BRPI1004418A2

BRPI1004418A2 - mistura de ácido hialurÈnico para tratar e prevenir doença inflamatória do intestino

Info

Publication number: BRPI1004418A2
Application number: BRPI1004418-3A
Authority: BR
Inventors: Tsung-Chung Wu
Original assignee: Holy Stone Healthcare Co Ltd
Priority date: 2009-08-14
Filing date: 2010-08-12
Publication date: 2011-12-13
Also published as: KR101476802B1; TW201105340A; EP2292243A1; KR20110017826A; EP3842046A1; AU2010212350A1; JP2011037853A; JP5636225B2; TWI516269B; AU2010212350B2

Abstract

MISTURA DE áCIDO HIALURÈNICO PARA TRATAR E PREVENIR DOENçA INFLAMATóRIA DO INTESTINO. A presente invenção refere-se a uma formulação de ácido hialurónico que inclui uma mistura de ácidos hialurónicos que têm pesos moleculares ponderais diferentes e reologias diferentes, propriedades de suporte de tecidos, insulamento e degradação em solução aquosa. A formulação resultante demonstrou um ótimo equilíbrio entre adesão, suporte de tecido, insulamento e tempo de tratamento no tratamento e prevenção de IBD (doença inflamatória do intestino), tal como colite ulcerativa e doença de Crohn. Assim sendo, a formulação da presente invenção apresenta um efeito rápido e duradouro sobre o tratamento e prevenção de úlcera duodenal ou péptica e sangramento que é realmente uma coisa muito boa.

Description

"MISTURA DE ACIDO HIALUR0NIC0 PARA TRATAR E PREVENIR DOENÇA INFLAMATÓRIA DO INTESTINO"

Este pedido de patente reivindica o benefício de prioridade do pedido de patente taiwanês número 098127430, depositado em 14 de agosto de 2009 e do pedido de patente taiwanês número 099122995, depositado em 13 de julho de 2010.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Campo Técnico da Invenção

A presente invenção fornece uma mistura do ácido hialurônico para tratar e prevenir a doença inflamatória do intestino (IBD). Mais particularmente, a presente invenção refere-se a uma mistura que compreende pelo menos dois ou mais peso moleculares médios diferentes de ácido hialurônico (Mw) e ácido hialurônico com reologia diferente, para obter um ácido hialurônico com a propriedade apropriada de adesão, funções de suporte (scaffold) tecidual, insulamento e tempo de tratamento, para tratar e prevenir IBD (doença inflamatória do intestino) que inclui colite ulcerativa, doença de Crohn ou cicatrização de feridas no estômago e intestino, e assim sendo, conseguir o pronto tratamento e para prolongar o efeito.

Descrição das Técnicas Relacionadas

O ácido hialurônico, conhecido também como hialuronano, hialuronato e hialuronato de sódio, e referido genericamente como HA, é um glicosaminoglicano natural que inclui o grupamento alternativo N-acetil-D- glicosamina e ácido D-glicurônico.

A macromolécula de ácido hialurônico na forma de sal de sódio é genericamente a composição conhecida existente há mais de cinqüenta anos. Fazendo referência a Meyer e outros (J. Biol. Chem. 107:629 (1934)), o ácido hialurônico contém intrinsecamente a glicosamina de alta viscosidade alternativa com ácido β1-3 glicurônico e βΙ-4-glicosamina, e o Mw da glicosamina de alta viscosidade é entre 50.000 dáltons (Da) e alguns milhões de dáltons.

Descobriu-se que o ácido hialurônico no tecido conjuntivo mole no corpo de mamíferos, e a pele, o humor vítreo do olho, o líquido sinovial, o tecido do cordão umbilical e a cartilagem contêm um volume mais alto do ácido hialurônico.

