BRPI9801130B1 - "fitase modificada de aspergillus fumigatus com uma atividade específica aperfeiçoada e alimento ou composição alimentícia". - Google Patents

Abstract

patente de invenção: <b>"fitases modificadas"<d>. a presente invenção refere-se a um processo para a produção de uma fitase modificada com propriedades de atividades aperfeiçoadas, caracterizada pelo fato de que são efetuadas as seguintes etapas: a) a estrutura tridimensional da fitase a ser modificada e, opcionalmente, de outra fitase com propriedades de atividade que são mais favoráveis do que aquelas da fitase a ser modificada, é/são modelada(s) em computador com base na estrutura tridimensional da fitase de <mu>aspergillus niger<mv>; b) a estrutura dos sítios ativos da fitase a ser modificada e da fitase com as propriedades de atividades mais favoráveis são comparadas e aqueles resíduos de aminoácidos em ambos os sítios ativos que sejam diferentes são identificados; c) uma seqüência de adn que codifica uma fitase modificada é construída modificando-se os nucleotídeos que codificam pelo menos um dos aminoácidos pelos quais ambos os sítios ativos se diferem; d) integrar uma tal seqüência de adn em um vetor capaz de expressão em uma célula de hospedeiro adequada; e) transformar uma célula de hospedeiro adequada pela seqüência de adn de c) ou o vetor d), crescer a dita célula de hospedeiro sob condições de crescimento adequadas e isolar a fitase modificada a partir da célula de hospedeiro ou do meio de cultura por processos conhecidos no estado da técnica. a presente invenção refere-se ainda à fitase modificada obtida ou obtenível por tal processo, à seqüência de adn que codifica esta fitase, ao vetor que compreende tal seqüência de adn, à célula de hospedeiro transformada por tal seqüência de adn e a um alimento ou composição alimentícia compreendendo esta fitase.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FITASE MODIFICADA DE ASPERGILLUS FUMIGATUS COM UMA ATIVIDADE ESPECÍFICA APERFEIÇOADA E ALIMENTO OU COMPOSIÇÃO ALIMENTÍCIA".

Fitases (mio-inositol hexaquisfosfato fosfoidrolases; EC 3.1.3.8) são enzimas que hidrolisam fitato (mio-inositol hexaquisfosfato) para formar mio-inositol e fosfato inorgânico são bem conhecidas para avaliar aditivos de alimentos.

Uma fitase foi primeiramente descrita em farelo de arroz em 1907 [Suzuki et al., Bull. Coll. Agr. Tokio Imp. Univ. 7, 495 (1907)] e fitases a partir de espécies de Aspergillus em 1911 [Dox e Golden, J. Biol. Chem. 10, 183-186 (1911)]. Fitases também foram encontradas em farelo de trigo, sementes de plantas, intestinos de animais e em microrqanismos [Howsen e Davis, Enzyme Mibrob. Technol. 5, 377-382 (1983), Lambrechts et al., Biotech. Lett. 14, 61-66 (1992), Shieh e Ware, Appl. Microbiol. 16,1348-1351 (1968)]. A clonagem e a expressão da fitase a partir de Aspergillus niaer (ficuum) foi descrita por Van Hartingsveldt et al., em Gene, 127, 87-94 (1993) e no pedido de patente europeu, n° de publicação (EP) 420 358 e a partir de As-perqillus niaer ver. Awamori por Piddington et al., em Gene, 133, 55-62 (1993).

Clonagem, expressão e purificação de fitases com propriedades aperfeiçoadas foram reveladas na patente européia 684 313. Entretanto, uma vez que ainda existe uma necessidade persistente de outras fitases aperfeiçoadas, especialmente com respeito às propriedades de atividades, é um objeto da presente invenção fornecer o seguinte: i) Um processo para a produção de uma fitase modificada com propriedades de atividade aperfeiçoadas caracterizada pelo fato de que as seguintes etapas são efetuadas: a) a estrutura tridimensional da fitase a ser modificada e, opcionalmente, de outra fitase com propriedades de atividade que sejam mais favoráveis do que aquelas da fitase a ser modificada é/são modelada(s) em computador à base da estrutura tridimensional da fitase de Aspergillus niger (ficuum); b) a estrutura dos sítios ativos da fííase a ser modificada e da fitase com as propriedades de atividades mais favoráveis são comparadas e aqueles resíduos de aminoácidos em ambos os sítios ativos que são diferentes são identificados; c) uma seqüència de ADN que codifique uma fitase modificada é construída mudando-se os nucleotídeos que codifiquem pelo menos um dos aminoácidos peios quais ambos os sítios ativos se diferem; d) integrar uma tal seqüència de ADN em um vetor capaz de expressão em uma célula de hospedeiro adequada; e) transformar uma célula de hospedeiro adequada pela sequência de ADN de c) ou o vetor de d), crescer a dita célula de hospedeiro sob condições de crescimento adequadas e isolar a fitase modificada a partir da célula hospedeira ou o meio de cultura por processos conhecidos no estado da técnica; ou ii) um processo conforme descrito sob i), em que a fitase a ser modificada é origem ©ucaríótica, de preferência fúngica, mais preferivelmente Aspergillus, por exemplo Asperaillus fumiaatus: ou iii) um processo conforme descrito sob i) ou ii), em que a fitase com propriedades de atividade mais favoráveis é de origem eucariótica, de preferência fúngica, mais preferivelmente Aspergillus, por exemplo, Asperaillus niaer ou Asperaillus terreus (Asperaillus terreus cbs 116,46 ou 9A1); ou iv) um processo conforme descrito sob i), ii) ou iii), em que a fitase a ser modificada é uma fitase de Asperaillus fumiaatus e a fitase com as propriedades de atividade mais favoráveis é a fitase de Asperaillus terreus ou a fitase de Asperaillus niaer.

Nesse contexto, deve ser mencionado que outra possibilidade de produzir fitases com propriedades aperfeiçoadas é isolando-se fitases a partir do mesmo organismo, como, por exemplo, o Asperaillus ftcuum, porém cepas diferentes que podem ser encontradas na natureza e que tenham sido depositadas por qualquer das autoridades depositárias conhecidas, 4 Suas seqüèncias de aminoácidos podem ser determinadas clonando-se suas sequências de ADN correspondentes por processos conforme descritos, por exemplo, no pedido de patente europeu n° (EP) 684 313. Uma vez que tais sequências tenham sido definidas elas podem ser modeladas à base da estrutura tridimensional da fitase de A. niaer e os sítios ativos de ambas as sequências podem ser comparados para verificar se tal fitase deve ter propriedades de atividades aperfeiçoadas (ver Exemplo 8} ou ambas as se-qüèncias de sítios ativos podem ser diretamente comparadas e, então, testadas para atividade aumentada e/ou aperfeiçoada pelos testes descritos no presente pedido.

Além disso, é um objetivo da presente invenção fornecer uma fitase modificada que seja obtenível por um processo conforme descrito acima.

Em geral, é um objeto da presente invenção fornecer uma fitase que tenha sido modificada de uma maneira que sua propriedade de atividade é mais favorável do que aquela da fitase nâo-modificada, especificamente uma tal fitase caracterizada pelo fato de que a seqüêncip de aminoá-cidos da fitase não-modificada tenha sido modificada por delação, substituição e/ou adição de um ou mais aminoáctdos mais especificamente uma tal fitase em que mudanças tenham sido feitas em pelo menos uma posição que seja homóloga àquela das posições seguintes da sequência de amino-ácidos da fitase de Aspergillus (A.) niger (ver Figura 1); 27, 66. 71; 103, 14Q) 141, 188, 205, 234, 235, 238, 274, 277, 282, 340 e/ou 424, de preferência, 27, 66, 140, 205, 274, 277, 282 e/ou 340, e ainda mais especifioamente uma tal fitase que é a fitase de origem eucariótica, de preferência fúngíca, mais preferivelmente Aspergillus e muitíssimo de preferência Aspergillus fumiga-tus.

