BRPI0621656A2

BRPI0621656A2 - misturas binárias de ácido hialurÈnico e uso terapêutico destas

Info

Publication number: BRPI0621656A2
Application number: BRPI0621656-0A
Authority: BR
Inventors: Sandra Gobbo; Robert Petrella
Original assignee: Sandra Gobbo; Robert Petrella
Priority date: 2006-05-11
Filing date: 2006-05-11
Publication date: 2011-12-20
Also published as: EP2026821A1; ATE440609T1; TW200812597A; PT2026821E; JP2009536625A; EP2026821B1; WO2007131546A1; TWI399208B; EA200802307A1; BRPI0621656B8; BRPI0621656B1; MX2008014403A; ES2332667T3; PL2026821T3; CA2651039C; DE602006008834D1; EA014469B1; MY149505A; US20090163441A1; CA2651039A1

Abstract

MISTURAS BINáRIAS DE áCIDO HIALURÈNICO E USO TERAPêUTICO DESTAS. A presente invenção refere-se a composições de ácido hialurónico consistindo em misturas binárias de amostras de ácido hialurónico apresentando pesos moleculares médios ponderais principalmente diferentes e, desta forma, diferentes propriedades reológicas em solução aquosa. As composições resultantes demonstraram comportamento reológico peculiar com um equilíbrio entre a viscosidade e a viscoelasticidade. Da mesma forma, estas composições de ácido hialurónico são úteis para o tratamento de doenças articulares por administração intra-articular ou aplicação extra-articular em distúrbios do tecido mole.

Description

MISTURAS BINARIAS DE ACIDO HIALURONICO E USO TERAPEUTICO DESTAS

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a misturas binárias de ácido hialurônico obteníveis com amostras de ácido hialurônico apresentando diferentes pesos moleculares médios ponderais e a seu uso para aplicação intra-articular em doenças das articulações ou aplicação extra-articular em distúrbios de tecido mole.

Antecedente da Invenção

0 ácido hialurônico é um polissacarídeo biológico de alto peso molecular bem conhecido, pertencente à classe dos glicosaminoglicanos, presente em grande extensão em todos os tecidos conectivos de vertebrados, em fluido sinovial de articulação e cartilagem, onde é o componente principal, e fluidos oculares endo-bulbares, e amplamente empregado para o tratamento de uma variedade de condições patológicas. Na natureza seu peso molecular pode atingir um peso molecular acima de 10.000 kDa, no entanto, como sabido, quando extraído e manipulado, o ácido hialurônico é sempre uma amostra comumente identificada por um peso molecular médio ponderai, sendo formado por diferentes polímeros apresentando um peso molecular compreendido em uma faixa de pesos moleculares. Em outras palavras, uma amostra deste biopolímero apresenta uma distribuição de pesos moleculares, de tal forma que qualquer amostra de HA pode ser também caracterizada por um índice de polidispersão. Desta forma, mesmo que não especificado, para o ácido hialurônico deve-se pretender uma amostra de ácido hialurônico apresentando um peso molecular médio ponderai (ou peso molecular numérico médio) ou distribuição de pesos moleculares, quando se utiliza as palavras ácido hialurônico ou hialuronano ou hialuronato, usualmente na forma de sal de sódio, (doravante também indicado como HA) significa ácido hialurônico exógeno na forma de sal.

No que diz respeito à sua aplicação biomédica, muitas amostras deste biopolimero extraídas de fontes animais ou caldo bacteriano estão em uso há muito tempo em condições patológicas tais como cura de feridas, doenças artrósicas/artríticas e cirurgia ocular, estes usos sendo essencialmente baseados em seu papel biológico e nas propriedades físicas não newtonianas (por exemplo, viscosidade e/ou sua viscoelasticidade estrutural) de suas soluções aquosas. Tanto a viscosidade quanto as propriedades viscoelásticas são principalmente dependentes da faixa de peso molecular das amostras de HA, da concentração do polímero, mas outras características técnicas, tais como o grau de reticulação, podem contribuir para aumentar a performance reológica bem como o peso molecular reivindicado.

