanguins sont collectés et l'immunoglobuline ou le sérum sont séparés. Les méthodes classiques de production d'anticorps monoclonaux comprennent l'immunisation d'un animal avec un antigène, suivie de la récupération des cellules spléniques qui sont ensuite fusionnées avec des cellules immortalisées, telles que des cellules de myélome. Les hybridomes résultant produisent des anticorps monoclonaux et peuvent être sélectionnés par dilutions limites de manière à isoler les clones individuels. Les fragments Fab ou F (ab')2 peuvent être produits par digestion à l'aide d'une protéase selon les techniques conventionnelles.

L'invention concerne également une méthode de production d'anticorps, comprenant l'injection d'un polypeptide tel que défini ci-avant ou d'un fragment immunogène de ce dernier à un animal non humain et la récupération des anticorps ou des cellules productrices d'anticorps. Les anticorps préférés sont des anticorps spécifiques des isoformes de PSA et KLK-2 décrites dans la présente demande, et essentiellement non-spécifique des formes sauvages.

L'invention concerne des hybridomes produisant les anticorps monoclonaux décrits ci-dessus et leur utilisation pour produire lesdits anticorps.

Les anticorps peuvent être couplés à des fragments hétérologues telles que des toxines, des marqueurs, des médicaments ou tout autre agent thérapeutique, de façon covalente ou non, soit directement, soit par l'intermédiaire d'agents de couplage. Les marqueurs peuvent être choisis parmi les radio-marqueurs, des enzymes, des agents fluorescents, des particules magnétiques, etc.

Les anticorps de l'invention peuvent être utilisés comme agents de criblage ou pour détecter ou quantifier la présence ou la quantité d'isoformes de PSA ou KLK-2 dans des échantillons collectés à partir d'un sujet, typiquement, un fluide biologique provenant d'un mammifère, par exemple d'un être humain.

Un autre objet de l'invention concerne un (produit comprenant un) support sur lequel un ou plusieurs anticorps (ou fragments ou dérivés) tels que définis ciavant sont immobilisés. Le support peut être solide, plan ou non, régulier ou non, comme par exemple du nylon, verre, plastique, etc., ou tout autre matériau compatible. Les anticorps sont préférentiellement immobilisés par une extrémité, dans des conditions laissant la molécule accessible pour une réaction d'interaction avec un antigène spécifique. Les anticorps peuvent être arrangés de manière précise sur le support, et déposés en plusieurs exemplaires.

Méthodes de détection/diagnostic La présente demande décrit également de nouveaux procédés de détection d'une pathologie ou d'une prédisposition à une pathologie chez un sujet, comprenant la détermination de la présence, dans un échantillon dudit sujet, d'un acide nucléique, ou d'une altération génétique ou d'une protéine ou polypeptide tels que définis ci-avant.

La détermination peut être réalisée par différentes techniques, telles que séquençage, hybridation et/ou amplification sélectives. Des méthodes utilisables

pour déterminer la présence de protéines (ou domaines protéiques) sont basées par exemple sur des réactions immuno-enzymatiques, telles que ELISA, RIA, EIA, etc. Des techniques utilisables pour déterminer la présence de gènes ou d'ARN altérés sont par exemple la PCR, la RT-PCR, la réaction de ligation en chaîne (LCR), la technique de PCE ou TMA ( Transcriptional Mediated Amplification ), la migration sur gel, l'électrophorèse, notamment la DGGE ( denaturing gel gradient electrophoresis ), etc.

Dans le cas où une étape d'amplification est réalisée, celle-ci met préférentiellement en oeuvre une amorce ou un couple d'amorces tel que défini ci-avant.

Un objet particulier de l'invention concerne l'utilisation d'acides nucléiques complémentaires et spécifiques de fragments des gènes ou des messagers de KLK2-EHTa-1 et de PSA-EHTa-u (e. g., domaines introniques retenus, jonctions spécifiquement crées, mutations particulières, etc. ) pour la détection de cancers, notamment du cancer de la prostate, et plus particulièrement de sa forme bénigne, BPH. Cette détection pourra en particulier s'effectuer grâce à des puces à ADN ou à la mise en oeuvre d'une PCR à partir de fluides biologiques tels que du sang (le sérum notamment), des urines, du fluide séminal, etc.

