EA014469B1

EA014469B1 - Бинарные смеси гиалуроновой кислоты и их терапевтическое применение

Info

Publication number: EA014469B1
Application number: EA200802307A
Authority: EA
Inventors: Сандра Гоббо; Роберт Петрелла
Original assignee: Сандра Гоббо; Роберт Петрелла
Priority date: 2006-05-11
Filing date: 2006-05-11
Publication date: 2010-12-30
Also published as: AR060784A1; CN101437527A; JP2009536625A; PT2026821E; MX2008014403A; CA2651039A1; ES2332667T3; TWI399208B; BRPI0621656B8; ATE440609T1; EP2026821B1; PL2026821T3; EA200802307A1; DE602006008834D1; CA2651039C; BRPI0621656A2; TW200812597A; BRPI0621656B1; MY149505A; WO2007131546A1

Abstract

Настоящее изобретение относится к композициям гиалуроновой кислоты, заключающимся в бинарных смесях образцов гиалуроновой кислоты, имеющих главным образом различную среднемассовую молекулярную массу и далее различные реологические свойства в водном растворе. Получающиеся композиции демонстрировали необычное реологическое поведение с равновесием между вязкостью и вязкоупругостью. Соответственно эти композиции гиалуроновой кислоты пригодны для лечения болезней суставов посредством внутрисуставного введения или внесуставного применения при нарушениях в мягкой ткани.

Description

Настоящее изобретение относится к бинарным смесям гиалуроновой кислоты, получаемым с образцами гиалуроновой кислоты, имеющими различную среднемассовую молекулярную массу, и их применению для внутрисуставного введения при поражениях сустава или внесуставного использования при нарушениях мягких тканей.

Сведения о предшествующем уровне техники

Гиалуроновая кислота (НА) является хорошо известным биологическим полисахаридом с высоким молекулярным весом, принадлежащим к классу гликозаминогликанов, присутствующим в большой степени во всех соединительных тканях позвоночных, в суставной синовиальной жидкости и хряще, где она является основным компонентом, в глазных эндобульбарных жидкостях; она широко применяется для лечения различных патологических состояний. В природе молекулярная масса НА может достигать более чем 10000 кДа, но, как известно, при экстрагировании и манипулировании гиалуроновая кислота неизменно представляет собой образец, определяемый обычно посредством средней молекулярной массы, будучи образованный различными полимерами, имеющими молекулярную массу, заключающую в себе диапазон молекулярных масс. Другими словами, образец этого биополимера представляет собой распределение молекулярной массы таким образом, что любой образец НА также может быть охарактеризован индексом полидисперсности. Следовательно, даже если точно не указано, в отношении гиалуроновой кислоты подразумевается, что образец гиалуроновой кислоты, имеющий установленную среднемассовую молекулярную массу (или среднечисловую молекулярную массу) или распределение молекулярных масс, при формулировке гиалуроновая кислота, или гиалуронан, или гиалуронат обычно в виде натриевой соли (в дальнейшем также указанные как НА) имеет значение экзогенной гиалуроновой кислоты в виде соли.

Что касается биомедицинского применения НА, многие образцы этого биополимера, экстрагированного из животных источников или бактериального бульона, постоянно используют при патологических состояниях, таких как лечение раны, артрозоартритные болезни, и в глазной хирургии, причем эти применения, по существу, основаны на ее биологической роли и на аномальных физических свойствах (например, вязкости и/или структурной вязкоупругости) ее водных растворов. Вязкость и/или вязкоупругие свойства в основном зависят от диапазона молекулярной массы образцов НА, концентрации полимера, а другие технические характеристики, такие как степень образования поперечных связей, могут способствовать увеличению реологического проявления, так же как и заявленная молекулярная масса.

В действительности, реологические свойства НА находятся под влиянием или проистекают из комбинации различных технических свойств рассматриваемого образца. Тем не менее общеизвестно и осуществляется на практике - обращаться к образцам НА с высокой молекулярной массой, когда требуются высокая вязкость и/или вязкоупругие свойства, в частности, например, при состояниях воспаления коленного сустава, когда гиалуроновая кислота применяется с целью пополнения синовиальной жидкости и ее качеств вязкости/вязкоупругости.