De fato, as propriedades reológicas de um HA são influenciadas ou resultantes da combinação de diferentes características técnicas da amostra considerada. Todavia, são conhecimento e prática comuns fazer-se referência a amostras de HA de alto peso molecular quando são requeridas altas viscosidades e/ou propriedades viscoelásticas, em particular, por exemplo, em condições inflamatórias articulares dos joelhos, onde o ácido hialurônico é empregado para propósito de suplementação do fluido sinovial e por suas propriedades de viscosidade/visco- elásticas.

De fato, o papel primário do HA endógeno em fluido sinovial é o de prover as propriedades mecânicas adequadas da articulação por meio de sua viscosidade e/ou viscoelasticidade, desta forma preservando a estrutura e função da matriz articular da cartilagem, na medida em que ambas são afetadas em doenças articulares. Por exemplo, a osteoartrite e o resulto de eventos mecânicos e biológicos que desestabilizam a síntese degradante da cartilagem articular (Dieppe P. Osteoarthritis. Acta Orthop. Scand. Suppl. 1998; 281:2-5) e é caracterizada por uma redução da concentração e peso molecular de HA endógeno, o que, por sua vez, pode levar aos sinais característicos de dor e perda de função em articulações que suportam peso tais como os joelhos(Balasz E.A., Denlinger S.L.

Viscosupplementation: a new concept in the treatment of osteoarthritis. J. Rheumatol. 1993; 20 (Suppl 39):3-9) .

Desta forma, para visco-suplementação/condroproteção intra-articular com uma amostra de HA, foi feita uma relação direta entre uma viscosidade e/ou viscoelasticidade adequadas e um peso molecular médio ponderai, preferivelmente uma peso molecular médio ponderai alto, com o propósito de restaurar a concentração e peso molecular característicos do fluido sinovial para melhorar o controle da dor e função articular. Em experimentos clínicos, preparações intra-articulares de HA mostraram alívio da dor significativamente maior que o placebo (Dahlberg L., Lohmander L.S., Ryd L. Intraarticular injections of hyaluronan in patients with cartilage abnormalities and knee pain. Arthritis Rheum. 1994; 37:521-528; Dougados Μ., Nguyen M., Listrat V., Amor Β. High molecular weight sodium hyaluronate (hyalectin) in osteoarthritis of the knee: a 1- year placebo-controlled trial. Osteoarthritis Cartilage 1993; 1:97-103; Petrella R.J., DiSilvestro M.D., Hildebrand C. Effects of hyaluronate sodium on pain and physical functioning in osteoarthritis of the knee. Arch. Intern. Med. 2002; 162:292-298; Karlsson J., Sjogren L.S., Lohmander L.S. Comparison of two hyaluronan drugs and placebo in patients with knee osteoarthritis: a controlled, randomized, double-blind, parallel-design multi-center study. Rheumatology (Oxford) 2002; 41:1240-1248) e comparável ou superior aos glucocorticóides intra- articulares (Mamlin L. A, Melfi C.A., Parchman M.L., et al. Management of osteoarthritis of the knee by primary care physicians. Arch. Fam. Med. 1998; 7:563-567). Embora o alívio da dor seja alcançado mais lentamente com as preparações de HA que com injeções intra-articulares de glucocorticóides, o efeito pode durar consideravelmente mais tempo (Adams M.E., Atkinson M.H., Lussier A.J. et al. The role of viscosupplementation with hylan GF-20 (Synvisc) in the treatment of osteoarthritis of the knee: a Canadian multi-centre trial comparing hylan GF-20 alone, hylan GF-20 with non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) and NSAIDs alone. Osteoarthrits Cartilage 1995; 3:213-226). Similarmente, o HA intra-articular mostrou melhora comparável da dor com preparações antiinflamatórias orais (Adams M.E. et al. 1995 ref. cit.). Várias preparações de HA são atualmente utilizadas em todo o mundo por médicos, as quais diferem de maneira consistente no peso molecular do HA (de 500.000 a 6xl06) , nos regimes de dosagem e nas pretensões de eficácia. Especificamente, não está claro se as diferenças na eficácia são encontradas entre os produtos (Lo G.H., LaValley M., McAlindon T., Felson D.T. Intra- articular hyaluronic acid in treatment of knee osteoarthritis: a meta-analysis. JAMA 2003; 290:3115-21) na medida em que os pacientes recebem produtos específicos sem quaisquer critérios objetivos para uma dada escolha.

