FR2805279A1 - Sequences retrovirales associees a des affections cutanees - Google Patents

Abstract

Cette invention concerne la mise en évidence de séquences nucléotidiques rétrovirales dénommées PsoRV1 et PsoRV2, associées à des affections cutanées, notamment au psoriasis, et à leurs applications diagnostiques et thérapeutiques.

Description

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L'invention a trait à la mise en évidence de séquences nucléotidiques rétrovirales associées à des affections cutanées, telles que le psoriasis.

Le psoriasis est une pathologie fréquente (2 à 3 % de la population caucasienne), cutanée, chronique, d'origine inconnue et caractérisée par une prédisposition génétique, une hyperprolifération épidermique associée à des anomalies de la différenciation des kératinocytes, et des anomalies de l'immunité locale ou systémique proches de celles observées dans les pathologies auto-immunes. Récemment, il a été démontré que l'hyperprolifération kératinocytaire était due à l'activation des lymphocytes psoriasiques. Mais, l'origine de cette activation reste inconnue. Une théorie antérieure suggérait que cette activation soit générée par la présence de rétrovirus (Guilhou et al, 1978 et Guilhou, 1981). La présence de particules ressemblant à des rétrovirus a par ailleurs été observée dans les fluides biologiques de patients atteints de psoriasis (Guilhou et al, 1982 ; Iversen, 1983 et Dalen et al, 1983), sans qu'une activité transcriptase inverse ne puisse être démontrée.

Les auteurs de la présente invention sont maintenant parvenus à caractériser des séquences nucléotidiques spécifiquement exprimées dans les lésions de patients atteints de psoriasis. Ces séquences correspondent à une séquence partielle de deux rétrovirus humains (à savoir un virus étant hébergé par un humain) codant, d'une part, pour la protéase et la partie NH2 terminale de l'ADN polymérase ARN-dépendante dénommée PsoRVI et, d'autre part, pour l'enveloppe dénommée PsoRV2. Ces rétrovirus sont des rétrovirus endogènes puisque leur présence dans l'ADN génomique a pu être détectée non seulement chez tous les patients atteints de psoriasis mais aussi chez les sujets sains.

Les auteurs de la présente invention ont en outre montré que des séquences nucléotidiques rétrovirales homologues, en particulier celles concernant le gène de la polymérase de PsoRVI, étaient également présentes dans d'autres maladies de la peau.

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Le terme "PsoRV" utilisé dans la présente description désigne tout agent pathogène, associé aux pathologies citées ci-dessus, notamment une espèce virale, les souches atténuées de ladite espèce virale, ou les particules défectives interférentes ou contenant des génomes co-encapsidés ou encore des génomes recombinés avec une partie du génome PsoRV, dérivées de cette espèce. Il est connu que les virus et plus particulièrement les virus contenant de l'ARN ont une variabilité, consécutive notamment à des taux élevés de mutation spontanée, dont on tiendra compte dans le cadre de la présente invention.

L'invention porte donc sur les séquences nucléotidiques des rétrovirus PsoRVI et PsoRV2, et les polypeptides codés par ces séquences, étant entendu que font également partie de l'invention les équivalents de ces séquences.

Deux séquences nucléotidiques ou peptidiques sont dites équivalentes ou dérivées l'une par rapport à l'autre, ou par rapport à une séquence de référence, si fonctionnellement les biopolymères correspondants peuvent jouer sensiblement le même rôle, sans être identiques, vis à vis de l'application ou utilisation considérée, ou dans la technique dans laquelle elles interviennent. Sont notamment équivalentes deux séquences obtenues du fait de la variabilité naturelle, notamment mutation spontanée de l'espèce à partir de laquelle elles ont été identifiées ou induites, ainsi que deux séquences homologues, l'homologie étant définie ci-après.

Etant donné qu'un virus possédant une activité enzymatique transcriptase inverse peut être génétiquement caractérisé aussi bien sous forme d'ARN que d'ADN, il sera fait mention aussi bien de l'ADN que de l'ARN viral pour caractériser les séquences relatives à un virus possédant une telle activité transcriptase inverse, dit PsoRV selon la présente description.

Un listage de séquences est annexé à la présente description.

La séquence SEQ ID n 1 représente la séquence nucléotidique de PsoRV1.

La séquence SEQ ID n 2 représente la séquence nucléotidique de PsoRV2.

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Les séquences SEQ ID n 1 et n 2 étant des séquences rétrovirales, elles peuvent être lues dans les six phases de lecture possibles et peuvent en outre être chevauchantes les unes par rapport aux autres
La séquence SEQ ID n 3 représente la séquence peptidique de la protéase de PsoRV1 correspondant au cadre de lecture 1 de la séquence nucléotidique SEQ ID n 1 (paires de bases n 1 à 291 ).

La séquence SEQ ID n 4 représente la séquence peptidique de la polymérase de PsoRV1 correspondant au cadre de lecture 3 de la séquence nucléotidique SEQ ID n 1 (paires de bases n 207 à 950).