Фактически, основная роль эндогенной НА в синовиальной жидкости состоит в том, чтобы обеспечить соответствующие механические свойства сустава посредством вязкости и/или вязкоупругости и далее сохранения структуры и функции хрящевого суставного матрикса, поскольку при болезнях суставов поражаются и структура, и функция. Например, остеоартрит является результатом механических и биологических явлений, которые дестабилизируют нормальный деградационный синтез (бедгабайопк 8уп111С518. катаболизм) суставного хряща (Όίορρο Р. ОЧсоаПйпЩ. Ас!а Оййор 8сапб 8ирр1. 1998; 281:2-5), и отличается снижением концентрации и молекулярной массы эндогенной НА, что, в свою очередь, может приводить к признакам боли и потере функции в несущих вес суставах, таких как колено (Ва1а5/ Е.А., Оепбпдег 8.Ь. УЛсощррктсШаВоп: а пе\\' сопсер! ίη 1йе 1геа!теп! οί оЧсоагОшЩ. 1. Кйеита1о1. 1993; 20 (8ирр1. 39):3-9). Следовательно, для образца НА для внутрисуставного увеличения вязкости/хондропротекции была установлена прямая связь между соответствующей вязкостью и/или вязкоупругостью и подходящей среднемассовой молекулярной массой, предпочтительно высокой среднемассовой молекулярной массой, при намерении восстановить характеристики суставной жидкости по концентрации и молекулярной массе для устранения боли и улучшения функции сустава. В клинических испытаниях внутрисуставные препараты НА показали более значительное облегчение боли, чем плацебо (ЭаЫЬегд Ь., Ьоктапбег Ь.8., Руб Ь. 1п1гааШси1аг бцесбощ оГ 1уа1игопап ίη рабепй \νί(1ι сагШаде аЬпоттаШгек и кпее рат. Λγ11ιγ6ι5 Вйеит. 1994; 37:521-528; Ооидабок М., Ыдиуеп М., Ьщйа! V., Атог В. Н1дй то1еси1аг \\όι§1ιΙ кобшт йуа1игопа!е (йуа1есйп) ίη оЧеоаПНпбх оГ Не кпее: а 1-уеаг р1асеЬо-соп!го11еб !г1а1. ОЧеоагбибЛ СагШаде. 1993; 1:97-103; Ре1ге11а В.1., О|ШкеЧго Μ.Ό., НйбеЬгапб С. ЕГГес!§ оГ йуа1игопа!е зобшт оп раш и р11улса1 Гипсбошпд ш оЧеоаПНпбх оГ 1бе кпее. Агс1 1п!егп Меб 2002; 162:292298; Каг188оп 1., 8)одгеп Ь.8., Ьойтапбег Ь.8. Сотрапюп оГ 1\\ό 1уа1игопап бгидк и р1асеЬо ш рабепй νίΐΗ кпее оЧеоагбшЦу а соп!го11еб, гапбот17еб, боиЬ1е-Ь1тб, рага11е1-бемдп тиШ-сеШег §!ибу. РНеита1о1оду (ОхГогб) 2002; 41:1240-1248), и сравнимое или большее относительно применения внутрисуставных глюкокортикоидов (Матйп Ь.А, Ме1й С.А., Рагсйтап М.Ь., е! а1. Мападетеп! оГ о^еоагШпШ оГ 1бе кпее Ьу ргбпагу саге рйумаапк. Агс1. Гат. Меб. 1998; 7:563-567). Несмотря на то что облегчение боли достигается более медленно при применении препаратов НА, чем при внутрисуставных инъекциях глюкокорти

- 1 014469 коидов, действие может продолжаться значительно дольше (Абатз М.Е., А1кш8ои М.Н., Еи881ег ЛЭ. е! а1. ТНе го1е о! У18СО8ирр1етеп!а!1оп \\'бб Ну 1аη СЕ-20 (§уиу18с) ίη 1бе 1геа1теп1 о! О81еоаг(Нг1118 о! 1бе кпее: а Сапаб1ап тиШ-сеибе 1г1а1 сотрапид Ну1ап СЕ-20 а1опе, Ну1ап СЕ-20 νίίΠ пои-8!его1ба1 ап11-1пДатта!огу бгидз (ΝδΆΙΌδ) и ΝδΆΙΌβ а1опе. О81еоаг(Нг1(8 СагШаде. 1995; 3:213-226). Подобным образом, внутрисуставная НА продемонстрировала снижение боли, сравнимое с оральными противовоспалительными препаратами (Абатз М.Е. е! а1. 1995 ге! сб.). В настоящее время клиницистами во всем мире применяются некоторые препараты НА, которые различаются последовательно по молекулярной массе НА (от 500000 до 6х10⁶), режимам дозирования и по притязаниям на эффективность. В особенности непонятно, обнаружены ли различия в эффективности между продуктами (Ьо С.Н., ЬаУайеу М., МсАйпбои Т., Ее1зоп Ό.Τ. 1п1га-агбси1аг гиалуронов кислот ίη 1геа1шеп1 о! кпее оз1еоаг1Нгб1з: а те!а-апа1у818. 1АМА 2003; 290:3115-21), в то время как пациенты принимают отдельные продукты без какого-либо объективного критерия для данного выбора.

Кроме того, было описано, что среди взрослых встречаются различия в составе эндогенной НА с изменением вязкоупругих свойств при остеоартритах, что согласуется со степенью тяжести и характером симптомов (Ва1азх и ОепНпдег. 1993 ге!. сб.). Изменение молекулярной массы, установленное по статье Ва1а8/. составляет от 5 до 2 млн.

Лечение суставной болезни гиалуроновой кислотой с относительно низкой среднемассовой молекулярной массой может быть поддержано фактом, упомянутым в литературе, что молекулы экзогенной НА возможно задерживаются или адсорбируются в сети коллагеновых волокон (Ва1азх Е.А., В1оот Ο.Ό., 8\νηηη Э.А. Еебегабои Ргосеебшдз. 1966, 25, 1813-1816). Что касается тонкой структуры и содержания гликана в поверхностном слое суставного хряща, адсорбция этого биополимера при приеме дополнения для увеличения (поддержания) вязкости на привлеченной (айгасбид) хрящевой поверхности не может быть исключена вследствие присутствия молекул коллагена даже при электростатическом взаимодействии. Следовательно, в частности, диффузия молекул НА в межповерхностный слой и адсорбция полимеров, содержащихся в образце НА, имеющем низкую или относительно низкую среднемассовую молекулярную массу в относительно высокой концентрации, на хрящевой поверхности могут быть обоснованы и могут быть предпочтительны по сравнению с высокой среднемассовой молекулярной массой.

