BRPI1010704B1 - Polipeptídeo recombinante, proteína de fusão recombinante, preparação farmacêutica e uso da mesma - Google Patents

Polipeptídeo recombinante, proteína de fusão recombinante, preparação farmacêutica e uso da mesma Download PDF

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treatment
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Jasbir Seehra
Ravindra Kumar
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Acceleron Pharma Inc
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Abstract

proteínas de fusão actriib truncadas. em certos aspectos, a presente invenção fornece composições e métodos para modular (promover ou inibir) o crescimento de um tecido, tal como um osso, cartilagem, músculo, gordura, gordura marrom e/ou tecido neuronal e para o tratamento de distúrbios metabólicos, tais como diabetes e obesidade, bem como distúrbios associados com qualquer um dos tecidos já mencionados.

Description

Referência Cruzada aos Pedidos Relacionados
[001]Este pedido de patente reivindica os benefícios dos Pedidos de Patente Provisórios US 61/268,420, depositado em 12 de junho de 2009 e US 61/280,543, depositado em 3 de novembro de 2009. Esses pedidos de patente são aqui inteira-mente incorporados como referência.
Fundamentos da Invenção
[002]A superfamília do fator de transformação do crescimento beta (TGF- beta) contém uma variedade de fatores de crescimento que compartilham elementos de sequência comuns e motivos estruturais. Estas proteínas são conhecidas por exercer efeitos biológicos em uma grande variedade dos tipos de células em animais vertebrados e invertebrados. Membros da superfamília desempenham funções im-portantes durante o desenvolvimento embrionário na formação de padrões e especi-ficações do tecido e podem influenciar uma variedade de processos de diferencia-ção, incluindo adipogênese, miogênese, condrogênese, cardiogenesis, hematopoi- ese, neurogênese e diferenciação de células epiteliais. A família é representada por proteínas denominadas, de forma variada, ativinas e inibinas, fatores de diferencia-ção e de crescimento TGF-beta (GDFs) e fatores morfogenéticos dos ossos (BMPs). Outros membros da família também são conhecidos, como Nodal e Lefty. Pela ma-nipulação da atividade de um membro da família TGF-beta, é muitas vezes possível induzir significativas alterações fisiológicas em um organismo. Por exemplo, os novi-lhos de gado Piedmontese e Belgas Azuis carregam uma mutação de perda de fun-ção no gene GDF8 (também chamado miostatina) que causa um aumento significa-tivo na massa muscular. Grobet et al. Nat Genet. 1997, 17 (1): 71-4. Além disso, em humanos, os alelos inativos do GDF8 estão associados com aumento da massa muscular e, alegadamente, a uma força excepcional. Schuelke et al., N Engl J Med 2004, 350:2682-8.
[003]Alterações no músculo, osso, gordura, cartilagem e em outros tecidos podem ser obtidas através da sinalização agonista ou antagonista que é mediada por meio de um adequado membro da família TGF-beta. Assim, há uma necessidade de agentes que funcionem como reguladores potentes da sinalização por membros da superfamília TGF-beta.
Sumário da Invenção
[004]Em certos aspectos, a presente divulgação fornece novos polipeptídeos ActRIIB, particularmente, truncamentos terminais amino e carboxi e alterações de sequência. Em uma modalidade, polipeptídeos incluindo aminoácidos 25-131 de Ac- tRIIB humanos (SEQ ID No: 1) ou suas variantes, são descritos. Tais polipeptídeos demonstram ter eficácia surpreendente no tratamento de uma variedade de distúr-bios, mais particularmente doenças associadas à obesidade, resistência à insulina e outros distúrbios metabólicos. Os polipeptídeos ActRIIB divulgados neste documento podem ser usados de modo a ter uma variedade de efeitos desejáveis em pacientes, incluindo, por exemplo, aumento da massa corporal magra, redução da massa gorda branca, aumento da massa de gordura marrom, redução dos triglicerídeos séricos, diminuição dos níveis séricos de insulina ou redução dos níveis séricos de ácidos graxos livres. Os polipeptídeos ActRIIB divulgados aqui podem ser usados para o tratamento de uma variedade de doenças ou condições, incluindo distúrbios muscu-lares e neuromusculares (por exemplo, distrofia muscular, esclerose lateral amiotró- fica (ELA), e atrofia muscular), distúrbios do tecido adiposo (por exemplo, obesidade, doença de gordura hepática), distúrbios metabólicos (por exemplo, diabetes tipo 2, resistência à insulina, síndrome metabólica), doenças neurodegenerativas, e perda de massa muscular associada à idade avançada (sarcopenia), terapia de câncer de próstata (por exemplo, terapia de privação de androgênio), e caquexia associada a uma variedade de cânceres. Exemplos de polipeptídeos ActRIIB incluem uma prote-ína de fusão ActRIIB-Fc humana estabelecida na SEQ ID No: 8 e aqui descrita como ActRIIB (25-131)-hFc.
[005]Em certos aspectos, a divulgação fornece novos polipeptídeos que são derivados de ActRIIB (referido como polipeptídeos ActRIIB). Em algumas modalida- des, um polipeptídio pode ser selecionado do grupo que consiste de: um polipeptídio compreendendo uma sequência de aminoácidos no qual a sequência de aminoáci- dos consiste na sequência da SEQ ID No: 8 ou uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID No: 8 em não mais de um, dois, três, quatro ou cinco posições de aminoácidos; um polipeptídio produzido pela expressão em uma célula de mamíferos do ácido nucléico da SEQ ID No: 4 ou um ácido nucléico que hibridiza sob condi-ções rigorosas ao seu complemento; um polipeptídio produzido pela expressão em uma célula de mamíferos do ácido nucléico da SEQ ID No: 6 ou um ácido nucléico que hibridiza sob condições rigorosas ao seu complemento. Um polipeptídio aqui divulgado pode incluir uma porção derivada de ActRIIB e uma ou mais porções hete- rólogas, onde a porção derivada de ActRIIB pode incluir uma sequência de aminoá- cidos que consiste na sequência de aminoácidos 25-131 da SEQ ID No: 1 ou um aminoácido sequência que difere da sequência de aminoácidos 25-131 da SEQ ID No: 1 em não mais de um, dois, três, quatro ou cinco posições de aminoácidos. A porção heteróloga pode incluir um domínio constante de uma imunoglobulina, um domínio Fc de uma imunoglobulina ou, particularmente, um domínio Fc de uma IgG1 humana (o “termo IgG1 humana” deve ser entendido como incluindo variantes de Fc de tal forma que sejam compatíveis com o uso em seres humanos). Polipeptídeos ActRIIB podem incluir uma porção derivada de ActRIIB que compreende uma se-quência de aminoácidos que consiste na sequência de aminoácidos 25-131 da SEQ ID No: 1. Um polipeptídio ActRIIB aqui divulgado pode ser tal que o terminal amino tenha sequência ETR. Um polipeptídio ActRIIB aqui divulgado pode causar um au-mento estatisticamente significativo na massa corporal magra em um camundongo, após quatro semanas de tratamento duas vezes por semana a um nível de dosagem de 10 mg/kg. O aumento médio da massa de tecido magro pode ser pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5 ou mais gramas. Um polipeptídio ActRIIB aqui divulgado pode causar uma diminuição estatisticamente significativa da massa gorda em um camundongo alimentado com uma dieta rica em gordura, após quatro semanas de tratamento duas vezes por semana a um nível de dosagem de 10 mg/kg. A redução média da massa gorda pode ser 5, 7, 10, 15 ou mais gramas. Um polipeptídio ActRIIB aqui divulgado pode causar uma diminuição estatisticamente significativa nos níveis de triglicerídeos séricos em um camundongo alimentado com uma dieta rica em gordu-ra,após quatro semanas de tratamento duas vezes por semana a um nível de dosa-gem de 10 mg/kg. A redução média nos valores séricos de triglicerídeos podem ser pelo menos 50, 75, 100, 125 ou 150 ou mais mg/dL. Um polipeptídio ActRIIB aqui divulgado pode causar uma diminuição estatisticamente significativa nos níveis séri- cos de ácidos graxos livres em um camundongo alimentado com uma dieta rica em gordura, após quatro semanas de tratamento duas vezes por semana a um nível de dosagem de 10 mg/kg. A redução média em ácidos graxos livres pode de ser pelo menos 500, 750, 1000 ou mais μmol/dL ácidos graxos livres. Um polipeptídio Ac- tRIIB aqui divulgado pode causar uma diminuição estatisticamente significativa nos níveis séricos de insulina em um camundongo alimentado com uma dieta rica em gordura, após quatro semanas de tratamento duas vezes por semana a um nível de dosagem de 10 mg/kg. A redução média nos níveis séricos de insulina pode ser, de pelo menos, 0,5, 1, 1,5, 2 ou mais ng/mL de insulina. Como usado aqui, o termo “es-tatisticamente significativo” geralmente se refere a um valor de p ou > 0,05, mas ou-tras medidas de importância podem ser reconhecidas para diferentes tipos de testes estatísticos, e em tais casos, o termo “estatisticamente significativo” deve usar a fórmula mais amplamente utilizada para avaliar a significância dos dados. Polipeptí- deos ActRIIB podem incluir pelo menos um açúcar N-articulado, e podem incluir dois, três ou mais açúcares N-articulados. Tais polipeptídeos podem também compreender açúcares O-articulados. Os polipeptídeos ActRIIB podem ser produzidos em uma variedade de linhagens de células que glicosilam a proteína de uma maneira que seja adequada para uso dos pacientes, incluindo células de inseto ou de leveduras produzidas por engenharia, e células de mamíferos, tais como células COS, células CHO, células HEK e células NSO. Polipeptídeos ActRIIB podem formar dí- meros covalentes ou não covalentes, incluindo homodímeros. Geralmente, as proteínas de fusão Fc tendem a formar homodímeros que são ligados de forma covalente. Qualquer um dos polipeptídeos precedentes pode ser incorporado a uma preparação farmacêutica.
[006]Em certos aspectos, os polipeptídeos ActRIIB divulgados neste docu-mento se ligam a um ligante ActRIIB como GDF8, GDF11, ativina, BMP7, GDF3 ou nodal. Opcionalmente, um polipeptídio ActRIIB associa-se a um ligante ActRIIB com um Kd menor que 10 μmol ou menor que 1 μmol, 100, 10, 1 ou 0,1 nmol. Um poli- peptídio ActRIIB aqui divulgado pode incluir um, dois, três, quatro, cinco ou mais al-terações na sequência de aminoácidos (por exemplo, no domínio de ligação-ligante) relativamente a um polipeptídio ActRIIB natural. A alteração na sequência de amino- ácidos pode, por exemplo, alterar a glicosilação do polipeptídio quando produzida em uma célula de mamífero, de insetos ou outras células eucarióticas ou alterar cli-vagem proteolítica do polipeptídio relativamente ao polipeptídio ActRIIB naturalmente ocorrente. Um polipeptídio ActRIIB pode ser uma proteína de fusão que tem como um domínio, uma sequência de aminoácidos derivado de ActRIIB (por exemplo, um domínio de ligação-ligante de um ActRIIB ou uma variante dele) e um ou mais domí-nios adicionais que fornecem uma propriedade desejável, como a farmacocinética melhorada, de mais fácil purificação, visando a tecidos particulares, etc. Por exemplo, um domínio de uma proteína de fusão pode melhorar um ou mais de estabilidade in vivo, meia-vida in vivo, captação/administração, localização ou distribuição de tecido, formação de complexos de proteína, multimerização da proteína de fusão, e/ou purificação. Uma proteína de fusão ActRIIB pode incluir um domínio imunoglo- bulina Fc (do tipo selvagem ou mutante) ou uma albumina sérica. Em certas modali-dades, uma ActRIIB-Fc de fusão compreende um articulador relativamente desestru- turado posicionado entre o domínio e o domínio Fc ActRIIB extracelular. Este articu- lador não estruturado pode corresponder aproximadamente à região não estruturada aminoácido 15 na extremidade C-terminal do domínio extracelular de ActRIIB (a “cauda”), ou pode ser uma sequência artificial de entre 5 e 15, 20, 30, 50 ou mais aminoácidos que são relativamente livres de estrutura secundária. O articulador pode ser rico em resíduos glicina e prolina e pode, por exemplo, conter sequências de repetição de treonina/serina e glicinas (por exemplo, repetições TG4 ou SG4). No contexto de um polipeptídio da SEQ ID No: 8 parecemos ser vantajosos usar um articulador, curto, flexível, tal como um, dois, três, quatro ou cinco resíduos glicina, opcionalmente com um ou mais resíduos pequenos, tais como alanina, treonina ou serina. A proteína de fusão pode incluir uma subsequência de purificação, tal como um identificador epítopo, um identificador FLAG, uma sequência poliistidina, e uma fusão GST. Opcionalmente, um polipeptídio ActRIIB inclui um ou mais resíduos de aminoácidos modificados selecionados: um aminoácido glicosilado, um aminoácido PEGilado, um aminoácido farnesilado, um aminoácido acetilado, um aminoácido bio- tinilado, um aminoácido conjugado a uma molécula de lipídio, e um aminoácido con-jugado a um agente orgânico derivativo.
[007]Em certos aspectos, um polipeptídio ActRIIB pode ser formulado como uma preparação farmacêutica. A preparação farmacêutica será preferencialmente livre de pirogênio (significando livre de pirogênios até o nível exigido pelas normas governamentais de produtos para uso terapêutico). A preparação farmacêutica tam-bém pode incluir um ou mais compostos adicionais, tais como um composto que é usado para tratar um distúrbio associado com ActRIIB.
[008]Em certos aspectos, a divulgação fornece ácidos nucléicos que codifi-cam um polipeptídio ActRIIB. Tal ácido nucléico pode compreender uma sequência de ácido nucléico de 73 a 396 da SEQ ID No: 4 ou uma que hibridiza sob condições rigorosas ao complemento de nucleotídeos 73 a 396 da SEQ ID No: 4. Tal ácido nu- cléico pode ser um que compreenda a sequência da SEQ ID No: 4. Tal ácido nucléi- co pode compreender uma sequência de ácido nucléico de 73 a 396 da SEQ ID No: 6 ou um que hibridiza sob condições rigorosas ao complemento de nucleotídeos 73 a 396 da SEQ ID No: 6. Tal ácido nucléico pode ser aquele que compreenda a se-quência da SEQ ID No: 6. Em certos aspectos, uma proteína ActRIIB pode ser ex-pressa em uma linhagem de células de mamíferos que adequadamente medeie a glicosilação natural da proteína ActRIIB, de modo a diminuir a probabilidade de uma desfavorável resposta imuno em um paciente (incluindo a possibilidade de pacientes veterinários). Linhagens de células humanas e CHO foram usadas com sucesso, e espera-se que outros vetores usuais de expressão em mamíferos sejam úteis. Assim, a divulgação fornece células cultivadas compreendendo qualquer um dos áci-dosnucléicos divulgados neste documento. Tais células podem ser células de mamí-feros, incluindo células CHO, células NSO, células HEK e células COS. Outras célu-las podem ser escolhidas dependendo da espécie de paciente pretendida. Outras células são divulgadas aqui. Células cultivadas são entendidas significar células mantidas em laboratório ou em outras condições desenvolvidas pelo homem (por exemplo, congelados ou em meio) e não parte de um organismo vivo.
[009]Em certos aspectos, a divulgação fornece métodos para fazer um poli- peptídio ActRIIB. Tal método pode incluir expressar qualquer dos ácidos nucléicos (por exemplo, SEQ ID: NO: 4 ou 6, e os mesmos ácidos nucléicos que hibridizam sob condições rigorosas) aqui revelados em uma adequada célula, tal como uma célula de ovário de hamster chinês (CHO). Tal método pode compreender: (a) cultivar uma célula sob condições adequadas para a expressão do polipeptídio ActRIIB, em que a referida célula é transformada com um construto da expressão ActRIIB, e (b) recuperar o polipeptídio ActRIIB assim expresso. Os polipeptídeos ActRIIB podem ser recuperados em bruto, parcialmente purificados ou frações altamente purificadas usando qualquer uma das técnicas conhecidas para a obtenção de proteína a partir de culturas de células, bem como técnicas descritas neste documento.
[0010]Em certos aspectos a divulgação fornece métodos para tratar um indi-víduo com uma doença associada com perda de massa muscular ou com insuficien-te crescimento muscular. Tal método pode incluir a administração ao individuo de uma quantidade efetiva de qualquer um dos polipeptídeos ActRIIB precedentes ou preparações farmacêuticas dos mesmos.
[0011]Em certos aspectos a divulgação fornece métodos para aumentar a massa magra ou reduzir a taxa de perda de massa magra em um indivíduo com ne-cessidade disso. Tal método pode incluir a administração ao individuo de uma quan-tidade efetiva de qualquer um dos polipeptídeos ActRIIB precedentes ou prepara- ções farmacêuticas dos mesmos.
[0012]Em certos aspectos, a divulgação fornece métodos para diminuir o teor de gordura corporal ou reduzir a taxa de aumento no conteúdo de gordura corporal em um indivíduo. Tal método pode incluir a administração ao individuo de uma quantidade efetiva de qualquer um dos polipeptídeos ActRIIB precedentes ou prepa-rações farmacêuticas dos mesmos.
[0013]Em certos aspectos, a divulgação fornece métodos para tratar um dis-túrbio associado com o indesejável ganho de peso corporal em um indivíduo. Tal método pode incluir a administração ao individuo de uma quantidade efetiva de qualquer um dos polipeptídeos ActRIIB precedentes ou preparações farmacêuticas dos mesmos.
[0014]Em certos aspectos, a divulgação fornece métodos para o tratamento de um distúrbio metabólico em um indivíduo. Tal método pode incluir a administração ao individuo de uma quantidade efetiva de qualquer um dos polipeptídeos Ac- tRIIB precedentes ou preparações farmacêuticas dos mesmos. Um paciente elegível para tratamento pode ter uma ou mais das características seguintes: elevados níveis séricos de triglicerídeos; elevados níveis de ácidos graxos livres, ou elevados níveis séricos de insulina. Exemplos de distúrbios metabólicos incluem diabetes tipo 2, sín- drome metabólica, resistência à insulina e obesidade.
[0015]Em certos aspectos, um polipeptídio ActRIIB aqui divulgado pode ser utilizado em um método para tratar um indivíduo com uma doença associada com perda de massa muscular ou insuficiente crescimento muscular. Tais distúrbios in-cluem; atrofia muscular, distrofia muscular, esclerose lateral amiotrófica (ELA), e um distúrbio de perda muscular (por exemplo, caquexia, anorexia, Síndrome DMD, sín- drome de BMD, síndrome de caquexia da AIDS, distrofias musculares, doenças neu- romusculares, doenças neurono-motoras, doença da junção neuromuscular e miopa- tias inflamatórias). Um método pode incluir a administração a um indivíduo com necessidade do mesmo com uma quantidade eficaz de um polipeptídio ActRIIB.
[0016]Em certos aspectos, um polipeptídio ActRIIB aqui divulgado pode ser utilizado em um método para diminuir o teor de gordura corporal ou reduzir a taxa de aumento no conteúdo de gordura corporal, e para o tratamento de um distúrbio associado com o indesejável ganho de peso, tais como obesidade, diabetes mellitus não-insulino dependente (NIDDM), doenças cardiovasculares, câncer, hipertensão, osteoartrose, derrame, problemas respiratórios e doenças da vesícula biliar. Estes métodos podem incluir a administração a um indivíduo com necessidade do mesmo com uma quantidade eficaz de um polipeptídio ActRIIB.
[0017]Em certos aspectos específicos, um polipeptídio ActRIIB aqui divulga-do pode ser utilizado em um método para o tratamento de um distúrbio associado com a atividade anormal de GDF8. Tais distúrbios incluem distúrbios metabólicos, como diabetes tipo 2, deficiência da tolerância à glicose, síndrome metabólica (por exemplo, a síndrome X), e resistência à insulina induzida por trauma (por exemplo, queimaduras ou desequilíbrio de nitrogênio); distúrbios de tecido adiposo (por exemplo, obesidade); distrofia muscular (incluindo a distrofia muscular de Duchen-ne); esclerose lateral amiotrófica (ELA), atrofia muscular, atrofia de órgãos; fragilida-de,síndrome do túnel do carpo, doença obstrutiva pulmonar congestiva; sarcopenia, caquexia e outras síndromes de perda muscular; osteoporose; osteoporose induzida por glicocorticóides; osteopenia; osteoartrite; fraturas relacionadas à osteoporose; baixa massa óssea devido à terapia glicocorticóide crônica, falha gonadal prematura, supressão androgênica, a deficiência de vitamina D, hiperparatireoidismo secundá-rio,deficiências nutricionais e anorexia nervosa. O método pode incluir a administra-ção a um indivíduo com necessidade do mesmo com uma quantidade eficaz de um polipeptídio ActRIIB.
[0018]Em certos aspectos, a divulgação fornece um método para identificar um agente que estimula o crescimento de um tecido, como ossos, cartilagem, mús-culo e gordura. O método compreende: (a) identificação de um agente de teste que se liga a um domínio de ligação-ligante de um polipeptídio ActRIIB competitivamente com um polipeptídio ActRIIB; e (b) avaliar o efeito do agente sobre o crescimento do tecido.
[0019]Em certos aspectos, a divulgação fornece métodos para antagonizar a atividade de um polipeptídio ActRIIB ou um ligante ActRIIB (por exemplo, GDF8, GDF11, ativina, GDF3, BMP7, e Nodal) em uma célula. Os métodos compreendem contatar a célula com um polipeptídio ActRIIB. Opcionalmente, a atividade do poli- peptídio ActRIIB ou do ligante ActRIIB é monitorada por uma transdução de sinaliza-ção mediada pelo complexo ActRIIB/ligante ActRIIB, por exemplo, mediante monitorar a proliferação celular. As células dos métodos incluem uma célula osteoblasto, condrócito, miocito, adipócito e uma célula muscular.
[0020]Em certos aspectos, a divulgação proporciona o uso de um polipeptí- dio ActRIIB para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio ou condição aqui descrita.
Breve Descrição dos Desenhos
[0021]A Figura 1 mostra a sequência aminoácida completa, não processada, para ActRIIB (25-131)-hFc (SEQ ID No: 3). Os domínios líder TPA (resíduos 1-22) e ActRIIB extracelular de duplo truncamento (resíduos 24-131, usando numeração com base na sequência nativa em SEQ ID No: 1) estão cada um sublinhado. Desta-cadoestá o glutamato revelado pelo sequenciamento a ser o aminoácido N-terminal da proteína de fusão madura, que está na posição 25 relativamente à SEQ ID No: 1.
[0022]A Figura 2 mostra uma sequência de nucleotídeos que codifica Ac- tRIIB (25-131)-hFc (a fita codificadora é mostrada na parte superior, SEQ ID No: 4, e o complemento mostrado na parte inferior 3'-5', SEQ ID No: 5). Sequências de codi-ficação dos domínios líder TPA (nucleotídeos 1-66) e ActRIIB extracelular (nucleotí- deos 73 a 396) estão sublinhados. A sequência de aminoácido correspondente a ActRIIB (25-131) também é mostrada.
[0023]A Figura 3 mostra uma alternativa sequência nucleotídica de codifica-ção ActRIIB (25-131)-hFc (a fita codificadora é mostrada na parte superior, SEQ ID No: 6, e o complemento mostrado na parte inferior 3'-5', SEQ ID No: 7). Esta se-quência confere um maior nível de expressão da proteína em transformantes iniciais, tornando o desenvolvimento da linhagem celular um processo mais rápido. Sequên- cias de codificação dos domínios líder TPA (nucleotídeos 1-66) e ActRIIB extracelu- lar (nucleotídeos 73 a 396) são sublinhados e substituições na sequência do tipo selvagem de nucleotídeos do ECD (ver Figura 2) estão destacadas. A corresponden-tesequência de aminoácido para ActRIIB (25-131) também é mostrada.
[0024]A Figura 4 mostra o efeito de quatro semanas de tratamento com Ac- tRIIB (25-131)-hFc sobre a massa de tecido magro em camundongos. O veículo foi o salino Tris-tamponado (TBS). Os dados são médios (n = 10 por grupo) ± SEM. **, P <0,01 versus TBS pelo teste t não pareado. O tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc aumentou a massa de tecido magro em uma maneira dose-dependente clara.
[0025]A Figura 5 mostra o efeito de quatro semanas de tratamento com Ac- tRIIB (25-131)-hFc na massa muscular peitoral em camundongos. O veículo foi o salino Tris-tamponado (TBS). Os dados são médios (n = 10 por grupo) ± SEM. *, P <0,05; **, P <0,01 versus TBS pelo teste t não pareado. O tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc aumentou a massa muscular peitoral em uma maneira dose- dependente clara.
[0026]A Figura 6 mostra o efeito do tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc na força de apreensão em camundongos. O veículo foi o salino Tris-tamponado (TBS). Os dados são médios (n = 10 por grupo). **, P <0,01 versus TBS pelo teste t não pareado. Tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc aumentou a força de apreensão de uma maneira dose-dependente.