Além disto, foi descrito que diferenças em composições de HA endógeno ocorrem entre adultos com uma troca das propriedades viscoelásticas na osteoartrite que é consistente com o grau de severidade e caráter dos sintomas (Balasz e Denlinger, 1993 ref. cit.) . A variação de peso molecular estimada a partir do artigo de Balasz é de 5 a 2 milhões.

0 tratamento de uma doença articular com HA de peso molecular relativamente baixo pode ser favorecido pelo fato que é mencionado na literatura de que moléculas de HA endógeno são aprisionadas ou adsorvidas na rede de fibra de colágeno. (Balasz E.A., Bloom G.D., Swann D.A. Federation Proceedings 1966, 25, 1813-1816). Em relação à estrutura fina e teor de glicano da camada superficial da cartilagem articular, uma adsorção deste biopolímero a partir da administração de visco-suplementação em uma superfície de cartilagem atraente não pode ser excluída devido á presença de moléculas de colágeno mesmo por interação eletrostática. Desta forma, em particular, uma difusão de moléculas de HA na camada interfacial e adsorção dos polímeros, contidos em uma amostra de HA apresentando um peso molecular médio baixo ou relativamente baixo em uma concentração relativamente alta, na superfície de cartilagem, podem ser consideradas e podem ser favorecidas em comparação com um peso molecular médio ponderai alto.

Por outro lado, a presença de ácido hialurônico tanto em cartilagem quanto em fluido sinovial ressalta um papel biológico duplo do ácido hialurônico endógeno, um relacionado a seu papel biológico na organização estrutural da matriz extracelular cartilaginosa e um relacionado com suas propriedades físicas no fluido sinovial, e mesmo se considerando apenas este último aspecto, o problema da escolha da melhor amostra de HA para os propósitos de tratamento de doença articular, não é fácil apesar do grande corpo de dados experimentais existentes sobre este polissacarídeo. De fato, o joelho em movimento dinâmico requer composição elástica com peso molecular ideal em equilíbrio com as necessidades viscosas. Por exemplo, carga de alta freqüência através do fluido sinovial é dissipada através de uma alteração dinâmica no ácido hialurônico no sentido de um módulo mais elástico em comparação com as propriedades mais viscosas quando a carga para ácido hialurônico é de baixa freqüência (Balasz e Delinger, 1993 ref. cit.). Embora um dado produto de HA apresente uma faixa limitada de peso molecular tipicamente baixo, médio ou alto, nenhum produto foi desenhado para prover um complemento de composição que mimetize as necessidades da articulação do joelho osteoartrítica ativa em relação ao módulo elástico e viscoso do fluido sinovial. Além disto, a viscosidade e a viscoelasticidade são reconhecidas como sendo ambas úteis na terapia por visco- suplementação das doenças articulares, mas não necessariamente a mesma amostra de HA apresenta ambas estas características juntas adaptadas para a visco- suplementação, de tal forma que é imprevisível qual o peso molecular médio ponderai pode ser preferível para o tratamento da doença articular. 0 mesmo problema ocorre também em distúrbios dos tecidos moles, tais como ligamentos, de tal forma que também nestes casos um equilíbrio correto entre a viscosidade e as propriedades viscoelásticas é necessário.