O ácido hialurônico é o líquido com a elasticidade, preenchimento entre as células e as fibras colagenosas e cobre alguns tecidos epidérmicos, mormente para a proteção e lubrificação das células para proporcionar uma plataforma para transportar a célula T reguladora a fim de estabilizar e proteger a rede de colágeno contra dano mecânico. O ácido hialurônico pode ser o lubrificante no tendão e bainha do tendão e sobre a superfície da membrana sinovial devido à característica lubrificante e a alta absorvência de choque, e é útil para a mecânica reológica de tecido, movimento e proliferação celular (vide Delpech1 B., Girard, N., Bertrand, P., Courel, M. -N., Chauzy, C., Delpech1 A., "Hyaluronan: fundamental principies and applications in câncer", J. Intern. Med. 242:41-48 (1997); Rooney, P., Kumar, S., Ponting, J., Wang, M., "The role of hyaluronan in tumour neovascularization", Int. J. Câncer 60:632-36 (1995); Entwistle, J., Halll C.L., Turley, E.A., "Receptors: regulators of signaling to the cytoskeleton", J. Cell Biochem. 61:569-77 (1996)), e participa na interação de receptores sobre a superfície de algumas células; especialmente, o principal receptor de CD44. O efeito regulador de CD44 é amplamente aceito como uma marca dos linfócitos ativados (vide Teder, P., Vandivier, R.W., Jiang D, Liang J., Crohn, L., Pure1 E., Henson, PM., Noble, P.W., "Resolution of Iung inflammation by CD44", Science 2002; 296:155-158 (2002); Sheehan1 K.M., DeLott1 L.B., Day1 S.M., DeHeer1 D.H., "Hyalgan has a dose-dependent differential effect on macrophage proliferation and cell death" J. Orthop. Res. 21:744-51 (2003)).

O ácido hialurônico tem a capacidade de criar e preencher devido à organização e modificação da matriz extracelular, e é amplamente aplicado em preencher os tecidos moles e restringir o envelhecimento da pele causado pela idade e luz, bem como para ajustar o obstáculo do metabolismo de lipídeos sobre o rosto, para prevenir o aumento de cicatriz secundária ou a formação de cicatriz sobre a pele.

Além disso, o ácido hialurônico pode ser aplicado como agente adjuvante para a operação do olho ou para reduzir a dor enquanto se move o joelho e a articulação de pacientes de osteoartrite.

Recentemente, o ácido hialurônico é aplicado no tratamento clínico, na forma de sal de sódio, mormente no tratamento cirúrgico dos olhos, da pele, artérias, e no campo de cosméticos. O ácido hialurônico com íon de metal alcalino, íon de metal alcalinoterroso (por exemplo, íon de magnésio), íon de alumínio, íon amônio, e na forma de sal de substituição do íon amônio, pode ser o carreador para auxiliar a absorção de fármacos (vide patente belga ns 904.547). O sal de prata é usado como micocida e o sal de ouro é usado para tratar artrite reumatoide, entre os sais de metais pesados do ácido hialurônico (vide documento n- WO 87/05517 da World Intellectual Property Organization ).

O efeito de tratar úlcera no quadril e decúbito pela composição (complexo) do ácido hialurônico e íon de elemento do Grupo IV da Tabela Periódica, por exemplo, o hialuronato de zinco e o sal de cobalto foi comprovado na patente húngara n- 203.372.

Bioniche, a empresa canadense, descreveu um método e estrutura relacionada para usar o ácido hialurônico com uma contração eficaz para tratar cistite na patente n- US 5.888.986, onde o Mw do ácido hialurônico é maior do que 200.000 Da. Apenas o ácido hialurônico com o certo Mw foi aplicado na sua modalidade, por exemplo, para usar o ácido hialurônico com Mw de 650 kDa ou 1.900 para tratar cistite; entretanto, o único peso molecular do ácido hialurônico não pode ser usado para conseguir pronto tratamento de também efeito prolongado.

O pedido de patente n- US 2005/0080037 (A1), em nome de Robert Peter Petrella, um canadense, descreveu o uso de ácido hialurônico para tratar entorse aguda e recidivante e suas reações, onde o Mw do ácido hialurônico é apenas entre 90 mil Da e 120 Da, e um único peso molecular do ácido hialurônico não consegue realizar a pronta cicatrização e também ação prolongada.

Seikagaku Kogyo, uma empresa japonesa, depositou a patente n- US 7.354.910 em 4 de abril de 2008, intitulada "Use of Agent for treating inflammatory bowel disease" para descrever que o ácido hialurônico e hialuronato com Mw entre 600 kDa e 1.200 kDa pode ser usado para tratar IBD. Entretanto, a degradação é rápida demais para reter o efeito de tratamento depois de injetar no paciente; portanto, clinicamente é muito inconveniente para os pacientes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um objeto da presente invenção é usar a atividade biológica de