[0027]A Figura 7 mostra o efeito de quatro semanas de tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc sobre a massa de tecido magro em um camundongo modelo de privação de androgênio. O veículo foi o salino Tris-tamponado (TBS). Dados para camundongos orqudectomizados (ORX) ou controle-operados são médios (n = 10 por grupo) ± SD. ***, P <0,001 vs controle TBS. ActRIIB (25-131)-hFc aumentou a massa de tecido magro de forma tão eficaz como fez o sua contraparte ActRIIB (20- 134)-mFc de comprimento completo.
[0028]A Figura 8 mostra o efeito da ActRIIB (25-131)-hFc sobre a massa de tecido magro em um camundongo modelo de obesidade induzida por dieta. O veículo foi o salino Tris-tamponado (TBS). Os dados são médios (n = 9-10 por grupo). ***, P <0,001 vs controle TBS. ActRIIB (25-131)-hFc aumentou a massa de tecido magro eficazmente em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura.
[0029]A Figura 9 mostra o efeito da ActRIIB (25-131)-hFc sobre a massa gorda em um camundongo modelo de obesidade induzida por dieta. O veículo foi o salino Tris-tamponado (TBS). Os dados são médios (n = 9-10 por grupo) ± SD. *, P <0,05; ***, P <0,001 vs controle TBS. Em comparação com veículo, O tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc por 12 semanas reduziu a massa gorda em cerca da metade em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura.
[0030]A Figura 10 mostra as concentrações séricas de triglicerídeos em camundongos em função da dieta e do tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc por 60 dias. Os dados são as médias ± SEM. ***, P <0,001. Em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura, ActRIIB (25-131)-hFc reduziu as concentrações de triglicéridos em mais de 50%, normalizando desse modo os triglicerídeos aos níveis observados nos níveis padrões de controle dietético.
[0031]A Figura 11 descreve concentrações séricas livres de ácidos graxos (FFA) em camundongos em função da dieta e do tratamento com ActRIIB (25-131)- hFc por 60 dias. Os dados são as médias ± SEM. ***, P <0,001. Em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura, ActRIIB (25-131)-hFc reduziu as concentrações FFA por quase 55%, normalizando desse modo os níveis de FFA observados nos níveis padrões de controle dietético.
[0032]A Figura 12 descreve concentrações séricas de lipoproteína de alta densidade (HDL) em camundongos como uma função da dieta e do tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc por 60 dias. Os dados são as médias ± SEM. ***, P <0,001. Em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura, ActRIIB (25-131)- hFc reduziu as concentrações de HDL em cerca de 50%, normalizando assim o HDL aos níveis observados nos níveis padrões de controle dietético.
[0033]A Figura 13 descreve concentrações séricas de lipoproteína de baixa densidade (LDL) em camundongos em função da dieta e do tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc por 60 dias. Os dados são as médias ± SEM. *, P <0,05. Em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura, ActRIIB (25-131)-hFc reduziu as concentrações de LDL em mais de 40%.
[0034]A Figura 14 mostra as concentrações séricas de insulina em camundongos em função da dieta e do tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc por 60 dias. Os dados são as médias ± SEM. **, P <0,01. Em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura, ActRIIB (25-131)-hFc reduziu as concentrações de insulina em mais de 60%, normalizando assim a insulina para níveis observados nos níveis padrões de controle dietético.
[0035]A Figura 15 mostra as concentrações séricas de adiponectina em camundongos em função da dieta e do tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc por 60 dias. Medições ELISA detectam todas as principais isoformas oligoméricas (adiponectina total), e os dados são as médias ± SEM. **, P <0,01; ***, P <0,001. Em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura, ActRIIB (25-131)-hFc aumentou as concentrações de adiponectina em mais de 75% e ainda reforçou a adiponectina significativamente acima dos níveis observados nos níveis padrões de controle dietético.
[0036]A Figura 16 mostra alterações histológicas termogênicas induzidas com tecido epididimal adiposo branco por tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc por 60 dias em um camundongo modelo de obesidade induzida por dieta. Todas as imagens microscópicas são mostradas com a mesma ampliação. Tingimento hematoxilina e eosina (H & E) indicam a capacidade de ActRIIB (25-131)-hFc em reduzir o tamanho das gotículas lipídicas e induzir agrupamentos de adipócitos multiloculares (setas) característicos da gordura marrom. O imuno-tingimento de seções não-adjacentes revela indução citoplasmática generalizada de UCP1 (fluorescência verde) em ambos os adipócitos multiloculares e uniloculaes.
[0037]A Figura 17 mostra o efeito do tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc durante 60 dias nos niveis UCP1 mRNA em gordura branca epididimal em um camundongo modelo de obesidade induzida por dieta. Dados obtidos por reação de cadeia polimerase de transcriptase reversa (RT-PCR), em unidades relativas (RU), são médias ± SEM, n = 6-7 por grupo; *, p <0,05. ActRIIB (25-131)-hFc causou um aumento de 60 vezes na mRNA que codifica este marcador seletivo para gordura marrom, indicando supra-regulação da capacidade termogênica dentro deste depósito de gordura branca.
[0038]A Figura 18 mostra os níveis de adiponectina mRNA em gordura branca epididimal de camundongos em função da dieta e do tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc por 60 dias. Dados de RT-PCR, em unidades relativas (RU), são médias ± SEM, n = 7 por grupo; *, p <0,05. Em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura, ActRIIB (25-131)-hFc aumentou os níveis de adiponectina mRNA em mais de 60%, contribuindo para elevadas concentrações circulantes de adiponectina nesses camundongos.
[0039]A Figura 19 mostra o efeito do tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc por 60 dias, sobre os depósitos de gordura no fígado (esteatose hepática), em um camundongo modelo de obesidade induzida por dieta. Seções de fígado (todas mostradas com a mesma ampliação) tingidas com Oil Red O revelam pronunciada deposição de lipídios sob dieta de alto teor de gordura, mas não sob condições de controle. As setas indicam diversas das muitas gotículas de lipídios adensadamente empacotadas, as quais são tingidas de vermelho brilhante, mas difícil de discernir em imagens em preto-e-branco. ActRIIB (25-131)-hFc inibiu a formação de tais gotículas lipídicas e restaurou grandemente a aparência do tecido hepático àquela de camundongos alimentados com a dieta padrão.
[0040]A Figura 20 mostra o efeito do tratamento com ActRIIB (25-131)-mFc por 35 dias sobre a distribuição de gordura abdominal em um camundongo modelo de obesidade induzida por dieta. Depósitos de gordura visceral e subcutânea foram detectados e diferenciados in vivo por micro-tomografia computadorizada (microCT) abrangendo segmentos da medula espinhal T13-L5. N = 4 por grupo; barra de escala = 5 mm. Comparados aos controles alimentados com uma dieta rica em gordura, o tratamento com ActRIIB (25-131)-mFc reduziu o volume de ambos os depósitos de gordura abdominal visceral e subcutâneo.
[0041]A Figura 21 mostra o efeito do tratamento com ActRIIB (25-131)-mFc por 60 dias, sobre o volume de gordura visceral, conforme determinado por microCT em um camundongo modelo de obesidade induzida por dieta. Os dados são as médias ± SEM, n = 4 por grupo; ***, P <0,001. Em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura, ActRIIB (25-131)-mFc reduziu o volume de gordura visceral em mais de 60% comparado ao veículo.
[0042]A Figura 22 mostra o efeito do tratamento com ActRIIB (25-131)-mFc por 60 dias, sobre o volume de gordura subcutânea abdominal, conforme determinado por microCT em um camundongo modelo de obesidade induzida por dieta. Os dados são as médias ± SEM, n = 4 por grupo; ***, P <0,001. Em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura, ActRIIB (25-131)-mFc reduziu o volume de gordura subcutânea por quase 60% comparado ao veículo.
[0043]A Figura 23 mostra fotografias de pares bilaterais de depósitos de gordura marrom interescapular em função da dieta e tratamento com ActRIIB (25- 131)-mFc por 60 dias em um camundongo modelo de obesidade induzida por dieta. A dieta de alto teor de gordura aumentou o tamanho e realçou a cor dos depósitos, enquanto que ActRIIB (25-131)-mFc reverteu amplamente essas alterações.
[0044]A Figura 24 mostra o efeito do tratamento com ActRIIB (25-131)-mFc por 60 dias sobre a massa de gordura marrom interescapular em um camundongo modelo de obesidade induzida por dieta. Os dados são as médias ± SEM para os depósitos esquerda e direita combinados; ***, p <0,001. ActRIIB (25-131)-mFc reverteu o efeito da dieta de alto teor de gordura na massa deste depósito de gordura marrom.
[0045]A Figura 25 mostra o efeito do tratamento com ActRIIB (25-131)-mFc por 60 dias, na densidade da gordura marrom interescapular, conforme determinado por microCT em um camundongo modelo de obesidade induzida por dieta. Dados (média ± SEM) são expressos em unidades padronizadas com base em um valor positivo para a hidroxiapatita mineral óssea (HA) e um valor de zero para a água e, portanto, valores de gordura são negativas, com valores para gordura branca geralmente perto de -120. **, P <0,01. ActRIIB (25-131)-mFc inverteu completamente o efeito de dieta de alto teor de gordura sobre a densidade deste depósito de gordura marrom.
[0046]A Figura 26 mostra o efeito do tratamento com ActRIIB (25-131)-mFc em massa de tecido magro como determinado em um camundongo modelo de envelhecimento por análise de ressonância magnética nuclear (RMN) em momentos diversos. Dados são meias de 10-15 camundongos por grupo, por momento; ***, P <0,001 vs veículo no mesmo momento. Após 7 semanas de administração, a massa de tecido magro em camundongos envelhecidos tratados com ActRIIB (25-131)-mFc aumentou quase 20% relativamente ao valor basal, em contraste com valores essencialmente inalterados em controles tratados com veículo.
[0047]A Figura 27 mostra o efeito do tratamento com ActRIIB (25-131)-mFc na força de apreensão de membros dianteiros, conforme determinado em múltiplos momentos em um camundongo modelo de envelhecimento. Os dados são as médias de 13-15 camundongos por grupo por momento; **, P <0,01 versus veículo no mesmo momento. Camundongos tratados com ActRIIB (25-131)-mFc apresentaram uma tendência geral de aumento da força de apreensão em todo o estudo, em contraste com o declínio da força de apreensão observada nos controles veículo sobre o mesmo faixa.
[0048]A Figura 28 mostra o efeito do tratamento com ActRIIB (25-131)-mFc por 8 semanas na densidade mineral óssea, conforme determinado em um camundongo modelo de envelhecimento por absorciometria de dupla energia de raios-x (DEXA). Os dados são as médias ± SEM; *, P <0,05. A densidade mineral óssea em camundongos envelhecidos tratados com ActRIIB (25-131)-mFc (n = 10) aumentou significativamente em relação aos controles tratados com veículo (n = 14).
[0049]A Figura 29 mostra o efeito do tratamento com ActRIIB (25-131)-mFc massa gordurosa do corpo como um todo, conforme determinado em um camundongo modelo de envelhecimento através da análise de RMN em momentos diversos. Os dados são as médias de 10-15 camundongos por grupo por momento. ***, P <0,001 vs veículo no mesmo momento. Após 7 semans de dosagem, a massa de gordura em camundongos envelhecidos tratados com ActRIIB (25-131)-mFc apresentou um percentual de redução relativamente à linha basal de mais de duas vezes a magnitude daquela dos controles tratados com veículo.
[0050]A Figura 30 mostra o efeito do tratamento com ActRIIB (25-131)-mFc por 8 semanas sobre as concentrações séricas de insulina em um camundongo modelo de envelhecimento. Os dados são as médias ± SEM; *, P <0,05. Concentrações de insulina em camundongos envelhecidos tratados com ActRIIB (25-131)-mFc (n = 10) foram reduzidas em mais de 40% comparado aos controles tratados com veículo (n = 14).
[0051]A Figura 31 mostra o efeito do tratamento com ActRIIB (25-131)-mFc por 8 semanas nas concentrações circulantes de hemoglobina glicada (A1C). Os dados são as médias ± SEM, n = 5-6 por grupo; **, P <0,01. ActRIIB (25-131)-mFc reduziu significativamente as concentrações de hemoglobina glicada, um indicador amplamente aceito das concentrações médias de glicose no sangue durante um período prolongado.
[0052]A Figura 32 mostra o efeito do tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc por 5 semanas em massa de tecido magro como determinado pela análise de RMN em um camundongo modelo com caquexia cancerosa. Os dados são as médias ± SEM; ***, P <0,001. Em camundongos implantados de tumor, o tratamento com veículo (n = 7) foi associado com uma perda de 7% na massa de tecido magro, ao passo que o tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc (n = 12) causou um ganho de 27% em massa de tecido magro relativamente ao valor basal.
Descrição Detalhada 1. Visão Geral
[0053]Em certos aspectos, a presente divulgação está relacionada com polipeptídeos ActRIIB. Como usado aqui, o termo “ActRIIB” está relacionado a uma família de proteínas receptores ativina tipo IIB (ActRIIB) e proteínas ActRIIB- relacionadas, provenientes de qualquer espécie. Membros da família ActRIIB são geralmente todas as proteínas transmembrana, composto de um domínio extracelular de ligação-ligante com região rica em cisteína, um domínio transmembrana e um domínio citoplasmático com especificidade serina/treonina quinase prevista.
[0054]O termo “polipeptídeo ActRIIB” é usado para se referir a polipeptídeos compreendendo qualquer polipeptídeo natural de um membro da família ActRIIB, bem como quaisquer variantes das mesmas (incluindo os mutantes, fragmentos, fusões, e formas peptidomiméticas) que retêm uma atividade útil. Por exemplo, polipeptídeos ActRIIB incluem polipeptídeos derivados da sequência de qualquer ActRIIB conhecido tendo uma sequência de pelo menos cerca de 80% idêntica à sequência de um polipeptídeo ActRIIB, e de preferência pelo menos 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou maior de identidade.
[0055]O precursor ActRIIB humano tem a seguinte sequência de ácido aminado, com o sinal de peptídeo sublinhado, o domínio extracelular indicado em negrito, e os potenciais locais de glicosilação N-articulado em uma caixa (SEQ ID No: 1) (NM_001106, 512 aa).MTAPKVALALLWGS LWPGSSBCE&E TRE CIYYNANWE LERT^QS GLERCEGEQDKRLHC YASWR^ S SG TIE LVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENFQVYFCC CE GNFCNERFTHL PE AGGPEVTYEPPPTWIL LTVLAYS LL PIGG L S LIVL LA FWMY RH RK P PY G HV DI HE D P G PP PP S PLVGL.KP LQLLEIKARGRF G CVW KAQ.LMNDFVAVKIFPLQ DKQSWQS EREIFS T PGHK HE N LLQ FIAAE KRG3N LE'VE LW LI TA E■ H DK G3 LT DY LKGN11TWNELC HVAE THS PC- L S Y LHE DVPW C RG E G H K P SIAH RD FK S KNVL L KS DLT AVI AD FG LAVR FE PG K P PG D THGQVGTRRYMAPEVLEGA I NFQ]<I)Ah'I.R I DMYAMGLVI.wELVSRCKAAI:GPV[ÍEYMI.P FEE EIGQ H PS LE E LQE WVH KKMRPT IK DH W L KH PG LAQLC VTI EE CW DH DAE ARL S A G C VE E RV SLIRRS VIIS T T S DC L VS L VT SV Tbl V DLP PKE SSI
[0056]Polipeptídeos ActRIIB podem incluir qualquer domínio natural de uma proteína extracelular ActRIIB, bem como quaisquer variantes das mesmas (incluindo mutantes, fragmentos e formas peptidomiméticas) que retêm uma atividade útil. Por exemplo, o domínio extracelular de uma proteína ActRIIB associa-se a um ligante e é geralmente solúvel. A sequência de sinal pode ser uma sequência nativa de sinal de um ActRIIB, ou uma sequência sinalizadora de uma outra proteína, tal como uma sequência sinalizadora de ativador do plasminogênio tecidual (TPA) ou uma sequência de sinal colméia melatina (HBM).
[0057]Em parte a divulgação fornece um novo polipeptídeo ActRIIB que é truncado, de modo que a porção derivada de ActRIIB é a partir de aminoácidos 25131 da SEQ ID No: 1. Como mostrado aqui, polipeptídeos deste tipo, quando administrados como um construto Fc, ActRIIB (25-131)-hFc, promovem a formação de massa magra corporal (principalmente musculares) e a perda de massa gorda, além de ter notáveis efeitos desejáveis sobre os parâmetros metabólicos tais como triglicerídeos no soro, níveis séricos de ácidos graxos e níveis serivos de insulina. Notavelmente, ActRIIB (25-131)-hFc tem um efeito muito maior sobre esses parâmetros metabólicos do que uma proteína relacionada, ActRIIB (20-134). Estes dados são apresentados nos exemplos abaixo.
[0058]Os sinais de TGF-β são mediados por complexos heteroméricos de receptores serina/treonina quinase tipo I e tipo II, que fosforilam e ativam proteínas Smad a jusante quando da estimulação ao ligante (Massagué, 2000, Nat. Rev. Mol Biol. Cell. 1:169-178 ). Estes receptores tipo I e tipo II são todos do tipo proteínas transmembrana, constituídas de um domínio extracelular de ligação-ligante com região rica em cisteína, um domínio transmembrana e um domínio citoplasmático com especificidade serina/treonina prevista. Os receptores do tipo I são essenciais para a sinalização; e os receptores do tipo II são necessários para a ligação de ligantes e para a expressão dos receptores do tipo I. Receptores activina tipo I e II formam um complexo estável após ligação ao ligante, resultando na fosforilação dos receptores tipo I pelos receptores tipo II.
[0059]Dois receptores tipo II relacionados, ActRIIA e ActRIIB, foram identificados como os receptores do tipo II para activinas (Mathews e Vale, 1991, Cell 65:973-982; Attisano et al, 1992, Cell 68: 97-108.). Além de activinas, ActRIIA e ActRIIB podem reagir bioquimicamente com várias outras proteínas da família TGF- β, incluindo BMP7, Nodal, GDF8 e GDF11 (Yamashita et al, 1995, Cell Biol J. 130:217-226;.. Lee e McPherron, de 2001, Proc Natl Acad Sci 98:9306-9311; Yeoe Whitman, 2001, Mol Celular 7:. 949-957; Oh et al, 2002, Genes Dev 16:2749-54).
[0060]Em certas modalidades, a presente invenção está relacionada a uma antagonização de um ligante de receptores ActRIIB (também referida como um ligante ActRIIB) com um polipeptídeo ActRIIB em questão (por exemplo, um polipeptídeo ActRIIB-Fc). Assim, composições e métodos da presente invenção são úteis para tratar distúrbios associados com a atividade anormal de um ou mais ligantes de receptores ActRIIB. ligantes representativos de receptores ActRIIB incluem alguns membros da família TGF-β, como ativina, Nodal, GDF3, GDF8, GDF11 e BMP7.
[0061]Activinas são fatores de crescimento do tipo polipeptídeo dimérico e pertencentes à superfamília TGF-beta. Existem três tipos de activinas (A, B e AB), que são homo/heterodímeros de duas subunidades β intimamente relacionadas (βAβA, βBβB e βAβB). Na superfamília TGF-beta, as activinas são fatores únicos e multifuncionais que podem estimular a produção de hormônio em células do ovário e de placenta, sustentar a sobrevivência da célula neuronal, influenciar o progresso do ciclo celular positiva ou negativamente, dependendo do tipo celular e induzir a diferenciação mesodérmica pelo menos em embriões de anfíbios (DePaolo et al, 1991, Proc Med Biol SocEp 198:500-512;.. Dyson et al, 1997, Curr Biol 7:81-84; Woodruff, 1998, Biochem Pharmacol 55:953-963). Além disso, fator de diferenciação eritróide (FED) isolado de células leucêmicas monocíticas humanas estimuladas foi descoberto ser idêntico a ativina A. (Murata et al., 1988, PNAS, 85:2434). Foi sugerido que ativina A age como um regulador natural da eritropoiese na medula óssea. Em vários tecidos, a sinalização ativina é antagonizada pelo seu heterodímero relacionado, inibina. Por exemplo, durante a liberação do hormônio folículo-estimulante (FSH) pela hipófise, a ativina promove a secreção e a síntese de FSH, enquanto que a inibina impede a secreção e síntese de FSH. Outras proteínas que podem regular a bioatividade ativina e/ou se ligar a ativina incluem folistatina (FS), proteína relacionada com a folistatina (FSRP), α2-macroglobulina, Cerberus, e endoglina, que são descritas abaixo.
[0062]A proteína morfogênica óssea 7 (BMP7), também chamada de proteína osteogênica-1 (OP-1), é bem conhecida a induzir a formação de ossos e de cartilagens. Adicionalmente, a BMP7 regula uma grande variedade de processos fisiológicos. Notadamente, a BMP7 foi recentemente identificada como um promotor chave da diferenciação dos adipócitos marrons (Tseng et al., 2008, Nature 454:1000-1004). Neste estudo, a ablação genética de BMP7 levou à escassez de gordura marrom e quase completa ausência de UCP1 em embriões de camundongos. Além disso, supra-regulação da expressão de BMP7 em camundongos pela administração de adenovírus aumentou a massa de gordura marrom e o gasto energético. Como a ativina, BMP7 se liga a receptores do tipo II, e ActRIIA ActRIIB. No entanto, BMP7 e ativina recrutam distintos receptores do tipo I nos complexos receptores heteroméricos. O principal receptor de BMP7 tipo I observado foi ALK2, enquanto activina se liga exclusivamente a ALK4 (ActRIIB). BMP7 e activina suscitaram distintas respostas biológicas e ativaram diferentes rotas Smad (Macias-Silva et al., 1998, J Biol Chem. 273:25628-36).
[0063]O Fator-3 de crescimento e diferenciação (GDF3), também conhecido como Vg1-relacionado 2, desempenha um papel importante no desenvolvimento embrionário e também está implicado na adipogênese durante a vida adulta. Em suma, expressão de GDF3 no tecido adiposo branco está correlacionada com a massa corporal ou obesidade (Weisberg et al. 2003, J Clin Invest 112:1796-1808), e a super-expressão de GDF3 mediada por adenovírus exacerba o aumento da adiposidade observada sob condições de dieta de alto teor de gordura em camundongos tipo selvagem (Wang et al. 2004, Biochem Biophys Res Commun 321:1024-1031). De forma importante, camundongos com ablação genética de GDF3 são saudáveis e essencialmente normais quando mantidos em uma dieta padrão mas são protegidos da obesidade, e exibem uma aumentada taxa metabólica basal, quando mantidos em uma dieta rica em gordura (Shen et al. 2009, Mol Endocrinol 23:113-123). Tomados em conjunto, estas descobertas implicam o GDF3 especificamente em obesidade induzida por dieta e de modo mais geral na regulação da adiposidade.
[0064]Proteínas nodais possuem funções na indução e formação do mesoderma e endoderma, bem como a subsequente organização das estruturas axiais tais como coração e estomago na embriogênese precoce. Foi demonstrado que o tecido dorsal em um embrião de vertebrado em desenvolvimento contribui predominantemente para as estruturas axiais da placa notocorda e pré-cordal na medida em que ele recruta células circundantes para formar estruturas embriônicas não-axiais. Nodal parece sinalizar através de ambos os receptores tipo I e tipo II e efetores intracelulares conhecidos como proteínas Smad. Estudos recentes sustentam a idéia de que ActRIIA e ActRIIB servem como receptores do tipo II para Nodal (Sakuma et al. Cells Genes. 2002, 7:401-12). Sugere-se que ligantes Nodal interagem com seus co-fatores (por exemplo, cripto) para ativar receptores ativina tipo I e tipo II, que fosforilam Smad2. Proteínas Nodal estão implicadas em muitos eventos críticos para o início embrionário de vertebrados, incluindo a formação do mesoderma, padronização anterior, e especificação de eixo esquerdo-direito. Evidências experimentais demonstraram que a sinalização Nodal ativa PAR3-Lux, um mensageiro luciferase previamente mostrado a responder especificamente a ativina e TGF-beta. No entanto, Nodal é incapaz de induzir pTlx2-Lux, um mensageiro especificamente sensível às proteínas morfogenéticas ósseas. Resultados recentes fornecem evidências bioquímicas diretas que a sinalização Nodal é mediada por ambos os Smads, Smad2 e Smad 3 de rota ativina-TGF-beta. Evidências adicionais mostraram que a proteína extracelular cripto é necessária para a sinalização Nodal, tornando-a distinta da sinalização activina ou sinalização TGF- beta.