L'invention réside également dans la mise au point et l'utilisation de tests immunologiques contenant un ou plusieurs anticorps tels que décrits ci-dessus ou fragments de ces derniers. Ces tests permettent de détecter et/ou mesurer individuellement un variant à l'aide d'un anticorps spécifique, plusieurs variants, en parallèle, grâce aux anticorps spécifiques appropriés, ou un ou plusieurs rapports entre les isoformes telles que décrites ci-dessus ou entre lesdites isoformes et d'autres formes décrites pour kallikreine-2 et PSA.

Une méthode particulière comprend la mise en contact d'un échantillon provenant d'un sujet avec une sonde telle que définie ci-avant, et la mise en évidence d'une hybridation.

Une autre méthode particulière comprend la mise en contact d'un échantillon provenant d'un sujet avec une amorce ou une paire d'amorces telles que définies ci-avant, et la mise en évidence d'un produit d'amplification.

Une autre méthode particulière comprend la mise en contact d'un échantillon provenant d'un sujet avec un anticorps tel que défini ci-avant, et la mise en évidence d'un complexe antigène-anticorps.

Typiquement, plusieurs tests sont réalisés en parallèle, à partir de plusieurs échantillons et/ou en utilisant plusieurs sondes, amorces et/ou anticorps. Ainsi, dans un mode particulier, le procédé de l'invention comprend la détermination, en parallèle, de la présence de plusieurs variants ou altérations génétiques tels que décrits ci-avant dans un échantillon d'un patient.

Un autre objet de l'invention réside dans un kit utilisable pour la mise en #uvre d'un procédé tel que défini ci-avant comprenant i. un couple d'amorces ou une sonde ou un anticorps tels que définis ci-avant, et ii. les réactifs nécessaires à l'amplification ou à une réaction d'hybridation ou immunologique.

L'invention réside également dans la mise au point d'une méthode permettant de détecter et/ou de mesurer des partenaires spécifiques d'un ou de plusieurs de ces variants par ajout de l'un ou de plusieurs de ces variants ou de leurs fragments dans des fluides biologiques à tester, tels que du sang (sérum notamment), des urines ou du fluide séminal.

Criblage de composés actifs Les variants spécifiques de KLK2 et de KLK3 selon l'invention représentent des cibles thérapeutiques particulièrement intéressantes pour le traitement des cancers et notamment du cancer de la prostate.

A cet égard, un objet particulier de l'invention réside dans une méthode de sélection, d'identification, de caractérisation, d'optimisation ou de production de composés actifs, comprenant la mise en contact in vitro ou ex vivo d'un composé test avec un polypeptide tel que défini ci-avant ou une cellule exprimant un polypeptide tel que défini ci-avant, et la sélection ou l'identification de composés modulant l'expression ou l'activité dudit polypeptide.

Le procédé peut être mis en #uvre pour sélectionner ou identifier un activateur ou un inhibiteur de l'expression ou de l'activité de l'antigène spécifique de la PSA ou de KLK-2.

Préférentiellement, les méthodes de l'invention comprennent la sélection des composés se liant audit polypeptide, ou au gène ou à l'ARN correspondant, ou modulant l'expression du dit polypeptide. La liaison au polypeptide au gène ou à l'ARN correspondant peut être mesurée par différentes techniques, telles que le déplacement d'un ligand marqué, la migration sur gel, l'électrophorèse, etc. La modulation de l'expression peut être déterminée par dosage des ARN ou des protéines, ou au moyen d'un système rapporteur. Les cellules utilisées peuvent être toute cellule compatible, notamment des cellules eucaryotes ou procaryotes telles que mentionnées plus haut.

Dans un mode de réalisation particulier, le composé est un acide nucléique antisens, capable d'inhiber l'expression des variants décrits. L'acide nucléique antisens peut comprendre tout ou partie de séquences spécifiques des variants décrits. L'anti-sens peut notamment comprendre une région complémentaire de la forme d'épissage identifiée, et inhiber (ou réduire) sa traduction en protéine.

Selon un autre mode de réalisation, le composé est un composé chimique, d'origine naturelle ou synthétique, notamment une molécule organique ou inorganique, d'origine végétale, bactérienne, virale, animale, eucaryote, synthétique ou semi-synthétique, capable de moduler l'expression ou l'activité de l'un ou de plusieurs des variants décrits ci-dessus.

On préfère des composés spécifiques, c'est-à-dire capables de moduler l'expression ou l'activité des variants, sans affecter significativement l'expression ou l'activité des formes sauvages.

Les composés ainsi identifiés sont utilisables pour la préparation d'une composition destinée au traitement du cancer de la prostate.