Além disso, é um objeto da presente invenção fornecer uma tal fitase, em que, na posição 27 ou pelo menos na posição 27, ocorre uma mudança, de preferência, uma fitase em que o amínoácido na posição 27 é substituído por um selecionado a partir dos seguintes grupos: a) Ala, Vai, Leu, lie; ou b) Thr ou c) Asn; e, além disso, uma tai fitase em que, em adição à posição 27, ocorre uma mudança também na posição 66, ou em que, em adição ã posição 27, ocorre uma mudança também na posição 140 e/ou nas posições 274 e/ou 277, É também um objetivo da presente invenção fornecer uma fitase conforme especificada acima, a qual é caracterizada por pelo menos uma das seguintes mutações: Q27L, Q27N, Q27T, Q27I. Q27V, Q27A, G27G, S66D, S140Y, D141G, A205E, 0274L, G277D, G277K. Y282K e/ou N340S..

Além disso, é um objetivo da presente invenção fornecer muteí-nas de fitase que sejam resistentes contra degradação por proteases de origem fúngica, de preferência Ásperoiilus, e muitíssimo de preferência Asper-qillus nioer {ficuum). Tais muteínas são caracterizadas pelo fato de que pelo menos uma das seguintes posições (que se refere à posição homóloga na sequência de aminoácidos de A. niaerí. a saber, a posição 130 ou 129 e 130, de preferência, do Asperoillus fumiaatus. ou 167, 168, de preferência da sequência de aminoácidos de fitase de A. nidulans. o aminoácido que está presente na seqüência de tipo selvagem foi substituído contra outro aminoácido que é conhecido para mudar a sensibilidade de protease, por exemplo, no caso de A. fumiaatus na posição 130 de "S" para "N" e na posição 129 de "R" para "L", e, no caso de A, nidulans, na posição 167 de "K" para "G" e na posição 168 de R para G. Tais posições também podem ser combinadas com aquelas fornecendo propriedades de atividade aperfeiçoadas.

Nesse contexto, "propriedade de atividade aperfeiçoada" significa que qualquer tipo de aperfeiçoamento da atividade da fitase mutada quando comparada à não-mutada. Isso podería significar, por exemplo, uma atividade específica mais elevada, de preferência, pelo menos duas vezes ou mais preferivelmente pelo menos 3 ou 4 vezes mais elevada em um teste conhecido no estado da técnica para medir a atividade de fitase, ver, por exemplo, na patente européia 684 313 ou descrito nos exemplos do presente pedido, Além disso, isso podería significar uma especificidade de substrato diferente determinada em um teste conhecido no estado da técní- ca ou conforme descrito, por exemplo, nos exemplos específicos da presente invenção. Isso também podería significar um máximo da atividade específica em um pH mais favorável diferente ou um ótimo de pH mais amplo ("perfil de pH aperfeiçoado") determinado por um teste conforme conhecido no estado da técnica ou conforme descrito, por exemplo, nos exemplos. Fina Imente, isso também podería significar qualquer combinação de tais propriedades. "Homólogo", no contexto da presente invenção, significa o melhor ajuste da estrutura primária, de preferência, também secundária, e, muitíssimo de preferência, também terciária, da fitase a ser modificada e a fitase de Asperaillus nioer. Como tal melhor ajuste pode ser obtido é descrito em detalhe no Exemplo 1 da presente invenção. A Figura 1 dá um exemplo de tal melhor ajuste para as sequências de aminoácidos de fitase de Asperaillus fumioatus e Asperaillus terreus alinhado à base da seqüência de aminoácidos de Asperaillus niaer. sequência última essa é também usada como a referência para qual as posições das outras sequências, por exemplo, aquelas nominadas antes, se referem. Além disso, a fitase de Asperaillus fumioatus modificada com a mutação Q27L, significa nada mais do que a fitase de Asperaillus fumioatus. em que, na posição 27 de acordo com a atribuição conforme definida acima (que é, de fato, a posição 23 da se-qüência de aminoácidos de Asperaillus fumiaatusl a glutamina que ocorre naturalmente ("Q" se refere ao código de aminoácidos de uma letra UPAC padrão) foi substituída por Jeucina ("L"). Todas as muteínas da presente invenção são designadas dessa maneira independentemente de se elas são muteínas resistentes à protease ou muteínas com propriedades de atividade aperfeiçoadas, Além disso, é um objetivo da presente invenção fornecer uma seqüência de ADN que codifique uma fitase conforme descrito acima, um vetor, de preferência, um vetor de expressão, compreendendo uma tal seqüência de ADN, uma célula de hospedeiro que tenha sido transformada por uma tal seqüência de ADN ou vetor, um processo para a preparação de uma fitase da presente invenção, em que a célula de hospedeiro, conforme des- Dfíta acima, é cultivada sob condições de cultura adequadas e a fitase é isolada a partir de tal célula dê hospedeiro ou o meio de cultura por processos conhecidos no estado da técnica, ou um alimento ou composição de alimentos compreendendo uma fitase da presente invenção.

Nesse contexto, deve ser observado que é também um objeto da presente invenção fornecer uma sequência de ADN que codifique uma fitase portando pelo menos uma das mutações específicas da presente invenção e que se hibridize sob condições padrão com as seqüências de ADN das fitases modificadas específicas da presente invenção ou uma sequência de ADN que, por causa da degeneração do código genético, não se hibridí-ze, mas que codifique um polipeptídeo com exatamente a mesma sequência de amínoácidos que aquela codificada pela sequência de ADN para qual ela não se hibridize ou uma seqüència de ADN que seja um fragmento de tais sequências de ADN que mantenha as propriedades de atividade do polipeptídeo do qual ela é um fragmento. "Condições padrão" para hibridização significam, no contexto das condições que são geralmente usadas por um técnico especializado no assunto, para detectar sinais de hibridização específicos e que são descritos, por exemplo, por Sambrook et a!., "Molecular Cloning", segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, New York, ou, de preferência, a assim chamada hibridização estrita e condições de lavagem não-estritas ou mais preferivelmente a assim chamada hibridização estrita e condições de lavagem estritas, com as quais um técnico especializado no assunto está familiarizado, são descritas, por exemplo, em SAmbrook et ai, (s.a.).

Além disso, é um objetlVo da presente invenção fornecer uma seqüència de ADN que pode ser obtida pelo assim chamado processo de reação em cadeia de polimerase {"RCP") por iniciadores de RCP projetados com base nas seqüências de ADN especifica mente descritas da presente invenção. É entendido que as seqüências de ADN assim obtidas codificam fitases com pelo menos a mesma mutação que aquelas a partir das quais elas são projetadas e mostram propriedades de atividades comparáveis.

Os princípios do processo de reação em cadeia de polimerase (RCP) são delineados, por exemplo, por White et al., Trends in Genetics, 5, 185-189 (1989), enquanto que processos aperfeiçoados são descritos, por exemplo, em Innis et al. [PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. (1990}].

Sequências de ADN da presente invenção podem ser construídas partindo-se de seqQèncias de ADN genòmico ou de cADN que codifiquem fitases conhecidas no estado da técnica [para informação de seqüên-cias ver as referências mencionadas acima, por exemplo, a patente européia 684 313 ou as bases de dados de seqüências, por exemplo, como o Genbank (Intelligenetics, Califórnia, EUA), European Bioinformatics Institute (Hinston Hall, Cambhdge, Grã Bretanha}, NBRF (Georgetown University, Medicai Centre, Washington DC, EUA) e Vecbase (University of Wisconsin, Biotechnology Centre, Madison, Wisconsin, EUA) ou reveladas nas figuras por processos de mutagènese in vitro [ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]. Uma estratégia amplamente usada para tal "mutagènese sítio dirigida", como original mente delineada por Hurchinson e Edgell [J. Vi rol., 8, 181 (1971)], envolve o anelamento de um oligonucleotídeo sintético portando a substituição de nucleotídeo desejado para uma região de alvo de uma sequência de ADN de cadeia única, em que a mutação deva ser introduzida [para revisão ver Smith, Annu, Rev. Genet, 19, 423 (1985) e para processos aperfeiçoados ver as referências 2-6 em Stanssen et al., Nucl. Acid Res., 17, 4441-4454 (1989)]. Outra possibilidade de se mutar uma dada sequência de ADN, que é também preferida para a prática da presente invenção é a mutagêne-se usando-se a reação em cadeia de polimerase (RCP). ADN como material de partida pode ser isolado por processos conhecidos no estado da técnica e descritos, por exemplo, em Sambrook et al. (Molecular Cloning) a partir das cepas respectivas. Para informação de cepas, ver, por exemplo, a patente européia 684 313 ou qualquer autoridade depositária indicada abaixo. Ásperoillus nicrer [ATCC 9142], Mvceliophthora thermophila [ATCC 48102], Talaromvcas thermophilus [ATCC 20186] e Asoeraillus fumiaatus [ATCC 34625] foram redepositados em 14 de março de 1997, de acordo com as condições do Tratado de Budapeste no American Type Culture Cell Collee-tion sob os seguintes números de acesso: ATCC 74337, ATCC 74340, ATCC 74338 e ATCC 74339, respectiva mente. Entretanto, é entendido que o ADN que codifique uma fitase a ser mutada de acordo com a presente invenção também pode ser preparada com base em uma seqüência de ADN conhecida, por exemplo, conforme mostrado na Figura 6, de uma maneira sintética e descrita, por exemplo, na patente européia 747 483 por processos conhecidos no estado da técnica.