[0065]O Fator-8 de Crescimento e Diferenciação (GDF8) é também conhecido como miostatina. GDF8 é um regulador negativo da massa muscular esqueletal. GDF8 é altamente expressa no desenvolvimento e na musculatura esqueletal em adultos. A mutação nula GDF8 em camundongos transgênicos é caracterizada por uma acentuada hipertrofia e hiperplasia do musculatura esqueletal (McPherron et al., Nature, 1997, 387:83-90). Aumentos similares da massa muscular esqueletal são evidentes em mutações de GDF8 que ocorrem naturalmente em bovinos (Ashmore et al, 1974, Crescimento, 38:501-507;. Swatland e Kieffer, J. Anim Sci, 1994, 38:752-757..; McPherron e Lee, Proc Natl Acad Sci EUA, 1997, 94:12457-12461; e Kambadur et al, Genome Res, 1997, 7:910-915) e, surpreendentemente, em seres humanos (Schuelke et al, N Engl J Med 2004;. 350:2682-8). Estudos também têm demonstrado que atrofia muscular associado com a infecção por HIV em humanos é acompanhado pelo aumento da expressão da proteína GDF8 (Gonzalez-Cadavid et al., PNAS, 1998, 95:14938-43). Além disso, GDF8 pode modular a produção de enzimas musculares específicas (por exemplo, creatina quinase) e modular a proliferação de células mioblastos (WO 00/43781). O propeptídeo GDF8 pode se ligar de forma não covalente ao dímero domínio GDF8 maduro, inativando sua atividade biológica (Miyazono et al (1988) J. Biol Chem, 263: 6407-6415; Wakefield et al (1988) J. Biol Chem, 263; 7646-7654, e Brown et al (1990) Growth Factors, 3: 35-43). Outras proteínas que se ligam a GDF8 ou proteínas estruturalmente relacionadas que inibem sua atividade biológica incluem folistatina e, potencialmente, proteínas relacionadas com a folistatina (Gamer et al Dev (1999) Biol, 208: 222-232).
[0066]Fator-11 de Crescimento e Diferenciação (GDF11), também conhecido como BMP11, é uma proteína secretada (McPherron et al, 1999, Nat Genet 22: 260-264). GDF11 é expressa no nascedouro da cauda, nascedouro dos membros, arcadas maxilares e mandibulares, e gânglios da raiz dorsal durante o desenvolvimento do camundongo (Nakashima et al, 1999, Mech Dev 80: 185-189). GDF11 desempenha um papel único na padronização de ambos os tecidos mesodérmico e neural (Gamer et al., 1999, Dev Biol., 208:222-32). GDF11 mostrou- se um regulador negativo de condrogênese e miogênese no desenvolvimento de membros de pintinhos (Gamer et al., 2001, Dev Biol. 229:407-20). A expressão de GDF11 no músculo sugere também o seu papel na regulação do crescimento muscular de forma semelhante ao GDF8. Além disso, a expressão de GDF11 no cérebro sugere que GDF11 pode também possuir atividades que se relacionem com a função do sistema nervoso. Curiosamente, GDF11 foi descoberto inibir a neurogênese no epitélio olfativo (Wu et al. 2003, Neuron. 37:197-207). Assim, GDF11 pode ter aplicações in vitro e in vivo no tratamento de doenças tais como doenças musculares e doenças neurodegenerativas (por exemplo, esclerose lateral amiotrófica).
[0067]Em certos aspectos, a presente invenção diz respeito à utilização de certos polipeptídeos ActRIIB para antagonizar a sinalização de ligantes ActRIIB geral, em qualquer processo associado com a atividade ActRIIB. Opcionalmente, polipeptídeos ActRIIB da invenção podem antagonizar um ou mais ligantes de receptores ActRIIB, como ativina, Nodal, GDF8, GDF11 e BMP7, e podem ser, portanto, úteis no tratamento de distúrbios adicionais.
[0068]Portanto, a presente invenção contempla o usode polipeptídeos ActRIIB no tratamento ou prevenção de doenças ou condições que estejam associadas com a atividade anormal de um ActRIIB ou um ligante ActRIIB. ActRIIB ou ligantes ActRIIB estão envolvidos na regulação de muitos processos biológicos importantes. Devido às suas funções-chave nesses processos, eles podem ser alvos desejáveis para a intervenção terapêutica. Por exemplo, polipeptídeos ActRIIB (por exemplo, polipeptídeos ActRIIB-Fc) podem ser usados para tratar distúrbios ou condições em humanos ou animais. Exemplo de tais distúrbios ou condições incluem, mas não estão limitados a, distúrbios metabólicos, como diabetes tipo 2, deficiência da tolerância à glicose, síndrome metabólica (por exemplo, a síndrome X), e resistência à insulina induzida por trauma (por exemplo, queimaduras ou desequilíbrio de nitrogênio); distúrbios dos tecidos adiposos (por exemplo, obesidade); distúrbios musculares e neuromusculares como a distrofia muscular (incluindo distrofia muscular de Duchenne); esclerose lateral amiotrófica (ELA); atrofia muscular; atrofia de órgãos; fraqueza, síndrome do túnel carpal; doença pulmonar obstrutiva congestiva; e sarcopenia, caquexia e outras síndromes de atrofia muscular. Outros exemplos incluem a osteoporose, especialmente nos idosos e/ou mulheres pós-menopausa; osteoporose induzida por glicocorticóides; osteopenia, osteoartrite, e fraturas relacionadas à osteoporose. No entanto, outros exemplos incluem baixa massa óssea devido à terapia glicocorticóide crônica, deficiência gonadal prematura, supressão androgênica, deficiência de vitamina D, hiperparatireoidismo secundário, deficiências nutricionais e anorexia nervosa. Esses distúrbios e condições são discutidos abaixo sob o título “Usos Terapêuticos Representativos”. Como se observa, os polipeptídeos ActRIIB truncados aqui divulgados parecem ter efeitos particularmente benéficos sobre os parâmetros metabólicos.
[0069]Os termos usados neste relatório discritivo geralmente têm seus significados comuns na arte, no contexto desta invenção e no contexto específico onde cada termo é usado. Alguns termos são discutidos abaixo ou em outro lugar no relatório descritivo, para fornecer orientações adicionais para o praticante na descrição das composições e dos métodos da invenção e como da sua produção e utilização. O escopo ou o significado de qualquer uso de um termo será evidente a partir do contexto específico em que o termo é usado.
[0070]“Cerca de” e “aproximadamente” irão significar um grau aceitável de erro para a quantidade medida dada a natureza ou a precisão das medições. Tipicamente, graus representativos de erro estão inseridos em 20%, preferivelmente dentro de 10% e mais de preferência dentro de 5% de um determinado valor ou faixa de valores.
[0071]Alternativamente, e particularmente em sistemas biológicos, os termos “cerca de” e “aproximadamente” podem significar valores que estejam dentro de uma ordem de magnitude, de preferência dentro de 5 vezes e mais de preferência dentro de 2 vezes um determinado valor. Quantidades numéricas dadas aqui são aproximadas salvo indicação em contrário, o que significa que o termo “cerca de” ou “aproximadamente” podem ser inferidos, quando não expressamente indicados.
[0072]Os métodos da invenção podem incluir as etapas de comparar sequências umas com outras, incluindo sequência do tipo selvagem a uma ou mais mutantes (variantes da sequência). Tais comparações geralmente compreendem alinhamentos da sequências de polímero, por exemplo, usando programas da sequência de alinhamento e/ou algoritmos que são bem conhecidas na arte (por exemplo, BLAST, FASTA e MEGALIGN, para citar alguns). Aquele usualmente versado na técnica pode facilmente perceber que, em tais alinhamentos, onde uma mutação contém uma inserção ou exclusão de resíduos, o alinhamento da sequência vai introduzir uma “lacuna” (geralmente representada por um traço, ou “A”) na sequência do polímero não contendo o resíduo inserido ou apagado.
[0073]“Homólogo”, em todas as suas formas gramaticais e variações de grafia, está relacionada a relação entre duas proteínas que possuem uma “origem evolutiva comum”, incluindo proteínas provenientes de superfamílias na mesma espécie de organismo, bem como proteínas homólogas de diferentes espécies de organismo. Tais proteínas (e seus ácidos nucléicos de codificação) têm homologia da sequência, como refletido pela sua semelhança de sequência, quer em termos de percentual de identidade ou pela presença de resíduos ou motivos específicos e posições conservadas.
[0074]O termo “similaridade da sequência”, em todas as suas formas gramaticais, refere-se ao grau de identidade ou correspondência entre o ácido nucléico ou sequências de aminoácidos que podem ou não compartilharem uma origem evolutiva comum.
[0075]No entanto, no uso comum e na aplicação imediata, o termo “homólogo”, quando modificado com um advérbio como “altamente”, pode referir-se a uma similaridade da sequência e pode ou não dizer respeito a uma origem evolutiva comum.
2. Polipeptídeos ActRIIB
[0076]Em certos aspectos, a invenção se refere a polipeptídeos ActRIIB (por exemplo, polipeptídeos ActRIIB-Fc), e particularmente a formas truncadas exemplificadas por polipeptídeos compreendendo aminoácidos 25-131 da SEQ ID No: 1, e suas variantes. Opcionalmente, os fragmentos, variantes funcionais e formas modificadas têm atividades biológicas similares ou iquais àquelas de seus correspondentes polipeptídeos ActRIIB do tipo selvagem. Por exemplo, uma variante ActRIIB da invenção pode se ligar e inibir a função de um ligante ActRIIB (por exemplo, ativina A, ativina AB, ativina B, Nodal, GDF8, GDF11 ou BMP7). Opcionalmente, um polipeptídeo ActRIIB modula o crescimento de tecidos, como osso, cartilagem, músculo, gordura ou parâmetros metabólicos, tais como triglicerídeos, ácidos graxos livres ou insulina. Exemplos de polipeptídeos ActRIIB incluem precursor do polipeptídeo ActRIIB humano (SEQ ID No: 1) e proteínas de fusão Fc, por exemplo, SEQ ID Nos. 3 e 8. Variações sobre esses polipeptídios podem ser preparadas de acordo com a orientação seguinte. A numeração dos aminoácidos nos polipeptídeos ActRIIB é baseada na sequência da SEQ ID No: 1, independentemente de a sequência nativa líder utilizada.
[0077]A divulgação identifica porções e variantes funcionalmente ativas de ActRIIB. Os requerentes constataram que uma proteína de fusão Fc que possui a sequência revelada por Hilden et al. (Blood. 1994 15 de abril; 83 (8):2163-70), que tem uma Alanina na posição correspondente ao aminoácido 64 da SEQ ID No: 1 (A64), tem uma afinidade relativamente baixa para ativina e GDF-11. Por outro lado, a mesma proteína de fusao Fc com uma Arginina na posição 64 (R64) tem uma afinidade para ativina e GDF-11 na faixa de baixo nmol a alta pmol. Portanto, uma sequência com um R64 é usada como a sequência de referência do tipo selvagem para ActRIIB humana nesta divulgação.
[0078]Attisano et al. (Cell. 1992 Jan 10; 68 (1):97-108) mostraram que o apagamento do nó de prolina no C-terminal do domínio extracelular de ActRIIB reduziu a afinidade do receptor para ativina. Mutações de P129 e P130 não diminem substancialmente a ligação ao ligante.
[0079]O bolso de ligação ao ligante ActRIIB é definida por resíduos Y31, N33, N35, L38 até T41, E47, E50, Q53 até K55, L57, H58, Y60, S62, K74, W78 até N83, Y85, R87, A92 e E94 até F101. Nessas posições, é esperado que mutações conservadoras sejam toleradas, embora uma mutação K74A seja bem tolerada, como são R40A, K55A, F82A e mutações na posição L79. R40 é um K no Xenopus, indicando que aminoácidos básicos nesta posição serão tolerados. Q53 é R em ActRIIB bovino e K em Xenopus ActRIIB e, portanto, aminoácidos, incluindo R, K, Q, N e H serão tolerdos nesta posição. Assim, uma proteína ActRIIB pode ser uma que compreenda os aminoácidos 25-131 e compreendendo não mais do que 1, 2, 5, 10 ou 15 alterações aminoácidos conservadora no bolso ligação do ligante, e zero, um ou mais não-conservadora alterações na posições 40, 53, 55, 74, 79 e/ou 82 no bolso ligante-ligante. Essa proteína pode reter mais de 80%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos 25-131 da SEQ ID No: 1. Sítios fora da bolsa ligante, em que a variabilidade pode ser particularmente bem tolerada incluem os terminais amino e carbóxi do domínio extracelular (como mencionado acima), e posições 42-46 e 65-73. Uma alteração de asparagina para alinina na posição 65 (N65A) realmente melhora a ligação ao ligante na base A64, e isso não é esperado ter efeito prejudicial na ligação ao ligante na base R64. Esa alteração provavelmente elimina a glicosilacao em N65 na base A64, demonstrando assim que uma alteração significativa nessa região é possível de ser tolerada. Embora uma alteração R64A seja fracamente tolerada, R64K é bem tolerada, e desse modo um outro resíduo básico, tal como H pode ser tolerado na posição 64.
[0080]ActRIIB está bem conservada em quase todos os vertebrados, com grandes extensões de domínio extracelular ploenamente conservados. Muitos dos ligantes que se ligam a ActRIIB também são altamente conservados. Assim, as comparações de sequências ActRIIB provenientes de diversas organismos vertebrados fornecem uma percepção com respeito a resíduos que podem ser alterados. Portanto, um ActRIIB humano, ativo, pode incluir um ou mais aminoácidos nas correspondentes posições a partir da sequência de outro ActRIIB de vertebrados, ou pode incluir um resíduo que seja semelhante àquele na sequência humana ou outra sequência de vertebrados. Os exemplos a seguir ilustram esta abordagem para a definição de uma variante ActRIIB ativa. L46 é uma valina no Xenopus ActRIIB, e assim esta posição pode ser alterada e, opcionalmente, pode ser alterada para outro resíduo hidrofóbico, tal como V, I ou F, ou um resíduo não- polar, tal como A. E52 é um K no Xenopus, indicando que este sítio pode ser tolerante com uma grande variedade de alterações, incluindo resíduos polares, tais como E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y e, provavelmente, A. T93 é um K no Xenopus, indicando que uma grande variação estrutural é tolerada nessa posição, com resíduos polares favorecidos, tais como S, K, R, E, D, H, G, P, G e Y. F108 é um Y no Xenopus, e, portanto, Y ou um grupo hidrofóbico, tais como I, V ou L devem ser tolerados. E111 K está em Xenopus, indicando que os resíduos carregados serão tolerados nessa posição, incluindo D, R, K e H, bem como Q e N. R112 é K em Xenopus, indicando que os resíduos básicos são tolerados nessa posição, incluindo R e H. A na posição 119 é relativamente mal conservada, e aparece como P em roedores e V em Xenopus, assim, essencialmente, qualquer aminoácido deve ser tolerado nesta posição.
[0081]Adicionais sítios de glicosilação N-articulados (N-X-S/T) podem ser adicionados a um polipeptídeo ActRIIB, e pode aumentar a meia-vida sérica de uma proteína de fusão ActRIIB-Fc, relativamente à forma ActRIIB (R64)-Fc. Exemplos de sequências NX (T/S) são encontradas em 42-44 (NQS) e 65-67 (NSS), embora esta última possa não ser eficientemente glicosilada com o R na posicao 64. Sequências N-X-S/T podem ser geralmente introduzidas nas posições fora da bolsa ligante- ligante. Sítios particularmente adequados para a otdç de sequências N-X-S/T incluem aminoácidos 20-29, 20-24, 22-25, 109-134, 120-134 ou 129-134. Sequências N-X-S/T também podem ser introduzidas no articulador entre a sequência ActRIIB e o Fc ou outro componente de fusão. Um tal sítio pode ser introduzido com mínimo esforço mediante introduzir um N na posição correta com respeito a um S ou T pré-existente, ou mediante introduzir um S ou T numa correspondente posição relativamente a um N pré-existente. Assim, alterações desejáveis que possam criar um sítio de glicosilação N-articulado são: A24N, R64N, S67N (possivelmente combinado com uma alteração N65A), E106N, R112N, G120N, E123N, P129N, A132N, R112S e R112T. Qualquer S que esteja previsto a ser glicosilado pode ser alterado a um T sem criar um sítio imunogênico, devido à proteção conferida pela glicosilação. Da mesma forma, qualquer T que está previsto a ser glicosilado pode ser alterado para um S. Assim, as alterações S67T e S44T estão contempladas. Da mesma forma, em uma variante A24N, uma alteração S26T pode ser usada. Assim, uma variante ActRIIB pode incluir uma ou mais sequências de consenso de glicosilação N-articuladas, não endógenas, adicionais.
[0082]As variações aqui descritas podem ser combinadas de várias maneiras. Além disso, existem posições de aminoácidos em ActRIIB que muitas vezes são benéficas para a conservação. Estes incluem a posição 64 (aminoácido básico), a posição 80 (ácidos ou hidrofóbicos aminoácido), a posição 78 (hidrofóbicos e, particularmente triptofano), a posição 37 (ácido, particularmente o ácido aspártico e glutâmico ou), a posição 56 (aminoácido básico), a posição 60 (aminoácidos hidrofóbicos, particularmente fenilalanina ou tirosina). Outras posições que pode ser desejável para a conservação são os seguintes: a posição 52 (aminoácido ácido), a posição 55 (aminoácido básico), a posição 81 (ácido), 98 (polar ou carregada, principalmente, E, D, R ou K).
[0083]Em certas modalidades, a presente invenção se contempla produzindo fariantes funcionais mediante modificação da estrutura de um polipeptídeo ActRIIB para fins tais como o de melhorar a eficácia terapêutica, ou estabilidade (por exemplo, vida de prateleira e resistência ex vivo relativamente à degradação proteolítica in vivo). Polipeptídeos ActRIIB modificados também podem ser produzidos, por exemplo, pela substituição, exclusão ou adição de aminoácidos. Por exemplo, é razoável esperar que uma substituição de uma leucina isolada com uma isoleucina ou valina, um aspartato com um glutamato, uma treonina com uma serina, ou um substituto semelhante de um aminoácido com um aminoácido estruturalmente relacionado (por exemplo, mutações conservador) não terá um grande efeito sobre a atividade biológica da molécula resultante. Substituições conservadoras são aquelas que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos que estão relacionados em suas cadeias laterais. No caso de uma alteração na sequência aminoácido de um polipeptídeo ActRIIB resultar em um homólogo funcional, isso pode ser facilmente determinado mediante avaliar a capacidade da variante polipeptídeo ActRIIB a produzir uma resposta nas células em um modo similar ao do polipeptídeo ActRIIB tipo selvagem, ou a se ligam a um ou mais ligantes, tais como ativina, GDF-11 ou da miostatina em um modo similar ao do tipo selvagem.
[0084]Em certas modalidades específicas, a presente invenção contempla produzir mutações no domínio extracelular (também referida como domínio de ligação-ligante) de um polipeptídeo ActRIIB tal que a variante (ou mutantes) do polipeptídeo ActRIIB altere as atividades ligante-ligante (por exemplo, afinidade de ligação ou especificidade de ligação). Em certos casos, tais variantes polipeptídeos ActRIIB têm alterada (aumentada ou reduzida) afinidade ligante quanto a um ligante específico. Em outros casos, a variante polipeptídeos ActRIIB tem alterada a especificidade ligante quanto aos seus ligantes.
[0085]Em certas modalidades, a presente invenção contempla mutações específicas dos polipeptídeos ActRIIB, de modo a alterar a glicosilação do polipeptídeo. Tais mutações podem ser seleccionados de forma a introduzir ou eliminar um ou mais sítios de glicosilação, como sítios de glicosilação O-ligados ou N-ligados. Sítios de reconhecimento de glicosilação asparagina-ligados compreendem geralmente uma sequência de tripeptídeo, asparagina-X-treonina (onde “X” é qualquer aminoácido) que é expressamente reconhecido pelas apropriadas enzimas de glicosilação celular. A alteração também pode ser feita pela adição de, ou substituição por um ou mais resíduos serina ou resíduos de treonina relativamente à sequência polipeptídeo ActRIIB tipo selvagem (para sítios de glicosilação O-ligados). Uma variedade de substituições ou de supressões de aminoácidos em uma ou ambas das primeira ou terceira posições de aminoácidos de um sítio de reconhecimento de glicosilação (e/ou exclusão de aminoácidos na segunda posição) resulta em não-glicosilação na modificada sequência de tripeptídeos. Outro meio de aumentar o número de porções de carboidratos em um polipeptídeo ActRIIB é por acoplamento químico ou enzimático dos glicosídeos ao polipeptídeo ActRIIB. Dependendo do modo de acoplamento utilizado, o(s) açúcar(s) pode ser associado a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxila livres, (c) grupos sulfidrila livres, tais como aqueles de cisteína, (d) grupos hidroxila livres, tais como aqueles de serina, treonina, ou hidroxiprolina, (e) resíduos aromáticos como os de fenilalanina, tirosina ou triptofano, ou (f) o grupo amida da glutamina. Esses métodos são descritos em WO 87/05330 publicada em 11 de setembro de 1987, e em Aplin e Wriston (1981) Crit CRC. Rev. Biochem., pp 259-306, incorporadas por referência neste documento. A remoção de uma ou mais porções de carboidratos presentes em um polipeptídeo ActRIIB pode ser realizada quimicamente e/ou enzimaticamente. A deglicosilação química pode envolver, por exemplo, a exposição do polipeptídeo ActRIIB ao composto ácido trifluormetanosulfônico, ou um composto equivalente. Este tratamento resulta na clivagem da maioria ou todos os açúcares, exceto o açúcar de ligação (N-acetilglicosamina ou N-acetilgalactosamina), deixando a sequência de aminoácidos intacta. A deglicosilação química é ainda descrita por Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52 e por Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131. A clivagem ezimática de frações de carboidratos em polipeptídeos ActRIIB pode ser alcançada através da utilização de uma variedade de endo- e exo-glicosidases, como descrito por Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350. A sequência de um polipeptídeo ActRIIB pode ser ajustada, conforme apropriado, dependendo do tipo de sistema de expressão utilizado, na medida que células de mamíferos, de levedura, de insetos, e de vegetais podem todas introduzir diferentes padrões de glicosilacao que podem ser influenciados pela sequência aminoácido do peptídeo. Em geral, as proteínas ActRIIB para uso em humanos serão expressas em uma linhagem de células de mamíferos que forneça apropriada glicosilação, tais como linhagens de células HEK293 ou de células CHO, embora outras linhagens de células de expressão em mamíferos sejam esperadas serem úteis também.
[0086]Essa revelação também contempla um método de geração de variantes, particularmente conjuntos de variantes combinatórias de um polipeptídeo ActRIIB, incluindo, opcionalmente, as variantes de truncamento; coligação de mutantes combinatoriais são especialmente úteis para a identificação da sequências variantes funcionais. A finalidade deste exame bibliotecas combinatórias pode ser para gerar, por exemplo, as variantes polipeptídeo ActRIIB que alteraram as propriedades, como a farmacocinética alteradas, ou ligação ao ligante modificado. Uma variedade de testes de rastreio são fornecidas abaixo, e tais ensaios podem ser usados para avaliar variantes. Por exemplo, uma variante polipeptídeo ActRIIB podem ser selecionados para capacidade de se ligar a um polipeptídio ActRIIB, para impedir ligação de um ligante ActRIIB a um polipeptídeo ActRIIB.
[0087]A atividade de um polipeptídeo ActRIIB ou suas variantes também pode ser testada em um ensaio in vivo de base celular. Por exemplo, o efeito de uma variante polipeptídeo ActRIIB na expressão de genes envolvidos na produção de osso em um dos osteoblastos ou precursor pode ser avaliada. Isto pode, quando necessário, ser realizado na presença de uma ou mais proteínas de ligante ActRIIB recombinante (por exemplo, BMP7), e as células podem ser transfectadas de forma a produzir um polipeptídeo ActRIIB e/ou suas variantes, e, opcionalmente, um ligante ActRIIB. Da mesma forma, um polipeptídeo ActRIIB pode ser administrado a um camundongo ou outro animal, e uma ou mais propriedades do osso, tais como densidade ou volume podem ser avaliadas. A taxa de cicatrização de fraturas ósseas pode ser também avaliada. Da mesma forma, a atividade de um polipeptídeo ActRIIB ou suas variantes podem ser testadas em células musculares, adipócitos, e células neuronais quanto a qualquer efeito sobre o crescimento dessas células, por exemplo, através dos ensaios, conforme descrito abaixo. Tais ensaios são bem conhecidos e rotineiros na arte. Um gene mensageiro SMAD-responsivo pode ser usado em linhagens de células para monitorar tais efeitos sobre a sinalização a jusante.
[0088]Variantes combinatorialmente derivadas podem ser geradas as quais possuem uma potência seletiva relativamente a um polipeptídeo ActRIIB naturalmente ocorrente. Tais proteínas variantes, quando expressas a partir de construtos DNA recombinantes, podem ser usadas em protocolos de terapia genética. Da mesma forma, a mutagênese pode dar origem a variantes que têm meia-vida intracelular dramaticamente diferente daquela do correspondente polipeptídeo ActRIIB do tipo selvagem. Por exemplo, a proteína alterada pode ser trazida a ser mais estável ou menos estável à degradação proteolítica ou a outros processos que resultem na destruição, ou de outro modo, inativação do polipeptídeo ActRIIB nativo. Tais variantes, e os genes que as codificam, podem ser utilizadas para alterar os níveis do polipeptídeo ActRIIB mediante modulação da meia-vida dos polipeptídeos ActRIIB. Por exemplo, uma meia-vida curta pode dar origem a efeitos biológicos mais transitórios e, quando parte de um sistema de expressão induzível, pode permitir um controle mais aprimorado dos níveis do polipeptídeo ActRIIB recombinante dentro da célula.