A cet égard, un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé capable de moduler, i.e. de stimuler, d'inhiber ou de réduire, l'expression d'un ou de plusieurs variants tels que décrits ci-dessus, pour la préparation d'une composition destinée au traitement des cancers et notamment du cancer de la prostate.

Dans le contexte de l'invention, le terme traitement désigne le traitement préventif, curatif ou palliatif, ainsi que la prise en charge des patients (réduction de la souffrance, amélioration de la durée de vie, ralentissement de la progression de la maladie), etc. Le traitement peut en outre être réalisé en combinaison avec d'autres agents actifs.

Un autre objet de l'invention concernent des méthodes de sélection, d'identification, ou de caractérisation de composés actifs utilisables dans le cadre de la préparation de compositions destinées au traitement de pathologies cancéreuses, comprenant la mise en contact d'un ou de plusieurs composés tests avec des extraits cellulaires exprimant les protéines décrites dans la présente invention, ou avec lesdites protéines purifiées.

Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de ligands cytotoxiques spécifiques d'un ou de plusieurs variants tels que décrits ci-dessus localisés à la surface des cellules cancéreuses et en particulier des cellules cancéreuses prostatiques.

D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.

EXEMPLES L'analyse qualitative différentielle a été effectuée à partir d'ARN poly adénylés (poly A+) extraits d'échantillons tumoraux et normaux prostatiques proprement caractérisés par un anatomo-pathologiste.

Les ARN poly A+ sont préparés selon des techniques connues de l'homme de métier. Il peut s'agir en particulier d'un traitement au moyen d'agents chaotropiques tels que le thiocyanate de guanidium suivi d'une extraction des ARN totaux au moyen de solvants (phénol, chloroforme par exemple). De telles méthodes sont bien connues de l'homme du métier (voir Maniatis et al., Chomczynsli et al., Anal. Biochem. 162 (1987) 156), et peuvent être aisément mises en #uvre en utilisant des kits disponibles dans le commerce. A partir de ces ARN totaux, les ARN poly A+ sont préparés selon des méthodes classiques connues de l'homme de métier et décrites dans les kits commerciaux.

Ces ARN poly A+ servent de matrice à des réactions de transcription inverse à l'aide de transcriptases inverses. Des transcriptases inverses dépourvues d'activité RNase H sont avantageusement utilisées. Elles permettent d'obtenir des brins d'ADN complémentaire de tailles supérieures à ceux obtenus à l'aide de transcriptases inverses classiques. De telles préparations de transcriptases inverses sans activité RNase H sont disponibles commercialement.

Conformément à la technique DATAS, pour chaque point de la cinétique des hybridations d'ARNm (C) avec des ADNc (T) et des hybridations réciproques d'ARNm (T) avec des ADNc (C) sont réalisées.

Ces hétéroduplexes ARNm/ADNc sont ensuite purifiés selon les protocoles prévus par la technique DATAS.

Les séquences d'ARN non appariées avec un ADN complémentaire sont libérées de ces hétéroduplex sous l'action de la RNase H, cette enzyme dégradant les séquences d'ARN appariées. Ces séquences non appariées représentent les différences qualitatives qui existent entre des ARN par ailleurs homologues entre eux. Ces différences qualitatives peuvent être localisées n'importe où sur la séquence des ARN, aussi bien en 5' ou en 3' qu'à l'intérieur de la séquence et notamment à l'intérieur de la séquence codante. Selon leur localisation, ces séquences peuvent être non seulement des modifications d'épissage mais également des conséquences de translocations ou de délétions.

Les séquences d'ARN représentant les différences qualitatives sont ensuite clonées selon les techniques connues de l'homme de métier et notamment celles décrites dans le brevet relatif à la technologie DATAS.

Ces séquences sont regroupées au sein de banques de ADNc qui constituent des banques qualitatives différentielles. Une de ces banques contient les exons et les introns spécifiques de la situation saine ; les autres banques contiennent les événements d'épissage caractéristiques des conditions pathologiques.

Les fragments issus des gènes humains de KLK2 et de KLK3 proviennent de ces banques.

Quatre échantillons tumoraux ont été mélangés pour former un pool tumoral.

Ce pool d'ARN a été traité à la Dnase à l'aide du kit DNA free de la société Ambion (n cat. 1906).

Cet ARN est ensuite reverse-transcrit à l'aide de la transcriptase inverse du kit High capacity cDNA Archive de la société Aplied Biosystems (n cat.