Uma vez que as seqüências de ADN completas da presente invenção tenham sido obtidas, elas podem ser integradas em vetores por processos conhecidos no estado da técnica e descritos, por exemplo, em Sam-brook et al. (s.a.) para sobreexpressar o polipeptídeo codificado em sistemas de hospedeiro apropriados. Entretanto, um técnico especializado no assunto sabe que também as próprias seqüências de ADN podem ser usadas para transformar os sistemas de hospedeiros adequados da invenção para se obter a sobreexpressão do polipeptídeo codificado. Sistemas de hospedeiro apropriados são, por exemplo, fungos, como Aspergílli, por exemplo, Ásperailtus nioer [ATCC 9142] ou Asperoillus ficuum [NRRL 3135] ou como Trichoderma, por exemplo, Thchoderma reesei. ou leveduras, como Saccharomyces, por exemplo, Saccharomvces cerevisae. ou Píchía, como Pichia pastoris, ou Hansenula polvmorpha, por exemplo, H. polvmor-oha (DSM5215). Um técnico especializado no assunto sabe que tais micror-oanismos estão disponíveis a partir de autoridades depositárias, por exemplo, o American Type Culture Cell Collection (ATCC), o Centraalbureau voor Schímmelcultures (CBS) ou o Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) ou qualquer outra autoridade depositária conforme listada no Jornal "Industrial Property" [(1991), 1, páginas 29-40]. Bactérias que podem ser usadas são E. coli, Bacilli como, por exemplo, Bacillys subtilis ou Streptomyces, por exemplo. Streptomyces lividans (ver, por exemplo, Anné e Mallaert em FEMS Microbiol. Letters, 114. 121 (1993). E. coli, que podería ser usada são cepas de E. coli K12, por exemplo, M15 [descritas como DZ 291 por Villarejo et al,, em J. Bacteriol., 120, 466-474 (1974)], HB 101 [ATCC n° 33694] ou E. coli SG13009 [Gottesman et al., J, Bacíeriol., 148, 265-273 (1981)].

Vetores que podem ser usados para a expressão em fungos são conhecidos no estado da técnica e descritos, por exemplo, na patente européia 420 358, ou por Cullen et al., [Bio/Technology, 5, 369-376 (1987)] ou Ward em Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for Fila-mentous Fungi, Marcei Dekker, New York (1991), Upshall et al., [Bio/Technology, 5, 1301-1304 (1987)] Gwynne et al. [Bio/Technology, 5, 71-79 (1987)], Puntet al. [J. Biotechnol,, 17, 19-34 (1991)] e para leveduras para Sreekrishna et al. [J, Basic Mícrobiol., 28, 265-278 (1988), Biochemis-try, 28, 4117-4125 (1989)], Hitzemann et al. [Nature, 293, 717-722 (1981)] ou na patente européia 183 070, na patente européia 183 071, na patente européia 248 227, na patente européia 263 311. Vetores adequados que podem ser usados para a expressão em E. coli são mencionados, por exemplo, por Sambrook et al. [s.a.] ou por Fiers et al., em Procd. 8th Int. Bi-otechnology Symposium [Soc. Franc, de Mícrobiol,, Paris (Durand et aL, eds.), páginas 680-697 (1988)] ou por Bujard et al., em Methods in En-zymology, eds. Wu e Grossmann, Academic Press, Inc., Vol. 155. 416-433 (1987) e Stüber et al., em Immunological Methods, eds. Lefkovits e Pernis, Academic Press, Inc., Vol. IV, 121-152 (1990). Vetores que poderíam ser usados para expressão em Bacilli são conhecidos no estado da técnica e descritos, por exemplo, na patente européia 405 370, Procd. Natl. Acad. Sei. EUA, 81, 439 (1984) por Yansura e Henner, Meth. Enzymol., 185. 199-288 (1990) ou a patente européia 207 459. Vetores que podem ser usados para a expressão em H. Polvmoroha são conhecidos no estado da técnica e descritos, por exemplo, em Gellínsen et al., Biotechrology, 9, 291 -295 (1991).

Ou tais vetores já portam elementos reguladores, por exemplo, promotores, ou as seqüèncias de ADN da presente invenção podem ser engenhe iradas para conter tais elementos. Elementos de promotor adequados que podem ser usados são conhecidos no estado da técnica e são, por exemplo, para Trichoderma reesei. o promotor cbh1 [Haarki et al., Bio- hnofogy, 7, 596*600 (1989)] ou o promotor pki1 [Schindler et ai, Gene, 3, 271-275 (1993)], para Aspergilius oryzae, o promotor amy [Christensen ai, Abstr. 19th Lunteren Lectures on Molecular Genetics F23 (1987), ristensen etal., Biotechnolgy, 6,1419-1422 (1988), Tada et ai, Mol. Gen. net., 229. 301 (1991)], para Asoeraillus niaer o promotor glaA [Cullen et Bio/Technology, 5, 369-376 (1987), Gwynne et al., Bio/Technology, 5, 3-719 (1987), Ward em Molecular Industrial Mycology, Systems and plications for Filamentous Fungi, Marcei Dekker, New York, 83-106 191)], promotor alcA [Gwynne et al., Bio/Technology, 5, 718-719 (1987)], imotor suc1 [Boddy et al., Gurr. Gen et., 24, 6066 (1993)], promotor aphA acRae et al., Gene, 71, 339-348 (1988), MacRae et al, Gene, 132. 193-3 (1993)], promotor tpiA [McKnight et ai, Cell, 46, 143-147 (1986), Up-all et al., Bio/Technology, 5, 1301-1304 (1987)], promotor gpdA {punt et Gene, 69, 49-57 (1988), Punt et al., J. Biotechnoi, 17, 19-37 (1997)} e o imotor pkiA [de Graaff et ai, Curr. Genet., 22, 21-27 (1992)]. Elementos promotor adequados que poderíam ser usados para a expressão em le-dura são conhecidos no estado da técnica, por exemplo, o promotor pho5 jgel et ai, Mol. Cell. Bio!., 2050-2057 (1989); Rudotf e Hinnen, Proc. Natl. ad. Sei., 84, 1340-1344 (1987)] ou o promotor gap para a expressão em ochromvces cerevisae e para Pichia pastoris, por exemplo, o promotor <1 [Koutz et ai, Yeast, 5,167-177 (1989); Sreekrishna et al., J. Basic Mí-íbioi, 28, 265-278 (1988)], ou o promotor FMD {Holienberg et ai, EPA 0299108] ou promotor MOX [Ledeboer et ai, Nucleic Acids Res., 13, 33-3082 (1985)] para H. oolvmorpha.

Consequentemente, vetores compreendendo seqüèncias de iN da presente invenção, de preferência, para a expressão das ditas se-ãncias de ADN em hospedeiros de bactérias ou fúngico ou de levedura e s hospedeiros de bactérias ou fúngicos ou de levedura são também um jetivo da presente invenção.