[0089]Em certas modalidades, os polipeptídeos da invenção ActRIIB podem ainda compreender modificações pós-traducionais, além de quaisquer que estejam naturalmente presentes nos polipeptídeos ActRIIB. Tais modificações incluem, mas não se limitam a, acetilação, carboxilação, glicosilação, fosforilação, lipidação e acilação. Como um resultado, os polipeptídeos ActRIIB modificados podem conter elementos não-aminoácidos, tais como polietileno glicóis, lipídios, poli- ou mono- sacarídeos, e fosfatos. Efeitos de tais elementos não-aminoácidos sobre a funcionalidade de um polipeptídeo ActRIIB podem ser testados como aqui descrito para outras variantes de polipeptídeos ActRIIB. Quando um polipeptídeo ActRIIB é produzido nas células pela clivagem uma forma nascente do polipeptídeo ActRIIB, o processamento pós-translacional opde ser também importante para a correta multiplicação e/ou funcionamento da proteína. Células diferentes (tais como CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 ou HEK293) têm específicos maquinários celulares e mecanismos cracterísticos para tais atividades pós-traducionais e podem ser selecionados de modo a garantir a modificação correta e o correto processamento dos polipeptídeos ActRIIB.
[0090]Em certos aspectos, as variantes funcionais ou formas modificadas do polipeptídeos ActRIIB incluem proteínas de fusão com pelo menos uma parte dos polipeptídeos ActRIIB e um ou mais domínios de fusão. Exemplos bem conhecidos de domínios de fusão incluem, mas não estão limitados a, poliistidina, Glu-Glu, glutationa S transferase (GST), tioredoxina, proteína A, proteína G, uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, um Fc), proteína ligante a maltose (MBP), ou albumina de soro humano. Um domínio de fusão pode ser selecionado de modo a conferir uma propriedade desejada. Por exemplo, alguns domínios de fusão são particularmente úteis para o isolamento das proteínas de fusão por cromatografia de afinidade. Para efeitos de purificação de afinidade, matrizes pertinentes quanto a cromatografia de afinidade, tal como resinas de conjugação a glutationa, amilase e níquel ou cobalto, são usadas. Muitas de tais matrizes estão disponíveis na forma de um “kit”, tal como o sistema de purificação Pharmacia GST e o sistema QIAexpressTM (Qiagen) úteis com parceiros de fusão (HIS6) fusão. Como outro exemplo, um domínio de fusão pode ser seleccionado de forma a facilitar a detecção dos polipeptídeos ActRIIB. Exemplos de domínios de detecção deste tipo incluem as várias proteínas fluorescentes (por exemplo, GFP), bem como “marcadores epítopo”, que geralmente são sequências de peptídeo curto para as quais um específico anticorpo se predispõe. Marcadores epitopos bem conhecidos para os quais anticorpos monoclonais específicos são facilmente disponíveis incluem FLAG, haemagglutinin do vírus da gripe (HA), e marcadores c- myc. Em alguns casos, os domínios de fusão têm um sítio de clivagem da protease, como para Fator Xa ou Trombina, que permite à protease pertinente parcialmente digerir as proteínas de fusão e desse modo liberar as proteínas recombinantes a partir daí. As proteínas liberadas podem ser então isoladas a partir do domínio de fusão mediante subsequente separação por cromatografia. Em certas modalidades preferidas, um polipeptídeo ActRIIB é fundido com um domínio que estabiliza o polipeptídeo ActRIIB in vivo (um “estabilizador” de domínio). Por “estabilização” é significada qualquer coisa que aumente a meia-vida sérica, independentemente de isso ser devido à reduzida destruição, reduzida depuração pelos rins, ou a outro efeito farmacocinético. Fusões com a porção Fc de uma imunoglobulina são conhecidas conferir desejáveis propriedades farmacocinéticas em uma ampla variedade de proteínas. Da mesma forma, fusões à albumina sérica humana podem conferir propriedades desejáveis. Outros tipos de domínios de fusão que podem ser selecionados incluem; domínios de multimerização (por exemplo, dimerização, tetramerização) domínios funcionais (que conferem uma função biológica adicional, tais como mais estimulação do desenvolvimento muscular).
[0091]Como um exemplo específico, a presente invenção fornece uma proteína de fusão como um antagonista GDF8 que compreende um domínio extracelular (por exemplo, GDF8-binding) fundido a um domínio Fc (por exemplo, NO, SEQ ID: 9).THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDÍA)VSHEDPEVKFNWYVDG VE VI IN AKTKPREEQYNSTYRV V S VL TV L HQDWLN G KE Y KCK(A) VS NK AL P V PI EKT IS K AK GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG PFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN(A)HYTQKSLSLSPGK*
[0092]Opcionalmente, o domínio Fc tem uma ou mais mutações em resíduos, como Asp-265, lisina 322 e Asn-434. Em certos casos, o domínio Fc mutante que possui uma ou mais dessas mutações (por exemplo, mutação Asp-265) tem reduzida capacidade de ligação ao receptor Fcy relativamente a um domínio Fc tipo selvagem. Em outros casos, o domínio Fc mutante que possui uma ou mais essas mutações (por exemplo, Asn-434 mutação) tem aumentada capacidade de ligação ao receptor Fc relacionado a MHC Classe I (FcRn) em relação a um domínio Fc tipo selvagem.
[0093]Entende-se que diferentes elementos das proteínas de fusão podem ser organizados em qualquer forma que seja consistente com a funcionalidade desejada. Por exemplo, um polipeptídeo ActRIIB pode ser colocado em posição C- terminal relativamente a um domínio heterologo, ou, alternativamente, um domínio heterólogo pode ser colocado em posição C-terminal relativamente a um polipeptídeo ActRIIB. O domínio polipeptídeo ActRIIB e o domínio heterólogo não precisam ser adjacentes em uma proteína de fusão, e os domínios adicionais ou sequências de aminoácidos podem estar inclusos no C- ou N-terminal relativamente a um ou outro domínio ou entre os domínios.
[0094]Em certas modalidades, os polipeptídeos ActRIIB da presente invenção contêm uma ou mais modificações que são capazes de estabilizar os polipeptídeos ActRIIB. Por exemplo, essas modificações aumentam a meia-vida dos polipeptídeos ActRIIB, melhoram a meia-vida circulatória dos polipeptídeos ActRIIB ou reduzem a degradação proteolítica do polipeptídeos ActRIIB. Tais modificações de estabilização incluem, mas não se limitam a, às proteínas de fusão (incluindo, por exemplo, proteínas de fusão compreendendo um polipeptídeo ActRIIB e um domínio estabilizador), modificações de um local de glicosilação (incluindo, por exemplo, adição de um local de glicosilação de um polipeptídeo ActRIIB), e modificações da fração carboidrato (incluindo, por exemplo, a remoção das frações carboidratos a partir de um polipeptídeo ActRIIB). No caso de proteínas de fusão, um polipeptídeo ActRIIB é fundido a um domínio estabilizador tal como uma molécula de IgG (por exemplo, um domínio Fc). Como usado aqui, o termo “domínio estabilizador” não se refere apenas a um domínio de fusão (por exemplo, Fc), como no caso de proteínas de fusão, mas também inclui modificações não-proteináceas tais como uma fração carboidrato, ou polímero não-proteináceo, tal como polietileno glicol.
[0095]Em certas modalidades, a presente invenção torna disponíveis isoladas e/ou formas purificadas dos polipeptídeos ActRIIB, que estão isolados de, ou de outra forma, substancialmente livres de outras proteínas.
[0096]Em certas modalidades, polipeptídeos ActRIIB (não modificados ou modificados) da invenção podem ser produzidos por uma variedade técnicas conhecidas na arte. Por exemplo, tais polipeptídeos ActRIIB podem ser sintetizados através de técnicas padrões da química de proteínas tais como aquelas descritas em Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin e (1993) e Grant GA (ed.), Synthetic Peptides: A User’s Guide, WH Freeman and Company, New York (1992). Além disso, sintetizadores automatizados de peptídeos estão disponíveis comercialmente (por exemplo, Advanced ChemTech Modelo 396; Milligen/Biosearch 9600). Alternativamente, os polipeptídeos ActRIIBs, seus fragmentos ou variantes podem ser produzidos utilizando diversos sistemas recombinantes de expressão (por exemplo, E. coli, as células do ovário de hamster chinês, células COS, baculovírus), como é conhecido na arte (veja também adiante). Em uma modalidade adicional, os polipeptídeos ActRIIB modificados ou não modificados podem ser produzidos através da digestão dos polipeptídeos ActRIIB de comprimento completo naturalmente ocorrentes ou produzidos de forma recombinante mediante utilizar, por exemplo, uma protease, por exemplo, a tripsina, termolisina, quimiotripsina, pepsina ou enzima conversora de aminoácido básico emparceirado (PACE). A análise por computador (utilizando um software comercialmente disponível, por exemplo, MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) pode ser usada para identificar sítios proteolíticos de clivagem. Alternativamente, tais polipeptídeos ActRIIB podem ser produzidos a partir de polipeptídeos ActRIIB de comprimento completo naturalmente ocorrentes ou produzidos de forma recombinante tais como as técnicas padrões conhecidas na arte, tais como por clivagem química (por exemplo, brometo de cianogênio, hidroxilamina).
3. Ácidos nucléicos que codificam Polipeptídeos ActRIIB
[0097]Em certos aspectos, a invenção fornece ácidos nucléicos isolados e/ou recombinantes que codificam quaisquer dos polipeptídeos ActRIIB divulgados neste documento. Por exemplo, a SEQ ID No: 4 codifica um polipeptídeo precursor de ActRIIB (25-131)-hFc, enquanto que a SEQ ID No: 6 codifica a mesma proteína mas com uma sequência alternativa, e nucleotídeos 73-396 de cada uma das SEQ ID Nos. 4 e 6 codificam a porção ActRIIB-derivada das proteínas codificadas. Os ácidos nucléicos em questão podem ser de fita simples ou de dupla fita. Tais ácidos nucléicos podem ser moléculas de DNA ou RNA. Estes ácidos nucléicos podem ser usados, por exemplo, em métodos para a produção de polipeptídeos ActRIIB.
[0098]Por exemplo, a sequência seguinte codifica um polipeptídeo precursor ActRIIB humano naturalmente ocorrente (SEQ ID No: 2) (nucleotídeos 5-1543 de NM_001106, 1539 bp): atgacggcgccctgggtggccctcgccctcctctggggatcgctgtggcccggctct gggcgtggggaggctgagacacgggagtgcatctactacaacgccaactgggagctg gagcgcaccaaccagagcggcαtggagcgctgcgaaggcgagcaggacaagcggctg eactgctacgcctcctggcgcaacagctctggcaccatcgagetcgtgaagaagggc tgctggctagatgacttcaactgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggag aacceccaggtgta cttctgctgctgtgaaggcaacttctgeaacgagcgcttcact eatttgccagaggctgggggcccggaagtcacgtacgagccacccccgacagcccec accctgctcacggtgctggcctactcactgctgcccatcgggggcctttccctcatc gtcctgctggccttttggatgtaccggcatcgcaagcccccictacggtcatgtggac atccatgaggacectgggcctccaccaccatcccctctggtgggcctgaagccactg cagctgctggagatcaaggctcgggggcgctttggctgtgtctggaaggcceagctc atgaatgactttgtagctgtcaagatcttcecactccaggacaagcagtcgtggcag agtgaacgggagatctteagcacacctggcatgaagcacgagaacctgctacagttc att getgcegagaagcgaggetccaacctegaagtagagetgtggcteat ca eggec ttccatgacaagggctccctcacggattacctcaaggggaacatcatcacatggaac gaactgtgteatgtagcagagaegatgt cacgaggc ctctcatacetgcatgaggat gtgccc I .g g tgcegtggegagggccacaagccgtetattgcecacagggactttaaa agtaagaatgtattgctgaagagcgacctcacagccgtgctggctgactttggcttg getgttcgatttgagccagggaaacctccaggggacacccacggacaggtaggcacg agacggtacatggctcctgaggtgctQgagggagccatcaacttccagagagatgcc ttcctgcgcattgacatgtatgccatggggttggtgctgtgggagcttgtgtctcgc tgcaaggctgcagacggacccgtggatgagtacatgctgccctttgaggaagagatt ggccagcacccttegttggaggagctgcaggaggtggtggtgcacaagaagatgagg cccaccattaaagaLcactggttgaaacacccgggcctggcccagett tgtgtgacc ategaggagtgctgggaecatgatgcagaggetcgcttgtccgcgggetgtgtggag gagcgggtgtccctgattcggaggtcggtcaacggeactacctcggactgtetcgtt tccctggtgacctctgtcaccaatgtggacctgccccctaaagagtcaagcatctaaA sequência seguinte codifica um polipeptídeo ActRIIB (extracelular) humano solúvel (SEQ ID No: 10) (348 pb). tctgggcgtggggaggctgagacacgggagtgcatctactacaacgccaactgggag ctggagcgcaccaaccagagcggcctggagcgctgcgaaggcgagcaggacaagcgg ctgcactgctacgcctcctggcgcaacagctctggcaccatcgagctcgtgaagaag ggctgctggctagatgacttcaactgctacgataggcaggagtgtgtggccactgag gagaacccccaggtgtacttctgctgctgtgaaggcaacttctgcaacgagcgcttc actcatttgccagaggctgggggcccggaagtcacgtacgagccacccccgacagcc cccacc
[0099]Em certos aspectos, os ácidos nucléicos em questão que codificam polipeptídeos ActRIIB são ainda entendidos a incluir ácidos nucléicos que são variantes da SEQ ID No: 4 ou 6. Sequências nucleotídicas variantes incluem sequências que diferem por uma ou mais substituições, acréscimos ou supressões de nucleotídeos, tais como variantes alélicas; e, portanto, incluem sequências de codificação que diferem da sequência de nucleotídeos da sequência de codificação designada na SEQ ID No: 4 ou 6.
[00100]Em certas modalidades, a invenção fornece sequências nucleotídicas isoladas ou recombinantes que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas à SEQ ID No: 4 ou 6, e particularmente aquelas suas porções que são derivadas de ActRIIB (nucleotídeos 73 a 396). Aquele usualmente versado na técnica irá notar que as sequências nucleotídicas complementárias a SEQ ID No: 4 ou 6, e variantes da SEQ ID No: 4 também estão dentro do escopo da presente invenção. Em modalidades adicionais, as sequências de ácido nucléico da invenção podem ser isoladas, recombinante, e/ou fundidas com uma sequência nucleotídica heteróloga, ou numa biblioteca de DNA.
[00101]Em outras modalidades, ácidos nucléicos da invenção também incluem sequências de nucleotídeos que hibridizam em condições altamente rigorosas à sequência de nucleotídeos designada em SEQ ID No: 4 ou 6, sequência de complemento da SEQ ID No: 4 ou 6, ou seus fragmentos (por exemplo, nucleotídeos 73 a 396). Como discutido acima, aquele usualmente versado na técnica vai entender facilmente que as apropriadas condições de rigor que pomovem a hibridização de DNA podem ser variadas. Por exemplo, pode-se realizar a hibridação em 6,0 x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) em cerca de 45 ° C, seguido de uma lavagem de 2,0 x SSC a 50 ° C. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada a partir de um baixo rigor de cerca de 2,0 x SSC a 50 ° C até um alto rigor de cerca de 0,2 x SSC a 50 ° C. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada desde condições de baixo rigor na temperatura ambiente, a cerca de 22 ° C, até condições de elevado rigor em cerca de 65 ° C. Tanto a temperatura e o sal podem ser variados, ou a temperatura e a concentração de sal podem ser mantidas constante enquanto que a outra variável é alterada. Em uma modalidade, a invenção fornece ácidos nucléicos que hibridizam em condições de baixo rigor de 6 x SSC na temperatura ambiente seguido por uma lavagem a 2 x SSC em temperatura ambiente.
[00102]Ácidos nucléicos isolados que diferem dos ácidos nucléicos, conforme estabelecido na SEQ ID No: 4 ou 6, devido à degeneração do código genético também estão dentro do escopo da invenção. Por exemplo, uma série de aminoácidos está designada por mais que um tripleto. Códons que especificam o mesmo aminoácido, ou sinônimos (por exemplo, CAU e CAC são sinônimos para histidina) podem resultar em mutações “silenciosas” que não afetam a sequência de aminoácidos da proteína. No entanto, é esperado que polimorfismos da sequência DNA que levam a alterações nas sequência aminoácido das proteínas em questão irão existir entre as células de mamíferos. Aquele usualmente versado na técnica irá notar que essas variações em um ou mais nucleotídeos (até cerca de 3-5% dos nucleotídeos) dos ácidos nucléicos que codifica uma determinada proteína podem existir entre os indivíduos de uma dada espécie devido à variação alélica natural. Todas e quaisquer de tais variações de nucleotídeo e polimorfismos de aminoácido resultante estão inseridos no escopo da presente invenção.
[00103]Em certas modalidades, os ácidos nucléicos recombinantes da invenção podem ser operavelmente ligados a uma ou mais sequências nucleotídicas regulatórias em um construto de expressão. Sequências nucleotídicas regulatórias serão geralmente apropriadas para a célula hospedeira usada para a expressão. Vários tipos apropriados de vetores de expressão e sequências regulatórias são conhecidos na arte para uma variedade de células hospedeiras. Tipicamente, as referidas uma ou mais sequências nucleotídicas regulatórias podem incluir, mas não estão limitados a, as sequências promotoras, sequências líder ou de sinal, sítios de ligação ribossomal, sequências de início e de terminação transcricional, sequências de início e de terminação traducional, e sequências intensificadoras ou ativadoras. Promotores constitutivos ou induzíveis como conhecidos na arte são contemplados pela invenção. Os promotores podem ser tanto promotores naturalmente ocorrentes, ou promotores híbridos que combinam elementos de mais de um promotor. Um construto de expressão pode estar presente em uma célula em uma episomo, tal como um plasmídeo, ou o construto de expressão pode ser inserido em um cromossomo. Em uma modalidade preferida, o vetor de expressão contém um gene marcador selecionável para permitir a seleção de células hospedeiras transformadas. Adequados genes marcadores são bem conhecidos na arte i irão variar de acordo com a célula hospedeira utilizada.
[00104]Em certos aspectos da invenção, o ácido nucléico em questão é provido em um vetor de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo ActRIIB e operavelmente ligados a pelo menos uma sequência regulatória. Sequências regulatórias são conhecidas na arte e são selecionadas para direcionar a expressão do polipeptídeo ActRIIB. Assim, o termo sequência regulatória inclui promotores, melhoradores, e outros elementos de controle de expressão. Sequências regulatórias representativas são descritas em Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Por exemplo, qualquer de uma ampla variedade de sequências de controle de expressão que controlam a expressão de uma sequência DNA, quando operativamente ligada a ela, pode ser usada nesses vetores para expressar sequências de DNA que codifica um polipeptídeo ActRIIB. Tais sequências de controle de expressão úteis, incluem, por exemplo, os promotores precoces e tardios de SV40, promotor tet, promotor precoce imediato adenovirus ou citomegalovirus, promotores RSV, o sistema lac, o sistema trp, o sistema TAC ou TRC, promotor T7 cuja expressão esteja direcioada pela polimerase T7 RNA, o principal operador e regiões promotoras do fago lambda, as regiões de controle para a proteína de revestimento fd, o promotor para a 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, os promotores da fosfatase ácida, por exemplo, Pho5, os promotores dos fatores a-compatibilização de levedura, o promotor poliedro do sistema baculovírus e outras sequências conhecidas a controlar a expressão dos genes de células procarióticas ou eucarióticas ou seus vírus, e diversas combinações desses mencionados. Deverá ser entendido que o projeto do vetor de expressão pode depender de fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada e/ou do tipo de proteína desejada a ser expressa. Além disso, o número de cópias do vetor, a capacidade para controlaresse número de cópias e a expressão de qualquer outra proteína codificada pelo vetor, tal como marcadores antibióticos, deverão ser também considerados.
[00105]Um ácido nucléico recombinante da invenção pode ser produzido pela ligação do gene clonado, ou uma parte dele, em um vetor adequado para a expressão em quaisquer células procarióticas, células eucarióticas (levedura, aves, insetos ou mamíferos), ou ambos. Veículos de expressão para produção de um polipeptídeo ActRIIB recombinante incluem plasmídeos e outros vetores. Por exemplo, vetores adequados incluem plasmídeos dos tipos: plasmídeos pBR322- derivados, plasmídeos pEMBL-derivados, plasmídeos Pex-derivados, plasmídeos pBTac-derivados e plasmídeos PUC-derivados para expressão em células procarióticas, tais como E. coli.
[00106]Alguns vetores de expressão em mamíferos contêm ambas as sequências procarióticas para facilitar a propagação do vetor em bactérias, e uma ou mais unidades eucarióticas de transcrição que são expressas em células eucarióticas. Os vetores derivados de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, prc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-DHFR, pTk2, pRSVneo, PMSG, pSVT7, PKO-neo e derivados de pHyg são exemplos de vetores de expressão em mamíferos apropriados para a transfecção de células eucarióticas. Alguns destes vetores são modificados com sequências de plasmídeos bacterianos, tais como pBR322, para facilitar a replicação e seleção de resistência ao fármaco em células procariotas e eucariotas. Alternativamente, os derivados de vírus como o vírus do papiloma bovino (BPV-1), ou vírus Epstein-Barr (pHEBo, pREP-derivados e P205) podem ser usados para a expressão transiente de proteínas em células eucarióticas. Exemplos de outros sistemas de expressão viral (incluindo retroviral) podem ser encontrados abaixo na descrição dos sistemas de entrega da terapia genética. Os vários métodos utilizados na preparação dos plasmídeos e na transformação dos organismos hospedeiros são bem conhecidos na arte. Para outros sistemas de expressão adequados tanto para células procariotas e eucariotas, bem como procedimentos gerais recombinante, ver Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2 aed., Ed. por Sambrook, Fritsch e Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) capítulos 16 e 17. Em alguns casos, pode ser desejável expressar os polipeptídeos recombinantes pelo uso de um sistema de expressão baculovírus. Exemplos de tais sistemas de expressão baculovírus incluem vetores derivados de CVp (tais como pVL1392, pVL1393 e pVL941), vetores derivados de pAcUW (como pAcUW1), e vetores derivados de pBlueBac (como os pBlueBac III contendo β-gal).
[00107]Em uma modalidade preferida, um vetor será projetado para a produção dos polipeptídeos ActRIIB em questão em células CHO, como um vetor Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, Califórnia), vetores pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia) e vetores PCI-neo (Promega, Madison, Wisconsin.). Como será evidente, os construtos genéticos em questao podem ser usados para induzir a expressão dos polipeptídeos ActRIIB em questão em células propagadas em cultura, por exemplo, para produzir proteínas, incluindo proteínas de fusão ou proteínas variantes, para a purificação.
[00108]Esta invenção também se refere a uma célula hospedeira transfectada com um gene recombinante, incluindo uma sequência codificadora (por exemplo, SEQ ID No: 4 ou 6) para um ou mais dos polipeptídeo ActRIIB em questão. A célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica. Por exemplo, um polipeptídeo ActRIIB da invenção pode ser expresso em células bacterianas, como a E. coli, células de insetos (por exemplo, usando um sistema de expressão baculovírus), levedura, ou células de mamíferos. Outras células hospedeiras adequadas são conhecidas por aqueles usualmente versados na técnica.
[00109]Por conseguinte, a presente invenção está ainda relacionada a métodos de produzir os polipeptídeos ActRIIB em questão. Por exemplo, uma célula hospedeira transfectadas com um vetor de expressão que codifica um polipeptídeo ActRIIB pode ser cultivada em condições adequadas para permitir a ocorrência da expressão do polipeptídeo ActRIIB. O polipeptídeo ActRIIB pode ser segregado e isolado a partir de uma mistura de células e meio contendo o polipeptídeo ActRIIB. Alternativamente, o polipeptídeo ActRIIB pode ser mantido a nível citoplasmático ou em uma fração membrana e as células colhidas, lisadas e as proteínas isoladas. A cultura de células inclui células hospedeiras, meio e outros subprodutos. Suportes adequados para a cultura de células são bem conhecidos na arte. Os polipeptídeos ActRIIB em questão podem ser isolados do meio de cultura celular, células hospedeiras, ou ambos, utilizando técnicas conhecidas na arte de purificação de proteínas, incluindo cromatografia de troca iônica, cromatografia de filtração em gel, ultrafiltração, eletroforese e purificação de imunoafinidade com anticorpos específicos para determinados epítopos do polipeptídeos ActRIIB. Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo ActRIIB é uma proteína de fusão contendo um domínio que facilita a sua purificação.
[00110]Em outra modalidade, um gene de fusão que codifica para uma sequência líder de purificação, como uma sequência de sítio de clivagem poli- (His)/enteroquinase no N-terminal da porção desejada do polipeptídeo ActRIIB recombinante, pode permitir a purificação da expressada proteína de fusão por cromatografia de afinidade utilizando uma resina de metal Ni2+. A sequência líder de purificação pode ser posteriormente removida por tratamento com enteroquinase para fornecer o polipeptídeo ActRIIB purificado (por exemplo, ver Hochuli et al, (1987) J. Chromatography 411:177;.. E Janknecht et al, PNAS 88:8972 EUA).