4322171).

L'ADNc ainsi produit sert de matrice pour des réactions de PCR afin d'amplifier spécifiquement différentes régions d'ARNs messagers dérivés de la kallikreine-2 et de la kallikreine-3 humaines selon le protocole suivant :

<tb>
<tb> Tampon <SEP> Invitrogen <SEP> 10X <SEP> : <SEP> 2 l
<tb> DNTPs <SEP> 2mM: <SEP> 2pL
<tb> MgCI2 <SEP> 50mM: <SEP> 0.6pL
<tb> Primer <SEP> amont <SEP> 10 M: <SEP> 0.4pL
<tb> Primer <SEP> aval <SEP> 10 M: <SEP> 0.4pL
<tb> Taq <SEP> polymerase <SEP> : <SEP> 0.2pL
<tb> H20: <SEP> 13.4pL
<tb> cDNA <SEP> 1 L
<tb>
Volume final : 19 L Selon le programme de cycles suivant :

<tb>
<tb> 94 C <SEP> 3min
<tb> 94 C <SEP> 30sec
<tb> 55 C <SEP> 1 <SEP> min <SEP> ) <SEP> 35 <SEP> cycles <SEP>
<tb> 72 C <SEP> 3min
<tb> 72 C <SEP> 6min
<tb>
Les oligonucléotides utilisés comme amorces de PCR sont les suivants : Pour KLK2 :

<tb>
<tb> 163 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> GGTTCTCTCCATCGCCTTG <SEP> 3' <SEP> - <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> :
<tb> 103)166 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> GCTCTAGCACACATGTCATTGGA <SEP> 3'- <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 104)
<tb> 167: <SEP> 5' <SEP> CAGTCATGGATGGGCACACT <SEP> 3'- <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 105)
<tb> 169 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> GCCAGATGGTGTAGCTGGG <SEP> 3'- <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 106)
<tb> 170 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> CATGATGTGATACCTTGAAGCACC <SEP> 3'- <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> :
<tb> 107)172 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> GCTTTGATGCTTCAGAAGGC <SEP> 3'- <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 108) <SEP>
<tb> 173 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> CCTGCCAAGATCACAGATGTTG <SEP> 3'- <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> :
<tb> 109)174 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> TGGTTAGCTTTCAGATTGCAGC <SEP> 3'- <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> :
<tb> 110)213 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> TTTAGGGAATCAGAGAACTGGCC <SEP> 3'- <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 111)
<tb> 214 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> AGCTCAATGTGTGTGCATGTGAG <SEP> 3'- <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> :
<tb> 112)215 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> AAAGGATGCGGGAAGTCAGA <SEP> 3'- <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 113)
<tb>

<tb>
<tb> 218 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> GGAGTGACGATGAGGATGACC <SEP> 3'- <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 114)
<tb> 221 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> CCACTACAGAGCCCTCACTCCA <SEP> 3'- <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 115)
<tb>
Pour PSA :

<tb>
<tb> 175 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> CGTGACGTGGATTGGTGAGA <SEP> 3'- <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 116)
<tb> 178 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> GTGAACTTGCGCACACACG <SEP> 3'- <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 117)
<tb> 179 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> TGGCAGGTGCTTGTGGC <SEP> 3'- <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> Il <SEP> 8) <SEP>
<tb> 181 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> GTCCAGCCCACAACAGTG <SEP> 3'- <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 119)
<tb> 182 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> CCTTGAAGCACACCATTACAGAC <SEP> 3'- <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> :
<tb> 120)200 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> TCCCAGAGACCTTGATGCTT <SEP> 3'- <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 121)
<tb> 201 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> GTTTGCAGGTTGGTGGCTG <SEP> 3'- <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> :
<tb> 122)202 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> GTCCCGGTTGTCTTCCTCAC <SEP> 3'- <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> :
<tb> 123)203 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> GACCCATTTGTTGTCTCAGGC <SEP> 3'- <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> :
<tb> 124)204 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> CTGAACACACGCACGGGAT <SEP> 3'- <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 125)
<tb> 205 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> CCAAAGCCCTTCCTTTTCTCA <SEP> 3'- <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> :
<tb> 126)207 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> CCTCAGAGTGGCTCAGCTGTAG <SEP> 3'- <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 127)
<tb> 208 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> TGACTCCCTCAAGGCAATAGGTTA <SEP> 3'- <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 128 <SEP>
<tb> 209 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> TGTTTGCTCACTCCCACCTTCT <SEP> 3'- <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> :
<tb> 129)210 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> TGCTGGACAGAAGCAGGACA <SEP> 3'- <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> :
<tb> 130)211 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> ATCATCACTCCCTCCACATCC <SEP> 3'- <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 131)
<tb>
Les produits amplifiés sont ensuite clonés dans le système Topo de la société Invitrogen (n cat. K4600) selon le protocole fourni. Les produits de ligation sont transformés dans des cellules Top 10 compétentes. Les colonies sont identifiées sur milieu agar/LB supplémenté d'ampicilline.