Desta forma, a questão de qual é o tipo mais apropriado de ácido hialurônico no que diz respeito ao peso molecular e particularmente a suas propriedades físicas resultantes para estes tratamentos é ainda uma questão aberta e a necessidade por uma preparação de ácido hialurônico apresentando viscosidade correta e viscoelasticidade adequada, independentemente de seu peso molecular médio ponderai, ainda permanece não resolvida.

Sumário

A presente invenção provê misturas de amostras de ácido hialurônico que apresentam diferentes características no que diz respeito à viscosidade e/ou viscoelasticidade e principalmente pesos moleculares diferentes e tendo estas misturas de HA demonstrado um equilíbrio correto entre o módulo viscoso e o módulo viscoelástico para sua utilização, em particular, no tratamento de doenças articulares.

Desta forma, um primeiro objetivo da presente invenção é prover misturas binárias de duas amostras de ácido hialurônico na forma de sal, onde as características reológicas das ditas misturas binárias a uma concentração de 10 mg/ml em solução aquosa e a uma temperatura de 250C são:

- uma viscosidade de fluxo com um valor de pelo menos 5 Pa/sec à taxa de cisalhamento de 1 segundo,

— uma viscoelasticidade por reologia dinâmica com G' de pelo menos 7,5 Pa e G'' de pelo menos 7 Pa a 1 Hz,

e onde as ditas duas amostras de ácido hialurônico apresentam:

a) a primeira amostra um peso molecular médio ponderai abaixo de 1.000.000 Da;

b) a segunda amostra um peso molecular médio ponderai acima de 1.500.000 Da.

As misturas binárias de amostras de ácido hialurônico da invenção são adequadas para restaurar a elasticidade de fluido sinovial e a lubrificação biológica, desta forma um objeto adicional da presente invenção provê sua utilização para o tratamento de doenças articulares inflamatórias e/ou traumáticas ou como adjuvante em artroscopia por aplicação intra-articular e para distúrbios dos tecidos moles por aplicação extra-articular.

Estes e outros objetos da presente invenção bem como suas características e vantagens serão melhor compreendidas a partir da descrição detalhada apresentada abaixo.

Breve descrição dos desenhos

A Figure 1 mostra a reologia dinâmica G'/G'' para um ácido hialurônico de baixo peso molecular médio ponderai (LMHA o,• ) , um ácido hialurônico de peso molecular médio ponderai alto (HMHA ■, □) e a mistura destes LMHA:HMHA (□, □ ) em uma proporção em peso de 80:20. Fica claro que a transição G'=G'' é trocada para freqüência mais baixa e aumenta o comportamento elástico da solução de LMHA na presença de HMHA.

A Figure 2 mostra a influência da composição da mistura sobre a viscosidade do complexo como função da freqüência de um ácido hialurônico de baixo peso molecular médio ponderai (LMHA □), um ácido hialurônico de alto peso molecular médio ponderai (HMHA ), as misturas destes LMHA:HMHA em uma proporção em peso de 80:20 (O) e de 60:40 (□) ·

A Figure 3 mostra a reologia dinâmica para um ácido hialurônico de baixo peso molecular médio ponderai (LMHA o, o) , um ácido hialurônico de alto peso molecular médio ponderai (HMHA □, ■) e a mistura destes LMHA:HMHA em uma proporção em peso de 50:50 (□, □) . Fica claro que a transição G'=G'' aparece na freqüência baixa e aumenta o comportamento elástico da solução da solução de LMHA pela adição de HMHA.

A Figure 4 mostra a influência da composição da mistura sobre a viscosidade do complexo como função da freqüência de um ácido hialurônico de baixo peso molecular médio ponderai (LMHA □) , um ácido hialurônico de alto peso molecular médio ponderai (HMHA ■) e a mistura destes LMHA:HMHA em uma proporção em peso de 50:50 (□).