La séquence SEQ ID n 5 représente la séquence peptidique de l'enveloppe de PsoRV2 correspondant au cadre de lecture 3 de la séquence SEQ ID n 2. (paires de bases n 3 à 260).

Les séquences SEQ ID n 6 à 14 sont des amorces oligonucléotidiques, telles que décrites dans les exemples ci-après.

L'invention a donc pour objet un acide nucléique isolé, dont la séquence est choisie parmi SEQ ID n 1, SEQ ID n 2, ou la séquence des fragments allant du nucléotide 1 au nucléotide 291 sur SEQ ID n 1, ou allant du nucléotide 207 au nucléotide 950 sur SEQ ID n 1, ou allant du nucléotide 3 au nucléotide 260 sur SEQ ID n 2, ou une séquence homologue, définie comme i) une séquence identique à au moins 80 % de la séquence SEQ ID n 1, SEQ ID n 2 ou de la séquence des fragments allant du nucléotide 1 au nucléotide 291 sur SEQ ID n 1, ou allant du nucléotide 207 au nucléotide 950 sur SEQ ID n 1, ou allant du nucléotide 3 au nucléotide 260 sur SEQ ID n 2, ii) une séquence hybridant avec la séquence SEQ ID n 1, SEQ ID n 2, ou la séquence des fragments allant du nucléotide 1 au nucléotide 291 sur SEQ ID n 1, ou allant du nucléotide 207 au nucléotide 950 sur SEQ ID n 1, ou allant du nucléotide 3 au nucléotide 260 sur SEQ ID n 2, ou leurs séquences complémentaires, dans des conditions stringentes d'hybridation.

De préférence, une séquence nucléotidique homologue selon l'invention est identique à au moins 85 % des séquences SEQ ID n 1 ou n 2

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ou de leurs fragments indiqués ci-dessus, de préférence encore au moins 90 %, ou au moins 95 %.

De manière préférentielle, une telle séquence nucléotidique homologue hybride spécifiquement aux séquences complémentaires des séquences SEQ ID n 1 ou n 2 ou de leurs fragments indiqués ci-dessus, dans des conditions stringentes. Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm).

Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, Tm est définie par la relation: Tm=81,5+0,41 (%G+C)+16,6Log(concentration en cations) - 0,63 (%formamide) -(600/nombre de bases) (Sambrook et al., 1989).

Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm= 4(G+C) + 2 (A+T).

Dans des conditions de stringence appropriées, auxquelles les séquences aspécifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation est approximativement de 5 à 30 C, de préférence de 5 à 10 C en dessous de Tm, et les tampons d'hybridation utilisés sont de préférence des solutions de force ionique élevée telle qu'une solution 6xSSC par exemple.

Les séquences nucléotidiques homologues d'intérêt incluent toute séquence nucléotidique qui diffère des séquences SEQ ID n 1 ou n 2 ou de leurs fragments indiqués ci-dessus par mutation, insertion, délétion ou substitution d'une ou plusieurs bases, ou par la dégénérescence du code génétique.

La présente invention a également pour objet un polypeptide isolé, comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID n 3 à SEQ ID n 5, ou une séquence homologue, définie comme i) une séquence identique à au moins 80% de la séquence SEQ #D n 3 à n 5 ; ou ii) une séquence codée par une séquence d'acide nucléique hybridant avec la séquence SEQ ID n 1 ou 2 ou de leurs fragments indiqués ci-dessus, ou sa séquence complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation.

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Plus généralement, par séquence d'acides aminés homologue , on entend toute séquence d'acides aminés qui diffère de la séquence SEQ ID n 3 à 5 par substitution, délétion et/ou insertion d'un acide aminé ou d'un nombre réduit d'acides aminés, notamment par substitution d'acides aminés naturels par des acides aminés non naturels ou pseudoacides aminés à des positions telles que ces modifications ne portent pas significativement atteinte aux propriétés antigéniques ou biologiques du polypeptide. Ces propriétés sont notamment des propriétés protéasiques pour les homologues de SEQ ID n 3, des propriétés de polymérase pour les homologues de SEQ ID n 4 et des propriétés de protéine de structure pour les homologues de SEQ ID n 5.

Lesdites substitutions sont de préférence des substitutions conservatives, c'est-à-dire des substitutions d'acides aminés de même classe, telles que des substitutions d'acides aminés aux chaînes latérales non chargées (tels que l'asparagine, la glutamine, la serine, la thréonine, et la tyrosine), d'acides aminés aux chaînes latérales basiques (tels que la lysine, l'arginine, et l'histidine), d'acides aminés aux chaînes latérales acides (tels que l'acide aspartique et l'acide glutamique) ; d'acides aminés aux chaînes latérales apolaires (tels que la glycine, l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la proline, la phénylalanine, la méthionine, le tryptophane, et la cystéine).

De préférence, une telle séquence d'acides aminés homologue est identique à au moins 85 % de la séquence SEQ ID n 3 à n 5, de préférence au moins 90 %, de préférence encore au moins 95%.