pelo menos dois ou mais pesos moleculares médios de ácidos hialurônicos no sal farmaceuticamente aceitável com diferente Mw para tratar doença inflamatória do intestino (IBD). Por causa do baixo peso molecular médio do ácido hialurônico (LMWHA) e do alto peso molecular médio do ácido hialurônico (HMWHA), as taxas de adesão, insulamento e degradação diferentes, o ácido hialurônico com Mw médio mais baixo do que 1,5 milhão Da é classificado como LMWHA, e entre 1,5 milhão e 5 milhões de Da é classificado como HMWHA. Assim sendo, a mistura de LMWHA e HMWHA pode formar uma formulação desejada, onde o LMWHA pode cobrir rapidamente a superfície inflamatória para tratar IBD (por exemplo, colite ulcerativa, enterite aguda, enterite crônica, doença de Crohn ou a cicatrização de feridas no estômago e intestino), e o HMWHApode prolongar a degradação para atingir um período eficaz mais longo. Assim sendo, um tratamento mais rápido e um efeito de liberação prolongada podem ser conseguidos. O peso molecular do ácido hialurônico aplicado na presente

invenção é, de preferência, entre 1,5 milhão e 3,5 milhões de Da do ácido hialurônico com peso molecular médio alto (HMWHA), e mais preferivelmente, entre 2 milhões de Da do ácido hialurônico com médio alto (HMWHA). O Mw do ácido hialurônico aplicado na presente invenção é mais preferivelmente entre 0,5 milhão e 1,5 milhão de Da do ácido hialurônico com peso molecular médio baixo (LMWHA), e mais preferivelmente, 1 milhão de Da do ácido hialurônico com peso molecular médio baixo (LMWHA).

Outro objeto da presente invenção é fornecer uma mistura de ácidos hialurônicos que compreende LMWHA e também HMWHA em conjunto com um esteroide, agente imunossupressor ou fármaco anti-inflamatório, para potencializar o efeito.

Outro objeto da presente invenção é fornecer uma mistura de ácidos hialurônicos, que compreende LMWHA e também HMWHA, que forma o principal ingrediente ativo com o excipiente apropriado (por exemplo, porém sem limitações, gelatina, colágeno, quitosano, condroitina, Carbopol, ágar, carbóxi-metil-celulose (CMC) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS)1 pelo menos um dos itens supramencionados ou o composto dos itens supramencionados) na preparação para formular como um comprimido (por exemplo, comprimido revestido entérico), supositório (supositório retal), líquido perfusado (para o reto ou cólon). A preparação supramencionada é realizada pelas técnicas comuns neste campo técnico.

Outro objeto da presente invenção é fornecer uma concentração de uma mistura de ácidos hialurônicos, que compreende LMWHA e também HMWHA ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em uma faixa entre 0,5 mg/mL e 50 mg/mL, e a concentração preferível é entre 0,5 mg/mL e 5 mg/mL; uma concentração na forma de solução fica na faixa entre 0,05% e 5% (p/v) e a concentração preferível é entre 0,05% (p/v) e 0,5% (p/v).

A dosagem preferida para do fármaco para tratamento ou prevenção oral na presente invenção é de pelo menos 10 a 1.000 mg por administração, e a dosagem mais preferida é 10 a 500 mg por administração.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A mistura de ácidos hialurônicos da presente invenção, usada para tratar e prevenir IBD, compreende pelo menos dois ou mais do que dois pesos moleculares médios de ácidos hialurônicos, incluindo a mistura de ácido hialurônico de baixo peso molecular médio (LMWHA) e ácido hialurônico de alto peso molecular médio (HMWHA). O HMWHA e o LMWHA podem ser transformados em um HÁ linear, um HÁ reticulado ou uma combinação de pelo menos um dos itens supramencionados. Os Mw diferentes têm reologia diferente, funções de suporte de tecido e insulamento e degradação na solução, e portanto, a mistura de ácidos hialurônicos tem melhor adesividade e insulamento e o suporte de tecido funciona para equilibrar o efeito terapêutico é a taxa de degradação para tratar e prevenir IBD (por exemplo, colite ulcerativa, colite aguda, colite crônica, doença de Crohn, ou para cicatrizar feridas do estômago e intestinos), bem como para atingir um efeito de tratamento apropriado e um efeito de tratamento prolongado.

O Mw médio mais baixo do que 1,5 milhão de Da é classificado como LMWHA, o preferível fica dentro de uma faixa entre 0,5 milhão e 1,5 milhão de Da. O Mw mais alto do que 1,5 milhão de Da é classificado como HMWHA1 e o Mw fica dentro da faixa entre 1,5 milhão e 5 milhões de Da. A formulação que contém uma mistura de LMWHA e HMWHA, onde o LMWHA cobre prontamente a parte inflamatória para tratar e prevenir IBD, e o HMWHA prolonga o efeito do tratamento, e assim sendo atingir pronto tratamento e efeito de liberação prolongada.