[00111]Técnicas para a produção de genes de fusão são bem conhecidas. Essencialmente, a junção dos diversos fragmentos DNA que codificam para diferentes sequências polipeptídeos é realizada de acordo com as técnicas convencionais, empregandoterminações de pontas cegas ou de pontas escalonadas para ligação, digestão por enzima de restrição para contribuir para a apropriada terminação, preenchimendo das terminações coesivas como apropriado, tratamento de fosfatase alcalina para evitar ligaduras indesejáveis, e ligação enzimática. Em outra modalidade, o gene de fusão pode ser sintetizado através de técnicas convencionais, incluindo sintetizadores automatizados de DNA. Alternativamente, a amplificação de fragmentos do gene pode ser realizada utilizando iniciadores de ancoragem os quais dão surgimento a projeções complementares entre dous fragmentos consecutivos de genes que podem ser em seguida anelados para gerar uma sequência de genes quiméricos (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al, John Wiley & Sons: 1992).
5. Usos Terapêuticos Representativos
[00112]Em certas modalidades, as composições (por exemplo, polipeptídeos ActRIIB) da presente invenção podem ser usadas para tratar ou prevenir uma doença ou condição que esteja associada com a atividade anormal de um polipeptídeo ActRIIB e/ou um ligante ActRIIB (por exemplo, GDF8). Estas doenças, distúrbios ou condições são geralmente referidas aqui como “condições ActRIIB- associada”. Em certas modalidades, a presente invenção fornece métodos de tratamento ou prevenção de um indivíduo com necessidade dos mesmos através de administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo ActRIIB como descrito acima. Estes métodos são especialmente destinados a tratamentos terapêuticos e profiláticos dos animais e, mais particularmente, dos seres humanos.
[00113]Como usado aqui, uma terapêutica que “impede” um distúrbio ou condição está relacionada a um composto que, em uma amostra estatística, reduz a ocorrência da doença ou condição na amostra tratada em relação a uma amostra controle não tratada, ou retarda o início ou reduz a gravidade de um ou mais sintomas da doença ou condição em relação à amostra controle não tratada. O termo “tratamento” como aqui utilizado inclui a profilaxia da denominada condição ou melhora ou eliminação da condição uma vez ela tenha se estabelecido.
[00114]Complexos ActRIIB/ligante ActRIIB desempenham um papel essencial no crescimento de tecidos, bem como nos processos desenvolvimentais iniciais tais como a correta formação das diversas estruturas ou em uma ou mais capacitações pós-desenvvolvimentais que incluem o desenvolvimento sexual, produção do hormônio pituitária,e a criação de ossos e cartilagens. Assim, condições associadas com ActRIIB incluem, mas não se limitam a, crescimento tecidual anormal e defeitos no seu desenvolvimento. Adicionalmente, as condições ActRIIB- associadas incluem, mas não se limitam a, distúrbios do crescimento e diferenciação celular tais como alergia, inflamação, doenças auto-imunes, doenças infecciosas e tumores.
[00115]Condições representativas para tratamento incluem distúrbios neuromusculares (por exemplo, distrofia muscular e atrofia muscular), doença obstrutiva pulmonar congestiva (e perda de massa muscular associada com DPOC), síndrome de perda de massa muscular, sarcopenia, caquexia, doenças do tecido adiposo (por exemplo, a obesidade), diabetes tipo 2 e doença óssea degenerativa (por exemplo, osteoporose). Outras condições exemplares incluem distúrbios musculodegenerativos e neuromusculares, reparo tecidual (por exemplo, cicatrização de feridas), doenças neurodegenerativas (por exemplo, esclerose lateral amiotrófica), distúrbios imunológicos (por exemplo, distúrbios relacionados à proliferação anormal ou função de linfócitos) e obesidade ou transtornos relacionados com a proliferação anormal de células adiposas.
[00116]Em certas modalidades, composições (por exemplo, polipeptídeos ActRIIB-Fc) da invenção são usadas como parte de um tratamento para uma distrofia muscular. O termo “distrofia muscular” está relacionado a um grupo de doenças musculares degenerativas caracterizadas pelo gradual enfraquecimento e deterioração dos músculos esqueletais e, por vezes dos músculos do coração e respiratórios. As distrofias musculares são distúrbios genéticos caracterizados pelo progressivo atrofia e fraqueza muscular que se iniciam com alterações microscópicas no músculo. À medida que os músculos se degeneram com o tempo, a força muscular do indivíduo sofre declínio. Exemplos de distrofias musculares que podem ser tratadas com um regime que inclui polipeptídeos ActRIIB incluem: Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), Distrofia Muscular de Becker (BMD), Distrofia Muscular de Emery-Dreifuss (EDMD), Distrofia Muscular de Limb-Girdle (LGMD), Distrofia Muscular Facioescapuloumeral (FSH ou FSHD) (também conhecido como Landouzy-Dejerine), distrofia miotônica (MMD) (também conhecida como doença de Steinert), Distrofia Muscular Oculofaríngea (OPMD), Distrofia Muscular Distal (DD), Distrofia Muscular de Congênita (CMD).
[00117]A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) foi descrita pela primeira vez pelo neurologista francês Guillaume Benjamin Amand Duchenne na década de 1860. A Distrofia muscular de Becker (BMD) é denominada após o médico alemão Peter Emil Becker, que primeiro descreveu essa variante da DMD na década de 1950. DMD é uma das doenças hereditárias mais frequentes em homens, afetando um em cada 3.500 meninos. DMD ocorre quando o gene da distrofina, localizado no braço curto do cromossomo X, está quebrado. Uma vez que somente os machos carregam uma cópia do cromossomo X, eles possuem apenas uma cópia do gene da distrofina. Sem a proteína distrofina, o músculo é facilmente danificado durante os ciclos de contração e relaxamento. Embora no início da doença o músculo se compensa por regeneração, posteriormente as células progenitoras musculares não podem se manter com o dano continuado e o músculo saudável é substituído por tecido fibro-adiposo não funcional.
[00118]BMD resulta de diferentes mutações no gene da distrofina. Pacientes com BMD possuem alguma distrofina, mas ela é ainda em quantidade insuficiente ou de má qualidade. Ter alguma distrofina protege os músculos daqueles com BMD de degeneração de forma tão má ou tão rápida como daqueles com DMD.
[00119]Por exemplo, pesquisas recentes demonstram que a função de bloqueio ou de eliminação de GDF8 (um ligante ActRIIB) in vivo pode efetivamente tratar, pelo menos alguns sintomas em pacientes com DMD e BMD. Assim, os polipeptídeos ActRIIB em questão podem atuar como inibidores GDF8 (antagonistas), e constituem um meio alternativo de bloquear as funções de GDF8 e/ou ActRIIB in vivo em pacientes com DMD e BMD. Esta abordagem é confirmada e apoiada pelos dados aqui apresentados, pelo que uma proteína ActRIIB-Fc foi demonstrada aumentar a massa muscular em um camundongo modelo de distrofia muscular.
[00120]Da mesma forma, os polipeptídeos ActRIIB em questão proporcionam um meio eficaz para aumentar a massa muscular em outras condições de doença que estejam com necessidade de desenvolvimento muscular. Por exemplo, esclerose lateral amiotrófica, também chamada de doença de Lou Gehrig (doença neurono-motora) é uma doença crônica, incurável e irreversível do SNC que ataca os neurônios motores, componentes do SNC que conectam o cérebro aos músculos esqueletais. Na ELA, os neurônios motores deteriorar-se e acabam por morrer, e apesar de cérebro de uma pessoa normalmente permanecer plenamente funcional e alerta, o comando para movimentação nunca chega até os músculos. A maioria das pessoas que adquire ELA tem entre 40 e 70 anos de idade. Os neurônios motores que primeiramente se enfraquecem são aqueles que levam para os braços ou pernas. Indivíduos com ELA podem ter dificuldade em andar, eles podem deixar cair coisas, terem quedas, deficiência no falar, e rir ou chorar incontrolavelmente. Eventualmente os músculos nos membros começam a atrofia a partir do desuso. Esta fraqueza muscular irá se tornar debilitante a pessoa irá necessitar de uma cadeira de rodas ou se tornar incapaz de atividade fora de um leito. A maioria dos pacientes com ELA morre de insuficiência respiratória ou das complicações decorrentes da assistência ventilatória, tal como por pneumonia, de 3- 5 anos após o início da doença. Esta abordagem é confirmada e apoiada pelos dados aqui apresentados, em que uma proteína ActRIIB-Fc foi mostrada melhorar a aparência, a massa muscular e vida útil de um camundongo modelo de ELA.
[00121]O aumento da massa muscular induzida pelo polipeptídeo ActRIIB também pode beneficiar aqueles que sofrem de doenças de atrofia muscular. Gonzalez-Cadavid et al. (Supra) relata que a expressão de GDF8 está relacionada irreversivelmente com a massa gorda livre em humanos e que a aumentada expressão do gene GDF8 está associada com perda de peso em homens com síndrome de atrofia por AIDS. Mediante inibição da função de GDF8 em pacientes com AIDS, pelo menos alguns sintomas da AIDS podem ser aliviados, se não completamente eliminado, melhorando assim de forma significativa a qualidade de vida em pacientes com AIDS.
[00122]Uma vez que a perda da função GDF8 (um ligante ActRIIB) também está associada com a perda de gordura, sem diminuição da ingestão de nutrientes (Zimmers et al, supra;. McPherron e Lee, supra), os polipeptídeos ActRIIB em questão podem ser ainda usados como um agente terapêutico para retardar ou prevenir o desenvolvimento de obesidade e diabetes tipo II. Esta abordagem é confirmada e apoiada pelos dados aqui apresentados, em que uma proteína ActRIIB-Fc foi demonstrada melhorar o estado metabólico em camundongos obesos.
[00123]Em certas modalidades, composições (por exemplo, polipeptídeos ActRIIB) da invenção são usadas como parte de um tratamento para a síndrome metabólica (também conhecido como síndrome X e síndrome de resistência à insulina), que é uma combinação de distúrbios e fatores de risco que aumentam o risco de desenvolver doenças cardiovasculares e diabetes mellitus tipo II. A maioria dos pacientes é de indivíduos idosos, obesos, sedentários, e que possuem algum grau de resistência à insulina. A adiposidade central (abdominal ou visceral) é uma característica importante da síndrome.
[00124]Em modalidades relacionadas, os polipeptídeos ActRIIB e outras composições da invenção podem ser usados como parte de um tratamento para o diabetes mellitus tipo II (também conhecido como diabetes mellitus não insulino- dependente ou diabetes adulta inicial), que se caracteriza por elevados niveis de glicose no sangue no contexto da insulino-resistência e insulino-deficiência relativa. Alterações metabólicas complexas e multifatoriais no diabetes levam muitas vezes a danos e ao comprometimento funcional de muitos órgãos, principalmente do sistema cardiovascular. Diabetes mellitus tipo II está muitas vezes associada à obesidade (adiposidade abdominal ou visceral), hipertensão, colesterol elevado, e síndrome metabólica. Importantes fatores de risco para diabetes mellitus tipo II incluem o envelhecimento, dietas ricas em gordura, e um estilo de vida sedentário.
[00125]Em outras modalidades relacionadas, os polipeptídeos ActRIIB e outras composições da invenção podem ser usados como parte de um tratamento para a aterosclerose, uma doença inflamatória crônica na qual as paredes das artérias engrossam devido ao acúmulo de depósitos de gordura, muitas vezes referidas como placas. Fatores de risco para a aterosclerose são: o envelhecimento, diabetes mellitus, dislipoproteinemia, obesidade (adiposidade abdominal ou visceral), e um estilo de vida sedentário.
[00126]Os polipeptídeos ActRIIB também pode ser usados para distúrbios lipodistróficos, que tendem a estar associados com a síndrome metabólica. Resistência grave à insulina pode ser resultado de ambas as formas genéticas e adquiridas de lipodistrofia, incluindo neste último caso o vírus da imunodeficiência humana (HIV) relacionadas com lipodistrofia em pacientes tratados com terapia anti-retroviral.
[00127]A síndrome de anorexia-caquexia cancerosa é um dos aspectos mais debilitantes e fatais de câncer. A progressiva perda de peso na síndrome da anorexia-caquexia cancerosa é uma característica comum de muitos tipos de câncer e é responsável não só pela má qualidade de vida e má resposta à quimioterapia, mas também por um menor tempo de sobrevivência daquele que é encontrado em pacientes com tumores comparáveis sem perda de peso. Associados com anorexia, a perda de gordura e de tecido muscular, distresse psicológico, e uma baixa qualidade de vida, caquexia surge de uma interação complexa entre o câncer e o hospedeiro. Ela é uma das causs mais comuns de morte entre os pacientes com câncer e está presente em 80% no momento da morte. É um exemplo complexo do caos metabólico que influencia o metabolismo de proteína, carboidrato e gordura. Os tumors produzem anomalias tanto diretas e indiretas, resultando em anorexia e perda de peso. Atualmente, não existe um tratamento para controlar ou reverter o processo. A síndrome de anorexia-caquexia cancerosa afeta a produção de citocinas, liberação de lipídios, mobilização e indução de fatores de proteólise e alterações no metabolismo intermediário. Embora a anorexia seja comum, uma reduzida ingesta de alimentos por si só é incapaz de explicar as alterações na composição orgânica observadaa em pacientes com câncer, e o aumento da ingesta de nutrientes é incapaz de reverter a síndrome de atrofia. A caquexia deve ser suspeitada em pacientes com câncer se uma perda involuntária de peso superior a cinco por cento do peso pré-mórbido ocorrer dentro de um período de seis meses.
[00128]Uma vez que a superexpressão sistêmica de GDF8 em camundongos adultos foi descoberta induzir profunda perda muscular e de gordura análogas àquelas observadas em humanos com síndrome de caquexia (Zimmers et al., Supra), os polipeptídeos ActRIIB em questão como composições farmacêuticas podem ser beneficamente utilizados para prevenir, tratar, ou aliviar os sintomas da síndrome de caquexia, onde o crescimento muscular seja desejado.
[00129]Em outras modalidades, a presente invenção fornece métodos de induzir a formação de ossos e/ou cartilagens, impedir a perda óssea, aumentar a mineralização óssea ou prevenir a desmineralização dos ossos. Por exemplo, os polipeptídeos ActRIIB em questão e compostos identificados na presente invenção têm aplicação no tratamento da osteoporose e na cura de fraturas ósseas e defeitos de cartilagem em humanos e outros animais. Os polipeptídeos ActRIIB podem ser úteis em pacientes que são diagnosticados com baixa densidade óssea subclínica, como medida de proteção contra o desenvolvimento de osteoporose.
[00130]Em uma modalidade específica, métodos e composições da presente invenção podem encontrar utilidade médica na cura de fraturas ósseas e defeitos de cartilagem em humanos e outros animais. Os métodos e composições em questão podem ter também uso profilático na redução de fraturas fechadas e expostas e também na aprimorada fixação de juntas artificiais. A formação de osso novo induzido por agente osteogênico contribui para a reparação de defeitos craniofaciais congenicos, ou induzidos por lesões ou por resecção oncológica, e também é útil na cirurgia plástica para fins cosméticos. Além disso, métodos e composições da invenção podem ser usados no tratamento da doença periodontal, e em outros processos de reparação do dente. Em certos casos, os polipeptídeos ActRIIB em questão podem proporcionar um ambiente para atrair células formadoras de ossos, estimular o crescimento de células formadoras de ossos ou induzir a diferenciação de células progenitoras de células formadoras de ossos. O polipeptídeo ActRIIBs da invenção também pode ser útil no tratamento da osteoporose. Além disso, polipeptídeos ActRIIB podem ser usados na reparação de defeitos em cartilagens e prevenção/reversão da osteoartrite.
[00131]Em outra modalidade específica, a invenção fornece um método terapêutico e composição para reparar fraturas e outras condições relacionadas a defeitos de cartilagens e/ou ósseos osso ou doenças periodontais. A invenção ainda fornece métodos terapêuticos e composições para a cicatrização e reparação tecidual. Os tipos de feridas incluem, mas não estão limitados a, queimaduras, incisões e úlceras. Veja por exemplo, Publicação PCT No. WO84/01106. Tais composições compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um dos polipeptídeos ActRIIB da invenção em mistura com um farmaceuticamente aceitável veículo, transportador, ou matriz.
[00132]Em uma outra modalidade específica, métodos e composições da invenção podem ser aplicados às condições que causam perda óssea, como a osteoporose, hiperparatireoidismo, doença de Cushing, tireotoxicose, estado diarréico crônico ou má-absorção, acidose tubular renal, insuficiência renal crônica ou anorexia nervosa. Muitas mulheres sabem que, possuir um baixo peso corporal, e levar um estilo de vida sedentário, são fatores de risco para a osteoporose (perda da densidade mineral óssea, que leva ao risco de fraturas). No entanto, a osteoporose pode também resultar do uso a longo prazo de certos medicamentos. Osteoporose resultante de drogas ou de outra condição médica é conhecida como osteoporose secundária. Em uma condição conhecida como doença de Cushing, a quantidade excessiva de cortisol produzido pelo organismo resulta em osteoporose e fraturas. Os medicamentos mais comuns associados com osteoporose secundária são os corticóides, uma classe de drogas que age como o cortisol, um hormônio produzido naturalmente pela glândula adrenal. Embora níveis adequados de hormônios da tireóide (que são produzidos pela glândula tireóide) sejam necessários para o desenvolvimento do esqueleto, o excesso do hormônio tireoidiano pode diminuir a massa óssea ao longo do tempo. Antiácidos que contêm alumínio podem levar à perda óssea quando tomados em doses elevadas por pessoas com problemas renais, especialmente aqueles submetidos à diálise. Outros medicamentos que podem causar a osteoporose secundária incluem fenitoína (Dilantin) e barbitúricos que são usados para prevenir convulsões; metotrexato (Rheumatrex, Immunex, Folex PFS), uma droga para algumas formas de artrite, câncer e doenças imunológicas; ciclosporina (Sandimmune, Neoral ), uma droga usada para tratar algumas doenças auto-imune e para suprimir o sistema imunológico em pacientes de transplante de órgãos; agonistas do hormônio de liberação do hormônio (Lupron, Zoladex), usado para tratar câncer de próstata e endometriose; heparina (Calciparine, Liquaemin), uma medicação anti-coagulante; e colestiramina (Questran) e colestipol (Colestid), usado para tratar o colesterol elevado. A doença de Gum causa a perda óssea porque estas bactérias nocivas em nossas bocas força nossos corpos a se defender contra elas. As bactérias produzem toxinas e enzimas sob a gengiva, causando uma infecção crônica.
[00133]Em outras modalidades, a presente invenção fornece composições e métodos para regular o conteúdo de gordura corporal em um animal e para o tratamento ou prevenção de condições com elas relacionadas, e, particularmente, condições que comprometem a saúde de forma correlata. De acordo com a presente invenção, regular (controlar) o peso corporal pode se referir a reduzir ou aumentar o peso corporal, reduzir ou aumentar a taxa de ganho de peso, ou ao aumento ou redução da taxa de perda de peso, e também inclui manter ativamente, ou não alterar significativamente, o peso corporal (por exemplo, contra as influências externas ou internas, que podem de outra maneira aumentar ou diminuir o peso corporal). Uma modalidade da presente invenção está relacionada a regular o peso corporal pela administração a um animal (por exemplo, um ser humano) com necessidade disso, um polipeptídeo ActRIIB.
[00134]Em uma modalidade específica, a presente invenção está relacionada a métodos e compostos para reduzir a massa gorda e/ou reduzir o ganho de massa gorda em um animal e, mais particularmente, para tratar ou melhorar a obesidade em pacientes em risco ou que sofrem de obesidade. Em outra modalidade específica, a presente invenção está direcionada a métodos e compostos, voltados para o tratamento de um animal que está incapacitado de obter ou manter o peso (por exemplo, um animal com uma síndrome de atrofia). Tais métodos são eficazes para aumentar o peso corporal e/ou massa, ou para reduzir o peso e/ou perda de massa, ou para melhorar as condições associadas com ou provocadas por peso e/ou massa corpórea indesejavelmente baixa (por exemplo, não saudável).
7. Composições Farmacêuticas
[00135]Em certas modalidades, os compostos (por exemplo, polipeptídeos ActRIIB) da presente invenção são formulados com um veículo farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, um polipeptídeo ActRIIB pode ser administrado isoladamente ou como um componente de uma formulação farmacêutica (composição terapêutica). Os compostos em questão podem ser formulados para a administração de qualquer maneira conveniente para uso em medicina humana ou veterinária.
[00136]Em certas modalidades, o método terapêutico da invenção inclui administrar a composição tópica, sistêmica ou localmente como um implante ou dispositivo. Quando administrada, a composição terapêutica para uso na presente invenção está, naturalmente, em uma forma fisiologicamente aceitável, livre de pirogênicos. Além disso, a composição pode estar desejavelmente encapsulada ou injetada numa forma viscosa para a entrega a um sítio tecidual alvo (por exemplo, ossos, cartilagens, músculo, gordura ou neurônios), por exemplo, um sítio que possua um dano tecidual. A administração tópica pode ser adequada para a cicatrização e reparação tecidual. Agentes terapeuticamente úteis outros que os polipeptídeos ActRIIB que também podem ser opcionalmente inclusos na composição como acima descrita, podem ser de forma alternativa ou adicional, administrados simultaneamente ou sequencialmente com os compostos em questão (por exemplo, polipeptídeos ActRIIB) nos métodos da invenção.
[00137]Em certas modalidades, as composições da presente invenção podem incluir uma matriz capaz de entregar um ou mais compostos terapêuticos (por exemplo, polipeptídeos ActRIIB) para um sítio tecidual-alvo, proporcionando uma estrutura para o desenvolvimento de tecidos e idealmente capaz de ser reabsorvida pelo corpo. Por exemplo, a matriz pode fornecer liberação lenta dos polipeptídeos ActRIIB. Tais matrizes podem ser formadas de materiais atualmente em uso para outras aplicações de implantações de caráter médico.
[00138]A escolha do material de matriz é baseada em biocompatibilidade, biodegradabilidade, propriedades mecânicas, aparência cosmética e propriedades de interface. A aplicação em particular das composições em questão irá definir a formulação adequada. Matrizes com potencial para as composições podem ser biodegradáveis e quimicamente definicas de sulfato de cálcio, fosfato tricálcico, hidroxiapatita, ácido polilático e polianidridos. Outros materiais de potencial são aqueles biodegradáveis e biologicamente bem definidos, tais como colágeno ósseo ou dérmico. Matrizes adicionais são compreendidas de proteínas puras ou de componentes matriciais extracelulares. Outras matrizes potenciais são não- biodegradáveis e quimicamente definidas, tais como de hidroxiapatita sinterizada, bio-vidro, aluminatos, ou outros materiais cerâmicos. As matrizes podem ser compreendidas de combinações de quaisquer dos tipos acimamencionados de material, tais como ácido polilático e hidroxiapatita ou colágeno e fosfato tricálcico. Os materiais bio-cerâmicos podem ser alterados em suas composições, tais como em fosfato-aluminato-cálcio e processamento para alterar o tamanho de poro, tamanho de partícula, forma de partícula, e biodegradabilidade.
[00139]Em certas modalidades, os métodos da invenção podem ser administrados por via oral, por exemplo, na forma de cápsulas, pílulas, comprimidos, pastilhas (usando uma base com sabor, sacarose normalmente e acácia ou tragacanto), pós, grânulos, ou como uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou não aquoso, ou como uma emulsão líquida do tipo óleo-em-água ou água-em-óleo, ou como um elixir ou xarope, ou como pastilhas (usando uma base inerte, como a gelatina e glicerina, sacarose ou e acácia) e/ou como um enxaguatório bucal e assim por diante, cada um contendo uma quantidade predeterminada de um agente como um ingrediente ativo. Um agente também pode ser administrado como um bolus, electuário, ou pasta.
[00140]Em formas farmacêuticas de dosagem sólidas de administração oral (cápsulas, comprimidos, pastilhas, drágeas, pós, grânulos, e afins), um ou mais compostos terapêuticos da presente invenção podem ser misturados com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, como o citrato de sódio ou fosfato bicálcico, e/ou qualquer um dos seguintes: (1) cargas ou ampliadores, tais como amido, lactose, sacarose, glicose, manitol e/ou ácido silícico, (2) aglutinantes, tais como, por exemplo, carboximetilcelulose, alginato, gelatina, polivinil pirrolidona, sacarose e/ou de acácia; (3) umectantes, tais como o glicerol, (4) agentes de desintegração, tais como agar-agar, carbonato de cálcio, fécula de batata ou de tapioca, ácido algínico, certos silicatos, e carbonato de sódio, (5) agentes retardadores de solução, tais como parafina; (6) aceleradores de absorção, tais como compostos de amônio quaternário; (7) agentes umectantes, tais como por exemplo, álcool cetílico e monoestearato de glicerol; (8) absorventes, tais como caulim e argila bentonítica; (9) lubrificantes, tais como talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, glicóis de polietileno sólidos, lauril sulfato de sódio, e suas misturas, e (10) agentes corantes. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, as composições farmacêuticas podem também incluir agentes tamponados. Composições sólidas de um tipo semelhante também podem ser empregadas como cargas em cápsulas duras e moles de gelatina preenchidas usando excipientes tais como lactose ou açúcar de leite, bem como glicóis de polietileno de alto peso molecular.