L'homologie est généralement déterminée en utilisant un logiciel d'analyse de séquence (par exemple, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Des séquences d'acides aminés similaires sont alignées pour obtenir le maximum de degré d'homologie (i.e. identité). A cette fin, il peut être nécessaire d'introduire de manière artificielle des espaces ( gaps ) dans la séquence. Une fois l'alignement optimal réalisé, le degré d'homologie (i.e. identité) est établi par enregistrement de toutes les positions pour lesquelles les acides aminés des deux séquences comparées sont identiques, par rapport au nombre total de positions.

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Le polypeptide de la présente invention peut être synthétisé par toutes les méthodes bien connues de l'homme du métier. Le polypeptide de l'invention peut par exemple être synthétisé par les techniques de la chimie de synthèse, telles que la synthèse de type Merrifield qui est avantageuse pour des raisons de pureté, de spécificité antigénique, d'absence de produits secondaires non désirés et pour sa facilité de production.

Des polypeptides recombinants peuvent également être produits par un procédé, dans lequel un vecteur contenant un acide nucléique comprenant la séquence SEQ ID n 1 ou 2 ou de leurs fragments indiqués cidessus, ou une séquence homologue est transféré dans une cellule hôte qui est mise en culture dans des conditions permettant l'expression du polypeptide correspondant.

Le polypeptide produit peut ensuite être récupéré et purifié.

Les procédés de purification utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant obtenu peut être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps mono- ou polyclonaux spécifiques, etc.

La séquence d'acide nucléique d'intérêt peut être insérée dans un vecteur de clonage ou un vecteur d'expression, dans lequel elle est liée de manière opérante à des éléments permettant la régulation de son expression, tels que notamment des promoteurs, activateurs et/ou terminateurs de transcription.

Les signaux contrôlant l'expression des séquences nucléotidiques (promoteurs, activateurs, séquences de terminaison...) sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un

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hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple l'électroporation ou la précipitation au phosphate de calcium.

Les vecteurs de clonage et/ou d'expression tels que décrits cidessus, contenant une des séquences nucléotidiques définies selon l'invention font également partie de la présente invention.

L'invention vise en outre les cellules hôtes transfectées, de manière transitoire ou stable, par ces vecteurs d'expression. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes, procaryotes ou eucaryotes, d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée.

Des exemples de cellules hôtes incluent notamment des cellules de mammifères, des cellules d'insectes, des bactéries ou des souches de levures.

Les différentes séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences d'ADN ou d'ARN, obtenues par criblage de banques de séquences au moyen de sondes élaborées sur la base des séquences SEQ ID n 1 ou 2. De telles banques peuvent être préparées par des techniques classiques de biologie moléculaire, connues de l'homme de l'art.

Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent également être préparées par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage des banques.

Ces séquences nucléotidiques permettent la réalisation de sondes ou amorces, hybridant spécifiquement avec une séquence SEQ ID n 1 ou 2 ou leurs fragments, selon l'invention, ou son brin complémentaire. Les conditions d'hybridation appropriées correspondent aux conditions de température et de force ionique usuellement utilisées par l'homme du métier, de préférence dans des conditions stringentes telles que définies précédemment.

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La présente invention a ainsi pour objet l'utilisation d'un acide nucléique tel que défini précédemment pour la fabrication de sondes nucléiques ou d'amorces oligonucléotidiques, capables d'hybrider spécifiquement, dans des conditions stringentes, avec tout ou partie dudit acide nucléique tel que défini précédemment.

La présente invention a également pour objet un acide nucléique ayant au moins 10 nucléotides, qui hybride spécifiquement avec l'une des séquences d'acide nucléique SEQ ID n 1 ou 2 ou de leurs fragments, ou son complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation.

De tels acides nucléiques peuvent servir comme sonde pour la détection d'une séquence rétrovirale associée notamment au psoriasis, au lichen et à l'atopie. Ces acides nucléiques de l'invention utiles comme sondes comportent au minimum 10 nucléotides, préférentiellement au moins 20 nucléotides, préférentiellement encore au moins 100 nucléotides.

Les acides nucléiques de l'invention peuvent être utiles comme amorces pour l'amplification de tout ou partie d'une séquence rétrovirale associée notamment au psoriasis, au lichen et à l'atopie. Ces amorces comportent de préférence dans ce cas au minimum 10 nucléotides, de préférence au moins 14 nucléotides, et préférentiellement moins de 40 nucléotides.

On peut par exemple utiliser comme amorces, pour une amplification (par exemple par PCR), les acides nucléiques constitués des séquences SEQ ID n 6 à 14.

Préférentiellement, les sondes ou amorces de l'invention sont marquées, préalablement à leur utilisation. Pour cela, plusieurs techniques sont à la portée de l'homme du métier comme par exemple le marquage fluorescent, radioactif, chimioluminescent ou enzymatique. On peut également utiliser les sondes comme sondes de capture, immobilisées sur un support solide par tout moyen approprié, directement ou indirectement, par exemple par covalence ou adsorption passive.