Les ADNc présents dans ces colonies sont amplifiés de façon individuelle par amplification PCR à l'aide d'amorces Sp6 et T7 selon le protocole suivant :

<tb>
<tb> Primer <SEP> T7 <SEP> 10 M <SEP> : <SEP> 2 L
<tb> Primer <SEP> Sp6 <SEP> 10 M <SEP> 2 L
<tb> MgCI2 <SEP> 50mM: <SEP> 1.2pL
<tb> DNTPs <SEP> 2mM: <SEP> 4 L
<tb>

<tb>
<tb> Tampon <SEP> 10x <SEP> 4\iL
<tb> Taq <SEP> polymerase: <SEP> 0.2pL
<tb> H20: <SEP> 25.6pL
<tb> Colonie: <SEP> 1)-iL
<tb> vol <SEP> final <SEP> 40 L
<tb>
selon le programme de cycles suivant :

<tb>
<tb> 94 C <SEP> 5min
<tb> 94 C <SEP> 30sec)
<tb> 55 C <SEP> 30sec) <SEP> 30cycles
<tb> 72 C <SEP> 1 <SEP> min) <SEP>
<tb> 72 C <SEP> 5min
<tb>
Les produits d'amplification sont ensuite purifiés par P100 pour être séquences à l'aide du kit Big Dye Terminator de la société Applied Biosystems selon le protocole fourni par ce fournisseur. Les réactions de séquence sont analysées à l'aide d'un séquenceur 3100 d'Applied Biosystems. Le tableau suivant représente les différents ADNc ainsi que les couples d'oligonucléotides amorces utilisés pour leur obtention et permettant leur amplification dans un échantillon.

Tableau 1

<tb>
<tb> Isoformes <SEP> Couple <SEP> d'oligonucléotides
<tb> KLK2-EHTa <SEP> 163/172
<tb> KLK2-EHTb <SEP> 163/213
<tb> KLK2-EHTc <SEP> 163/213
<tb> KLK2-EHTd <SEP> 163/213
<tb> KLK2-EHTe <SEP> 167/172
<tb> KLK2-EHTf <SEP> 167/172
<tb> KLK2-EHTg <SEP> 169/170
<tb> KLK2-EHTh <SEP> 173/166
<tb> KLK2-EHTi <SEP> 173/174
<tb>

<tb>
<tb> KLK2-EHTj <SEP> 214/215
<tb> KLK2-EHTk <SEP> 218/170
<tb> KLK2-EHTI <SEP> 221/172
<tb> PSA-EHTa <SEP> 175/203
<tb> PSA-EHTc <SEP> 179/178
<tb> PSA-EHTd <SEP> 179/178
<tb> PSA-EHTe <SEP> 179/178
<tb> PSA-EHTf <SEP> 179/205
<tb> PSA-EHTg <SEP> 179/205
<tb> PSA-EHTh <SEP> 181/182
<tb> PSA-EHTi <SEP> 181/182
<tb> PSA-EHTj <SEP> 181/182
<tb> PSA-EHTk <SEP> 181/182
<tb> PSA-EHTI <SEP> 181/209
<tb> PSA-EHTm <SEP> 200/201
<tb> PSA-EHTn <SEP> 200/201
<tb> PSA-EHTo <SEP> 202/203
<tb> PSA-EHTp <SEP> 202/203
<tb> PSA-EHTq <SEP> 204/207
<tb> PSA-EHTr <SEP> 204/207
<tb> PSA-EHTs <SEP> 208/211
<tb> PSA-EHTt <SEP> 208/211
<tb> PSA-EHTu <SEP> 210/182
<tb>
La séquence complète des variants est fournie dans la liste de séquence jointe.

REFERENCES David et.al, (2002) J. Biol. Chem Riegman et al (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 155,181-188.