O Mw do ácido hialurônico aplicado na presente invenção é, de preferência, entre 1,5 milhão e 3,5 milhões de Da do ácido hialurônico com alto peso molecular médio (HMWHA), e mais preferivelmente entre 2 milhões de Da do ácido hialurônico com alto peso molecular médio (HMWHA). O Mw do ácido hialurônico aplicado na presente invenção é mais preferivelmente entre 0,5 milhão e 1,5 milhão de Da do ácido hialurônico com baixo peso molecular médio (LMWHA), e mais preferivelmente entre 1 milhão de Da do ácido hialurônico com baixo peso molecular médio (LMWHA).

Aestrutura química genérica do hialuronano pode ser ilustrada da seguinte maneira:

<formula>formula see original document page 7</formula>

Hialuronano

Outra modalidade preferida da presente invenção inclui uma mistura 1: 1 de LMWHA e HMWHA do ácido hialurônico, e a razão ou a forma de sal pode ser ajustada dependendo do propósito clínico para entre 20:80 e 80:20. A mistura de ácidos hialurônicos com uma razão mais alta de LMWHA pode ser mais útil em acelerar o tratamento; contrariamente, uma razão mais alta de HMWHA pode proporcionar uma taxa de degradação melhor para prolongar o efeito do tratamento.

Outra modalidade preferida da presente invenção inclui uma mistura de ácidos que inclui LMWHAe HMWHAem conjunto com um esteroide, agente imunossupressor ou outro fármaco anti-inflamatório para potencializar o efeito.

Outra modalidade preferida da presente invenção inclui uma mistura de ácidos hialurônicos que inclui LMWHA e também HMWHA1 constituindo o ingrediente ativo principal com o excipiente apropriado para formular uma forma de dosagem oral (por exemplo, revestimento entérico), supositório (supositório retal), líquido perfusado (para o reto ou cólon).

Para a formulação oral (por exemplo, comprimido revestido entérico), o revestimento entérico proporciona maior resistência à dissolução e digestão no estômago, e depois de atingir o intestino e cólon, o revestimento entérico será dissolvido e o ácido hialurônico será liberado para formar uma membrana de proteção no cólon inflamado (a região do cólon ascendente ou descendente, ou cólon transverso) para acelerar a cicatrização da região inflamatória e também para prolongar o efeito do tratamento por longa taxa de degradação.

Para a formulação de supositórios, o supositório que contém o ácido hialurônico acima pode ser inserido dentro do ânus e o ácido hialurônico será liberado no reto e espalhado para outra região do cólon (por exemplo, a região descendente) para formar uma membrana de proteção no cólon inflamado, a fim de acelerar a cicatrização da região inflamada e também proporcionar efeito de liberação prolongada.

Para a formulação de perfusão (por exemplo, enema), a mistura de ácidos hialurônicos acima é o ingrediente ativo principal misturado com o excipiente (por exemplo, porém sem limitações, gelatina, colágeno, quitosano, condroitina, Carbopol, ágar, carbóxi-metil-celulose (CMC) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS), pelo menos um dos itens supramencionados ou o composto dos itens supramencionados) usado diretamente ou em um tubo macio para injetar a mistura de ácidos hialurônicos acima dentro do cólon. A mistura de ácidos hialurônicos será carregada dentro do cólon e espalhará para outra região do cólon (por exemplo, a região descendente) para formar uma membrana protetora no cólon inflamado, a fim de acelerar a cicatrização da região inflamada e também proporcionar efeito de liberação prolongada.

A concentração preferida da mistura de ácidos hialurônicos que inclui LMWHA e HMWHA ou seu sal farmaceuticamente aceitável fica na faixa entre 0,5 mg/mL e 5 mg/mL, mas a concentração preferida na forma de solução é dentro de uma faixa entre 0,05% e 0,5% (p/v). A concentração é entre 0,5 mg/mL e 50 mg/mL, e a concentração preferida é entre 0,5 mg/mL e 5 mg/mL. A solução pode ser formada, de preferência na concentração na faixa entre 0,05 e 5% (p/v); a solução mais preferida é formada na concentração na faixa entre 0,05 e 0,5% (p/v). Além disso, quanto à administração oral para prevenção ou melhora, a dose preferida é de pelo menos 10 a 500 mg para cada administração, e o sal farmaceuticamente aceitável da mistura de ácidos hialurônicos é o hialuronano sódico e o hialuronano de zinco.