[00141]Formas farmacêuticas líquidas para administração oral incluem os farmaceuticamente aceitáveis emulsões, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes, e elixires. Além do ingrediente ativo, a formas líquidas de dosagem podem conter solventes inertes comumente usados na arte, como a água ou outros solventes, agentes solubilizantes e emulsificantes, como o álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etila, acetato de etila, álcool benzílico, benzoato de benzila, propileno glicol, 1,3-butileno glicol, óleos (em particular, de amendoim sementes de algodão, milho, gérmen, verde-oliva, mamona, e óleos de gergelim), glicerol, álcool tetraidrofurílico, glicóis de polietileno e ésteres de ácidos graxos de sorbitano e suas misturas. Além de diluentes inertes, as composições orais também podem incluir adjuvantes, tais como agentes umectantes, agentes emulsificantes e de suspensão, adoçantes, aromatizantes, corantes, perfumantes, e conservantes.
[00142]As suspensões, além dos compostos ativos, podem conter agentes de suspensão, tais como álcoois etoxilados isoestearílico, ésteres de polioxietileno sorbitol, sorbitano e, celulose microcristalina, metaidróxido de alumínio, bentonita, agar-agar e tragacanto, e misturas desses mencionados.
[00143]Certas composições aqui reveladas podem ser administradas por via tópica, seja para a pele ou membranas mucosas. As formulações tópicas podem ainda incluir um ou mais de uma grande variedade de agentes conhecidos serem eficazes como intensificadores da penetração na pele ou extrato córneo. Exemplos destes são 2-pirrolidona, N-metil-2-pirrolidona, dimetilacetamida, dimetilformamida, propileno glicol, metil ou álcool isopropílico, dimetilsulfóxido, e azona. Agentes adicionais podem ainda ser incluídos para tornar a formulação cosmeticamente aceitável. Exemplos destes são as gorduras, ceras, óleos, corantes, fragrâncias, conservantes, estabilizantes e agentes ativos de superfície. Agentes queratolíticos, tais como os conhecidos na arte também podem ser incluídos. Exemplos são o ácido salicílico e enxofre.
[00144]Formas farmacêuticas para a administração tópica ou transdérmica incluem pós, sprays, pomadas, pastas, cremes, loções, géis, soluções, emplastros, e inalantes. O composto ativo pode ser misturado em condições estéreis com um veículo farmaceuticamente aceitável, e com conservantes, tampões, ou propelentes que possam ser necessários. As pomadas, pastas, cremes e géis podem conter, além de um composto do material da invenção (por exemplo, um polipeptídeo ActRIIB), excipientes, tais como gorduras animais e vegetais, óleos, ceras, parafinas, amido, tragacanto, derivados de celulose, polietilenoglicóis, silicones, bentonitas, ácido silícico, talco e óxido de zinco, ou misturas dos mesmos.
[00145]Pós e sprays podem conter, além de um composto em questão, excipientes como a lactose, talco, ácido silícico, hidróxido de alumínio, silicatos de cálcio e pó de poliamida, ou misturas destas substâncias. Sprays podem adicionalmente conter propelentes habituais, tais como hidrocarbonetos voláteis e hidroclorofluorcarbonos e hidrocarbonetos não substituídos, tais como butano e propano.
[00146]Em certas modalidades, composições farmacêuticas adequadas para administração parenteral podem incluir um ou mais polipeptídeos ActRIIB em combinação com uma ou mais farmaceuticamente aceitáveis soluções aquosas ou não aquosas estéreis isotônicas, dispersões, suspensões ou emulsões, ou pós estéreis, que possam ser reconstituídos na forma de soluções ou dispersões injetáveis estéreis logo antes do uso, eu possam conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos, solutos que tornem a formulação isotônica com o sangue do receptor pretendido ou agentes de suspensão ou de espessamento. Exemplos de adequados veículos aquosos e não aquosos que podem ser empregados nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis (como o glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e afins), e misturas desses mencionados, óleos vegetais, tais como azeite de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. A adequada fluidez pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tais como lecitina, mediante manutenção do necessário tamanho de partícula no caso de dispersões, e pelo uso de tensoativos.
[00147]As composições da invenção também podem conter adjuvantes, tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes. A prevenção da ação de microorganismos pode ser assegurada através da inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, ácido sórbico fenol, e assim por diante. Também pode ser desejável incluir agentes isotônicos, como açúcares, sódio, cloro e similares nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser provocada pela inclusão de agentes que retarddem a absorção, tais como o monoestearato de alumínio e gelatina.
[00148]É entendido que o regime de dosagem será determinado pelo médico assistente, considerando vários fatores que modificam a ação dos compostos da invenção (por exemplo, polipeptídeos ActRIIB). Os diversos fatores dependerão da doença a er tratada.
[00149]Em certas modalidades, a presente invenção também fornece terapia genética para a produção in vivo de polipeptídeos de ActRIIB ou de outros compostos divulgados neste documento. Tal terapia pode atingir o seu efeito terapêutico com a introdução das sequências de polinucleotídeo ActRIIB em células ou tecidosque possuam os distúrbios como listado acima. A entrega de sequências de polinucleotídeos ActRIIB pode ser alcançada usando um vetor de expressão recombinante, tal como um vírus quimérico ou um sistema de dispersão coloidal. Preferido para entrega terapêutica da sequências de polinucleotídeos ActRIIB é o uso de lipossomas direcionados.
[00150]Vários vetores virais que podem ser utilizados para a terapia de gene como ensinado aqui incluem adenovírus, vírus herpes, varíola, ou, de preferência, um vírus RNA, como um retrovírus. De preferência, o vetor retroviral é um derivado de um retrovírus murino ou aviário. Exemplos de vetores retrovirais em que um único gene estrangeiro pode ser inserido incluem, mas não estão limitados a: vírus da leucemia murina Moloney (MoMuLV), vírus do sarcoma murino Harvey (HaMuSV), vírus do tumor mamário murino (MuMTV), e Vírus do Sarcoma de Rous ( RSV). Um número de adicionais vetores retrovirais pode incorporar genes múltiplos. Todos estes vetores podem transferir ou incorporar um gene a um marcador selecionável para que as células transduzidas possam ser identificadas e geradas. Vetores retrovirais podem ser tornados direcionados a alvos específicos mediante anexar, por exemplo, um açúcar, um glicolipídeo, ou uma proteína. O atingimento do alvo preferido é conseguido mês utilizar um anticorpo. Aquele usualmente versado na técnica vai reconhecer que sequências específicas de polinucleotídeo podem ser inseridas no genoma retroviral ou anexado a um envelope viral para permitir a entrega aos objetivos específicos do vetor retroviral contendo o polinucleotídeo ActRIIB. Em uma modalidade preferida, o vetor é direcionado para células/tecidos ósseos, cartilagens, musculares ou neuronais.
[00151]Alternativamente, as células de cultura tecidual podem ser diretamente transfectadas com plasmídeos que codificam genes estruturais retrovirais gag, polímero e env, mediante a transfecção convencional por fosfato de cálcio. Essas células são então transfectadas com o vetor plasmídeo contendo os genes de interesse. As células resultantes liberam o vetor retroviral no meio de cultura.
[00152]Outro sistema de entrega prevista para polinucleotídeos ActRIIB é um sistema de dispersão coloidal. Sistemas de dispersão coloidal incluem complexos macromoleculares, nanocápsulas, microesferas, microesferas e lipídios, incluindo sistemas baseados em emulsões do tipo óleo em água, micelas, micelas mistas e lipossomas. O sistema coloidal preferido desta invenção é um lipossoma. Os lipossomas são vesículas de membrana artificiais que são úteis como veículos de entrega in vitro e in vivo. RNA DNA e viriões intactos podem ser emcapsulados no interior aquoso e serem entregues às células em uma forma biologicamente ativa (ver, por exemplo, Fraley, et al. Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Métodos para a eficiente transferência genética usando um veículo lipossoma são conhecidos na arte, ver, por exemplo, Mannino, et al. Biotechiques, 6:682, 1988. A composição dos lipossomas é geralmente uma combinação de fosfolipídeos, geralmente em combinação com esteróides, especialmente o colesterol. Outros fosfolípideos ou lipídios também podem ser usados. As características físicas dos lipossomas dependem do pH, força iônica e da presença de cátions divalentes.
[00153]Exemplos de lipídios úteis na produção de lipossomas incluem compostos fosfatidila, tais como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolipídios, cerebrosídeos e gangliosídeos. Fosfolipídios ilustrativos incluem fosfatidilcolina de ovo, dipalmitoilfosfatidilcolina e distearoilfosfatidilcolina. O direcionamento dos lipossomos também é possível com base, por exemplo, na especificidade do órgão, especificidade da célula, e especificidade da organela, como conhecido na arte.
Exemplificação
[00154]A invenção que está sendo agora descrita de forma geral, será mais facilmente entendida através da referência aos exemplos apresentados a seguir, os quais são inclusos para fins meramente de ilustração de alguams modalidades e de modalidades da presente invenção, e não são pretendidos a limitar a invenção.
Exemplo 1. Geração de ActRIIB (25-131) com HFC-Alternative sequências de nucleotídeos
[00155]Para gerar ActRIIB (25-131)-hFc, o domínio humano ActRIIB extracelular com truncamentos N-terminal e C-terminal (resíduos 25-131 da proteína nativa) foi fundido em N-terminal com uma sequência líder TPA usada como substituta para a ActRIIB líder nativa e ligada em C-terminal com um domínio Fc humano por meio de um articulador mínimo (três resíduos glicina) (Figura 1). Uma sequência nucleotídica que codifica essa proteína de fusão é mostrada na Figura 2. Os requerentes modificaram os códons e descobriram uma variante ácido nucléico que codifica a proteína ActRIIB (25-131)-hFc que proporcionou melhoria substancial nos níveis de expressão dos transformantes iniciais (Figura 3).
[00156]A proteína madura tem uma sequência de aminoácidos como se segue (terminação-N confirmada pelo sequenciamento N-termimal )(SEQ ID: 8): ETRECIYYUA NWELERTNQS GLERCEGEQD KRLHCYASWR NSSGTIELVK X G C l\ L J D FE G Y D R ? E C V ATE E M Fü V Y EC G G E GK FC K E R F T ] ■ 1P E AG C- P E V TYEPPPTGGG THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV WDVSHEDPE VKFtJWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQCJGNV FSCSVt-lHEAL HNHYTQKSLS LSPGK
Aminoácidos 1-107 são derivados de ActRIIB.
[00157]A molécula expressa foi purificada usando uma série de etapas de cromatografia em coluna, incluindo, por exemplo, três ou mais dos seguintes, em qualquer ordem: Cromatografia da Proteína A, Cromatografia da sefarose Q, cromatografia da fenilsefarose, cromatografia de exclusão dimensional e cromatografia de troca catiônica. A purificação pode ser completada com filtração viral e troca de tampão.
[00158]Exemplo 2. Ligação de alta afinidade a ligante por meio de ActRIIB (25-131)-hFc As afinidades de diversos ligantes para ActRIIB (25-131)-HFC e sua contraparte ActRIIB (20-134)-hFc de comprimento completo foram avaliadas in vitro com um instrumento Biacore™, e os resultados são resumidos na tabela abaixo. Os valores de Kd foram obtidos por ajuste da afinidade em estado de equilíbrio (“steady-state”) devido a uma muito rápida associação e dissociacao do complexo, o que impediu a exata determinação de kon e Koff. ActRIIB (25-131)-hFc se ligou a ativina A, ativina B, e GDF11 com alta afinidade. Curiosamente, ActRIIB (25-131)-hFc parece mostrar uma maior afinidade para GDF3 que a ActRIIB (20-134)-hFc (dados não mostrados). Afinidades ligantes d as formas ActRII B-hFc:
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[00159]Exemplo 3. ActRIIB (25-131)-hFc aumenta a massa muscular e força em VivoOs rquerentes pesquisaram a capacidade de ActRIIB (25-131)-hFc para aumentar a massa muscular e força em camundongos. Camundongos machos (n = 10 por grupo) foram tratados por via subcutânea duas vezes por semana com o veículo (salino Tris-tamponado) ou uma das cinco doses de ActRIIB (25-131)-hFc. Quatro semanas de tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc produziu um claro aumento dose-dependente na massa de tecido magro (Figura 4), como determinado pela varredura por ressonância magnética nuclear de todo o corpo (RMN). A aumentada massa muscular foi confirmada no final do estudo para músculos específicos, incluindo o peitoral (Figura 5), reto femoral e gastrocnêmio. De forma importante, a aumentada massa corporal foi acompanhada pelo aumento da força, como avlaiado pela força de apreensão, comparada ao veículo (Figura 6). Esses resultados fornecem evidências convincentes de que ActRIIB (25-131)-hFc aumenta a massa muscular e força muscular in vivo.
[00160]Exemplo 4. ActRIIB (25-131)-hFc Evita perda de massa muscular no camundongo modelo de privação de androgênioOs requerentes pesquisaram a capacidade de ActRIIB (25-131)-hFc para evitar a perda muscular em um camundongo modelo de privação de androgênio, uma intervenção terapêutica padrão para cancer prostático avancado em homens. Camundongos machos (n = 10 por grupo) foram orquidectomizados (ORX) ou controle-operados e tratados por via subcutânea duas vezes por semana com veículo TBS, ActRIIB (25-131)-hFc a 10 mg/kg, ou sua contraparte murina ActRIIB (20-134)-mFc de comprimento completo a 10 mg/kg. A massa de tecido magro foi determinada através de varredura por RMN de todo o corpo. Ratos ORX tratados por quatro semanas com uma ou outra das formas ActRIIB-Fc apresentaram um aumento na massa de tecido magro em comparação com o basal, o que foi altamente significativo comparado a uma redução observada nos controles ORX durante aquele período (Figura 7). Um aumento análogo, altamente significativo foi observado sob condições de gônadas intactas pra ambas as formas de ActRIIB-Fc comparado aos controles controles (Figura 7). Estes resultados demonstram que ActRIIB (25-131)-hFc pode aumentar a massa de tecido magro (evitar a perda muscular) de forma tão eficaz como a sua contraparte ActRIIB (20-134)-mFc de comprimento completo nesse modelo de privação de androgênio.
[00161]Exemplo 5. ActRIIB (25-131)-hFc Melhora a composição corporal em um camundongo modelo de obesidade induzida por dietaOs requerentes também investigaram a capacidade de ActRIIB (25-131)-hFc para aumentar a massa muscular e reduzir a massa gorda em um camundongo modelo de obesidade induzida por dieta. Camundongos machos (n = 10 por grupo) foram alimentados com uma dieta de ração padrão ou uma dieta rica em gordura e tratados de forma intraperitoneal duas vezes por semana com veículo TBS ou ActRIIB (25-131)-hFc em 10 mg/kg. Massa de tecido magro e a massa gorda foram determinadas através de varredura RMN por todo o corpo. O tratamento de camundongos com uma dieta rica em gorduras com ActRIIB (25-131)-hFc por quatro semanas resultou em um aumento de mais de 25% na massa de tecido magro, em comparação com um aumento de 2% com o tratamento com veículo (Figura 8). Resultados semelhantes foram obtidos em camundongos tratados com a dieta controle com ActRIIB (25-131)-hFc como comparado ao veículo (Figura 8). Além disso, a continuação do tratamento foi descoberta melhorar a adiposidade. Em comparação com veículo, o tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc por 12 semanas reduziu a massa gorda em cerca da metade em camundongos com uma dieta rica em gordura, bem como naqueles com a dieta controle (Figura 9).
[00162]Tomados em conjunto, estes dados demonstram que ActRIIB (25- 131)-hFc pode ser usado para melhorar a composição corporal in vivo sob uma variedade de condições, incluindo a privação de androgênio e alta ingestão de gordura.
[00163]Exemplo 6: ActRIIB (25-131)-hFc Normaliza Lípidios Séricos, insulina e adiponectina no camundongo modelo de obesidade induzida por dietaOs requerentes também investigaram os efeitos da ActRIIB (25-131)-hFc nas concentrações séricas de clinicamente importantes lipídios, insulina, adiponectina, e em outros parâmetros metabólicos em camundongos machos alimentados com uma dieta rica em gordura. Dez semanas de idade, camundongos C57BL/6 foram pareados por peso e tratados com ActRIIB (25-131)-hFc (n = 10) ou veículo Salino Tris-tamponado (TBS) (n = 7) duas vezes por semana, 10 mg/kg, sc, por 60 dias. Durante este período, os camundongos tiveram acesso ilimitado a uma dieta contendo 58% de gordura em vez da ração padrão contendo 4,5% de gordura.
[00164]O tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc causou uma quantidade de notáveis efeitos metabólicos. Em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura, ActRIIB (25-131)-hFc reduziu as concentrações séricas patologicamente elevadas de triglicerídeos, ácidos graxos livres, lipoproteína de alta densidade (HDL) e lipoproteínas de baixa densidade (LDL) (Figura 10 - 13), na maioria dos casos normalizando esses parâmetros aos níveis observados em camundongos alimentados com uma dieta padrão. De forma importante, o tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc também normalizou as concentrações de insulina em camundongos sob dieta rica em gordura (Figura 14) e aumentou significativamente as concentrações de adiponectina acima até mesmo daquelas em camundongos alimentados com uma dieta padrão (Figura 15). A adiponectina é um biomarcador chave da composição corporal, na medida em que os níveis de adiponectina circulante são conhecidos por variar inversamente com a massa de gordura/obesidade, e a adiponectina aumenta a sensibilidade à insulina nos tecidos- alvo. ActRIIB (25-131)-hFc também reduziu as concentrações séricas de leptina, outro importante indicador do estado de adipócitos, em cerca de 50% (P <0,05). Finalmente, os efeitos acima mencionados foram acompanhados por mudanças benéficas na composição corporal, como determinado por ressonância magnética nuclear (RMN) no basal e no Dia 48. Sob condições de dieta de alto teor de gordura, a massa total de gordura no veículo tratados com controles triplicou durante este período de 48 dias, e o tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc corta esse aumento em quase 40%. Por volta do Dia 48, a massa total de gordura era de 27% do peso corporal em camundongos tratados com ActRIIB-Fc vs 39% em camundongos de controle, enquanto a massa de tecido magro foi de 59% do peso corporal em camundongos tratados com ActRIIB (25-131)-hFc vs 55% em camundongos controle. Assim, o resultado líquido foi de uma composição corporal saudável sob condições de dieta rica em gorduras.
[00165]Pra os parâmetros séricos mencionados, ActRIIB (25-131)-hFc consistentemente superou ActRIIB (20-134)-hFc, que também foi avaliado nesse mesmo estudo. Assim, ActRIIB (25-131)-hFc melhorou os níveis de triglicerídeos em quase 6 vezes se tanto, os níveis de FFA em quase o dobro se tanto, os niveis de HDL em quase 4 vezes mais se tanto, os níveis de insulina em mais que duas vezes se tanto, e os níveis de adiponectina em quase 1,5 vezes se tanto quanto o fez o ActRIIB (20-134)-hFc na mesma dose.
[00166]Exemplo 7: ActRIIB (25-131)-hFc Induz Propriedades Termogênicas na gordura branca em um camundongo modelo de obesidade induzida por dietaNo estudo descrito acima (Exemplo 6), os requerentes também investigaram os efeitos de ActRIIB (25-131)-hFc nas propriedades termogênicas do tecido adiposo branco. Sob condições de dieta de alto teor de gordura, o tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc desencadeou alterações histológicas e um perfil de expressão gênica no tecido adiposo branco que eram consistentes com capacidade termogênica. Conforme mostrado na Figura 16, o exame histológico da gordura branca epididimal indicou que ActRIIB (25-131)-hFc reduzio o tamanho de gotícula de lipídio e induziu a formação de agrupamentos de adipócitos multioculares que são uma característica marcante da gordura marrom. Além disso, a análise imuno-histoquímica deste tecido revelou a indução citoplasmática generalizada de UCP1 em ambos os adipócitos multiloculares e unioculares como um resultado do tratamento com ActRIIB (25-131)- hFc (Figura 16).
[00167]Acompanhando estas mudanças histológicas ocorreram alterações dignificativas na expressão de importantes genes regulatórios termogênicos e metabólicos na gordura branca epididimal, como determinado por RT-PCR quantitativa (reação de cadeia polimerase de transcrição reversa). Em camundongos sob uma dieta rica em gordura, o tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc aumentou os niveis ICP1 mRNA em mais de 60 vezes comparado ao veículo (Figura 17), uma mudança particularmente expressiva uma vez que essa linhagem de camundongos apresentam uma indução severamente embotada de OCP1 e adipócitos marrons dentro dos depósitos chaves de gordura branca comparado com outras linhs de camundongos (Guerra et al, 1998, J Clin Invest 102:412-420; Xue et al, 2007, J Lipid Res 48:41-51). Além disso, o tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc aumentou os niveis de mRNA que codifica a sirtuína SIRT-1 (regulador dois da informação silenciosa, homólogo 1), como um regulador mestre sensível a energia (deacetilase) que protege contra dadnos metabólicos induzidos por uma dieta rica em gorduras (Pfluger et al., 2008, Proc Natl Acad Sci EUA 105:9793-9798) e está implicado como um importante controle da mobilização de ácido graxo (Rodgers et al., 2008, FEBS Lett 582:46-53). De forma significativa, o tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc também aumentou os níveis de codificação mRNA PGC-1α (coativador-1a de receptor gama ativado por proliferador peroxisomo), um bem documentado alvo de SIRT-1 que, por sua vez, controla a expressão de muitos genes necessários para a capacidade da biogênese mitocondrial e termogênica no tecido adiposo marrom (Uldry et al., 2006, Cell Metab, 3:333-341). De modo importante, a expressao forçada de PGC-1a em adipócitos brancos tem se mostrado induzir um programa termogênico da expressão genética, incluindo UCP1, que muito se assemelha àquele dos adipócitos marrons (Hansen et al. 2006, Biochem J 398:153-168). No presente estudo, ActRIIB (25-131)-hFc restaurou a expressão do gene PGC-1a no tecido adiposo branco sob condições de dieta rica em gorduras aos níveis indistinguíveis daqueles em camundongos alimentados com a dieta padrão.
[00168]Outras alterações associadas ao tratamento constituem um elo importante entre o perfil de expressão alterada no tecido adiposo branco e os benéficos efeitos hormonais e metabólicos. Assim, na gordura branca epididimal, ActRIIB (25-131)-hFc aumentou os níveis de nRNA que codificam FOXO-1 (caixa tipo garfo contendo proteína O da subfamília-1), um fator de transcrição que é ambos um alvo de SIRT-1 e um indutor chave da expressão de (Qiao et al. 2006, J Biol Chem 281:39915-39924). Consistentes com indução nRNA de FOXO-1, o tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc elevou os níveis de mRNA adiponectina na gordura branca (Figura 18), o que ajuda a explicar o aumento dos níveis circulantes de adiponectina (Figura 15, Exemplo 6), a sensibilidade reforçada da insulina nos tecidos alvos, e as concentrações normalizadas de insulina (Figura 14 Exemplo 6) nesses animais. Em resumo, O tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc sob condições de dieta de alto teor de gordura resultou em (1) alterações histológicas e um perfil de expressão genética no tecido adiposo brando que estavam consistentes com a capacidade termogênica e (2) alterações benéficas em uma ampla faixa de parâmetros hormonais e metabólicos.
[00169]Exemplo 8: Efeitos da ActRIIB (25-131)-hFc no fígado e músculos no camundongo modelo de obesidade induzida por dietaA doença de fígado gorduroso não alcoólico (NAFLD) é um espectro de distúrbios hepáticos cada vez mais comuns amplamente considerados serem a manifestação hepática da síndrome metabólica e caracterizada pelo acúmulo de gordura no fígado (esteatose), muitas vezes com efeitos deletérios. Um subgrupo de pacientes NAFLD desenvolve uma condição inflamatória referida como esteatohepatite não-alcoólica (NASH), que pode progredir para fibrose hepática, cirrose e carcinoma hepatocelular (Perlemuter et al. 2007, Nat Clin Pract Endocrinol Metab 3:458-469). No estudo descrito acima (Exemplos 6-7), os requerentes investigaram se ActRIIB (25-131)-hFc pode inibir a esteatose hepática associada a uma dieta rica em gordura. Ao término do estudo, o tecido hepático de camundongos alimentados com a dieta rica em gordura apresentou um grande número de gotículas lipídicas densamente empacotadas, avaliada através da coloração com Oil Red O, enquanto que camundongos alimentados com a dieta padrão não mostraram nenhuma evidência de depósitos hepáticos de lipídios (Figura 19). O tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc reverteu quase que completamente a deposição lipídica hepática e normalizou a aparência do tecido hepático independentemente da dieta rica em gordura. Assim, ActRIIB (25-131)-hFc foi um inibidor eficaz de esteatose hepática causada por dieta de alto teor de gorduras.