A Figure 5 mostra a viscosidade de fluxo de um ácido hialurônico de baixo peso molecular médio ponderai (LMHA o) , vim ácido hialurônico de alto peso molecular médio ponderai (HMHA ·) e a mistura destes LMHA: HMHA em uma proporção em peso de 50:50 (□) como função da taxa de cisalhamento.

Descrição detalhada da invenção

As características e vantagens da invenção ficarão claras na descrição a seguir e a partir das realizações preferidas que são fornecidas como ilustração sem propósitos de limitação. Implementação ou adaptações adicionais, bem como realizações prontamente óbvias aos especialistas na técnica devem ser consideradas dentro do escopo da presente invenção.

A presente invenção possibilita a superação das desvantagens existentes nas preparações de ácido hialurônico para o tratamento de doenças articulares por meio de misturas binárias de amostras de ácido hialurônico, onde uma amostra de HA das ditas misturas confere propriedades de lubrificação biológica e a segunda, elasticidade do fluido sinovial.

Conforme anteriormente mencionado, amostras de HA, apresentando pesos moleculares a partir de 500.000 a 6 χ 10"6 Da, são empregadas há muito por sua viscosidade e/ou viscoelasticidade em terapia de visco-suplementação de doenças articulares. Entretanto, o equilíbrio correto entre a contribuição viscosa para a lubrificação da articulação e a viscoelasticidade para o movimento dinâmico desta não é realizado de maneira adequada. De fato, é bem conhecido que, embora amostras de HA apresentando peso molecular baixo exibam um comportamento viscoso prevalecente, as amostras de HA apresentando peso molecular mais alto exibem um comportamento viscoelástico prevalecente. Outras características técnicas, tais como concentração polimérica, grau de reticulação, podem contribuir para aumentar a performance reológica, bem como o peso molecular requerido.

Os Depositantes observaram agora que a mistura de duas amostras de HA apresentando diferentes pesos moleculares médios ponderais e então diferentes perfis de viscosidade/viscoelásticos em solução aquosa, as misturas binárias resultantes apresentam um equilíbrio entre o módulo viscoso e o módulo viscoelástico adaptado para a visco-suplementação no tratamento de doença articular ou distúrbios do tecido mole, sendo a viscosidade essencial para a lubrificação biológica e a propriedade viscoelástica essencial para o movimento dinâmico da articulação. Por esta razão, composições de graus farmacêutico de misturas binárias de ácido hialurônico da invenção são particularmente úteis para aplicação intra-articular em doenças articulares inflamatórias e/ou traumáticas ou na aplicação extra-articular em distúrbios de tecido mole, solucionando o problema mencionado acima quanto a viscosidade e viscoelasticidade combinando as características corretas no que diz respeito ao comportamento viscoso e viscoelástico no mesmo produto.

De maneira a preencher o propósito da presente invenção, as misturas de ácido hialurônico são misturas binárias a uma concentração de 10 mg/ml em solução aquosa e a uma temperatura de 25°C, apresentando:

- uma viscosidade de fluxo com um valor de pelo menos 5 Pa/segundo a uma taxa de cisalhamento de 1 segundo, - uma viscoelastiçidade por reologia dinâmica com G' de pelo menos 7,5 Pa e G'' de pelo menos 7 Pa a 1 Hz,

e preferivelmente

- uma viscosidade de fluxo com um valor em uma faixa compreendida entre 5 e 25 Pa/segundo a uma taxa de cisalhamento de 1 segundo,

- uma viscoelasticidade por reologia dinâmica com G' em uma faixa compreendida entre 7,5 e 30 Pa e G'' em uma faixa compreendida entre 7 e 20 Pa a 1 Hz.

As características reológicas mais preferidas das ditas misturas binárias estão em uma concentração de 10 mg/ml e a uma temperatura de 25°C:

- uma viscosidade de fluxo com um valor em uma faixa compreendida entre 10 e 15 Pa/segundos a uma taxa de cisalhamento de 1 segundo,

- uma viscoelasticidade por reologia dinâmica com G' em uma faixa compreendida entre 10 e 15 Pa e G'' em uma faixa compreendida entre 7 e 10 Pa a 1 Hz.