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L'invention a également pour objet un procédé de détection in vitro de la présence d'une séquence nucléique rétrovirale associée à une affection cutanée chez un patient, comprenant les étapes consistant à : a1) isoler l'ADN ou l'ARN d'un échantillon biologique ; b1) éventuellement produire de l'ADNc à partir dudit ARN ; c1) mettre en présence ledit ADN ou ADNc avec des acides nucléiques tels que définis précédemment, comme amorces, dans des conditions permettant l'amplification spécifique d'une séquence SEQ ID n 1 ou 2, ou de leurs fragments, ou d'une séquence homologue telle que définie précédemment, d1) soumettre ledit ADN ou ADNc à une réaction d'amplification, e1) détecter les produits d'amplification, indicateurs de la présence d'une séquence rétrovirale associée à une affection cutanée, et/ou a2) la mise en contact d'un ADN ou ARN d'un échantillon biologique, avec un acide nucléique tel que défini précédemment, comme sonde, marquée de manière détectable, dans des conditions permettant l'hybridation spécifique dudit ADN ou ARN avec ladite sonde ; b2) la détection des complexes d'hybridation formés, indicateurs de la présence d'une séquence rétrovirale associée à une affection cutanée.

L'invention a en outre pour objet un procédé de diagnostic in vitro d'une affection cutanée, telle que notamment un psoriasis, un lichen ou un eczéma atopique, chez un patient, dans lequel on détecte, dans un échantillon biologique, la présence d'une séquence nucléique rétrovirale associée à l'une de ces pathologies, au moyen du procédé de détection décrit ci-dessus.

Par "échantillon biologique", on entend notamment un prélèvement du type fluide biologique, tissu vivant, fragment de tissu, mucosité, organe ou fragment d'organe ou tout surnageant de culture obtenu à l'aide d'un prélèvement.

Par "fluide biologique", on entend notamment le sérum, le plasma, l'urine ou le liquide céphalo-rachidien.

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Les sondes utilisées à des fins de diagnostic de l'invention peuvent être mises en #uvre dans toutes les techniques connues, et notamment les techniques dites "DOT-BLOT", "SOUTHERN-BLOT", "NORTHERN-BLOT" et la technique "SANDWICH". Avantageusement, on utilise la technique "SANDWICH" dans la présente invention, comprenant une sonde de capture spécifique et/ou une sonde marquée de manière détectable spécifique, étant entendu que la sonde de capture et la sonde de détection doivent présenter une séquence nucléotidique au moins partiellement différente.

On peut également mettre en oeuvre une hybridation in situ, par exemple au moyen de la technique "FISH", sur des tissus ou cellules.

L'invention a également pour objet des anticorps dirigés contre le polypeptides tels que définis précédemment.

Il peut s'agir d'anticorps poly- ou monoclonaux ou de leurs fragments, d'anticorps chimériques, notamment humanisés ou immunoconjugués.

Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus à partir du sérum d'un animal immunisé contre un polypeptide selon les modes opératoires usuels.

Selon un mode de réalisation de l'invention, on peut utiliser comme antigène un fragment peptidique approprié, pouvant être couplé par l'intermédiaire d'un résidu réactif à une protéine ou un autre peptide. Des lapins sont immunisés avec l'équivalent de 1 mg de l'antigène peptidique selon la procédure décrite par Benoit et al. (1982). A des intervalles de quatre semaines, les animaux sont traités par des injections de 200 g d'antigène et saignés 10 à 14 jours plus tard. Après la troisième injection, l'anti-sérum est examiné pour déterminer sa capacité à se lier au peptide antigène radiomarqué à l'iode, préparé par la méthode chloramine-T et est ensuite purifié par une chromatographie sur colonne échangeuse d'ion carboxyméthyl cellulose (CMC). Les molécules d'anticorps sont ensuite recueillies dans les mammifères et isolées jusqu'à la concentration souhaitée par les méthodes bien connues de l'homme de l'art.

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Afin d'augmenter la spécificité du sérum polyclonal, les anticorps peuvent être purifiés par une chromatographie d'immuno-affinité en utilisant des polypeptides immunisant en phase solide. L'anticorps est mis en contact avec le polypeptide immunisant en phase solide pendant une durée suffisante de façon à faire immuno-réagir le polypeptide avec la molécule d'anticorps afin de former un complexe immunologique en phase solide.

Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes décrite par Kôhler et Milstein (1975).

Les anticorps ou fragments d'anticorps de l'invention peuvent être par exemple des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab et F(ab')2. Ils peuvent également se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués.

Les anticorps de l'invention, en particulier les anticorps monoclonaux, peuvent notamment être utilisés pour l'analyse par immunohistochimie des polypeptides sur des coupes de tissus spécifiques, par exemple par immunofluorescence, marquage à l'or, immunoperoxydase...

Les anticorps ainsi produits peuvent être avantageusement mis en oeuvre dans toute situation où l'expression des polypeptides doit être observée.

L'invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un anticorps ainsi produit pour la détection ou la purification d'un polypeptide tel que défini précédemment dans un échantillon biologique.