С другой стороны, присутствие гиалуроновой кислоты и в хряще, и в синовиальной жидкости подчеркивает двойную биологическую роль эндогенной гиалуроновой кислоты: одна затрагивает ее биологическую роль в структурной организации хрящевого внеклеточного матрикса, а другая соотносится с ее физическими свойствами в синовиальной жидкости, и, даже принимая во внимание только последний аспект, проблема выбора лучшего образца НА для лечения болезни сустава не является такой легкой, как ожидалось, несмотря на большое количество экспериментальных данных, имеющихся по этим полисахаридам. Фактически, колено при динамическом движении требует эластичной композиции при оптимальной молекулярной массе в равновесии с потребностями вязкости. Например, высокая частота нагрузки через синовиальную жидкость является рассредоточенной вследствие динамического изменения в гиалуроновой кислоте относительно более упругого модуля по сравнению с более вязкими свойствами, когда нагрузка на гиалуроновую кислоту является нагрузкой низкой частоты (Ва1азх и Оекпдег, 1993 ге!. сб). Несмотря на то что данный продукт НА имеет ограниченный предел молекулярной массы, обычно низкий, средний или высокий, не разработан продукт для того, чтобы обеспечить дополнение композиции, который имитирует потребности коленного сустава с активным остеоартритом относительно эластичного и вязкого модулей синовиальной жидкости. Кроме того, признано, что показатели и вязкости и вязкоупругости полезны в увеличивающей вязкость терапии при болезнях суставов, но необязательно одни и те же образцы НА имеют обе эти характеристики, совместно подходящие для дополнения, поддерживающего вязкость, так чтобы являлось предсказуемым, какая среднемассовая молекулярная масса может быть предпочтительной для лечения болезни сустава. Та же самая проблема встречается также при расстройствах мягких тканей, таких как связки, так что в этих случаях тоже необходимо надлежащее соотношение между вязкостью и вязкоупругими свойствами.

Следовательно, спорный вопрос, что является наиболее подходящим видом гиалуроновой кислоты относительно молекулярной массы и особенно относительно получаемых физических свойств для подобных способов лечения, остается до сих пор открытым вопросом, и необходимость в препарате гиалуроновой кислоты, имеющем надлежащую вязкость и соответствующую вязкоупругость независимо от его среднемассовой молекулярной массы, является все еще нерешенной.

- 2 014469

Сущность изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает бинарные смеси образцов гиалуроновой кислоты, указанных образцов НА, имеющих различные характеристики относительно вязкости и/или вязкоупругости и в основном различную молекулярную массу и имеющих эти смеси НА, показывающие правильное соотношение между модулем вязкости и модулем вязкоупругости, для их применения, в частности при лечении болезней суставов.

Следовательно, первая цель настоящего изобретения - это бинарные смеси двух образцов гиалуроновой кислоты в виде соли, в которых реологические свойства указанных бинарных смесей при концентрации 10 мг/мл в водном растворе и при температуре 25°С составляют:

величина вязкости потока по меньшей мере 5 Па-к при скорости сдвига 1 с;

вязкоупругость при динамической реологии с О' по меньшей мере 7,5 Па и С по меньшей мере 7 Па при 1 Гц, и в которых указанные два образца гиалуроновой кислоты имеют:

первый образец среднемассовую молекулярную массу ниже чем 1000000 Да;

второй образец среднемассовую молекулярную массу выше чем 1500000 Да.

Бинарные смеси образцов гиалуроновых кислот изобретения пригодны для восстановления эластичности синовиальной жидкости и биологической смазки, далее следующая цель настоящего изобретения обеспечивает их применение для лечения воспалительной и/или травматической суставной болез ни или в качестве адъюванта в артроскопии посредством внутрисуставного применения и для лечения нарушений мягких тканей посредством внесуставного применения.

Эти и другие цели, так же как и признаки и преимущества настоящего изобретения, будут более понятны из подробного описания, помещенного ниже.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показывает динамическую реологию С'/С для гиалуроновой кислоты с низкой среднемассовой молекулярной массой ЬМНА (°>·);

с высокой среднемассовой молекулярной массой НМНА ^|в’°) _и смеси тех же самых ЬМНА:НМНА в соотношении мас./мас. 80:20.

Понятно, что переход С'=С является сдвигом к более низкой частоте и увеличивает упругость раствора ЬМНА в присутствии НМНА.

Фиг. 2 показывает влияние состава смеси на комплексную вязкость как функцию частоты гиалуроновой кислоты с низкой среднемассовой молекулярной массой ЬМНА (□);

с высокой среднемассовой молекулярной массой НМНА () и смеси тех же самых ЬМНА:НМНА в соотношениях мас./мас. 80:20 60:40 (♦)·

Фиг. 3 показывает динамическую реологию для гиалуроновой кислоты с низкой среднемассовой молекулярной массой ЬМНА (°>·);

с высокой среднемассовой молекулярной массой НМНА ^,в-^с) и для смеси тех же самых ЬМНА:НМНА в соотношении мас./мас. 50:50

Понятно, что переход С'=С появляется при низкой частоте и увеличивает упругость раствора ЬМНА при добавлении НМНА.

Фиг. 4 показывает влияние состава смеси на комплексную вязкость как функцию частоты гиалуроновой кислоты с низкой среднемассовой молекулярной массой ЬМНА (□);

с высокой среднемассовой молекулярной массой НМНА () и смеси тех же самых ЬМНА:НМНА в соотношении мас./мас. 50:50 (0).

Фиг. 5 показывает вязкость потока гиалуроновой кислоты с низкой среднемассовой молекулярной массой ЬМНА (°);

с высокой среднемассовой молекулярной массой НМНА (·) и смеси тех же самых ЬМНА:НМНА в соотношении мас./мас. 50:50 /°) как функции скорости сдвига.