[00170]O tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc também aumentou a massa muscular nesse modelo de obesidade induzida por dieta, de acordo com o encontrado em outros modelos (Exemplos 3-5). Especificamente, ActRIIB (25-131)- hFc aumentou a massa peitoral em mais de 70% (P <0,001), massa gastrocnêmica em quase 40% (P <0,001), e massa reto femoral em mais de 25% (P <0,001) comparados aos controles sob dieta de alto teor de gordura. Essas alterações na massa muscular foram acompanhadas por mudanças na expressão gênica do músculo, como determinado por RTpPCR no tecido gastrocnêmio. Comparados aos controles sob dieta de alto teor de gorduras o ActRIIB (25-131)-hFc aumentou os níveis de PGC-1α mRNA e níveis FOXO-1 mRNA em aproximadamente 50% cada (P <0,05) no gastrocnêmio.
[00171]Exemplo 9: Efeito da ActRIIB (25-131)-mFc na gordura branca visceral em um camundongo modelo de obesidade induzida por dietaO acúmulo de gordura visceral, ao contrário da gordura subcutânea, desempenha um papel crítico no desenvolvimento de doenças cardiovasculares e obesidade, distúrbios relacionados, tais como diabetes mellitus, hiperlipidemia, hipertensão e síndrome metabólica (Matsuzawa et al, 2006, FEBS Lett 580.: 2917-2921). Devido à sua localização, a gordura visceral (ou intra-abdominal) tem acesso imediato ao fígado através da circulação pelo portal hepático, onde poderia influenciar o metabolismo, promover a resistência à insulina, e provocar esteatose. Portanto, em um estudo semelhante ao descrito acima (Exemplos 6-8), os requerentes investigaram os efeitos da variante ActRIIB (25-131)-mFc truncada sobre as quantidades de gordura visceral versus a de gordura abdominal subcutânea sob condições de dieta de alto teor de gordura. Camundongos C57BL/6 de nove semanas de idade foram tratados com ActRIIB (25-131)-mFc (n = 20), a 10 mg/kg, sc, ou veículo Salino Tris-tamponado (TBS) (n = 10) duas vezes por semana, durante 60 dias. Aos sete dias iniciais antes do inívio da dosagem, os camundongos tiveram acesso ilimitado a uma dieta contendo 58% de gordura em vez da ração padrão contendo 4,5% de gordura. Um grupo adicional de camundongos (n = 10) mantidos na ração padrão da dieta também foi tratado com veículo TBS e seguido como um controle dietético. Volumes de gordura foram determinados por microCT para um subconjunto de camundongos (n = 4 por grupo), cujos percentuais de gordura corporal total, conforme determinado pela análise de ressonância magnética nuclear (RMN), eram os mais próximos aos grupos de média (todos os camundongos foram submetidos a análise de RMN).
[00172]A gordura visceral e gordura subcutânea abdominal, ambas variaram notadamente em tamanho com a dieta e o tratamento com ActRIIB (25-131)-mFc. A reconstrução tridimensional de imagens microCT obtidas parcialmente através do estudo (35 dias) demonstram que os depósitos de gordura visceral e gordura subcutânea ambos expandiram, como um resultado da dieta rica em gordura e que ActRIIB (25-131)-mFc reverteu em grande parte aqueles aumentos (Figura 20). Quando analisados quantitativamente na conclusão do estudo (60 dias), o efeito da ActRIIB (25-131)-mFc comparada a uma dieta rica em gordura sozinha foi altamente significativa para ambos a gordura visceral (Figura 21) e a gordura subcutânea abdominal (Figura 22).
[00173]Exemplo 10: Efeito da ActRIIB (25-131)-mFc em Propriedades Brown Fat no camundongo modelo de obesidade induzida por dietaNo estudo descrito no Exemplo 9, os requerentes também investigaram os efeitos de ActRIIB (25-131)-mFc sobre as ppds dos depositos de gordura marrom interescapular sob condições de dieta de alto teor de gorduras. Em comparação com a dieta padrão, a dieta rica em gordura produziu diversas alterações no depósito interescapular de tecido adiposo marrom, e o tratamento com ActRIIB (25-131)-mFc ou reverteu completamente ou amplamente cada uma dessas alterações. Especificamente, a dieta rica em gorduras causou uma pronunciada ampliação do depósito interescapular, bem como iluminação de sua cor de vermelho para rosa (Figura 23). Esta ampliação induzida por dieta reflete uma duplicação da massa (Figura 24) e uma redução na densidade (Figura 25) dos depósitos de gordura marrom. A densidade do depósito foi determinada por micro-tomografia computadorizada (microCT) in situ para um subconjunto de camundongos (n = 4 por grupo), cujos percentuais de gordura corporal total, conforme determinado pela análise de ressonância magnética nuclear (RMN), eram os mais próximos das médias dos grupos (todos os camundongos foram submetidos à análise de RMN). O tratamento com ActRIIB (25-131)-mFc inverteu completamente as alterações induzidas por dieta na massa de gordura marrom (Figura 24) e densidade (Figura 25), enquanto que reverteu amplamente as alterações dieta-induzidas em tamanho e coloração do depósito (Figura 23). Estes resultados indicam que, sob condições de dieta de alto teor de gordura, ActRIIB (25-131)-mFc restaura em grande parte ou completamente as propriedades prováveis de serem correlacionadas com a função de gordura marrom saudavem e desse modo melhora a qualidade da gordura marrom na medida que reduz o tamanho total dos depósitosde gordura marrom.
[00174]Exemplo 11: Efeitos da ActRIIB (25-131)-mFc nos musculos, ossos, gordura e hormonios metabólicos em um camundongo modelo de envelhecimentoA composição corporal se altera com o envelhecimento em uma forma previsível. O declínio normal idade-dependente na massa muscular e na força muscular, conhecido como sarcopenia, começa próximo da idade de 30 anos e se acelera após os 60 anos (Stenholm et al, 2008, Curr Opin Clin Nutr Metab Care 11:693-700). A massa e a resistência óssea apresentam um declínio similar com a idade, levando a um aumentado risco da osteoporose em idosos. A massa de gordura no corpo como um tod aumenta com a idade até próximo da idade de 70 anos, e em seguida declina em termos absolutos mas permanece numa proporção mais ou menos constante relativamente à massa corpórea total (Cartwright et al., 2007, Exp Gerontol 42:463-471). Com base na eficácia observada em outros modelos e aqui descritoos requerentes investigaram efeitos da ActRIIB (25-131)-mFc em músculo, osso, gordura e nos níveis de insulina em um camundongo modelo de envelhecimento. Camundongos C57BL/6 de dezenove meses de idade do sexo masculino tiveram acesso ilimitado a uma ração padrão de dieta e foram tratados com ActRIIB (25-131)-mFc (n = 16), a 10 mg/kg, sc, ou veículo TBS (n = 15) duas vezes por semana durante 8 semanas. Como um quadro de referência, a expectativa de vida média nesta linhagem de camundongos foi previamente descoberta ser de aproximadamente 27 meses, sob as condições padrões de dieta (Turturro et al, 2002, J Biol Sci Gerontol A Med Sci 57: B379-389).
[00175]O tratamento com ActRIIB (25-131)-mFc gerou uma série de mudanças notáveis na composição corporal e efeitos hormonais metabólicos nesses camundongos idosos. Conforme determinado pela análise RMN de corpo inteiro, a massa de tecido magro ficou essencialmente inalterada em camundongos controle no transcurso do estudo, enquanto que em camundongos tratados com ActRIIB (24- 131)-mFc ela aumentou progressivamente a quase 20% acima dos valores basais por sete semanas (Figura 26). Coerente com este efeito de corpo inteiro, ActRIIB (25-131)-mFc também aumentou significativamente a massa muscular de grupos de indivíduos, incluindo o peitoral (aumento de 55%), reto femoral (40%), tríceps (40%) e gastrocnêmio (28%), comparado aos controles tratados com veículo em 8 semanas. De forma importante, o tratamento com ActRIIB (25-131)-mFc melhorou a função neuromuscular, conforme determinado pelo teste de força de apreensao de acordo com um protocolo estabelecido (http://jaxservices.jax.org/phenotyping/gripstrength_protocol.html) (Figura 27).
[00176]Vários parâmetros relacionado aos ossos melhoraram através do tratamento com ActRIIB (25-131)-mFc em camundongos envelhecidos. Conforme determinado pela análise DEXA no basal e em momentos de 8 semanas, o ActRIIB (25-131)-mFc aumentou a densidade mineral óssea do corpo todo durante o transcurso do estudo, enquanto que os controles ficaram essencialmente inalterados (Figura 28). Além disso, a análise microCT da tíbia proximal demonstrou que o tratamento com ActRIIB (25-131)-mFc por 8 semanas dobrou a fração de volume ósseo da tíbia proximal comparada com os controles (P <0,01).
[00177]O ActRIIB (25-131)-mFc exerceu efeitos importantes sobre a gordura em camundongos envelhecidos. Conforme determinado pela análise de RMN em múltiplos momentos, houve um progressivo declínio na massa gordurosa de todo o corpo nos controles tratados com veículo no transcurso do estudo (Figura 29), consistente com os resultados de seres humanos em idade avançada. O tratamento com ActRIIB (25-131)-mFc acelerou esta mudança, provocando uma diminuição de duas vezes na magnitude observada no grupo controle (-44% vs -19%, respectivamente) (Figura 29). Pelo momento terminal, ActRIIB (25-131)-mFc reduziu significativamente a massa dos individuais depositos epididimal, inguinal e retroperitoneal da gordura branca em quantidades variando de 48-54%. Curiosamente, o tratamento com ActRIIB (25-131)-mFc também reduziu a massa dos depósitos de gordura marrom interescapular por quase 45% (P <0,05), semelhante aos resultados obtidos para este tecido no camundongo modelo da obesidade dietética (Exemplo 10). Finalmente, como determinado pela análise microCT em um subconjunto representativo de camundongos (n = 4) de cada grupo, o ActRIIB (25-131)-mFc reduziu o correspondente volume do componente visceral de gordura abdominal em 65% (P <0,01) e o do componente subcutâneo da gordura agdominal em 49% (P <0,01). Assim, o compartimento visceral crítico de gordura foi fortemente orientado por ActRIIB (25-131)-mFc neste modelo de envelhecimento.
[00178]O ActRIIB (25-131)-mFc também produziu mudanças benéficas em importantes hormônios metabólicos em camundongos envelhecidos. Oito semanas de tratamento com ActRIIB (25-131)-mFc quase dobrou as concentrações circulantes de adiponectina (P <0,001) e reduziu as concentrações circulantes de insulina em mais de 40% (Figura 30). Uma concentração elevada de insulina em jejum (hiperinsulinemia) é uma medida amplamente aceita de visualização da resistência à insulina (Weyer et al., 2000, Diabetes 49:2094-2101), e as aumentadas concentrações de adiponectina são prováveis de contribuir para a melhorada sensibilidade a insulina no presente estudo. As concentrações de hemoglobina glicada (A1C) foram significativamente reduzidas por ActRIIB (25-131)-mFc neste estudo (Figura 31), fornecendo assim evidência adicional para a melhora da regulação da glicose com o tratamento com ActRIIB (25-131)-mFc neste modelo de envelhecimento.
[00179]Exemplo 12: Efeito da ActRIIB (25-131)-hFc no tecido magro no camundongo modelo de Caquexia cancerosaCaquexia é a perda de peso indesejado resultante da perda de tecido muscular e adiposo. Muitos tumores estão associados com a perda do apetite e grave perda muscular, e pacientes que apresentam caquexia têm um prognostico mais sombrio que os pacientes que não possuem caquexia. Uma vez que a linhagem de células da colônia cancerosa CT26 induz caquexia profunda em camundongos, ActRIIB (25-131)-hFc foi testado neste camundongo modelo quanto aos potenciais efeitos sobre uma caquexia xenoenxerto-induzida. Camundongos BALB/c de oito semanas de idade foram injetados por via subcutânea com 106 células de adenocarcinoma de Colon-26 (CT26) por camundongo. Duas semanas após o implante do tumor, o tratamento foi iniciado com ActRIIB (25-131)-hFc (n = 15), a 10 mg/kg, sc, ou veículo Salino Tris-tamponado (TBS) (n = 13) duas vezes por semana. Outros grupos de camundongos BALB/c não recebeu células CT26, mas foram tratados com ActRIIB (25-131)-hFc ou veículo como acima. O tratamento com ActRIIB (25-131)-hFc resultou em um aumento significativo no peso corporal, que foi mantido durante todo o estudo. Menos de 5 semanas após a implantação do tumor, camundongos tratados com veículo apresentaram uma perda de 7% da massa de tecido magro relativamente ao valor inicial, conforme determinado pela análise de RMN, enquanto que camundongos tratados com ActRIIB (25-131)-hFc apresentaram um aumento de 27% na massa magra a partir de linha do basal (Figura 32). A massa de gordura não difere significativamente entre os grupos. Estes resultados demonstram que ActRIIB (25-131)-hFc pode aliviar caquexia em camundongos portadores de tumores e pode ser uma terapia eficaz para o tratamento da caquexia em pacientes com câncer.
[00180]Tomados em conjunto, estes dados indicam que a proteína de fusão ActRIIB (25-131)-hFc pode ser usada como um antagonista da sinalização pelos ligantes da família-TGF para reverter muitas das alterações metabólicas patológicas associadas com a obesidade induzida por dieta, e assim, tratar doenças metabólicas exacerbadas pela alta ingestão calórica. Além disso, ActRIIB (25-131)-hFc pode ser usado para tratar alterações metabólicas patológicas associadas com o envelhecimento ou caquexia cancerosa.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
[00181]Todas as publicações e patentes mencionadas neste documento são aqui incorporadas por referência em suas totalidades, como se cada patente ou publicação individualmente fosse especificamente e individualmente indicada para ser aqui incorporada por referência.
[00182]Embora as modalidades específicas do assunto em questão tenham sido discutidas, o relatório descritivo acima é apenas ilustrativo e não restritivo. Muitas variações se tornarão evidentes para aqueles usualmente versados na técnica quando analisarem este relatório descritivo e as reivindicações apresentadas adiante. O escopo completo da invenção deverá ser determinado mediante referência às reivindicações, juntamente com o escopo completo dos equivalentes, e do relatório descritivo, juntamente com tais variações.

Claims (8)

1. Polipeptídeo recombinante, CARACTERIZADO pelo fato de que consiste em um polipeptídeo que consiste na sequência da SEQ ID No: 8.
2. Proteína de fusão recombinante, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma porção derivada de ActRIIB e uma ou mais porções heterólogas, em que a porção derivada de ActRIIB consiste na sequência de aminoácidos 25 a 131 da SEQ ID No: 1 e em que a uma ou mais porção(ões) heteróloga(s) compreende(m) um domínio Fc de uma IgG1 humana.
3. Preparação farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o polipeptídeo como definido na reivindicação 1.
4. Uso da preparação farmacêutica como definida na reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento de um indivíduo tendo um distúbio associado com perda muscular ou crescimento muscular insuficiente.
5. Uso da preparação farmacêutica como definida na reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para aumentar a massa magra ou reduzir a taxa de perda de massa magra em um indivíduo em necessidade do mesmo.
6. Uso da preparação farmacêutica como definida na reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para diminuir o teor de gordura corporal ou reduzir a taxa de aumento no teor de gordura corporal em um indivíduo.
7. Uso da preparação farmacêutica como definida na reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio associado com ganho de peso corporal indesejável em um indivíduo.
8. Uso da preparação farmacêutica como definida na reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio metabólico em um indivíduo.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2332977T3 (en) 2004-07-23 2016-02-29 Acceleron Pharma Inc ActRII receptor polypeptides
CA2631013C (en) 2005-11-23 2019-06-11 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for promoting bone growth
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
ES2415666T3 (es) 2007-02-01 2013-07-26 Acceleron Pharma, Inc. Composiciones farmacéuticas que comprenden antagonistas de Activina-ActRIIa para uso en la prevención o el tratamiento de metástasis de cáncer de mama o pérdida ósea relacionada con el cáncer de mama
TW201627320A (zh) 2007-02-02 2016-08-01 艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
CN101687016B (zh) 2007-02-09 2014-12-31 阿塞勒隆制药公司 活化素-actriia拮抗剂和促进癌症患者骨骼生长的用途
US7960343B2 (en) 2007-09-18 2011-06-14 Acceleron Pharma Inc. Activin-ActRIIa antagonists and uses for decreasing or inhibiting FSH secretion
EP2283119B1 (en) * 2008-05-06 2015-01-07 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods and compositions for inducing brown adipogenesis
NZ590327A (en) * 2008-06-26 2013-12-20 Acceleron Pharma Inc Methods for dosing an activin-actriia antagonist and monitoring of treated patients
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
DK3750552T5 (da) 2008-08-14 2024-08-26 Acceleron Pharma Inc Gdf-fælder
US8138142B2 (en) 2009-01-13 2012-03-20 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin in a patient in need thereof
WO2010144452A1 (en) 2009-06-08 2010-12-16 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing thermogenic adipocytes
KR20180026795A (ko) 2009-06-12 2018-03-13 악셀레론 파마 인코포레이티드 절두된 ＡｃｔＲＩＩＢ-ＦＣ 융합 단백질
CA2773494A1 (en) * 2009-09-09 2011-03-17 Acceleron Pharma Inc. Actriib antagonists and dosing and uses thereof
CA2779472C (en) * 2009-11-03 2021-03-16 Acceleron Pharma Inc. The use of a composition comprising an activin type iib receptor polypeptide in the treatment of fatty liver disease
AU2010322011B2 (en) 2009-11-17 2016-03-31 Acceleron Pharma Inc. ActRIIB proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy
IN2012DN05169A (pt) * 2009-12-02 2015-10-23 Acceleron Pharma Inc
CA2817008A1 (en) 2010-11-08 2012-05-18 Acceleron Pharma Inc. Actriia binding agents and uses thereof
EP2718328A4 (en) * 2011-06-08 2014-12-24 Acceleron Pharma Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR INCREASING THE HALF TIME OF SERUM
US9809636B2 (en) 2012-04-06 2017-11-07 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing red blood cell levels comprising administering BMP9
RU2678117C2 (ru) 2012-11-02 2019-01-23 Селджин Корпорейшн Антагонисты активина-actrii и их применение для лечения нарушений костной ткани и других нарушений
MX2016016531A (es) 2014-06-13 2017-04-25 Acceleron Pharma Inc Metodos y composiciones para el tratamiento de las ulceras.
MA41052A (fr) 2014-10-09 2017-08-15 Celgene Corp Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii
HUE062189T2 (hu) 2014-12-03 2023-09-28 Celgene Corp Aktivin-ACTRII-antagonisták és alkalmazások mielodiszpláziás szindróma kezelésére
MA41919A (fr) 2015-04-06 2018-02-13 Acceleron Pharma Inc Hétéromultimères alk4:actriib et leurs utilisations
AU2016246708B2 (en) * 2015-04-06 2020-12-24 Acceleron Pharma Inc. ALK7:actRIIB heteromultimers and uses thereof
PT3280727T (pt) * 2015-04-06 2021-04-23 Acceleron Pharma Inc Proteínas de fusão do recetor de braço único do tipo i e tipo ii e respetivas utilizações
BR112017022658A2 (pt) 2015-04-22 2018-07-17 Alivegen Usa Inc proteína isolada, molécula de ácido nucleico isolada, vetor recombinante, célula hospedeira, método de produção de uma proteína actriib híbrida, composição farmacêutica, métodos de tratamentos de distúrbios relacionados à miostatina ou relacionados à ativina a, de doença de desgaste dos músculos, de doença cardiovascular, de distúrbios metabólicos, de células cancerígenas, de doença renal, de doença inflamatória/autoimune, de uma doença de fibrose, de anemia, da dor, da condição de envelhecimento, de distúrbios ósseos, de um desgaste dos músculos ou distúrbio metabólico ou fibrótico ou inflamatório ou relacionado à ativina em indivíduos, e, método de indução do crescimento das células-tronco para o reparo de tecido ou regeneração do órgão em um indivíduo
EP3298034A4 (en) 2015-05-20 2019-02-13 Celgene Corporation IN VITRO CELL CULTURE PROCEDURE FOR BETA THALASSEMIA BY MEANS OF ACTIVIN TYPE II RECEPTOR LIGANDS
EP3439741A4 (en) * 2016-04-06 2020-05-06 Acceleron Pharma Inc. ALK7 ANTAGONISTS AND USES THEREOF
WO2017192847A1 (en) * 2016-05-04 2017-11-09 University Of Cincinnati Female fertility therapies
PT3496739T (pt) 2016-07-15 2021-06-21 Acceleron Pharma Inc Composições compreendendo polipéptidos actriia para uso no tratamento de hipertensão pulmonar
CA3039525A1 (en) * 2016-10-05 2018-04-12 Acceleron Pharma Inc. Variant actriib proteins and uses thereof
AU2017340504A1 (en) 2016-10-05 2019-04-11 Acceleron Pharma, Inc. Compositions and method for treating kidney disease
BR112019006993A2 (pt) 2016-10-05 2019-09-03 Acceleron Pharma Inc heteromultímeros de alk4:actriib e usos dos mesmos
JOP20190085A1 (ar) * 2016-10-20 2019-04-17 Biogen Ma Inc طرق علاج الضمور العضلي ومرض العظام باستخدام بروتينات احتجاز مركب ترابطي actriib هجين حديثة
JP7139326B2 (ja) 2016-11-10 2022-09-20 ケロス セラピューティクス インコーポレイテッド アクチビンＩＩａ型受容体変異体および同変異体を含む医薬組成物
GB201620119D0 (en) 2016-11-29 2017-01-11 Pharmafox Therapeutics Ag Compounds
JOP20190152A1 (ar) * 2016-12-21 2019-06-20 Novartis Ag مضادات الميوستاتين، الآكتيفين أو مستقبلات الآكتيفين للاستخدام في علاج السمنة والحالات ذات الصلة
CN107011430B (zh) * 2017-04-07 2020-09-01 哈尔滨医科大学 一种具有生物学活性的截短的生长分化因子11及其制备方法
CA3065555A1 (en) 2017-06-20 2018-12-27 Corcept Therapeutics, Inc. Methods of treating neuroepithelial tumors using selective glucocorticoid receptor modulators
US11484573B2 (en) 2017-11-09 2022-11-01 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type IIa variants and methods of use thereof
JP7510875B2 (ja) 2018-01-12 2024-07-04 ケロス セラピューティクス インコーポレイテッド アクチビンｉｉｂ型受容体変異体および同変異体を含む医薬組成物
GB201821269D0 (en) * 2018-12-28 2019-02-13 Nippon Shinyaku Co Ltd Myostatin signal inhibitor
CN110590961B (zh) * 2019-10-08 2020-12-08 徐州医科大学 一种具有抗癌作用的多肽及其应用
US20240019431A1 (en) * 2020-12-28 2024-01-18 Cz Biohub Sf, Llc Autoantibodies as biomarkers for lipodystrophy

Family Cites Families (195)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0105014B1 (en) 1982-09-24 1992-05-20 THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary United States Department of Commerce Repair of tissue in animals
JPH0637520B2 (ja) 1985-07-03 1994-05-18 味の素株式会社 ポリペプチド
AU597574B2 (en) 1986-03-07 1990-06-07 Massachusetts Institute Of Technology Method for enhancing glycoprotein stability
US4973577A (en) 1986-04-04 1990-11-27 The Salk Institute For Biological Studies FSH-releasing peptides
EP0548276A4 (en) 1990-09-13 1993-12-29 Children's Hospital Medical Center Of Northern California Method for increasing red blood cell production by treatment with activin or activin-related peptides
US5118667A (en) 1991-05-03 1992-06-02 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Bone growth factors and inhibitors of bone resorption for promoting bone formation
US5885794A (en) 1991-05-10 1999-03-23 The Salk Institute For Biological Studies Recombinant production of vertebrate activin receptor polypeptides and identification of receptor DNAs in the activin/TGF-β superfamily
JPH06500574A (ja) 1991-05-10 1994-01-20 ザ　ソーク　インスティテュート　フォア　バイオロジカル　スタディーズ アクチビン／ＴＧＦ―βスーパーファミリーのレセプターのクローニングおよび組換えによる産生
US6162896A (en) * 1991-05-10 2000-12-19 The Salk Institute For Biological Studies Recombinant vertebrate activin receptors
US20050186593A1 (en) 1991-05-10 2005-08-25 The Salk Institute For Biological Studies Cloning and recombinant production of CRF receptor(s)
US6287816B1 (en) 1991-06-25 2001-09-11 Genetics Institute, Inc. BMP-9 compositions
KR100255415B1 (ko) 1991-06-25 2000-05-01 브루스 엠. 에이센 비엠피-9 조성물
US6692925B1 (en) 1992-11-17 2004-02-17 Ludwig Institute For Cancer Research Proteins having serine/threonine kinase domains, corresponding nucleic acid molecules, and their use
WO1994015965A1 (en) 1993-01-12 1994-07-21 Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-3
BR9406716A (pt) 1993-05-12 1996-02-06 Genetics Inst Molécula de DNA isolada célula hospedeira vetor método para produzir uma proteina (BMP-10) polipeptideo de proteina-10 morfogenética de osso purificada (BMP-10) e molécula de DNA quimérica
US5637480A (en) 1993-05-12 1997-06-10 Genetics Institute, Inc. DNA molecules encoding bone morphogenetic protein-10
US5831050A (en) 1993-06-07 1998-11-03 Creative Biomolecules, Inc. Morphogen cell surface receptor
AU701623B2 (en) 1993-10-14 1999-02-04 President And Fellows Of Harvard College Method of inducing and maintaining neuronal cells
US5658876A (en) 1994-04-28 1997-08-19 The General Hospital Corporation Activin antagonists as novel contraceptives
US5914234A (en) 1994-07-08 1999-06-22 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods of detecting growth differentiation factor-11
US5760010A (en) 1995-01-01 1998-06-02 Klein; Ira Method of treating liver disorders with a macrolide antibiotic
US6132988A (en) 1995-10-27 2000-10-17 Takeda Chemical Industries, Ltd. DNA encoding a neuronal cell-specific receptor protein
GB9526131D0 (en) 1995-12-21 1996-02-21 Celltech Therapeutics Ltd Recombinant chimeric receptors
US6004780A (en) 1996-03-26 1999-12-21 Human Genome Sciences, Inc. Growth factor HTTER36
US20050244867A1 (en) 1996-03-26 2005-11-03 Human Genome Sciences, Inc. Growth factor HTTER36
KR20000052807A (ko) 1996-10-25 2000-08-25 윌리암스 로저 에이 순환 교환된 에리트로포이에틴 수용체 아고니스트
US6605699B1 (en) 1997-01-21 2003-08-12 Human Genome Sciences, Inc. Galectin-11 polypeptides
US6034062A (en) 1997-03-13 2000-03-07 Genetics Institute, Inc. Bone morphogenetic protein (BMP)-9 compositions and their uses
US7041641B2 (en) 1997-03-20 2006-05-09 Stryker Corporation Osteogenic devices and methods of use thereof for repair of endochondral bone and osteochondral defects
US6426411B1 (en) 1997-05-30 2002-07-30 Dana-Farber Cancer Institute PGC-1, a novel brown fat pparγ coactivator
US6231880B1 (en) 1997-05-30 2001-05-15 Susan P. Perrine Compositions and administration of compositions for the treatment of blood disorders
US6656475B1 (en) 1997-08-01 2003-12-02 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor receptors, agonists and antagonists thereof, and methods of using same
WO1999006559A1 (en) 1997-08-01 1999-02-11 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods to identify growth differentiation factor (gdf) receptors
US6696260B1 (en) 1997-08-01 2004-02-24 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods to identify growth differentiation factor (GDF) binding proteins
US6891082B2 (en) 1997-08-01 2005-05-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor
US6953662B2 (en) 1997-08-29 2005-10-11 Human Genome Sciences, Inc. Follistatin-3
WO1999010364A1 (en) 1997-08-29 1999-03-04 Human Genome Sciences, Inc. Follistatin-3
ES2293691T3 (es) 1997-10-03 2008-03-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anticuerpo humano natural.