Riegman et.al (1991) Mol. Cell. Endicronol. 76,181-190.

Liu étal (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 264,833-839 Heuze et.al (1999) Cancer Res. 59,2820-2824.

Tanaka et.al (2000) Cancer Res. 60,56-59.

Claims

REVENDICATIONS 1.Acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend une séquence choisie parmi : a) les séquences SEQ ID NOs : 1 à 31, b) un variant des séquences SEQ ID NOs : 1 à 31 résultant de la dégénérescence du code génétique, c) le brin complémentaire des séquences SEQ ID NOs : 1 à 31, et d) un fragment spécifique des séquences a) à c).
2. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un ADN, choisi de préférence parmi les ADNc et les ADNg, ou d'un ARN.
3. Polypeptide codé par un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications précédentes.
4. Polypeptide comprenant tout ou une partie spécifique d'une séquence choisie parmi SEQ ID Nos : 32 à 102.
5. Protéine choisie parmi les variants KLK2-EHTa à KLK2-EHTI et PSA-EHTa à PSA-EHTu de séquence SEQ ID Nos : 32 à 102, respectivement.
6. Sonde nucléique caractérisée en ce qu'elle permet la détection par hybridation sélective d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 2.
7. Sonde selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 2.
8. Sonde selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce qu'elle comprend de 20 à 1000 nucléotides, de préférence de 50 à 800.

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9. Amorce, caractérisée en ce qu'elle est permet l'amplification d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 2 ou d'une partie de ceux-ci portant une altération associée à des cancers et notamment au cancer de la prostate.
10. Amorce selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle est composée de 3 à 50 bases, de préférence de 3 à 40 et encore plus préférentiellement de 3 à 35 bases.
11. Amorce selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisée en ce qu'elle est complémentaire d'une région au moins du gène codant pour l'antigène spécifique de PSA ou de celui codant pour KLK-2 portant une mutation impliquée dans un cancer.
12. Amorce selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'un acide nucléique simple-brin comprenant de 3 à 50 nucléotides complémentaires d'une partie au moins de l'une des séquences SEQ ID NO :1 à 31 ou de leur brin complémentaire.
13. Amorce caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 103 à 131.
14. Couple d'amorces comprenant une séquence sens et une séquence inverse, caractérisé en ce que les amorces de ladite paire s'hybrident avec une région d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 2 et permettent l'amplification d'au moins une portion spécifique de cet acide nucléique.
15. Anticorps, caractérisé en ce qu'il est spécifique d'une protéine ou d'un polypeptide selon l'une des revendications 3 à 5.
16. Anticorps selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polyclonal, d'un monoclonal ou d'un dérivé de ceux-ci.

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17. Procédé de détection d'une pathologie ou d'une prédisposition à une pathologie chez un sujet, comprenant la détermination de la présence, dans un échantillon dudit sujet, d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 2 ou d'une protéine ou polypeptide selon les revendications 3 à 5.
18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que la détermination est réalisée par séquençage, hybridation et/ou amplification sélectives.
19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'amplification est réalisée en utilisant un couple d'amorces selon la revendication 14.
20. Kit utilisable pour la mise en #uvre d'un procédé tel que défini dans les revendications 17 à 19 comprenant i. un couple d'amorces selon la revendication 14 ou une sonde selon l'une des revendications 6 à 8 ou un anticorps selon l'une des revendications 15 et 16, et ii. les réactifs nécessaires à l'amplification ou à une réaction d'hybridation ou immunologique.
21. Méthode de sélection ou d'identification de composés actifs, comprenant la mise en contact in vitro ou ex vivo d'un composé test avec une cellule exprimant un polypeptide selon l'une des revendications 3 et 4, et la sélection ou l'identification de composés modulant l'expression ou l'activité dudit polypeptide.
22. Méthode selon la revendication 21, caractérisée en ce qu'elle comprend la sélection des composés se liant audit polypeptide.
23. Méthode selon la revendication 21, caractérisée en ce qu'elle comprend la sélection des composés modulant l'expression du dit polypeptide.
24. Vecteur comprenant un acide nucléique selon la revendication 1 ou 2.

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25. Cellule recombinante comprenant un vecteur selon la revendication 24.
26. Produit comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 et 2, un vecteur selon la revendication 24, un polypeptide selon l'une des revendications 3 et 4, ou un anticorps selon l'une des revendications 15 et 16, immobilisé sur un support.