Além disso, o LMWHA no Mw e o HMWHA no Mw da presente invenção podem ser aplicados em conjunto com o esteroide, agente imunossupressor ou fármaco anti-inflamatório, para conseguir o melhor efeito do tratamento.

Para apresentar comprovação do efeito da mistura de ácidos hialurônicos na presente invenção, o teste com animais que foi realizado sob condições laboratoriais profissionais resultou no seguinte relatório:

Modalidade 1 (vide anexo)

1-1 Resumo: o propósito do teste é avaliar o efeito da amostra IBD98 no corpo do animal que tem IBD. IBD98 foi inserido no reto dos camundongos do grupo preventivo, e depois o ácido trinitrobenzenossulfônico (TNBS) foi administrado para induzir doença de enterite; em seguida, administração contínua da amostra IBD98 através do reto por 3 dias. O TNBS foi administrado apenas ao grupo de controle para induzir IBD. Depois de 3 dias de observação, todos os camundongos foram sacrificados no 4- dia para inspecionar as mudanças patológicas clínicas, o índice da amostra no sangue antes de administrar o fármaco e depois do término do teste. O resultado indica que as médias da extensão de inflamação do cólon nos grupos preventivo e de controle foram 3,9 cm e 4,3 cm, o que indicava nenhuma diferença significante. Os camundongos dos grupos preventivo e de controle têm diferença significante na concentração do TNF-α (Fator de Necrose Tumoral-alfa) e IL-1 β (lnterleucina-1β), indicando que os camundongos tiveram inflamação induzida substancial; a concentração de TNF-α no grupo preventivo depois da determinação do teste é significativamente mais baixa do que no grupo de controle, e a diferença é óbvia. Entretanto, não houve diferença significativa na concentração de IL-Ιβ. O teste confirmou que esse padrão pode induzir IBD no corpo do animal e não há qualquer diferença na mudança patológica clínica. Portanto, o efeito sobre a amostra pode ser avaliado observando o estado de recuperação depois de administrar a amostra IBD98. O resultado do teste indica que há diferença significante no TNF-α no desempenho dos grupos preventivo e de controle. Portanto, o resultado comprova que a amostra IBD98 é substancialmente eficaz em reduzir a reação inflamatória para prevenir IBD.

1-2 Procedimento do Teste:

A. Proposta do teste: induzir a IBD nos camundongos com TNBS para avaliar o efeito para tratamento ou prevenção de IBD ou para reduzir a inflamação.

B. Objetivo do Teste:

IBD98, compreendendo LMWHA e HMWHA, e o HMWHA em uma faixa de 2 milhões de Da e o LMWHA em uma faixa de 1 milhão de Da, misturados na razão de 1:1, dissolvidos em solução PBS para produzir uma concentração de

0.5%.

C. Método:

1. Alvo do Teste:

30 camundongos Sprague-Dawley grau SPF machos com 8 semanas de idade, foram selecionados e classificados em dois grupos, cada grupo contendo 15 camundongos, e mantendo dois camundongos em uma gaiola na sala de observação do laboratório.

2. Teste dos Animais:

Os camundongos passaram por jejum durante 24 horas no grupo preventivo; Dia do teste 1, os camundongos foram anestesiados para administrar 1 mL de IBD98 por via retal, e depois receberam administração de 1 mL de TNBS (50 mg/mL) por via retal; Dia do teste 2 a 4, receberam administração de 1 mL de IBD98 por via retal; Dia do teste 5, todos camundongos foram sacrificados para observar o cólon quanto a mudanças patológicas clínicas. Os camundongos jejuaram durante 24 horas no grupo de controle; Dia do teste 1, e depois os camundongos foram anestesiados para receber administração de 1 mL de TNBS (50 mg/mL) por via retal; Dia do teste 2 a 4, receberam administração de 1 mL de PBS por via retal; Dia do teste 5, e depois, todos camundongos foram sacrificados para observar o cólon quanto a mudanças patológicas clínicas.