Plus précisément, l'invention concerne une méthode in vitro pour la détection ou la mesure du taux d'expression des polypeptides de PsoRVI ou PsoRV2 tels que définis précédemment dans un prélèvement biologique comprenant la mise en contact d'au moins un anticorps tel que défini précédemment avec ledit prélèvement biologique dans des conditions permettant la formation éventuelle de complexes immunologiques spécifiques entre les polypeptides de PsoRVI ou PsoRV2 et le ou lesdits anticorps et la détection des complexes immunologiques spécifiques éventuellement formés.

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L'invention a également pour objet un kit pour la mise en #uvre de cette méthode comprenant : - au moins un anticorps spécifique des polypeptides de PsoRV1 et PsoRV2, éventuellement fixé sur un support ; - des moyens de révélation de la formation de complexes antigènes/anticorps spécifiques entre les polypeptides et ledit anticorps et/ou des moyens de quantification de ces complexes.

L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique tel que défini précédemment en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, ledit acide nucléique étant capable de s'hybrider in vivo ou in vitro sur l'ARN et/ou sur l'ADN de PsoRV1 ou PsoRV2 pour bloquer les phénomènes de réplication, notamment traduction et/ou transcription, et/ou pour dégrader ledit ADN et/ou ARN.

Ladite composition est destinée à être utilisée en thérapie génique. L'acide nucléique de préférence inséré dans un vecteur généralement viral (tels que les adénovirus et les rétrovirus) peut être administré sous forme nue, exempt de tout véhicule favorisant le transfert à la cellule cible, tels que des liposomes anioniques, des lipides cationiques, des microparticules, par exemple des microparticules d'or, des agents de précipitation, par exemple du phosphate de calcium, ou tout autre agent facilitant la transfection. Dans ce cas, le polynucléotide peut être simplement dilué dans une solution physiologiquement acceptable, telle qu'une solution stérile ou une solution stérile tampon, en présence ou en l'absence d'un véhicule.

De manière alternative, un acide nucléique de l'invention peut être associé à des agents qui facilitent la transfection. Il peut être, entre autres , (i) associé à un agent chimique qui modifie la perméabilité cellulaire tel que la bupivacaïne ; (ii) encapsulé dans des liposomes, éventuellement en présence de substances supplémentaires facilitant la transfection ; ou (iii) associé à des lipides cationiques ou des microparticules de silice, d'or ou de tungstène.

Lorsque les constructions d'acide nucléique de l'invention recouvrent des microparticules, celles-ci peuvent être injectées par voie

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intradermique ou intraépidermique par la technique du canon à gènes, "gene gun" (WO 94/24263).

La quantité à utiliser comme médicament dépend notamment de la construction d'acide nucléique elle-même, de l'individu auquel cet acide nucléique est administré, du mode d'administration et du type de formulation, et de la pathologie. De manière générale, une quantité thérapeutiquement ou prophylactiquement efficace variant d'environ 0,1 g à environ 1 mg, de préférence d'environ 1 g à environ 800 g et, de manière préférentielle d'environ 25 g à environ 250 pg, peut être administrée à des adultes humains.

Les constructions d'acides nucléiques de l'invention peuvent être administrées par toute voie d'administration conventionnelle. Le choix de la voie d'administration dépend en particulier de la formulation choisie.

L'application cutanée et l'injection intradermique sont toutefois préférées.

L'invention a également pour objet une méthode de traitement thérapeutique d'une affection cutanée dans laquelle on administre à un patient nécessitant un tel traitement, une quantité efficace d'un acide nucléique bloquant l'expression des séquences PsoRV1 ou PsoRV2.

Le patient visé est généralement un être humain, mais l'application peut également être étendue à tout mammifère le cas échéant.

Une thérapie ex vivo peut être également mise en place.

L'invention fournit plus précisément une méthode in vitro de préparation d'un ensemble cellulaire destiné à être implanté à un patient receveur, comprenant l'incorporation d'une séquence nucléotidique de PsoRV1 ou PsoRV2 telle que définie précédemment dans des cellules en culture.

Les cellules visées peuvent être des cellules autologues du patient receveur, mais aussi des cellules hétérologues (d'un autre donneur de la même espèce) ou xénologues (d'un donneur d'une autre espèce animale).

Il peut s'agir de préférence de cellules cutanées, plus particulièrement de kératinocytes.

Les séquences nucléotidiques peuvent être incorporées par toute technique de transfert connue de l'homme du métier, par gene gun , sous forme nue, ou en association avec des liposomes anioniques, des lipides

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cationiques, des microparticules, par exemple des microparticules d'or, ou tout autre agent facilitant la transfection.

Les séquences nucléotidiques sont pour cela de préférence préalablement insérées dans un vecteur, de type rétrovirus ou adénovirus par exemple.

Les modes d'implantation des cellules modifiées (greffe, injection, etc. ) dépendent notamment du type de cellules et de l'affection visée.