- 3 014469

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Признаки и преимущества изобретения станут очевидными из следующего описания и предпочтительных вариантов осуществления, которые даны для иллюстрации, а не с целью ограничения. Дальнейшее выполнение или приспособление, так же как и варианты осуществления, очевидные для специалистов в данной области техники, считаются включенными в рамки настоящего изобретения.

Настоящее изобретение позволяет преодолеть недостатки существующих препаратов гиалуроновой кислоты для лечения болезни сустава с помощью образцов бинарных смесей гиалуроновой кислоты, в котором один образец НА указанных смесей дает свойства биологической смазки, а второй - эластичность синовиальной жидкости.

Как указано выше, образцы НА, имеющие молекулярную массу от 500000 до 6х10⁶ Да, используют постоянно для их вязкости и/или вязкоупругости при добавляющей (увеличивающей) вязкость терапии болезней суставов. Однако правильное соотношение между вкладом вязкости для смазки сустава и вязкоупругости для динамического движения сустава не осуществляется соответствующим образом. Фактически хорошо известно, что, в то время как образцы НА, имеющие низкую молекулярную массу, проявляют преобладающее вязкое поведение, образцы НА, имеющие более высокую молекулярную массу, проявляют преобладающее вязкоупругое поведение. Другие технические характеристики, такие как концентрация полимера, степень образования поперечных связей, могут способствовать увеличению реологического проявления, так же как и заявленная молекулярная масса. Теперь заявители обнаружили, что при смешивании вместе двух образцов НА, имеющих различную среднемассовую молекулярную массу и затем равный профиль, вязкость/вязкоупругость в водном растворе, полученная бинарная смесь НА, обладает равновесием между модулем вязкости и модулем вязкоупругости, подходящим для дополнения вязкости при лечении болезни сустава или нарушений мягких тканей, представляя вязкость, необходимую для биологической смазки, и вязкоупругость, существенную для динамического движения сустава. Следовательно, композиции фармацевтической категории бинарных смесей гиалуроновой кислоты изобретения являются особенно пригодными для внутрисуставного применения при воспалительных и/или травматических болезнях сустава или внесуставного применения при нарушениях мягких тканей, решая вышеупомянутую задачу вязкости и вязкоупругости, объединив правильные характеристики относительно вязкости и вязкоупругости в одном и том же продукте. Для осуществления цели настоящего изобретения смеси гиалуроновой кислоты представляют собой бинарные смеси, имеющие при концентрации 10 мг/мл в водном растворе и при температуре 25°С:

величину вязкости потока по меньшей мере 5 Па-с при скорости сдвига 1 с;

вязкоупругость при динамической реологии с О' по меньшей мере 7,5 Па и С, по меньшей мере 7 Па при 1 Гц, предпочтительно величину вязкости потока в диапазоне от 5 до 25 Па-с при скорости сдвига 1 с;

вязкоупругость при динамической реологии с О' в диапазоне от 7,5 до 30 Па и С в диапазоне от 7 до 20 Па при 1 Гц.

Наиболее предпочтительными реологическими свойствами указанных бинарных смесей являются при концентрации 10 мг/мл и при температуре 25°С:

величина вязкости потока в диапазоне от 10 до 15 Па-с при скорости сдвига 1 с;

вязкоупругость при динамической реологии с С' в диапазоне от 10 до 15 Па и С в диапазоне от 7 до 10 Па при 1 Гц.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения бинарные смеси НА получают с образцами гиалуроновой кислоты, имеющими различные среднемассовые молекулярные массы. В частности, образец НА, имеющий низшую среднемассовую молекулярную массу, имеет среднемассовую молекулярную массу ниже чем 1000000 Да (ЪМНА), предпочтительно в диапазоне от 300000 до 1000000 Да и наиболее предпочтительно 500000-900000 Да. В большинстве случаев в этих пределах молекулярной массы образцы гиалуроновой кислоты имеют соответственно вязкость около 1 Па-с при 0,1 с^-1 и модуль упругости С'~1 Па ниже чем С при 1 Гц.

Второй образец НА, имеющий высшую среднемассовую молекулярную массу, имеет среднемассовую молекулярную массу не меньше чем 1500000 Да (НМНА), предпочтительно в диапазоне от 1500000 вплоть до 6000000 Да и предпочтительно между 1800000 и 3500000 Да. В большинстве случаев в этих пределах молекулярной массы образцы гиалуроновой кислоты имеют соответственно вязкость больше или равную 70 Па-с при 0,31 с^-1 и модуль вязкоупругости О' больше чем 65 Па.

Бинарные смеси НА, имеющие реологические свойства в значениях вязкости потока и вязкоупругости при динамической реологии, пригодные для выполнения цели изобретения, могут быть получены с двумя образцами НА, вышеупомянутыми здесь, в соответствующих мас./мас. соотношениях между ними.

- 4 014469

Одним предпочтительным вариантом осуществления изобретения является бинарная смесь, содержащая два образца гиалуроновой кислоты в виде соли, в котором реологические свойства указанной бинарной смеси составляют при концентрации 10 мг/мл в водном растворе и при температуре 25°С:

величина вязкости потока в диапазоне от 5 до 25 Па-с при скорости сдвига 1 с;

вязкоупругость при динамической реологии с О' в диапазоне от 7,5 до 30 Па и О от 7 до 20 Па при 1 Гц, и в котором указанные два образца гиалуроновой кислоты имеют:

первый образец среднемассовую молекулярную массу в диапазоне от 300000 до 1000000 Да;

второй образец среднемассовую молекулярную массу в диапазоне от 1500000 до 6000000 Да, будучи указанной бинарной смесью, получаемой смешиванием образца а) гиалуроновой кислоты в виде соли и образца Ь) гиалуроновой кислоты в виде соли в мас./мас, соотношениях в пределах охватывающих от 80:20 и 20:80.