Uma vez de tais sequências de ADN foram expressas em uma ula de hospedeiro apropriada em um meio adequado, a fita se pode ser fada ou a partir do meio, no caso que a fitase é secretada para o meio, ou a partir do organismo hospedeiro, no caso que tal fitase esteja presente Intrace lula rmente por processos conhecidos no estado da técnica de purificação de proteínas ou descritos, por exemplo, na patente européia 420 358, Consequentemente, um processo para a preparação de um polipeptídeo da presente invenção caracterizado pelo fato de que bactérias transformadas ou uma célula de hospedeiro conforme descritas acima são cultivadas sob condições de cultura adequadas e o polipeptídeo é recuperado a partir delas e um polipeptídeo quando produzido por um tal processo ou um polipeptídeo codificado por uma sequência de ADN da presente invenção são também um objetivo da presente invenção.

Fitases da presente invenção também podem ser expressas em plantas de acordo com os processos conforme descritos, por exemplo, por Pen et aL, em Bio/Technology, JM, 811-814 (1994) ou na patente européia 449 375, de preferência, em sementes, conforme descrito, por exemplo, na patente européia 449 376.

Por exemplo, uma sequência de ADN que codifique uma fitase da presente invenção pode ser colocada sob o controle de seqüèncias reguladoras a partir do gen que codifique a cruciferina de proteína de armazenamento 12S a partir de Brassica napus. O construto é, depois disso, subclonado em um vetor binário, tal como pMOG23 (em DH5ct de cepa K-12 de E. coli, depositado no Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holanda, sob o número de acesso CBS 102,90), Esse vetor é introduzido em Aorobacterium tumefaciens. que contém um pl asm ideo Ti desarmado. Células de bactérias contendo esse construto são co-cultivadas com tecidos a partir de tabaco ou de plantas de Brassica, je células de plantas transformadas são selecionadas por meios nutrientes contendo antibióticos e induzidas a se regenerarem para formar plantas diferenciadas em tais meios. As plantas resultantes produzirão sementes que contém e expressam o construto de ADN^Ou a sequência de ADN que codifica fitase pode ser colocada sob o controle de seqüèncias reguladoras a partir do promotor 35S de vírus de mosaico de couve-flor (CaMV). O construto é, depois disso, subclonado em um vetor binário. Esse vetor é, então, introduzido em Aorobacterium tu- nefadens, que contém um plasmícteo Ti desarmado. Células de bactérias contendo esse construto são co-cuitívadas com tecidos a partir de tabaco e le plantas de Brassica, e células de plantas transformadas são selecionadas por meios nutrientes contendo antibióticos e induzidas a se regenera-em para formar plantas diferenciadas em tais meios. As plantas resultantes ;ontêm e expressam o construto de ADN constitutivamente. A planta ou a parte de planta contendo fítase pode ser usada diretamente para a preparação de uma composição de alimentos ou pode ser extraída a partir de plantas ou de órgãos de plantas por processos conhecidos no estado da técnica. Consequentemente, é também um objetivo da presente invenção fornecer um processo para a produção das fitases da nresente invenção em plantas ou órgãos de plantas, como sementes, as fi-:ases, quando produzidas por tais processos, as plantas transformadas e os ãrgãos de plantas, como as próprias sementes.

Uma vez obtidos os polipeptídeos da presente invenção, eles oodem ser caracterizados considerando-se as suas propriedades que os :ornam úteis na agricultura por qualquer teste conhecido no estado da técnica e descrito, por exemplo, por Simons et al. [Br. J. Nutr., 64, 525-540 [1990)], Schõner et al. [J. Anim. Physiol. A. Anim. Nutr., 66, 248-255 (1991)], i/ogt [Arch. Geflügelk, 56, 93-98 (1992)], Jongbioed et al. [J. Anim. Sei., 70, 1159-1168 (1992)], Pemey et al. [Poultry Sei., 72, 2106-2114 (1993)], Farrel st al. [J. Anim. Physiol. a. Anim. Nutr,, §9, 278-283 (1993), Broz et al. [Br. Poultry Sei., 35, 273-280 (1994)} e Düngelhoef et al. [Animal Feed Sei, Te-chnol., 49, 1-10 (1994)] podem ser usados.

Em geral, os polipeptídeos da presente invenção podem ser usados sem estarem limitados a um campo de aplicação específico para a conversão de inosítol polifosfatos, como fitato a inositol e fosfato inorgânico.

Além disso, os polipeptídeos da presente invenção podem ser usados em um processo para a preparação de alimento ou alimentos compostos, em que os componentes de uma tal composição são misturados com um ou mais polipeptídeos da presente invenção. Consequentemente, alimento ou alimentos compostos compreendendo um ou mais polipeptídeos da presente invenção são também um objetivo da presente invenção. Um técnico especializado no assunto está familiarizado com seu processo de preparação. Tal alimento ou tais alimentos compostos podem compreender, adicionalmente, aditivos ou componentes geralmente usados para tal finalidade e conhecidos no estado da técnica.

Além disso, é um objetivo da presente invenção fornecer um processo para a redução de níveis de fitato em esterco animal caracterizado pelo fato de que um animal é alimentado com uma tal composição em uma quantidade eficaz em converter o fitato contido no alimento em inositol e fosfato inorgânico.

Antes de descrever a presente invenção em maiores detalhes, uma breve explanação das Figuras em anexo é dada abaixo.

Legendas das Figuras Figura 1: Alinhamento de seqüência primária de fitase de A. ni- ger (ficuum) (SEQ ID NO: 15), de A. terreus cbs116.46 e de A. fumioatus [ATCC 13073] (SEQ ID NO: 16). As estrelas mostram resíduos idênticos dentro do sítio ativo e os retângulos mostram resíduos não-idênticos dentro do sítio ativo.

Figura 2: Curvas ótimas de pH. Atividade específica de fitases de A. fumigatus do tipo selvagem e mutante são plotadas contra o pH de incubação. Os quadrados cheios representam fitase do tipo selvagem de A. fumigatus: triângulos abertos representam mutante de A. fumigatus Q27L; círculos cheios representam mutantes Q27L, Q274L de A. fumigatus: quadrados abertos representam mutantes Q27L, Q274L, G277D de A. fumigatus. Figura 3: Especificidades de substrato de fitases de A. fumigatus de tipo selvagem e de tipo mutante. (A) tipo selvagem; (B) mutante simples Q27L; (C) mutante triplo Q27L, Q274L, G277D. Os seguintes substratos foram usados: (1) ácido fítico; (2) fosfato de p-nitrofenila; (3) frutose- 1,6-bisfosfato; (4) frutose-6-fosfato; (5) glicose-6-fosfato; (6) ribose-5-fosfato; (7) a-glicerofosfato; (8) β-glicerofosfato; (9) 3-fosfoglicerato; (10) fosfoenol-piruvato; (11) AMP; (12) ADP; (13) ATP.

Figura 4: Seqüência de codificação completa (SEQ ID NO: 1) e seqüência de aminoácidos codificada (SEQ ID NO: 2) da fitase de Asoergillus nidulans.

Figura 5: Seqüência de codificação completa (SEQ ID NO: 3) e seqüência de aminoácidos codificada (SEQ ID NO: 4) da fitase de Talaromvces thermophilus.

Figura 6: Seqüência de codificação completa (SEQ ID NO: 5) e seqüência de aminoácidos codificada (SEQ ID NO: 6) da fitase de Asoergillus fumiqatus [ATCC 13073].

Figura 7: Seqüência de codificação completa (SEQ ID NO: 7) e seqüência de aminoácidos codificada (SEQ ID NO: 8) da fitase de Asoergillus terreus CBS 116.46.

Figura 8: Dados cristalográficos da estrutura da fitase de Asper- qillus niqer.

Figura 9: Especificidades de substrato de fitase (N1-N6) de A. fumiqatus de tipo selvagem e mutante. Substratos 1 a 13 são conforme indicados para a Figura 3.

Figura 10: Curvas ótimas de pH de outras fitases de A. fumiqatus mutantes (N1-N6). Todos os valores de atividade foram padronizados (atividade máxima = 1,0).

Figura 11a: Estéreo-figura da dobra tridimensional de fitase de A. niqer (A. ficuum: NRRK 3135). O sítio ativo é indicado com um círculo e os resíduos de aminoácidos cataliti-camente essenciais Arg 58 e His 59 são mostrados em representação bola-e-traço. Essa figura foi preparada com os programas "MOLSCRIPT" [Kraulis, P.J., Appl. Cryst., 24, 946-950 (1991)] e "RASTER3D" [Merrit, E.A. & Murphy, M.E.P., Acta Cryst., 869-873 (1994)].