Un autre objet de l'invention est une méthode de traitement chirurgical dans laquelle on implante chez un patient receveur nécessitant un tel traitement les cellules ainsi modifiées.

L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un polypeptide tel que défini précédemment, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Une composition pharmaceutique de ce type peut être particulièrement utile pour stimuler ou abroger les réponses immunitaires du patient vis-à-vis des polypeptides PsoRV1 et PsoRV2, endogènes, dans le cadre d'une vaccination ou d'une désensibilisation, respectivement.

L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un anticorps tel que défini précédemment, de préférence un anticorps monoclonal, le cas échéant humanisé, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Une composition à base d'un anticorps selon l'invention peut être particulièrement utile pour inactiver les polypeptides PsoRVI ou PsoRV2 dans le cadre d'une pathologie impliquant ces polypeptides, telle que les maladies de la peau.

Les modes d'administration, les posologies et les formes galéniques des compositions pharmaceutiques selon l'invention, contenant au moins un anticorps ou un polypeptide, peuvent être déterminées de manière usuelle par l'homme du métier, notamment selon les critères généralement pris en compte pour l'établissement d'un traitement thérapeutique adapté à un patient, comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de

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son état général, le tolérance au traitement, et les effets secondaires constatés, etc.

De manière générale, une quantité thérapeutiquement ou prophylactiquement efficace dudit anticorps ou polypeptide variant d'environ 0,1 g à environ 1 mg peut être administrée à des adultes humains.

Les pathologies visées sont toutes celles dans lesquelles l'expression de PsoRV1 ou PsoRV2 est observée. Les maladies de la peau sont plus particulièrement ciblées, et parmi celles-ci notamment les dermatoses à composante immunitaire.

On peut citer, à titre d'exemples de pathologies concernées, le psoriasis, le lichen, l'eczéma atopique, le lupus érythémateux, et les cancers cutanés (carcinomes), dont par exemple le carcinome basocellulaire et le carcinome spinocellulaire.

L'invention a enfin pour objet l'utilisation d'un polypeptide PsoRV1 ou PsoRV2 tel que défini précédemment ou d'un acide nucléique codant pour le polypeptide, pour le criblage de composés (isolés ou en mélange) susceptibles d'inhiber l'activité dudit polypeptide.

Une méthode de criblage de composés, isolés ou en mélange, susceptibles d'inhiber la polymérase de PsoRVI, peut ainsi être mise en #uvre, méthode comprenant : - la purification de la polymérase (par exemple au moyen de la technique des "Tags", ou étiquettes (Kevin J. Petty Chapitre X, "Short Protocols in Molecular Biology", 3ème Edition, Editions Aussubel et al, imprimerie John Willey and Son Corp.) ; - suivie des tests in vitro de transcription inverse selon le protocole de PERT (Pyra et al, 1994).

Parmi les composés à tester, on peut notamment citer des inhibiteurs d'autres polymérases connues, tels que des analogues nucléotidiques.

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Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.

EXEMPLE 1 :
Obtention du clone CONS-58-13 codant pour la protéase et la partie 5' de l'ADN polymérase ARN dépendante (PsoRVI).

Le clone 58-13 a été obtenu par transcription inverse et réaction de PCR dégénérée selon la méthode publiée par Tuke et al, (1997) à partir d'ARN totaux extraits de coupes de biopsies de peau lésionnelles de patients atteints de psoriasis et clonage dans le vecteur pCR# 2.1-Topo selon les conditions recommandées par le fabricant (TOPOTM TA-cloning system ; Invitrogen, The Netherlands). Le clone séquence grâce au kit "DyeTerminator sequencing kit" (Perkin-Elmer, France) et un séquenceur AB1373 (Applied Biosystems, USA) a permis de définir une amorce spécifique de PsoRV, dénommé 58-13 (SEQ ID n 6). Par une étude d'homologie entre MSRV1 et ERV9, numéro d'accès # AF009668 et # X57147XX (sur la base de données EMBL) respectivement, les auteurs de l'invention ont pu définir une amorce dénommée CONS SEQ ID n 7. Le clone CONS-58-13 a été obtenu par transcription inverse et PCR à l'aide des amorces définies ci-dessous et identifiées comme les séquences SEQ ID n 6 et SEQ ID n 7, à partir d'ARNs totaux extraits de coupes de biopsies de peau lésionnelles de patients atteints de psoriasis et clonage dans le vecteur pCR# 2.1-Topo selon les conditions recommandées par le fabricant (TOPOTM TA-cloning system ; Invitrogen, The Netherlands). amorce 58-13 : SEQ ID n 6 :
5'-GTA CGG ATG GAC AAA AGT G-3' amorce CONS : SEQ ID n 7 :
5'-CAR CAG GAC TGA GGG TGC C-3'

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EXEMPLE 2 :
Détection de l'expression de PsoRVI dans les biopsies de lésions de patients atteints de psoriasis.