Другие предпочтительные мас./мас. соотношения образца а) гиалуроновой кислоты и образца Ь) гиалуроновой кислоты находятся в пределах от 40:60 и 60:40, и наиболее предпочтительное мас./мас. соотношение составляет 50:50.

Для целей изобретения образцы НА, использованные для приготовления бинарных смесей, являются предпочтительно, но не исключительно линейными гиалуроновыми кислотами, тогда как соли их являются солями щелочных металлов и предпочтительно Να или К.

Для внутрисуставного применения при воспалительных и/или травматических болезнях суставов или внесуставного применения при нарушениях в мягких тканях композиции бинарных смесей гиалуроновой кислоты изобретения могут представлять собой композиции фармацевтического класса в соединении с растворителями и наполнителями, приемлемыми для предусматриваемого применения, предпочтительно в забуференной и сольватирующей среде, в которой гиалуроновая кислота находится в концентрации от 10 до 20 мг/мл. В предпочтительном варианте гиалуроновая кислота находится в концентрации 10 или 20 мг/мл. Предпочтительно растворители являются забуференными сольватирующими средами при физиологическом значении рН с соответствующей осмолярностью.

Экспериментальная часть, приведенная ниже, состоит в характеристике физических свойств (т.е. реология) отобранных коммерчески доступных образцов НА и их бинарных смесей (часть А) и клиническом исследовании на пациентах с остеоартритом, выполненном также с коммерчески доступными фармацевтическими продуктами НА и предназначенными для регулярного выпуска (часть В).

Для того чтобы охарактеризовать и оценить реологическое поведение смесей гиалуроновой кислоты изобретения в выполненных экспериментах, определяют ответ на давление и в то же время измеряют вклад упругости как вклад вязкости, как функцию пульсации (рад/с) или частоты (Гц) (ω).

Фактически, характеристическая вязкость может быть получена при нулевой скорости сдвига и нулевой концентрации полимера и хорошо известно, что существует эмпирическое соотношение между характеристической вязкостью в данном растворителе и данной температурой и молекулярной массой (отношение Марка-Хаувинка [η] (мл/г)=0,0336М^0,79 для НА в 0,15М Ναί,Ί). Кроме того, вязкость раствора зависит также непосредственно от этой характеристической вязкости и от концентрации полимера при низкой скорости сдвига. Выше данной критической концентрации полимера (в зависимости от этих двух факторов) цепи перекрываются и получается не ньютоновское поведение в экспериментах по течению. Следовательно, наиболее важной технической характеристикой для оценки раствора полимера, в частности растворов гиалуроновой кислоты, является вязкоупругость, характеризующая раствор полимера (полученный в динамических реологических экспериментах, где частота или пульсация, налагаемая для давления применяемого к растворам, изменяется, когда линейные условия соблюдены).

Экспериментальная часть

Часть А. Реологическое поведение бинарных смесей НА.

Материалы и методы.

Для исследования различных образцов гиалуроновой кислоты были использованы:

ΑΚΌ образец (партия № 03167), изготавливаемый ΑΚΌ, имеющий Μν, как заявлено производителем, около 10⁶ (образец 1);

образец Ну1иМеб (Оспхутс. лот 690113) имеющий Μν, как заявлено изготовителем, 2,59х10⁶ (образец 2);

Хилан ОР20, или Синвиск (Оепгуте), содержащий 20% поперечно связанной НА и 80% линейной НА, имеющий Μν, как заявлено изготовителем, 6х10⁶ (образец 3);

Суплазин (Вюшсйе), линейная НА из бактериального источника, имеющая Μν, как заявлено изготовителем (Μν 500000-1000000 Да) (образец 4);

смеси ΑΚΟ и Ну1иΜеά образцов 80/20 (образец 5);

смеси 60/40 (образец 6);

смеси Хилана ОР20 или Синвиска и Суплазина 50:50 (образец 7).

Вязкость образцов НА, поскольку она не была заявлена производителями, измеряли в определенных условиях (температура, растворитель, скорость сдвига).

- 5 014469

Было проанализировано реологическое поведение этих образцов при концентрации 10 мг/мл в 0,15 М ЫаС1 в водном растворе при температуре 25°С с помощью реометра ТА 1п51гитсШ. оснащенного р1апе-сопе деотеРу (плоско-конусной геометрией); конус был диаметром 4 см и углом 3,59°. Это оборудование позволяет выполнить:

(1) эксперимент по течению (определение вязкости в Па-с как функции скорости сдвига, выраженной в с^-1) и (2) динамические эксперименты, измеряющие сохранение (С) и потерю модуля (С), выраженную в Па, как функцию частоты деформации (ω в Герц); С' ознает упругое поведение раствора под давлением (качество подобное твердому) и С - качество вязкости. Для вязкоупругого раствора задается С>С' при низкой частоте, затем С' и С пересекаются при ω₀ и С' становится больше чем С при высокой частоте. Также вычисляют комплексную вязкость |η*| (в Па-с) и соединяют С' и С'. Для восстановления вязкоупругости синовиальной жидкости необходимо приготовить раствор, имеющий ω0 ниже чем 0,5 Гц (соответствующий гуляющей частоте, как дано Ва1а/5 (Ва1а/5 Е.А., С1ЬЬ§ Ό.Ά. ТЬе гйео1од1са1 ргорегРек аий ГипсОоп о! НА. 1п Сйетщру и то1еси1аг Ью1оду о! 1Не Ш1гасе11и1аг таРгх, ейй. Ва1а/5 Е.А., Асайетк рге§8, Ьопйоп и ΝΥ, 1970, 1241-1254).