Figura 11b: esquete topológico, usando o mesmo esquema que em (a). As cinco pontes de dissulfeto são mostradas como linhas de ziguezague pretas em conjunto com os números de seqüência dos resíduos de cisteínas envolvidos. As fitas β são definidas com os números de sequência A; 48-58; B: 134-138; C: 173-177; D: 332-337; E; 383-391 e F: 398-403. As α-hélices são definidas com os números de seqüência a; 66-82; b; 88-95; c; 107-123; d: 141-159; e; 193-197; f: 200-210; g; 213-223; h: 231-246; i: 257-261; j; 264-281; k: 290-305; I: 339-348; m: 423-429 e n: 439*443. O asterisco na extremidade C-terminal da fita β A marca o local dos resíduos de amínoácidos cataüticamente essenciais Arg 58 e His 59.

Figura 12: Estéreo-figura do sítio ativo de fitase de A. ficuum (ATCC 13073) com um modo de ligação hipotético da fitase de substrato. Nesse modelo, as moléculas de água de cristal de ligação foram removidas e as posições de átomos de proteínas foram mantidas fixas, exceto para pequenas adaptações dos ângulos de torsão de cadeia lateral de lys 68 a fim de interagir com o substrato. Todos os resíduos de aminoácidos conservados Arg 58, His 59, Arg 62, Arg 142, His 338 e Asp 339 formam ligações de hidrogênio ao grupo 3-fosfato passível de cisão de fitato, conforme indicado com linhas de pequenos pontos. His 59 em uma posição favorável para fazer um ataque nucleofílroo no fósforo passível de cisão, indicado com uma linha de pontos maiores, e Asp 339 está em uma posição para protonar o grupo de partida.

Figura 13: Construção dos plasmídios básicos pUC18-AfumgADN e pUC18-AfumcADN para mutagênese sitio dirigida.

Fiaura 14a: Conjuntos de iniciadores A-N usados para a mutagê- nese sítio dirigida.

Fiaura 14b: Conjuntos de iniciadores O-T usados para a mutagê- nese sítio dirigida.

Fiaura 15: Construção de plasmídios pgADNT 1 -pgADNT7.

Fiaura 16: Construção de plasmídios pgADNN1-pgADNN6, Fiaura 17a: Construção de plasmídios pcT 1 -pcT7.

Fiaura 17b: Construção de plasmídios pcT1-Avrll, pcT1-S66D e pcT1-S140Y-D141G.

Fiaura 17c: Construção de plasmídios pcADN-N27, -T27, -I27, - V27, -A27, -G27.

Fiaura 18: Construção de plasmídios pcN 1 -pc-N6.

Fiaura 19: Plasmídeo pAfum-T1 para a expressão de muteína T1 em Asperaillus niaer.

Fiaura 20: Curvas de ótimos de pH. A atividade específica de fita- ses de A. fumiaatus de tipo selvagem e mutante é plotada contra o pH de incubação. Triângulos abertos: fi-tase de tipo selvagem de A. fumiaatus [ATCC 13073]; losangos abertos: fitase de Q27G de A, fumiaatus; quadrados cheios: fitase de 327N de A. fumiaatus. triângulos cheios: fitase Q27V de A. fumiaatus; quadrados abertos: fitase G27A de A. fumiaatus: círculos cheios: fitase Q27I de A. fumiaatus: círculos abertos: fitase Q27T de A. fumiaatus; linha tracejada: fitase G27L de A. fumiaatus.

Fiaura 21: Especificidade de substrato de fitases de A. fumiaatus [ATCC 13073] de tipo selvagem e mutante. Os substratos 1-13 usados são os mesmos que os mencionados na Figura 3. As atividades específicas das diferentes fitases com qualquer um dos 13 substratos testados sâo dadas na seguinte ordem {da esquerda para a direita): fitase de A fumiaatus do tipo selvagem» fita-* se Q27N de A. fumigatus. fitase Q27T de A. fumigatus. fítase Q27L de A. fumigatus, fitase Q27I de A. fumiaa-tus. fitase Q27V de A. fumigatus. fitase Q27A de A. fumigatus, fitase Q27G de A. fumigatus.

Fiaura 22: Curvas de ótimos de pH. Atividade específica de fita- ses de A. fumigatus [ATCC 13073] de tipo selvagem e mutante é plotada contra pH de incubação. Losangos cheios: fitase de tipo selvagem de A. fumigatus: quadrados cheios: mutante simples Q27L de A. fumigatus: círculos abertos: mutante duplo Q27L-S66D de A. fumigatus: triângulos cheios: mutante triplo Q27L-S140Y-D141G de A. fumigatus.

Figura 23: Variação natural de fitases em diferentes isolados de A. fumigatus [ATCC 13073], As sequências de proteínas previstas são mostradas e comparadas àquelas da fitase a partir da cepa ATCC 13073 de A. fumigatus. Somente os aminoácidos que diferem daqueles em n° 13073 sâo mostrados, Fiaura 24: Atividade específica dependente de pH de fitases iso- ladas a partir de duas cepas de tipo selvagem de A fumigatus diferentes. Quadrados abertos: cepa ATCC 13073 de tipo selvagem; círcuíos fechados: cepa ATCC 32239.

Fiaura 25: Especificidades de substrato de fitases isoladas a par- tir de duas cepas de tipo selvagem de A, fumigatus diferentes, Barras pretas: cepa ATCC 13073 de tipo selvagem; barras brancas: cepa ATCC 32239.

Fiaura 26: Construção de olasmídios pc-8130N, pc-R129L-S130N, pc-K167G-R168Q.

Exemplos Exemplo 1 Modelagem de Homoloqía de Fitase cbs116.46 de A. fumiaatus e de A. tenreus As sequências de aminoácidos de fitases de A. fumiaatus [ATCC 13073] (ver a Figura 1} e de A. terreus cbs116.46 (ver a Figura 1) foram comparadas com a seqüència de fitase de A niger (fícuum) (ver a Figura 1) para a qual a estrutura tridimensional tinha sido determinada por cristalografia de raios X. Os dados cristalográficos são dados na Figura 8.

Um alinhamento de seqüència de aminoácidos múltiplo de fitase de A. nioer (fícuum), de fitase de A. fumiaatus e de fitase cbs116.46 de A. terreus foi calculada com o programa "PILEUP" (Prog. Menu for the Wiscon-sin Package, versão de 8 de setembro de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison Wisoonsin, EUA 53711). Os modelos tridimensionais de fitase de A. fumiaatus e de fitase cbs 116.46 de A. terreus foram construídos usando-se a estrutura de fitase de A. nioer (fícuum) como molde e trocando-se os aminoácidos de fitase de A. nioer (fícuum) de acordo com alinhamento de sequências para os aminoácidos de fitase de A. fumiaatus e de fitase cbs116.46 de A. terreus. respectivamente. A construção de modelo e a otimização de energia foram realizadas usando-se o programa Moloc (Gerber e Müller, 1995). Posições C-atfa foram mantidas fixadas exceto para novas inserções/deleções e em regiões de "loop" distantes do sítio ativo.

Somente pequenas diferenças das estruturas modeladas com relação à estrutura de cristal original poderíam ser observadas em "loops" externos. Além disso, as moléculas de substratos diferentes, que ocorrem principal mente na via de degradação de ácido fítico (mio-inositol-hexaquisfosfato) por fitase de Pseudomonas sp. bacterium e, tanto quanto determinado, por fitase de A. nioer (ficuum) (Cosgrove, 1980; Figura 1) foram construídas e moldadas para dentro da cavidade de sítio ativo de cada estrutura de fitase. Cada um desses substratos foi orientado de um modo de ligação hipotético proposto para fosfatases de ácido de histidina (Van Etten, 1982). O grupo fosfato passível de cisão foi orientado em direção a His 59 catalítica mente essencial para formar o intermediário de fosfoenzíma cova-lente. O oxigênio da ligação de fosfoéter de substrato que será protonado por Asp 339 depois da divagem foi orientado em direção ao doador de próton. A relaxaçâo conformacional da parte estrutural restante dos substratos, assim como os resíduos de sítios ativos circundantes foi realizada por otimização de energia com o programa Moloc.