A. Méthode
La recherche de l'expression de la séquence PsoRV1 a été obtenue par les techniques de transcription inverse à partir d'ARNs totaux extraits de coupes de biopsies de peaux lésionnelles de patients atteints de psoriasis. La synthèse d'ADNc a été réalisée avec une amorce oligo dT16 et la transcriptase inverse (GIBCO-BRL) selon les conditions préconisées par le fournisseur. Une PCR a ensuite été réalisée en utilisant les amorces définies à partir de la séquence du clone CONS-58-13. Deux couples d'amorces ont été utilisés : - le premier couple dénommé WALE-PIVA, SEQ ID n 8 et SEQ ID n 9, respectivement ; - le deuxième couple dénommé WALE-WQG, SEQ ID n 8 et SEQ ID n 10, respectivement.

Les échantillons sont ensuite analysés par migration électrophorétique sur gel d'agarose et détectés sous lumière UV après marquage du gel au bromure d'éthidium. Les échantillons sont considérés positifs après visualisation d'une amplification sur gel d'agarose. amorce 5' : SEQ ID n 8
5'-GAA GTT TGG GCA TTG GAA G-3' amorce 3' : SEQ ID n 9
5'-GGA ATT ACT GCC TCA TTG-3' amorce 3' : SEQ ID n 10
5'-CTC CAC TGA CCT TTC RG-3'
B. Résultats
Le tableau 1 ci-après représente la fréquence de détection de l'expression de PsoRVI dans les biopsies de lésions de patients atteints de psoriasis, de lichen ou d'atopie et dans les contrôles sujets sains.

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<tb>
<tb> Echantillon <SEP> PCR <SEP> PIVA-WALE <SEP> PCR <SEP> WALE-WQG
<tb> Psoriasis <SEP> 25/25(100%) <SEP> 23/25 <SEP> (92 <SEP> %) <SEP>
<tb> Lichen <SEP> 1/1 <SEP> (100 <SEP> %) <SEP> 0/1 <SEP> (0 <SEP> %) <SEP>
<tb> Atopie <SEP> 4/4 <SEP> (100 <SEP> %) <SEP> 0/4(0 <SEP> %)
<tb> Contrôle <SEP> 216 <SEP> (33 <SEP> %) <SEP> 1/11 <SEP> (9 <SEP> %) <SEP>
<tb> Carcinome <SEP> Basocellulaire <SEP> 3/5 <SEP> (60 <SEP> %) <SEP> 0/5 <SEP> (0 <SEP> %) <SEP>
<tb> Carcinome <SEP> Spinocellulaire <SEP> 2/2 <SEP> (100 <SEP> %) <SEP> 1/2 <SEP> (50 <SEP> %) <SEP>
<tb>

Ces résultats suggèrent fortement que l'expression des séquences rétrovirales de PsoRV participe au développement des pathologies indiquées ci-dessus.

EXEMPLE 3 :
Obtention du clone Env-PsoRV2 codant pour l'enveloppe du rétrovirus.

Les clones Env-PsoRV2-5' et Env-PsoRV2-3' ont été obtenus par transcription inverse et réaction de PCR dégénérée à l'aide d'amorces conservées au sein de la famille HERV-K, identifiées par les séquences Env5' SEQ ID n 11, LTR3' SEQ ID n 12, Env3' SEQ ID n 13 et LTR5' SEQ ID n 14, à partir d'ARN totaux extraits de coupes de biopsie de peaux lésionnelles de patients atteints de psoriasis. Les produits de PCR ont ensuite été clonés et séquences selon les méthodes décrites dans l'exemple 1.

- Séquence Env5' n 11 :
5'-TTA CTG TGG CCT CAC ACC A-3' - Séquence LTR3' n 12:
5'-ATG CTG CCT TCA AGC ATC TG-3' - Séquence Env3' n 13 :
5'-TCA CCA GCA GAA TAC GGT G-3' - Séquence LTR5' n 14 :
5'-CTT ACG AGA AAC ACC CAC AG-3'

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BIBLIOGRAPHIE - Benoit et al., PNAS USA, 79,917-921 (1982).

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- Guilhou, J. -J., Vannereau, H., Theunynck, D., Bergoin, M. & Blanchard, J. -M. Virological studies on psoriatic lymphocytes. In Psoriasis .

Eds. Farber E. M., Cox A.J. and Jacobs P.H. publ.: Grune & Stratton Inc. 1982.

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Development of a pan-retrovirus detection system for multiple sclerosis. Anal.

Neural. Scand. 169,16-21 (1997).