Для определения в отсутствие калибровки среднемассовой молекулярной массы и распределения всей молекулярной массы использовали пространственно-эксклюзионную хроматографию (\Уа1ег5 СРСУ АШапсе 2000), оснащенную 3 детекторами, в режиме он-лайн (рефрактометр, детектор рассеяния света \УуаР МАЕЬЗ, вискозиметр), являющуюся с нашей точки зрения единственным способом правомерным для определения молекулярной массы. Образцы приготавливали в концентрации 0,5 г/л в 0,1 М NаNΟ₃элюенте и фильтровали через пористую мембрану (с диаметром пор 0,2 мкм) перед впрыскиванием 108 мкл.

Различные смеси могут быть приготовлены путем смешивания контролируемого количества каждого образца НА, например, так, чтобы сохранить общую концентрацию полимера неизменной 10 г/л. НМНА устанавливает положение ω₀ при относительно низком значении, доходящем до критического значения 0,5 Гц; ЬМНА позволяет сохранить общее количество НА при впрыскивании, но также, предположительно, для лучшего взаимодействия с хрящем, чтобы образовать пограничную зону, богатую НА.

В табл. 1 представлены полученные результаты для образцов АКО и Сепхутех и их бинарных смесей, а результаты для образцов Синвиск и Суплазин и их смесей, использованных в клиническом испытании, сообщены в табл. 2.

Таблица 1

Влияние состава смеси на свойства. Раствор 10 г/л в 0,15М №С1, Т=25°С (АКО ЬМНА/Сепгуте НМНА)

Растворы	Вязкость Па.с при 0,1 з-1	О’ Па. при 1 Гц	С”Па. при 1 Гц	соо (Гц)	(η*\| Па.с. при 1 Гц	Ммг (г/мол)
ЬМНА	—	7.36	11.38	3.6	2.23	1x10
НМНА	—	67.28	29.93	0.06	12.13	2.59х10⁶
Смесь ЬМНА/НМНА 60/40	—	26.62	22.95	0.6	5.79
Смесь ЬМНА/НМНА 80/20	—	18.29	18.61	1	4.3

Те же самые результаты показаны на фиг. 1, 2. На фиг. 1 показано, что образец Сепхуте является очень вязкоупругим, когда образец АКО является менее переплетенным. Частота ω₀ для перехода в С', С расположена при значительно более высоком значении для АКО (3,7 Гц>0,064 Гц для Сепхуте), но при том же самом значении модуля С'=20 Па. На фиг. 2 комплексная вязкость как функция скорости сдвига дана для того же самого раствора; он показывает нормальное уменьшение с увеличением скорости сдвига для вязкоупругих (сложных, замешанных) переплетенных растворов.

- 6 014469

Таблица 2

Влияние состава смеси на свойства. Раствор 10 г/л в 0,15М ЫаС1, Т=25°С (Синвиск НМНА/суплазин ЬМНА)

Растворы	Вязкость Па.с при 0.1 8-1	О’ при 1Гц	О” при 1 Гц	<»о(Гц)	Мет (г/мол)	\|η*\| Па.с. при 1 Гц
ЬМНА	0.96	1.08	4.60	—	500,000- 1,000,000	0.76
НМНА	159.9	78.63	21.89	—	Данный при 6x10⁶	13
Смесь ЬМНА/НМН А 50/50	43.2	26.38	18.17	0.07		5.12

Те же самые результаты показаны на фиг. 3-5. На фиг. 3 динамические модули даны для тех же самых исходных растворов и смеси 50/50% при 10 г/л. Синвиск является упругим во всех областях охваченных частот; суплазин главным образом является вязким, что касается относительно низкой молекулярной массы без точки пересечения модулей. Смесь 50/50% имеет очень интересное поведение, являясь упругой главным образом в большом диапазоне частот с точкой пересечения при ω₀=0,075 Гц, более низкой, чем гуляющая частота 0,5 Гц. На фиг. 4 и 5 комплексная вязкость |η*| и вязкость η даны как функция скорости сдвига. Суплазин показывает плато Ньютона вследствие его относительно низкой молекулярной массы.

Часть В.

Внутрисуставное введение смесей (бинарные) гиалуроновой кислоты пациентам с остеоартритом колена.

С целью установления преимущества смесей НА изобретения относительно нескольких продуктов, имеющих молекулярную массу в диапазоне от низшей до высшей, используемых в настоящее время без ясно видимого различия в эффективности, было проведено клиническое исследование на пациентах с остеоартритом колена.

Метод.