US6696411B1 (en) 1998-04-22 2004-02-24 Cornell Research Foundation, Inc. Canine erythropoietin gene and recombinant protein
CA2343268A1 (en) 1998-09-17 2000-03-23 Eli Lilly And Company Protein formulations
JP2002526073A (ja) 1998-09-22 2002-08-20 龍 余 新規のヒト生長分化因子のコード配列、そのｄｎａ配列によりコードされるポリペプチド、およびこれらの製造方法。
US6472179B2 (en) 1998-09-25 2002-10-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Receptor based antagonists and methods of making and using
US6548634B1 (en) 1998-09-30 2003-04-15 Chiron Corporation Synthetic peptides having FGF receptor affinity
US6238860B1 (en) 1998-11-05 2001-05-29 Dyax Corp. Binding moieties for human parvovirus B19
US6777205B1 (en) 1998-11-06 2004-08-17 Sterrenbeld Biotechnologie North America, Inc. Host cells expressing recombinant human erythropoietin
US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
JP2003517580A (ja) 1999-01-21 2003-05-27 メタモーフイクス・インコーポレーテツド 増殖分化因子インヒビター及びそれらの用途
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
EP1174149A1 (en) 1999-04-19 2002-01-23 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Proliferation inhibitor for androgen-independent tumor
US6468543B1 (en) 1999-05-03 2002-10-22 Zymogenetics, Inc. Methods for promoting growth of bone using ZVEGF4
JP2003513681A (ja) 1999-11-12 2003-04-15 マキシゲン・ホールディングス・リミテッド インターフェロンガンマ・コンジュゲート
WO2001043763A1 (en) 1999-12-15 2001-06-21 Research Development Foundation Betaglycan as an inhibin receptor and uses thereof
US20030224501A1 (en) 2000-03-17 2003-12-04 Young Paul E. Bone morphogenic protein polynucleotides, polypeptides, and antibodies
JP4487376B2 (ja) 2000-03-31 2010-06-23 味の素株式会社 腎疾患治療剤
BRPI0110914B8 (pt) 2000-05-15 2021-05-25 Hoffmann La Roche 'composição farmacêutica líquida, processo para preparação da mesma e uso de uma composicão farmacêutica'
US6627424B1 (en) 2000-05-26 2003-09-30 Mj Bioworks, Inc. Nucleic acid modifying enzymes
WO2002008277A2 (en) 2000-07-19 2002-01-31 Eli Lilly And Company Nucleic acids, vectors, host cells, polypeptides, and uses thereof
US6632180B1 (en) 2000-09-07 2003-10-14 John H. Laragh Method for evaluating and treating hypertension
DE10045591A1 (de) 2000-09-15 2002-04-04 Klaus Pfizenmaier Ortsspezifische, antikörpervermittelte Aktivierung proapoptotischer Zytokine - AMAIZe (Antibody-Mediated Apoptosis Inducing Zytokine)
US7087224B2 (en) 2000-10-31 2006-08-08 Amgen Inc. Method of treating anemia by administering IL-1ra
CN1474831A (zh) 2000-11-20 2004-02-11 ����ŵ˹������ѧ�йܻ� 膜支架蛋白
US20030082233A1 (en) 2000-12-01 2003-05-01 Lyons Karen M. Method and composition for modulating bone growth
AU2002236558A1 (en) 2000-12-01 2002-06-11 Regents Of The University Of California Method and composition for modulating bone growth
TWI329129B (en) 2001-02-08 2010-08-21 Wyeth Corp Modified and stabilized gdf propeptides and uses thereof
US20040132675A1 (en) 2002-02-08 2004-07-08 Calvin Kuo Method for treating cancer and increasing hematocrit levels
US7294472B2 (en) 2001-03-14 2007-11-13 Caden Biosciences Method for identifying modulators of G protein coupled receptor signaling
WO2002074340A1 (fr) 2001-03-16 2002-09-26 Takeda Chemical Industries, Ltd. Procede de fabrication d'une preparation a liberation continue
ATE542545T1 (de) 2001-05-24 2012-02-15 Zymogenetics Inc Taci-immunoglobulin-fusionsproteine
AU2001286171B2 (en) 2001-05-25 2008-01-10 Serono Genetics Institute S.A. Human CDNAs and proteins and uses thereof
AUPR638101A0 (en) 2001-07-13 2001-08-09 Bioa Pty Limited Composition and method for treatment of disease
US6855344B2 (en) 2001-07-17 2005-02-15 Integrated Chinese Medicine Holdings, Ltd. Compositions and methods for prostate and kidney health and disorders, an herbal preparation
ATE448481T1 (de) 2001-07-17 2009-11-15 Teijin Ltd Selektionsverfahren für eine durch das austesten einer ppard aktivierenden wirkung charakterisierten substanz und arzneistoff
KR100453877B1 (ko) 2001-07-26 2004-10-20 메덱스젠 주식회사 연쇄체화에 의한 면역 글로블린 융합 단백질의 제조 방법 및 이 방법에 의해 제조된 ＴＮＦＲ/Ｆｃ 융합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 ＤＮＡ, 상기 ＤＮＡ를 포함하는벡터, 및 상기 벡터에 의한 형질전환체
US7320789B2 (en) 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
US6784154B2 (en) 2001-11-01 2004-08-31 University Of Utah Research Foundation Method of use of erythropoietin to treat ischemic acute renal failure
CN1602360A (zh) 2001-12-06 2005-03-30 法布罗根股份有限公司 提高内源性红细胞生成素(epo)的方法
US20060234918A1 (en) 2001-12-19 2006-10-19 Voyager Pharmaceutical Corporation Methods for treating and preventing cancers that express the hypothalamic-pituitary-gonadal axis of hormones and receptors
US20030144203A1 (en) 2001-12-19 2003-07-31 Voyager Pharmaceutical Corporation Methods for slowing senescence and treating and preventing diseases associated with senescence
US6998118B2 (en) 2001-12-21 2006-02-14 The Salk Institute For Biological Studies Targeted retrograde gene delivery for neuronal protection
US20030224397A1 (en) 2002-02-11 2003-12-04 Genentech, Inc. Antibody variants with faster antigen association rates
MXPA04008150A (es) 2002-02-21 2005-06-17 Wyeth Corp Gasp1: una proteina que contiene dominio de folistatina.
US20030219846A1 (en) 2002-02-28 2003-11-27 Pfizer Inc. Assay for activity of the ActRIIB kinase
AU2003232485A1 (en) 2002-04-18 2003-10-27 Mtm Laboratories Ag Neopeptides and methods useful for detection and treatment of cancer
US7632679B2 (en) 2002-07-16 2009-12-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Systems and methods for screening for modulators of neural differentiation
DE10234192B4 (de) 2002-07-26 2009-11-26 Epoplus Gmbh Co.Kg Verwendung von Erythropoetin
KR20050083635A (ko) 2002-08-16 2005-08-26 와이어쓰 Ｂｍｐ-2 에스트로겐 반응 요소 및 이의 사용 방법
AR047392A1 (es) 2002-10-22 2006-01-18 Wyeth Corp Neutralizacion de anticuerpos contra gdf 8 y su uso para tales fines
US20040223966A1 (en) 2002-10-25 2004-11-11 Wolfman Neil M. ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor
AU2002953327A0 (en) 2002-12-12 2003-01-09 Monash University Methods of diagnosing prognosing and treating activin associated diseases and conditions
DK1592416T3 (da) 2003-02-07 2009-04-20 Prometic Biosciences Inc Fedtsyrer med middel kædelængde, glycerider og analoger som stimulatorer af erythropoiesis
US20040197828A1 (en) 2003-03-26 2004-10-07 Gaddy Dana P. Method for diagnosis and treatment of bone turnover
US20070184052A1 (en) 2003-05-09 2007-08-09 Lin Herbert Y Soluble tgf-b type III receptor fusion proteins
MXPA05012965A (es) 2003-06-02 2006-03-09 Wyeth Corp Uso de inhibidores de miostatina (gdf8) en conjuncion con corticoesteroides para el tratamiento de desordenes neuromusculares y composiciones farmaceuticas para ello.
RS20050934A (en) 2003-06-16 2008-04-04 Celltech R. & D. Inc., Antibodies specific for sclerostin and methods fo r increasing bone mineralization
WO2005009460A2 (en) 2003-07-25 2005-02-03 Medexis, S.A. Pharmaceutical composition comprising activin a, alk-4 or derivatives thereof for the treatment of ophthalmic disorders or cancer
US8895540B2 (en) 2003-11-26 2014-11-25 DePuy Synthes Products, LLC Local intraosseous administration of bone forming agents and anti-resorptive agents, and devices therefor
AU2005206277B2 (en) 2004-01-22 2011-06-23 Merck Patent Gmbh Anti-cancer antibodies with reduced complement fixation
US20050197292A1 (en) 2004-01-30 2005-09-08 Glennda Smithson Compositions and methods for treating T-cell mediated pathological conditions
US7625867B2 (en) 2004-03-26 2009-12-01 Acceleron Pharma Inc. BMP-3 propeptides and related methods
US7459527B2 (en) 2004-03-31 2008-12-02 Xencor, Inc. BMP-7 variants with improved properties
WO2005113590A2 (en) 2004-05-12 2005-12-01 Acceleron Pharma Inc. Bmp10 propeptides and related methods
AU2005258286A1 (en) 2004-06-24 2006-01-05 Acceleron Pharma Inc. GDF3 propeptides and related methods
DK2332977T3 (en) 2004-07-23 2016-02-29 Acceleron Pharma Inc ActRII receptor polypeptides
EP1794191B1 (en) 2004-08-05 2016-05-18 The Regents of The University of California Molecules with effects on cellular development and function
EP1778275A2 (en) * 2004-08-12 2007-05-02 Wyeth Combination therapy for diabetes, obesity, and cardiovascular diseases using gdf-8 inhibitors
CA2581896C (en) 2004-09-29 2015-11-10 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Fsh and fsh receptor modulator compositions and methods for inhibiting osteoclastic bone resorption and bone loss in osteoporosis
NZ538097A (en) 2005-02-07 2006-07-28 Ovita Ltd Method and compositions for improving wound healing
ES2547866T3 (es) 2005-02-16 2015-10-09 The General Hospital Corporation Uso de proteínas de fusión de hemojuvelina para regular el metabolismo del hierro mediado por hepcidina
CN101198321A (zh) 2005-04-26 2008-06-11 味之素株式会社 骨髓祖红细胞分化诱导剂
JP2007099764A (ja) 2005-09-09 2007-04-19 Ajinomoto Co Inc 血糖低下剤
CA2621623A1 (en) 2005-09-28 2007-04-05 Zymogenetics, Inc. Il-17a and il-17f antagonists and methods of using the same
US8067562B2 (en) 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
CA2631013C (en) 2005-11-23 2019-06-11 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for promoting bone growth
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
AU2006321906C1 (en) 2005-12-06 2014-01-16 Amgen Inc. Uses of myostatin antagonists
CA2632936A1 (en) 2005-12-20 2007-06-28 Merck Frosst Canada Ltd. Heteroaromatic compounds as inhibitors of stearoyl-coenzyme a delta-9 desaturase
JP2009521452A (ja) 2005-12-21 2009-06-04 シェーリング コーポレイション コレステロール降下剤およびｈ３受容体アンタゴニスト／逆アゴニストを使用する非アルコール性脂肪性肝疾患の処置
EP1973909A2 (en) 2005-12-22 2008-10-01 Biogen Idec MA Inc. Transforming growth factor modulators
JP4925364B2 (ja) 2006-01-20 2012-04-25 ベックマン コールター， インコーポレイテッド 鉄欠乏を検出する方法
WO2007087505A2 (en) 2006-01-25 2007-08-02 Wellstat Therapeutics Corporation Compounds for the treatment of metabolic disorders
MX2008011022A (es) 2006-02-28 2008-09-10 Wellstat Therapeutics Corp Compuestos para el tratamiento de trastornos metabolicos.
CA2650131A1 (en) 2006-04-14 2007-10-25 Amgen Inc. Agonist erythropoietin receptor antibodies
WO2007123391A1 (en) 2006-04-20 2007-11-01 Academisch Ziekenhuis Leiden Therapeutic intervention in a genetic disease in an individual by modifying expression of an aberrantly expressed gene.
CA2652235A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Hemaquest Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating blood disorders
CN101522021B (zh) 2006-07-21 2014-07-30 莱因实验室 醋酸钙的液体组合物
GB0615129D0 (en) 2006-07-29 2006-09-06 Univ Cardiff Anti-cancer activity of BMP-9 and BMP-10 and their use in cancer therapies
CL2007002567A1 (es) 2006-09-08 2008-02-01 Amgen Inc Proteinas aisladas de enlace a activina a humana.
US7547781B2 (en) 2006-09-11 2009-06-16 Curis, Inc. Quinazoline based EGFR inhibitors containing a zinc binding moiety
WO2008060139A1 (en) 2006-11-17 2008-05-22 Erasmus University Medical Center Rotterdam Methods for controlling mineralization of extracellular matrix, therapeutic methods based thereon and medicaments for use therein
US20100003190A1 (en) 2006-12-08 2010-01-07 Caritas St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. Method for protecting renal tubular epithelial cells from radiocontrast nephropathy (RCN)
EP2103628A4 (en) 2006-12-14 2012-02-22 Forerunner Pharma Res Co Ltd MONOCLONAL ANTIBODY ANTI-CLAUDIN 3, AND TREATMENT AND DIAGNOSIS OF CANCER USING SUCH ANTIBODY
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
WO2008076437A2 (en) 2006-12-18 2008-06-26 Acceleron Pharma Inc. Activin-actrii antagonists and uses for increasing red blood cell levels
US20100028332A1 (en) 2006-12-18 2010-02-04 Acceleron Pharma Inc. Antagonists of actriib and uses for increasing red blood cell levels
ES2415666T3 (es) 2007-02-01 2013-07-26 Acceleron Pharma, Inc. Composiciones farmacéuticas que comprenden antagonistas de Activina-ActRIIa para uso en la prevención o el tratamiento de metástasis de cáncer de mama o pérdida ósea relacionada con el cáncer de mama
TW201627320A (zh) 2007-02-02 2016-08-01 艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
CN101687016B (zh) 2007-02-09 2014-12-31 阿塞勒隆制药公司 活化素-actriia拮抗剂和促进癌症患者骨骼生长的用途
TWI573802B (zh) 2007-03-06 2017-03-11 安美基公司 變異之活動素受體多肽及其用途
US8501678B2 (en) 2007-03-06 2013-08-06 Atara Biotherapeutics, Inc. Variant activin receptor polypeptides and uses thereof
WO2013106175A1 (en) 2011-12-19 2013-07-18 Amgen Inc. Variant activin receptor polypeptides, alone or in combination with chemotherapy, and uses thereof
US20090017019A1 (en) 2007-06-01 2009-01-15 Wyeth Methods and compositions for modulating bmp-10 activity
WO2009009059A1 (en) 2007-07-09 2009-01-15 Biogen Idec Ma Inc. Spiro compounds as antagonists of tgf-beta
GB0715087D0 (en) 2007-08-03 2007-09-12 Summit Corp Plc Drug combinations for the treatment of duchenne muscular dystrophy
CN101678107A (zh) 2007-08-03 2010-03-24 萨米特公开有限公司 用于治疗杜兴型肌营养不良的药物组合物
GB0715938D0 (en) 2007-08-15 2007-09-26 Vastox Plc Method of treatment of duchenne muscular dystrophy
WO2009025651A1 (en) 2007-08-17 2009-02-26 University Of Maine System Board Of Trustees Biologically active peptide and method of using the same
US20100279409A1 (en) 2007-09-13 2010-11-04 Neil Robson Method for modifying celluar immune resonse by modulating activin activity
US7960343B2 (en) 2007-09-18 2011-06-14 Acceleron Pharma Inc. Activin-ActRIIa antagonists and uses for decreasing or inhibiting FSH secretion
PE20091163A1 (es) 2007-11-01 2009-08-09 Wyeth Corp Anticuerpos para gdf8
CN101925611A (zh) 2007-11-21 2010-12-22 安姆根有限公司 Wise结合剂和表位
US8507501B2 (en) 2008-03-13 2013-08-13 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Inhibitors of the BMP signaling pathway
EP2283119B1 (en) 2008-05-06 2015-01-07 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods and compositions for inducing brown adipogenesis
WO2009137075A1 (en) 2008-05-06 2009-11-12 Acceleron Pharma Inc. Anti-activin antibodies and uses for promoting bone growth
EP2303917B1 (en) 2008-06-26 2020-11-11 Acceleron Pharma Inc. Antagonists of actriib and uses for increasing red blood cell levels
NZ590327A (en) 2008-06-26 2013-12-20 Acceleron Pharma Inc Methods for dosing an activin-actriia antagonist and monitoring of treated patients
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
DK3750552T5 (da) * 2008-08-14 2024-08-26 Acceleron Pharma Inc Gdf-fælder
US20110293526A1 (en) 2008-11-20 2011-12-01 University Of Southern California Compositions and methods to modulate hair growth
SG171813A1 (en) 2008-11-26 2011-07-28 Amgen Inc Variants of activin iib receptor polypeptides and uses thereof
US8138142B2 (en) 2009-01-13 2012-03-20 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin in a patient in need thereof
US8110355B2 (en) 2009-02-20 2012-02-07 GenRemedy, LLC Methods for identifying agents that inhibit cell migration, promote cell adhesion and prevent metastasis
MY153078A (en) 2009-04-27 2014-12-31 Novartis Ag Compositions and methods for increasing muscle growth
WO2010144452A1 (en) 2009-06-08 2010-12-16 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing thermogenic adipocytes
KR20180026795A (ko) 2009-06-12 2018-03-13 악셀레론 파마 인코포레이티드 절두된 ＡｃｔＲＩＩＢ-ＦＣ 융합 단백질
EP3117829B1 (en) * 2009-08-13 2020-10-07 Acceleron Pharma Inc. Combined use of gdf traps and erythropoietin receptor activators to increase red blood cell levels
CA2773494A1 (en) 2009-09-09 2011-03-17 Acceleron Pharma Inc. Actriib antagonists and dosing and uses thereof
CA2779472C (en) 2009-11-03 2021-03-16 Acceleron Pharma Inc. The use of a composition comprising an activin type iib receptor polypeptide in the treatment of fatty liver disease
AU2010322011B2 (en) 2009-11-17 2016-03-31 Acceleron Pharma Inc. ActRIIB proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy
US8580922B2 (en) 2011-03-04 2013-11-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Peptide linkers for polypeptide compositions and methods for using same
PL2726099T3 (pl) 2011-07-01 2018-12-31 Novartis Ag Sposób leczenia zaburzeń metabolicznych
KR20220075438A (ko) 2011-10-17 2022-06-08 악셀레론 파마 인코포레이티드 비효율적 적혈구생성 치료를 위한 방법 및 조성물
US8765385B2 (en) 2011-10-27 2014-07-01 Ravindra Kumar Method of detection of neutralizing anti-actriib antibodies
WO2013063536A1 (en) 2011-10-27 2013-05-02 Acceleron Pharma, Inc. Actriib binding agents and uses thereof
CN104023731A (zh) 2011-10-28 2014-09-03 帕仁塔生物科技有限公司 治疗粘液分泌亢进的方法
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
EP3521310A1 (en) 2012-06-14 2019-08-07 The Medical Research, Infrastructure, And Health Services Fund Of The Tel Aviv Medical Center Use of blocking agents of bone morphogenic protein (bmp) signaling for the treatment of neuroinflammatory and neurodegenerative diseases
CN104411720B (zh) 2012-07-02 2018-05-11 协和发酵麒麟株式会社 以抗bmp9抗体作为有效成分的、对肾性贫血、癌性贫血等贫血的治疗剂
CN112933223A (zh) 2012-10-24 2021-06-11 细胞基因公司 用于治疗贫血的方法
WO2014066486A2 (en) 2012-10-24 2014-05-01 Celgene Corporation Biomarker for use in treating anemia
WO2014064292A1 (en) 2012-10-26 2014-05-01 Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6) A method for preventing or treating atrial fibrillation
RU2678117C2 (ru) 2012-11-02 2019-01-23 Селджин Корпорейшн Антагонисты активина-actrii и их применение для лечения нарушений костной ткани и других нарушений
SG11201503637SA (en) 2012-11-08 2015-06-29 Clearside Biomedical Inc Methods and devices for the treatment of ocular diseases in human subjects
US20150328249A1 (en) 2012-12-11 2015-11-19 Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center Modulation of myofiber repair by anti-myostatin strategies and/or ppar gamma ligands, alone or in combination with stem cells, for the therapy of critical limb ischemia and other ischemic processes affecting the skeletal muscle
US20140220033A1 (en) 2013-02-01 2014-08-07 Santa Maria Biotherapeutics, Inc. Administration of an Anti-Activin-A Compound to a Subject
WO2014152940A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapeutic compositions and use to treat diseases and disorders
TW201920262A (zh) 2013-07-30 2019-06-01 美商再生元醫藥公司 抗活化素ａ之抗體及其用途
EP3033358A2 (en) 2013-08-14 2016-06-22 Novartis AG Methods of treating sporadic inclusion body myositis
JP2017505428A (ja) 2013-12-16 2017-02-16 パランタ バイオサイエンス リミテッド 診断及び治療の方法
EP3094751A4 (en) 2014-01-14 2017-06-07 Santa Maria Biotherapeutics, Inc. Activin inhibitor response prediction and uses for treatment
WO2015111008A2 (en) 2014-01-27 2015-07-30 Novartis Ag Biomarkers predictive of muscle atrophy, method and use
WO2015152183A1 (ja) 2014-03-31 2015-10-08 大日本住友製薬株式会社 進行性骨化性線維異形成症の予防剤及び治療剤
AU2015247459A1 (en) 2014-04-18 2016-10-27 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating sickle-cell disease
TW201622746A (zh) 2014-04-24 2016-07-01 諾華公司 改善或加速髖部骨折術後身體復原之方法
AP2016009647A0 (en) 2014-06-13 2016-12-31 Santa Maria Biotherapeutics Inc Formulated receptor polypeptides and related methods
WO2016183280A1 (en) 2015-05-13 2016-11-17 Celgene Corporation Treatment of beta-thalassemia using actrii ligand traps

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US9745559B2 (en) 2017-08-29
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