Claims (19)

REVENDICATIONS

1. Acide nucléique isolé, dont la séquence est choisie parmi SEQ ID n 1, SEQ ID n 2, ou la séquence des fragments allant du nucléotide 1 au nucléotide 291 sur SEQ ID n 1, ou allant du nucléotide 207 au nucléotide 950 sur SEQ ID n 1, ou allant du nucléotide 3 au nucléotide 260 sur SEQ ID n 2, ou une séquence homologue, définie comme i) une séquence identique à au moins 80 % de la séquence SEQ ID n 1, SEQ ID n 2 ou de la séquence des fragments allant du nucléotide 1 au nucléotide 291 sur SEQ ID n 1, ou allant du nucléotide 207 au nucléotide 950 sur SEQ ID n 1, ou allant du nucléotide 3 au nucléotide 260 sur SEQ ID n 2, ii) une séquence hybridant avec la séquence SEQ ID n 1, SEQ ID n 2, ou la séquence des fragments allant du nucléotide 1 au nucléotide 291 sur SEQ ID n 1, ou allant du nucléotide 207 au nucléotide 950 sur SEQ ID n 1, ou allant du nucléotide 3 au nucléotide 260 sur SEQ ID n 2, ou leurs séquences complémentaires, dans des conditions stringentes d'hybridation.

2. Acide nucléique isolé, dont la séquence code pour un polypeptide, comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID n 3 à SEQ ID n 5, ou une séquence homologue, définie comme identique à au moins 80 % de la séquence SEQ ID n 3 à 5.

3. Polypeptide isolé comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID n 3 à SEQ ID n 5, ou une séquence homologue, définie comme i) une séquence identique à au moins 80% de la séquence SEQ ID n 3 à n 5 ; ou ii) une séquence codée par une séquence d'acide nucléique hybridant avec la séquence SEQ ID n 1, SEQ ID n 2 ou la séquence des fragments allant du nucléotide 1 au nucléotide 291 sur SEQ ID n 1, ou allant du nucléotide 207 au nucléotide 950 sur SEQ ID n 1, ou allant du nucléotide 3

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au nucléotide 260 sur SEQ ID n 2, ou sa séquence complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation.

4. Vecteur de clonage et/ou d'expression contenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 2.

5. Cellule hôte transfectée par un vecteur selon la revendication 4.

6. Acide nucléique ayant au moins 10 nucléotides, qui hybride spécifiquement avec l'une des séquences d'acide nucléique de la revendication 1,2 ou 3 ou son complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation.

7. Utilisation d'un acide nucléique selon la revendication 1 ou 2 pour la fabrication de sondes nucléiques ou d'amorces oligonucléotidiques, capables d'hybrider spécifiquement, dans des conditions stringentes, avec tout ou partie dudit acide nucléique tel que défini dans la revendication 1 ou 2.

8. Anticorps dirigé contre le polypeptide tel que défini dans la revendication 3.

9. Utilisation d'au moins un anticorps selon la revendication 8 pour la détection ou la purification d'un polypeptide tel que défini dans la revendication 3 dans un échantillon biologique.

10. Utilisation d'un acide nucléique selon la revendication 6 comme amorce pour l'amplification de tout ou partie d'une séquence rétrovirale associée à une affection cutanée.

11. Utilisation d'un acide nucléique selon la revendication 6 comme sonde pour la détection d'une séquence rétrovirale associée à une affection cutanée.

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12. Procédé de détection in vitro de la présence d'une séquence nucléique rétrovirale associée à une affection cutanée chez un patient, comprenant les étapes consistant à : a1) isoler l'ADN ou l'ARN d'un échantillon biologique ; b1 ) éventuellement produire de l'ADNc à partir dudit ARN ; c1) mettre en présence ledit ADN ou ADNc avec des acides nucléiques selon la revendication 6, comme amorces, dans des conditions permettant l'amplification spécifique d'une séquence telle que définie à la revendication 1 ou 2, d1) soumettre ledit ADN ou ADNc à une réaction d'amplification, et) détecter les produits d'amplification, indicateurs de la présence d'une séquence rétrovirale associée à une affection cutanée, et/ou a2) la mise en contact d'un ADN ou ARN d'un échantillon biologique, avec un acide nucléique selon la revendication 6, comme sonde, marquée de manière détectable, dans des conditions permettant l'hybridation spécifique dudit ADN ou ARN avec ladite sonde ; b2) la détection des complexes d'hybridation formés, indicateurs de la présence d'une séquence rétrovirale associée à une affection cutanée.

13. Procédé de diagnostic in vitro d'une affection cutanée, telle que notamment un psoriasis, un lichen ou un eczéma atopique, chez un patient, dans lequel on détecte, dans un échantillon biologique, la présence d'une séquence nucléique rétrovirale associée à l'une de ces pathologies, au moyen du procédé de la revendication 12.

14. Composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique selon la revendication 1 ou 2, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

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15. Composition pharmaceutique comprenant un polypeptide selon la revendication 3, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

16. Composition pharmaceutique comprenant un anticorps selon la revendication 8, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

17. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 14 à 16, pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une affection cutanée, telle que notamment un psoriasis, un lichen ou un eczéma atopique.

18. Utilisation d'un acide nucléique selon la revendication 2 ou d'un polypeptide selon la revendication 3, pour le criblage de composés susceptibles d'inhiber l'activité dudit polypeptide.

19. Méthode in vitro de préparation d'un ensemble cellulaire destiné à une implantation chez un patient receveur, comprenant l'incorporation d'une séquence nucléotidique de la revendication 1 ou 2 dans des cellules en culture, telles que notamment des kératinocytes.