пациента (возраст 68±8 лет; значение длительности симптомов 7,4±4,1 лет), которые обращались за оказанием помощи по поводу остеоартрита колена и подвергались действию внутрисуставной терапии гиалуроновой кислотой, были ознакомлены с критериями включения в исследование, включая визуальную аналоговую шкалу (УАЗ) боли при покое >45 мм, радиографическое подтверждение одностороннего остеоартрита колена на стадии 1-3 и готовность получать внутрисуставную терапию гиалуроновой кислотой как одной молекулярной массы или комбинированного диапазона молекулярной массы были включены в рандомизированную, проспективную, отдельную натуралистическую когорту, отобранную слепым методом для продолжающегося в течение 12 недель исследования. Пациенты были выбраны по случайной схеме на этапе включения для получения серии из трех внутрисуставных инъекций одного суплазина (10 мг/мл; 2 мл/инъекцию, М\У 500000-1000000 Да, в дальнейшем обозначенные как ЬМ^), синвиска (8 мг±2/1мл; 2 мл/инъекцию, М\У 6 млн Да, в дальнейшем обозначенные как НМ\У). или комбинированных инъекций суплазин-синвиск (15 мг/1,5 мл+2 мг±3/1,5 мл; 3 мл/инъекцию, в дальнейшем обозначенные как Ь-НМ\У) в течение 3 недель. Пациенты могли свободно использовать сопутствующие лекарства или физиотерапию по их собственному выбору.

Пациенты выполняли базовую оценку по УАЗ боли в покое и при ходьбе (переменная первичной эффективности), по набору из 5 пунктов безусловного категорийного общего счета удовлетворения и регистрацию неблагоприятных событий и сопутствующих терапевтических способов воздействия при каждом визите в течение исследования и через одну неделю после последней инъекции. Пациенты были проинструктированы о необходимости повторения измерения, включая неблагоприятные события, через 12 недель.

Результаты.

Пациентов случайным образом распределили в одну из трех групп [ЬМ^=9; НМ\У=6; Ь-НМ^=8]. На этапе включения между группами не наблюдалось различия в демографических данных, стадии симптомов остеоартрита до применения продукта или с низкой или с высокой М\У или исходной эффективности результатов. Два субъекта (ЬМ^; Ь-НМ^) бросили исследование по причинам, не связанным с исследованием. На 4 и 12 неделе не наблюдалось различий между какими-либо группами по неблагоприятным событиям (<1,3% суммарно), ограниченным болью и местной опухолью. На 4 и 12 неделе соответственно изменение боли при ходьбе (УАЗ) было значительно улучшено по сравнению с исходным уровнем во всех трех группах: ЬМ^ (81,3%, р<0,001; 63,6%, р<0,001); НМ\У (78,1%, р<0.001; 59,1%, р<0,001) и Ь-НМ^ (50/50 смесь) (89,3%, р<0,001; 79,6%, р<0,001). Пациенты в группе Ь-НМ^ имели значительно большее улучшение и на 4 и на 12 неделях (р<0,007) по сравнению с другими группами, которые не отличались друг от друга. Подобным образом, боль в покое (УАЗ) значительно уменьшилась во всех 3 группах по сравнению с исходным уровнем на 4 и 12 неделе, однако не наблюдалось значи

- 7 014469 тельного различия между группами. Применение сопутствующих терапевтических средств на 4 неделе не различалось между группами, однако значительно больше пациентов ЬМ^ использовали сопутствующие терапевтические средства на 12 недель по сравнению с другими 2 группами (р<0,05).

Общее удовлетворение было значительно выше для Ь-ΗΜν по сравнению с другими группами на 12 недель (р<0,005).

Выводы.

Внутрисуставные инъекции гиалуроновой кислоты с применением любых низких, высоких или комбинированных молекулярных масс (М\У) были высокоэффективны в ослаблении боли в покое и также боли при ходьбе у пациентов с остеоартритом колена. Значительное улучшение результатов и в покое, и при активности у группы пациентов, которые получали комбинированную Ь-ΗΜν, с сопутствующим большим удовлетворением пациентов и меньшим применением сопутствующих терапевтических средств на 12 недель означает, что комбинированный диапазон Μν гиалуроновой кислоты может быть полезным, особенно среди пациентов с активным остеоартритом.

Следовательно, бинарные смеси НА настоящего изобретения могут быть успешно применены посредством внутрисуставного введения для лечения особых патологических состояний суставов и, в частности, травматических и/или воспалительных болезней суставов, отобранных в группу, состоящую из остеоартрита, артроза, так же как и адъювантного лечения в течение артроскопии при различных показаниях, включая разрыв мениска. Другим применением смесей НА изобретения является внесуставное применение при нарушениях мягких тканей, таких как связки, указанных нарушений, главным образом являющихся напряжением, растяжением и травмой.

Бинарные смеси НА согласно их применению для увеличения вязкости синовиальной жидкости и хондропротекции матрикса хряща могут быть применены посредством внутрисуставного введения в фармацевтических композициях в комбинации с наполнителями, диспергирующими присадками и растворителями, совместимыми с прогнозируемым фармацевтическим применением, известным или даже новым, как известно специалисту в данной области. В одном варианте осуществления смеси изобретения могут быть растворимыми или растворенными в физиологическом изотоническом водном растворе, предпочтительно солевом, не исключая, однако, неэлектролитные водные изотонические растворы. Дозировки зависят от тяжести патологии, так же как и состояния (возраст, масса тела, общее состояние здоровья) пациента. Для иллюстративных целей, но без ограничения, дозировки смесей согласно изобретению могут находиться в пределах между 10 и 20 мг/1мл, объем инъекции от 2 до 6 мл при однократном или еженедельно повторяющемся введении в течение периода времени от 1 до 3 недель.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Бинарная смесь, включающая два образца гиалуроновой кислоты в форме соли, в которой реологические свойства указанной бинарной смеси при концентрации 10 мг/мл в водном растворе и при температуре 25°С составляют величину вязкости потока по меньшей мере 5 Па/с при скорости сдвига 1 с, вязкоупругость при динамической реологии с О' по меньшей мере 7,5 Па и О по меньшей мере 7,0 Па при 1 Гц, причем указанные два образца гиалуроновой кислоты имеют:

a) первый образец среднемассовую молекулярную массу меньше чем 1000000 Да,

b) второй образец среднемассовую молекулярную массу выше чем 1500000 Да.
2. Бинарная смесь по п.1, в которой реологические свойства указанной бинарной смеси при концентрации 10 мг/мл в водном растворе и при температуре 25°С составляют величину вязкости потока в диапазоне от 5 до 25 Па-с при скорости сдвига 1 с, вязкоупругость при динамической реологии с О' в диапазоне от 7,5 до 30 Па и О в диапазоне от 7,0 до 20 Па при 1 Гц.
3. Бинарная смесь по п.2, в которой реологические свойства указанной бинарной смеси при концентрации 10 мг/мл в водном растворе и при температуре 25°С составляют величину вязкости потока в диапазоне от 10 до 15 Па-с при скорости сдвига 1 с, вязкоупругость при динамической реологии с О' в диапазоне от 10 до 15 Па и О в диапазоне от 7,0 до 10 Па при 1 Гц.
4. Бинарная смесь по п.1, в которой указанные два образца гиалуроновой кислоты имеют:

a) первый образец среднемассовую молекулярную массу в диапазоне от 300000 вплоть до 1000000 Да,

b) второй образец среднемассовую молекулярную массу в диапазоне от 1500000 до 6000000 Да.
5. Бинарная смесь по п.4, в которой указанные два образца гиалуроновой кислоты имеют:

a) первый образец среднемассовую молекулярную массу в диапазоне от 500000 до 900000 Да;

b) второй образец среднемассовую молекулярную массу в диапазоне от 1800000 вплоть до 3500000 Да.
6. Бинарная смесь по п.1, в которой образец а) гиалуроновой кислоты в форме соли и образец Ь)

- 8 014469 гиалуроновой кислоты в форме соли находятся в соотношениях мас./мас. в пределах от 80:20 и до 20:80.
7. Бинарная смесь по п.6, в которой указанный образец а) гиалуроновой кислоты и указанный образец Ь) гиалуроновой кислоты находятся в соотношениях мас./мас. в пределах от 40:60 и до 60:40.
8. Бинарная смесь по п.7, в которой указанный образец а) гиалуроновой кислоты и указанный образец Ь) гиалуроновой кислоты находятся в мас./мас. соотношении 50:50.
9. Бинарная смесь двух образцов гиалуроновой кислоты в форме соли, в которой реологические свойства указанной бинарной смеси составляют при концентрации 10 мг/мл в водном растворе и при температуре 25°С величину вязкости потока в диапазоне от 5 до 25 Па-с при скорости сдвига 1 с, вязкоупругость при динамической реологии с С в диапазоне от 7,5 до 30 Па и С в диапазоне от 7,0 до 20 Па при 1 Гц и в которой указанные два образца гиалуроновой кислоты имеют:

a) первый образец среднемассовую молекулярную массу в диапазоне от 300000 вплоть до 1000000 Да,

b) второй образец среднемассовую молекулярную массу в диапазоне от 1500000 вплоть до 6000000 Да, причем указанную бинарную смесь получают смешиванием образца а) гиалуроновой кислоты в форме соли и образца Ь) гиалуроновой кислоты в форме соли в мас./мас. соотношениях в пределах от 80:20 и до 20:80.
10. Бинарная смесь по п.9, в которой указанные два образца гиалуроновой кислоты имеют:

a) первый образец среднемассовую молекулярную массу в диапазоне от 500000 вплоть до 900000 Да;

b) второй образец среднемассовую молекулярную массу в диапазоне от 1800000 вплоть до 3500000 Да.
11. Бинарная смесь по п.9, в которой указанный образец а) гиалуроновой кислоты и указанный образец Ь) гиалуроновой кислоты находятся в мас./мас. соотношениях в пределах от 40:60 и до 60:40.
12. Бинарная смесь по п.11, в которой указанный образец а) гиалуроновой кислоты и указанный образец Ь) гиалуроновой кислоты находятся в мас./мас. соотношении 50:50.
13. Фармацевтическая композиция, приготовленная с соответствующими разбавителями, растворителями или наполнителями и бинарной смесью из двух образцов гиалуроновой кислоты в форме соли согласно любому из пп.1-12.
14. Фармацевтическая композиция по п.13, в которой бинарные смеси двух образцов гиалуроновой кислоты в форме соли находятся в концентрации в диапазоне от 10 до 20 мг/мл.
15. Применение бинарных смесей двух образцов гиалуроновой кислоты в форме соли по любому из предшествующих пп.1-12 для приготовления фармацевтических композиций для лечения воспалительных и/или травматических болезней суставов посредством внутрисуставного введения.
16. Применение бинарных смесей двух образцов гиалуроновой кислоты в форме соли по любому из предшествующих пп.1-12 для приготовления фармацевтических композиций для адъювантного лечения во время артроскопии посредством внутрисуставного введения.
17. Применение бинарных смесей двух образцов гиалуроновой кислоты в форме соли по пп.15 и 16, где указанные воспалительные и/или травматические болезни суставов выбраны из группы, состоящей из остеоартрита, артроза или разрыва мениска.
18. Применение бинарных смесей двух образцов гиалуроновой кислоты в форме соли по любому из предшествующих пп.1-12 для приготовления фармацевтических композиций для внесуставного введения при нарушениях мягких тканей.
19. Применение бинарных смесей двух образцов гиалуроновой кислоты в форме соли по п.18, где указанные нарушения выбраны из группы, состоящей из напряжения, растяжения и травмы.