3. Teste do índice Inflamatório

Foi coletada amostra de sangue pela veia da cauda dos camundongos dos grupos preventivo e de controle no Dia 1 antes de iniciar o teste, e depois foi coletada amostra de sangue do coração depois da determinação do teste; e coletou-se o soro depois de centrifugação, e inspecionou-se o soro quanto a mudanças do TNF-α e IL-1 β por ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado a enzima), respectivamente.

1-3 Figuras do Teste:

Quadro 1: mudanças patológicas clínicas no cólon dos camundongos nos grupos preventivo e de controle

<table>table see original document page 11</column></row><table> <table>table see original document page 12</column></row><table>

Quadro 2: mudanças do TNF-α e 1L-1 β no soro dos camundongos antes (D1) e 4 dias depois (D5) da administração do fármaco nos grupos preventivo e de controle

<table>table see original document page 12</column></row><table> <table>table see original document page 13</column></row><table>

**: a concentração do TNF-α no soro dos camundongos do grupo preventivo em D5 e D1 tem diferença significante (P<0,01), bem como no grupo de controle (P<0,01).

*: a concentração de IL-1 β no soro dos camundongos do grupo preventivo em D5 e D1 tem diferença significante (P<0,05), bem como no grupo de controle (P<0,05).

#: a concentração de TNF-α no soro dos camundongos dos grupos preventivo e de controle em D5 e D1 tem diferença significante (P<0,05). 1-4 ResuItadodoTeste 30 camundongos foram selecionados para realizar o teste e foram separados em dois grupos como grupo preventivo e grupo de controle, cada grupo contendo 15 camundongos que depois jejuaram durante 24 horas antes de efetuar o teste, e administrar o enema para esgotar as fezes antes de administrar o fármaco. Foi administrado 1 ml_ de TNBS ao grupo de controle no Dia 1 (D1) e adminstrou-se PBS nos 3 dias seguintes (D2-D4); administrou- se 1 mL de TNBS ao grupo preventivo no Dia 1 (D1), e depois administrou-se 1 ml_ de IBD98 depois de uma hora, e então continuou-se a administrar IBD98 nos 3 dias seguintes (D2-D4). Os camundongos em ambos grupos no Dia 5 (D5) foram sacrificados para realizar ainda a dissecção a fim de inspecionar a lesão intestinal e a faixa inflamatória. Os camundongos mortos durante o processo do teste não são levados em conta para o resultado do teste. Havia 13 camundongos qualificados no grupo preventivo e 12 no grupo de controle no final do teste. As médias da extensão inflamatória no grupo preventivo e no grupo de controle são respectivamente 3,9 cm e 4,3 cm, que têm diferença insignificante (vide quadro 1). Observou-se que a concentração média (pg/mL) do índice inflamatório de TNF-α no D1 e D5 subiu de 21,3 para 759,3 no grupo preventivo e de 12,3 para 1.349,6 no grupo de controle, o que indica a diferença significante (P<0,01); observou-se que a concentração média (pg/mL) do índice inflamatório de IL-1 β em D1 e D5 subiu de 3,3 para 275,8 no grupo preventivo e de 14,1 para 469,4 no grupo de controle, o que indica também a diferença significante (P<0,05). A indicação demonstra que antes de induzir TNBS, os camundongos do teste apresentaram substancialmente a reação inflamatória. Comparando o índice inflamatório dos dois grupos depois do processo contínuo de 3 dias no Dia 5, a concentração média de TNF-α é 759,3 no grupo preventivo, 1.349,6 no grupo de controle, houve uma diferença significante entre estes dois grupos (P<0,05); e a concentração do TNF-α no soro do grupo preventivo de forma substancialmente significante mais baixa do que no grupo de controle. Em outras palavras, os camundongos tratados com IBD98 tiveram menos inflamação do que os camundongos não tratados (vide quadro 2).

1-5 Conclusão

A IBD foi induzida em ambos grupos, e nos 3 dias seguintes, o grupo de controle não recebeu qualquer tratamento médico e o grupo preventivo foi tratado com TNBS e depois tratados com IBD98, a concentração de TNF-α e também 1L-1 β do índice inflamatório nos dois grupos sobre substancialmente, o que indica que a relação inflamatória foi induzida nos camundongos. A concentração de TNF-α do grupo preventivo foi significativamente mais baixa do que no grupo de controle, o que significa que há um efeito substancial para reduzir a reação inflamatória nos camundongos depois de tratados com IBD98.