Baseado nos modelos de estrutura, os resíduos apontando para a cavidade de sítio ativo foram identificados. Mais do que a metade (60%) dessas posições eram idênticas entre essas três fitases, enquanto que somente poucas posições não foram conservadas (ver Figura 1). Essa observação poderia ser estendida para quatro seqüèncias de fitase adicionais (A. nidulans. A. tenreus 9A1, Talaromyces thermophilus, Myceliophtora thermo-phila).

Os resultados que vêm do alinhamento das sequências e da informação estrutural, incluindo interações enzima-substrato favoráveis foram combinadas para definir as posições para análise mutacional, que são mostrados na Tabela 1.

Referências: Gerber, P, e Müller, K (1995) "Software" de modelagem molecular Moloc, J. Comput. Aided Mol. Des., 9, 251-268.

Van Etten, R. L. (1982) Human prostatic acid phosphatase: a histidine phos-phatase. Ann. NY Acad. Sei., 390. 27-50.

Cosgrove, D. J. (1980) Inositol phosphates-their chemistry, biochemistry and physiology: studies in organíc chemistry, Capítulo 4. Elsevier Scientific Pu-blishíng Company, Amsterdã, Oxford, New York.

Exemplo 2 Construção de Plasmídios pUC18-AfumoADN e pUC18-AfumcADN

Os plasmídios pUC18-AfumgADN e pUC18-AfumcADN, os construtos básicos para todas as muteínas de A. fumiaatus descritas abaixo foram construídas como se segue. pUC18-AfumgADN; A sequência de ADN genòmico do gen de fitase de Asoeroillus fumiaatus foi obtida por PCR usando-se o "Expand® High Fidelity PCR Kit" (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha) com os ini d adores n° 39 e n° 40 (projetado à base da sequência genõmica mos- trada na Figura 6) e ADN genômico de Aspergillus fumigatus [ATCC 13073} a partir da biblioteca genômica de A. fumigatus (NIH estoque 5233) em um vetor Lambda Fixll [Stratagene, Lugolla, CA 92037, EUA; N°. de catálogo: 946055], Iniciador n° 39: (SEQ ID NO: 9) BspHI

5'TAT ATC ATG ATT ACT CTG ACT TTC CTG CTT TCG3' MIT LTFLLS

Iniciador N°40: (SEQ ID NO: 10) EcoRV 3' CCT CTC ACG AAA TC A ACT CTA TAG ATA TAT 5 G E C F S * A mistura de reação incluiu 10 pmoles de cada iniciador e 200 ng de ADN de molde. 35 rodadas de amplificação foram feitas com os seguintes valores de ciclo: 95°C, 1 min/56°C, 1 min/72°C, 90 segundos. Os gens de muteína de Aspergillus fumigatus amplificados com PCR tinham um novo sítio BspHI no códon de início ATG, introduzido com o iniciador n° 39, que resultou na mudança do segundo aminoáci-do a partir de uma valina para uma isoleucina. Além disso, um sítio E-coRV foi criado com o iniciador n° 40 à jusante do códon de terminação TGA do gen. O fragmento de PCR (aproximdamente 1450 bp) foi subseqüen-temente clonado no sítio Smal de pUC18 usando o "sure clone Kit" (Boe-hringer Mannheim s.a.). O plasmídeo resultante foi denominado pUC18-AfumgADN. pUC18-AfumcADN: Esse plasmídeo carece do intron (letras de intervalo pequenas na Figura 6) do gen de fitase de A. fumigatus e foi construído como delineado na Figura 13. Brevemente, usando-se iniciado-res Fum28 e Fum11, a extremidade 5' de exon 2 foi amplificada por RCP (ver abaixo), digerida com Ncol e Eagl (novo sítio de restrição introduzido com o iniciador Fum28) e ligado em conjunto com o ligador que codifique o exon 1 feito de iniciadores Fum26 e Fum27 nos sítios Xbal e Ncol de pUC18-AfumgADN, por meio do que resulta em plasmídeo pUC18- AfumcADN.

Fum28: (SEQ ID NO: 11) 5' ATATATCGGCCGAGTGTCTGCGGCACCTAGT 3' Eagl Fum11: (SEQ ID NO: 12) 5' TGAGGTCATCCGCACCCAGAG 3' Fum26: (SEQ IDNO:13) 5' CTAGAATTCATGGTGACTCTGACTTTCCTGCTTTCGGCGGCGTATCT GCTTTCC 3' Fum27: (SEQ ID NO: 14) 5’ GGCCGGAAAGCAGATACGCCGCCGAAAGCAGGAAAGTCAGAGTC ACCATGAATT 3' A reação de RCP para se conseguir a extremidade 5' de exon 2 da fitase de A. fumiqatus: 2μΙ_ molde: pUC18-AfumgADN (20 ng) 1 μΙ_ dNTP's-mix (Boehringer Mannheim s.a.) 5 μι Tampão 10χ 1 μΙ_ Taq polimerase (Boehringer Mannheim s.a.) 1,9 μι. Fum11 (= 10 pmoles) 2 μΙ_ Fum28 (= 10 pmoles) 37,1 μΙ_ H20 Em total de 35 ciclos com o perfil de temperatura: 95°C durante 30 seg/56°C durante 30 seg/72°C durante 45 seg foram feitos. O fragmento amplificado (aproximadamente 330 bp) foi extraído uma vez com um volume igual de fenol/clorfórmio (1:1). Para a fase aquosa recuperada, 0,1 volume de acetato de sódio 3 M, pH 4,8 e 2,5 volumes de etanol foram adicionados. A mistura foi centrifugada durante 10 minutos à 12.000 g e o pellet foi res- suspendido em 20 μΙ_ de H20. Subsequentemente, o fragmento purificado foi digerido com Ncol e Eagl e processado como delineado acima.

Exemplo 3 Construção de Muteínas da Fitase de Asoeraillus fumiaatus para a Expressão em A. nioer Para construir todas as muteínas para a expressão em A. nioer. o plasmídeo pUC18-AfumgADN foi usado como molde para a mutagênese sítio dirigida. As mutações foram introduzidas usando-se o "quick exch^n-ge® site-directed mutagenesis kit" a partir de Stratagene (La Jolla, CA, EUA) seguindo o protocolo do fabricante e usando-se os iníciadores correspondentes (Figura 14), Todas as mutações feitas estão resumidas na Tabela 1A β B, em que T1 a T7 e N1 a N6, respectiva mente, referem-se às muteínas e "Mutação" aos aminoácidos substituídos em tal posição. Por exemplo, T5 refere-se a uma muteína com uma mutação dupla: L na posição 27 para Q e L na posição 274 para Q. Os conjuntos de iniciador (A-H) usados para introduzir as mutações correspondentes são mostradas na Figura 14a, O aminoácido recém-introduzido é mostrado em negrito e os índices indicam a posição na enzima de Ásperaillus fumiaatus madura em consideração à numeração da sequência de aminoácidos de A. nioer. As Figuras 15 e 16 delineiam o esquema para a construção de diferentes olasmídios pgT1 -pgT7 e pgN1-pgN6 que codificam as muteínas portando somente uma mutação (T1-T4; N1-N3) ou mais mutações (T5-T7; N4-N6). Clones abrigando as mutações desejadas foram identificados por análise de seqüên-cias de ADN conforme conhecidas no estado da técnica. As fitases mutadas foram verificadas por seqüênciamento completo dos gens.

Exemplo 4 Construção de Muteínas da Fitase de Asoeraillus nioer para a Expressão em Saccharomvces cerevisiae A construção de olasmídios pcT1-pcT7 (Figura 17a) e pcN1-pcN6 (Figura 18), respectivamente, codificando as muteínas T1-T7 e N1-N6 para a expressão em S. cerevisiae foi feita basicamente conforme delineado no Exemplo 3, Ao invés de usar pUC18-AfumgADN como o construto básico para introduzir as mutações, foi usado o pl asm ideo pUC18-AfumcADN (Figura 13).