Modalidade 2 (vide anexo)

2-1 Sinopse

IBD foi induzida nos animais testados para avaliar o efeito de IBD98 dentro do corpo animal. TNBS foi administrado aos camundongos no reto para induzir lesão intestinal, e depois a amostra de IBD98 foi administrada aos camundongos do grupo de tratamento, e PBS (solução salina tamponada com fosfato) foi administrada ao grupo de controle por via retal depois de 3 dias. Os camundongos foram sacrificados depois de 7 dias do tratamento contínuo, para inspecionar a lesão clínica. O resultado indica que a extensão inflamatória do cólon é em média cerca de 1,25 cm no grupo de tratamento tratado com a amostra IBD98, e 1,875 cm no grupo de controle tratado com PBS. Há 33% de recuperação comparando o grupo de tratamento com o grupo de controle. Em outras palavras, a IBD nos camundongos tratados com IBD98 é vencida de forma substancialmente vantajosa com a recuperação do tecido intestinal.

2-2 Processo do Teste

A. Propósito do Teste:

Induzir a IBD nos camundongos administrando TNBS e avaliar se IBD98 é vantajosa para tratar ou prevenir a IBD ou reduzir a inflamação nos camundongos.

B. ObjetivodoTeste

IBD98, que compreende LMWHA e HMWHA, e o HMWHA em faixa de 2 milhões de Da e o LMWHA em uma faixa de 1 milhão de Da, misturados na razão de 7:3, dissolvidos em solução PBS para obter uma concentração de 0,5%.

D. Método:

4. Alvo do Teste

36 camundongos Sprague-Dawley machos grau SPF com 8 semanas de idade foram selecionados e classificados em dois grupos, cada grupo contendo 18 camundongos, e mantendo dois camundongos em uma gaiola na sala de observação do laboratório.

5. Teste dos Animais

Os camundongos jejuaram por mais de 24 horas; Dia do teste 1, e depois anestesiados para administrar 1 mL de TNBS (ácido trinitrobenzenossulfônico, 50 mg/mL) por via retal, e depois observados por 3 dias, e foram escolhidos os camundongos com as fezes moles ou sintoma de diarréia no terceiro dia. Os camundongos do grupo de tratamento foram anestesiados para administrar 1 mL da IBD98 (5 mg/mL) no Dia 4 ao Dia 10. Os camundongos do grupo de controle foram administrados para administrar 1 mL de PBS no Dia 4 ao Dia 10, e depois todos camundongos foram sacrificados no Dia 11 para observar o cólon a fim de examinar a lesão clínica. 2-3 Figuras do Teste:

Quadro 1, a lesão intestinal clínica nos camundongos do grupo de controle

<table>table see original document page 16</column></row><table>

Quadro 2, a lesão clínica e a proporção de recuperação correspondente dos camundongos no grupo de tratamento

<table>table see original document page 16</column></row><table> *proporção da recuperação correspondente (%) = extensão inflamatória no grupo de tratamento - média da extensão inflamatória no grupo de controle/média da extensão inflamatória no grupo de tratamento.

A figura 1 é um gráfico representativo do resultado do teste realizado na recuperação da lesão do cólon nos camundongos do grupo de tratamento em comparação com o grupo de controle. 2-4 Resultado do Teste:

36 camundongos foram selecionados para realizar o teste e eles foram separados no grupo de tratamento e grupo de controle com 18 camundongos em cada grupo. Os camundongos jejuaram durante mais de 24 horas antes do teste. O enema foi administrado para esvaziar as fezes e administrar TNBS antes de administrar o fármaco. Depois de observar por 3 dias, dois camundongos morreram e 5 confirmaram ter adquirido IBD por dissecção. Os camundongos com estado normal das fezes foram excluídos, os camundongos com fezes moles e diarréia no Dia 4 foram considerados. IBD98 continuou a ser administrada por via retal aos 10 camundongos no grupo de tratamento e receberam administração de PBS aos 7 camundongos no grupo de controle por 7 dias (D4 a D10). Cada grupo perdeu um camundongo durante o teste, e depois todos camundongos foram sacrificados no Dia 11 para inspecionar a lesão intestinal e a extensão inflamatória.

No grupo de controle, um camundongo não teve qualquer lesão, três camundongos tiveram inflamação local de 0,3 a 1 cm e lesão grau 1, e dois camundongos tiveram inflamação local de 2 a 2,5 cm e lesão grau 2 (vide quadro 1). No grupo de tratamento, 7 camundongos tiveram inflamação local de 0,3 a 1,5 cm e lesão grau 1, e dois camundongos tiveram inflamação local de 2 cm e lesão grau 2 (vide quadro 2). Depois da análise estatística, a faixa de inflamação média nos camundongos do grupo de controle é 1,875 cm e 1,25 cm nos camundongos do grupo de tratamento; a taxa de recuperação é 33% comparada nos dois grupos (vide quadro 2 e Figura 1).