Os plasmídios pcAON-N27, -G27, -V27, -A27, -I27 e -T27 codificando as muteínas N27, G27, V27, A27, J27 e T27 foram construídos como s® segue: Um sítio de restrição siente para Avrll foi introduzido no plasmí-deo pcT1 por mutagênese sítio dirigida conforme descrito no Exemplo 3 usando-se o conjunto de iníciador I (Figura 14a; Figura 17b). O fragmento de gen de fitase de A. fumioatus Avrll/Xhol foi, então, substituído pelo fragmento ligador abrigando as mutações desejadas (Figura 17c), Cada fragmento de ligador foi gerado por anelamento dos pares respectivos de poli-nucleotídeos sintetizados (Figura 14b; fita em sentido e em anti-sentido (90 ng de cada) durante 3 min â 70°C em 9 μΙ_ de água destilada. A construção de plasmídios pcT1-S66D e pcT1 -S140V-D141G que codificam o mutante duplo Q27L-S66D de A. fumioatus e o mutante triplo Q27L-S140Y-D141G de A. fumioatus foi basicamente realizada no Exemplo 3. O plasmideo pcT1, abrigando a mutação que codifica Q27L, foi usado como molde para a mutagênese sítio dirigida em conjunto com os conjuntos de iníciador correspondentes J e K (Figura 14a; Figura 17b).

Todas as mutações foram verificadas por análise de sequência de ADN do gen inteiro.

Exemplo 5 Expressão em Aspemillus nioer Os gens que codificam as muteínas e fitase de tipo selvagem de A. fumioatus anteriormente mencionadas (Figura 16) foram isolados com BspHI e EcoRV a partir de plasmídios pgADNT 1 -pgADNT7 e pgADNNI-pgADNN6 e ligados no sítio Ncol à jusante do promotor de glicoamílase de Aspemillus nioer (glaA) e sítio de EcoRV à montante do terminador C de triptofano de Aspergillus nidulans (trpC) (Mullaney et al., 1985). Os olasmí-dios de expressão resultantes tinham, em adição, o gen orotidina-5'-fosfato descarboxilase (pyr4) de Neurospora crassa como marcador de seleção. A Figura 19 mostra um exemplo para um tal plasmideo de expressão portando o gen que codifica muteína T1 (van den Hondel et al„ 1991), O plasmídeo de expressão básico descrito acima corresponde basicamente ao vetor pGLAC descrito no Exemplo 9 da patente européia 684 313. A transformação de Aspemillus nioer e expressão das muteínas foi feita conforme descrito na patente européia 684 313. O sobrenadante foi concentrado por meio de ultrafiltração em células de Amicon 8400 (membranas PM30) e dispositivos de filtro centrífugos ultrafree-15 (Biomax-30K, Millipore). O concentrado (tipicamente 1,5-5 mL) foi dessaigado em alíquotas de 1,5 mL em uma coluna Fast Desalting HR 10/10 (Pharmacia Βίο-tech), com acetato de sódio 10 nM, pH 5,0, servindo como tampão de elui-ção. As amostras de A. fumiaatus dessalgadas foram carregadas diretamente em uma coluna de cromatografia de troca de cátions Poros HS/M de 1,7 mL (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA, EUA). A fitase de cbs 116,46 [CBS 220,95] de A. terreus foi diretamente carregada em uma coluna de cromatografia de troca de ânions Poros HQ/M de 1,7 mL. Em ambos os casos, a fitase foi eluída em forma pura por meio de um gradiente de cloreto de sódio.

Referências: Mullaney, E.J., J.E. Hamer, K.A. Robertí, MM. Yelton e W.E. Timberlake. 1985. Primary structure of the trpC gene from Aspergillus nidulans. Mol. Gen. Genet. 199:37-45.

Van den Hondel, C.A.M.J.J., P.J. Punt e R.F.M. van Gorcom. 1991. Hetero-logous gene expression in filamentous fungi. In: More gene manipulations in fungi, pp 396-428. Bennett, J.W. e Lasure, L.L. (eds.). Academic Press, Inc., San D lego, CA.

Exemplo 6 Expressão em Saocharomvces cerevisiae Os gens sem intron que codificam a fitase de tipo selvagem de A. fumiaatus e as diferentes muteínas (Figuras 17/18) mencionadas acima foram isoladas a partir dos plasmídios respectivos pUC18-AfumcADN, pcADNT 1 -pcADNT7 e pcADN1-pcADN6 com EcoRI e EcoRV e subclonados ou entre os sítios de Xhol terminados abruptamente e os sítios de Eco RI de plasmídeo pYES2 (Invitrogen, San Diego, CA, EUA) ou o promotor encurtado GAPFL (gIicera!deido-3-fosfato desidrogenase) e o terminador PH05 conforme descrito por James et al. (1990). A transformação de cepas de Saccharomyces cerevisiae, por exemplo, INVScl (Invitrogen, San Diego, CA, EUA) foi feita de acordo com Hinnen et al. (1978). Colônias simples abrigando o gen de fitase sob o controle do promotor GAPFL foram coletadas e cultivadas em meio de seleção de 5 mL (SD-uracila) (Sherman et al., 1986) à 30°C sob vigorosa agitação (250 rpm) durante 1 dia. A pré-cultura foi, então, adicionada para 500 mL de meio YPD (Sherman et aL, 1986) e cultivadas sob as mesmas condições. Depois de quatro dias o caldo de células foi centrifugado (7.000 rpm, rotor GS3, 15 minutos, 5°C) e o sobrena-dante foi coletado. A indução do promotor GAL1 (plasmídeo pYES2 a partir de Invitrogen, San Diego, CA, USA) foi feita de acordo com as instruções do fabricante. A purificação das muteínas foi conforme descrita no Exemplo 5 (s.a.).

Referências: Janes, Μ,, B. Meyhack, W. Zimmermanrt e A. Hinnen. 1990. The influence de GAP promoter variants on hirudine production, avarage plasmid copy number and cell growth in Saccharomyces cerevisiae. Curr. Genet. 18; 97-103.

Hinnen, A., J.B. Hicks e G.R. Fink. 1978, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 75: 1929-1933.

Sheman, J.P., Finck, G.R. e Hicks, J.B. (1986). Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor Univer-sity Press.

Exemplo 7 Determinação de Atividade de Fitase e de Especificidade de Substrato Atividade de fitase foi medida em uma mistura de teste contendo ácido fítíco à 0,5% (-5 mM), acetato de sódio 200 mM, pH 5,0. Depois de incubação durante 15 minutos à 37°C, a reação foi interrompida por adição de um volume igual de ácido tricloroacético à 15%. Os íons fosfato liberados foram quantificados misturando-se 100 pL de uma mistura de teste com 900 μ!_ de H20 e 1 mL de H2SO4 0,6 M, ácido ascórbioo à 2% e molibdato de amônto á 0,5%. Soluções padrão de fosfato de potássio foram usadas como referência.

No caso das curvas ótimas de pH, enzimas purificadas foram diluídas em acetato de sódio 10 mM, pH 5,0. Incubações foram iniciadas misturando-se alíquotas da proteína diluída com um volume igual de ácido fítico à 1% (-10 mM) em uma série de tampões diferentes: glicina 0,4 M de glicína/HCI» pH 2,5; acetato 0,4 M/NaOH, pH 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5; imi-dazol 0,4 IWHCI, pH 6,0, 6,5; Tris 0,4 M/HCI, pH 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0. Experimentos de controle mostraram que o pH foi somente levemente afetado pela etapa de misturação. As incubações foram realizadas durante 15 minutos à 37°C conforme descrito acima.

Para a determinação das especificidades de substrato de fitases de A. fumiaatus do tipo selvagem e mutante, ácido fítico na mistura de teste foi substituído por concentrações 5 mM dos compostos de fosfato respectivos. Os testes de atividade foram realizados conforme descrito acima.

As concentrações de proteína foram calculadas a partir da DO a 280 nm, usando-se valores de absorção teóricos calculados a partir das sequências de proteínas conhecidas com o "software" D NA* (DNASTAR, Inc., Madíson, Wisconsin, EUA). Uma absorção de DO 1,0 à 280 nm, corresponde a 0,94 mg/mL de fitase de A. fumiaatus e 0,85 mg/mL. de fitase cbs116.46 de A, terreus.

Perfis de pH de mutantes de Asperoillus fumiaatus T1 (Q27L), T5 (Q27L, Q274L) e T6 (Q27L, Q274L, G277D) mudaram drasticamente comparados à fitase de A. fumiaatus do tipo selvagem (ver a Figura 2). Todos os mutantes mostraram perfis de pH iguais. O aumento da atividade específica em pH 5,0 das muteínas quando comparada à fitase do tipo selvagem de Asperaillus fumiaatus é mostrada na Tabela 2. Atividades de enzima foram medidas sob condições de teste padrão em pH 5,0. Tomou-se a média de várias medições individuais (n. número de testes). 0 perfil de pH de mutante Q27A de fitase de A. fumiaatus se parece com o perfil de pH de fitase de tipo selvagem de A. fumiaatus sobre aproximadamente toda a faixa de pH (Figura 20), Enquanto que a atividade específica de fitase de tipo selvagem é decrescente em valores de pH abaixo de pH 4,0, a atividade específica do mutante Q27A de fitase permanece aproximadamente constante abaixo de pH 2,9. ^ As mudanças de aminoácidos simples Q27L, Q27I, Q27V ou Q27T aumentaram notavelmente a atividade específica sobre toda a faixa de pH, especialmente entre pH 5,0 e 7,5 (Figura 20), Valores máximos são alcançados em pH 6,5. Em adição, a mutação Q27T provocou os valores de atividade específica mais elevados para ácido fítico em pH baixo (pH 3,0-5,0), Atividades específicas mais elevadas são também obtidas pelas mutações simples G27G ou Q27N, entre pH 2,5 e 7,0, com valores máximos em pH 6,0 (Figura 20), A atividade especifica diminui em valores de pH abaixo de 3,5.

Todos os mutantes simples ainda mostram uma ampla especificidade de substrato que ê comparável àquela de fitase de tipo selvagem de A. fumiaatus (Figura 21). Alguns dos mutantes mostram atividades específicas significativamente mais elevadas do que outros mutantes para substratos selecionados, por exemplo, o mutante Q27T para fosfato de p-nítrofeniia e ATP, ou o mutante Q27G para fosfoenolpiruvato.

Como mostrado na Figura 22, a combinação de mutação Q27L com S66D ou S140Y e D141G conduziu a um deslocamento do perfil de pH em direção a pH mais baixo. A atividade específica máxima conseguida pela mutação simples Q27L é adicional mente aumentada pelas trocas de aminoácidos adicionais.

Conforme mostrado na Figura 3, o mutante T1 (Q27L) de fitase de Asperaillus fumiaatus não mostraram diferença em especificidade de substrato comparado ao mutante triplo T6 (G27L, Q274L, G277D).

Os perfis de pH das muteínas N1 -6, exceto N2, mostram diferenças significativas comparados à fitase de tipo seivagem{Figura 10). Enquan- to que o perfil de pH de muteína N4 é expandido em direção ao pH mais baixo, os perfis de muteínas N3 a N6 são deslocados em direção ao pH mais baixo. As muteínas N5, N6 alcançam atividade máxima já em pH 3,0.

As muteínas N1 a N6 mostram, em quase todos os casos, uma redução drástica em atividade específica para todos os substratos testados, exceto para ácido fítico (Figura 9). A atividade específica para ácido fítico permaneceu inalterada comparada â fítase de tipo selvagem, enquanto que os mutantes N3 e N6 mostram uma atividade tendencial mais elevada (Figura 19).

Tabela 1 A) Mutações com relação à fítase cbsi 16.46 de A. terreus B) Mutações com relação à fitase de A. niaer (fiaium) Tabela 2 U/mg Fitase de tipo selvagem de A. fumiaatus 26,5 + 5,2 22 Q27L de A. fumiaatus 83,4 4 Q27L, Q274L de A. fumiaatus 88,7 ±13,5 8 Q27L, Q274L, G277D de A. fumiaatus 92,3 ±12,0 9 Fitase cbs116.46 de A. terreus 195,8 ± 17,8 7 Tabela 3 Atividade específica sob condições de teste padrão em pH 5.0. Desvio padrão médio é de 10%.

Exemplo8 Como uma abordagem alternativa para se obter fitases com características modificadas e para se obter uma melhor idéia sobre a variação natural encontrada em características de fitase dentro de certas espécies, variantes que ocorrem naturatmente de fitase de A. fumigatos foram analisadas. Gens de fitase foram obtidos a partir de seis isolados diferentes de A. fumíaatus. A sequência de aminoácidos de fitase a partir de dois dos isolados de A. fumioatus (ATCC 26934 e ATCC 34625) não mostrou diferença com relação à sequência de aminoácidos original de fitase de A. fu-mioatus ATCC 13073 de tipo selvagem. Fitase a partir de três outros isolados tinha uma ou duas substituições de aminoácidos, nemhuma das quais diretamente afetou o sítio ativo. As características enzimáticas permaneceram nâo afetadas por essas substituições (náo-mostrado). A fitase de isolado de A. fumioatus (ATCC 32239) diferiram em 13 posições na sequência de sinal e 51 posições na parte madura da proteína comparada á fitase de A. fumioatus (ATCC 13073) de tipo selvagem originai. Várias dessas substituições afetam aminoácidos variáveis da cavidade de sítio ativo. Isso re- sultou em um aumento em atividade especifica com ácido fítico como substrato (47 U/mg, teste de enzima padrão) e em perda de atividade enzimática acima de pH 7 (Figura 24). Também nesse caso, a atividade específica contra ácido fítico foi aumentada com relação às atividades específicas com outros substratos (Figura 25).

Exemolo 9 Construção de plasmídios poS130N. pc-R129L-S130N, po-K167G-R168Q codificando o mutante simples S130N e mutante duplo R129L-S130N de fitase de A fumíoatus [ATCC 13073] e mutante duplo K167G-R168Q de fitase de A. nidulans foi basicamente realizada conforme descrito no Exemplo 3. O plasmídeo pUC18-AfumcADN foi usado como molde para mutagênese sítio dirigida em conjunto com os conjuntos de ini-ciador correspondentes L, M e N (Figura 14a; Figura 26).

Todas as mutações foram verificadas por análise de sequência de ADN do gen inteiro.

Exemplo 10 Quando expressas em A. niaer e armazenadas como sobrena- dantes de cultura concentrados à 4ÔC, as fitases a partir de A. fumíoatus. A nidutans exibiram a tendência para sofrer degradação proteolítica. O se-qüêncíamento N-terminal de fragmentos sugeriu que a divagem ocorreu entre aminoácidos S130-V131 e K167-R168, respectivamente. Comparado com a estrutura 3D de fitase de A. nioer. revelou-se que todos os sítios de divagem são encontrados dentro de estruturas de "loop" de superfície exposta e são, portanto, acessíveis a proteases. Â mutagênese sítio dirigida em sítios sensíveis a proteases de fitase de A. fumíoatus {S130N, R129L-S13QN) e fitase de A. nidulans (K167G-R168Q) produziu proteínas mutantes com suscetibilidade consideravelmente reduzida à proteólise.

Em contraste à expressão em A. nioer a degradação proteolítica não foi observada quando as fitases foram expressas em Hansenula po-lymorpha.

Claims (5)

1. Fitase modificada de Aspergillus fumigatus com uma atividade específica aperfeiçoada frente à atividade específica da fitase não-modificada, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos da fitase não-modifícada foi alterada na posição correspondendo à posição 23 da SEQ ID NO:16 para um amínoácido selecionado a partir do grupo consistindo em Ala, Vai, Leu, He, Thr, Asn e Gly,

2. Fitase modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos da SEG ID NO: 16 compreende ainda uma mutação adicional selecionada a partir do grupo consistindo em S62D, S136Y, D137G e Q269L,

3. Fitase modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16 foi alterada como segue: Q23L e S62D.

4. Fitase modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16 foi alterada como segue; Q23L, S136Y e D137G.

5. Alimento ou composição alimentícia, caracterizado pelo fato de que compreende uma fitase modificada, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.