Em conclusão, a presente invenção aplicou mormente a mistura de ácido hialurônico que compreende pelo menos dois ou mais do que dois ácidos hialurônicos farmaceuticamente aceitáveis na forma de sal com vários Mw (peso molecular), e as várias taxas de degradação entre Mw permite que o LMWHA com Mw baixo se difunda rapidamente para o HMWHA com Mw mais alto para conseqüentemente manter a degradação para estender melhor o efeito de liberação, e assim sendo, atingir a meta de pronto tratamento e efeito retardador.

Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com um melhor modo específico, deve-se entender que muitas alternativas, modificações, e variações ficarão evidentes para os versados nessas técnicas à luz do relatório descritivo precedente. Consequentemente, pretende-se englobar todas essas alternativas, modificações, e variações que caiam dentro do espírito e do âmbito das reivindicações incluídas. Todas as questões aqui enunciadas ou ilustradas no desenho apensado devem ser interpretadas no sentido ilustrativo e não limitativo.

Claims

1. Mistura do ácido hialurônico para tratar e prevenir doença inflamatória do intestino (IBD), caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos dois ou mais do que dois ácidos hialurônicos com um peso molecular mais baixo (Mw de LMWHA) e um peso molecular mais alto (Mw de HMWHA); sendo que o dito Mw de LMWHAfica em uma faixa de 0,5 milhão a -1,5 milhão de Da1 e o dito Mw de HMWHA fica em uma faixa de 1,5 milhão a 5 milhões de Da; e a razão da mistura do dito LMWHA para o dito HMWHA fica em uma faixa entre 20:80 e 80: 20.

2. Mistura do ácido hialurônico para tratar e prevenir doença inflamatória do intestino (IBD), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um volume preferido do dito HMWHA fica dentro de uma faixa de 1,5 milhão a 3,5 milhões de Da.

3. Mistura do ácido hialurônico para tratar e prevenir doença inflamatória do intestino (IBD), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um volume preferido do dito HMWHA é 2 milhões de Da.

4. Mistura do ácido hialurônico para tratar e prevenir doença inflamatória do intestino (IBD), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um volume preferido do dito LMWHA é 1 milhão de Da.

5. Mistura do ácido hialurônico para tratar e prevenir doença inflamatória do intestino (IBD), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito Mw da razão de mistura do dito LMWHA para o dito HMWHA é 1:1.

6. Mistura do ácido hialurônico para tratar e prevenir doença inflamatória do intestino (IBD), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita concentração da razão de mistura do dito LMWHA para o dito HMWHA é 0,5 mg/mL para 50 mg/mL.

7. Mistura do ácido hialurônico para tratar e prevenir doença inflamatória do intestino (IBD), de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que uma razão preferida da dita concentração da mistura do dito LMWHA para o dito HMWHAfica em uma faixa de 0,5 mg/mL a 5 mg/mL.

8. Mistura do ácido hialurônico para tratar e prevenir doença inflamatória do intestino (IBD), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita mistura de ácido hialurônico inclui um excipiente para formular uma forma de dosagem oral sólida.

9. Mistura do ácido hialurônico para tratar e prevenir doença inflamatória do intestino (IBD), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita mistura de ácido hialurônico inclui um excipiente para formular supositórios, ou uma forma retal ou perfusado.

10. Mistura do ácido hialurônico para tratar e prevenir doença inflamatória do intestino (IBD), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita mistura de ácido hialurônico pode incluir ainda um esteroide, agente imunossupressor ou fármaco anti-inflamatório.

11. Mistura do ácido hialurônico para tratar e prevenir doença inflamatória do intestino (IBD)1 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito ácido hialurônico é usado para tratar e prevenir colite ulcerativa, enterite aguda, enterite crônica ou doença de Crohn, e para auxiliar na cicatrização de feridas no estômago e intestino..

12. Mistura do ácido hialurônico para tratar e prevenir doença inflamatória do intestino (IBD), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita mistura do ácido hialurônico é para tratar e prevenir doença inflamatória do intestino (IBD) e síndrome do intestino irritável (IBS).