Em uma realização da presente invenção, as misturas binárias de HA são obteníveis com amostras de ácido hialurônico apresentando diferentes pesos moleculares médios ponderais.

Em particular, a amostra de HA, apresentando um peso molecular médio ponderai mais baixo, apresenta um peso molecular médio ponderai abaixo de 1.000.000 Da (LMHA) e pref erivelmente em uma faixa de peso molecular médio ponderai compreendida entre 300.000 e 1.000.000 Da e mais preferivelmente de 500.000 - 900.000 Da. Geralmente, nestas faixas de peso molecular as amostras de ácido hialurônico apresentam respectivamente uma viscosidade em torno de 1 Pa.s a 0,ls-1 e um módulo elástico G'-IPa, menor que G'' a 1 Hz.

A segunda amostra de HA, apresentando peso molecular médio ponderai mais alto, apresenta um peso molecular médio ponderai não menor que 1.500.000 Da (HMHA) e preferivelmente em uma faixa compreendida entre 1.500.000 até 6.000.000 Da e preferivelmente entre 1.800.000 e 3.500.000 Da de peso molecular médio ponderai. Geralmente, nestas faixas de peso molecular as amostras de ácido hialurônico apresentam respectivamente uma viscosidade maior ou igual a 70 Pa*s a 0,31s_1 e um módulo viscoelástico G' maior que 65 Pa.

As misturas binárias de HA, apresentando as características reológicas em termos de viscosidade de fluxo e viscoelasticidade por reologia dinâmica adequadas para atender o propósito da invenção, podem ser obtidas com as duas amostras de HA mencionadas acima em proporções em peso adequadas entre elas.

É uma das realizações preferidas da invenção uma mistura binária compreendendo duas amostras de ácido hialurônico na forma de sais, onde as características reológicas da dita mistura binária estão a uma concentração de 10 mg/ml em solução aquosa e a uma temperatura de 25°C:

- lima viscoelasticidade por reologia dinâmica com G' em uma faixa compreendida entre 7,5 e 30 Pa e G'' de 7 a 20 Pa a 1 Hz, e onde as ditas duas amostras de ácido hialurônico apresentam:

a) a primeira amostra um peso molecular médio ponderai em uma faixa compreendida entre 300.000 até 1.000.000 Da,

b) a segunda amostra um peso molecular médio ponderai em uma faixa compreendida entre 1.500.000 até 6.000.000 Da,

sendo a dita mistura binária obtenivel pela mistura da amostra de ácido hialurônico na forma de sal a) e amostra de ácido hialurônico na forma de sal b) em proporções em peso em faixas compreendidas entre 80:20 e 20:80.

Outras proporções em peso preferidas da amostra de ácido hialurônico (a) e amostra de ácido hialurônico (b) estão em faixas compreendidas entre 40:60 e 60:40 e mais preferivelmente a proporção em peso é de 50:50.

Para os propósitos da invenção, as amostras de HA utilizadas para a preparação das misturas binárias são preferivelmente, mas não exclusivamente, são de ácido hialurônicos lineares, enquanto que seus sais são sais de metais alcalinos e preferivelmente de Na ou K.

Para aplicação intra-articular em doenças articulares inflamatórias e/ou traumáticas ou para aplicação extra- articular em distúrbios do tecido mole, as composições das misturas binárias de ácido hialurônico da invenção podem ser composições de grau farmacêutico em associação com diluentes e excipientes aceitáveis para o uso previsto, preferivelmente um meio tamponado e de solvatação onde o ácido hialurônico está em uma concentração de 10 mg/ml a 20 mg/ml. Em uma realização preferida o ácido hialurônico está em uma concentração de 10 mg/ml ou 20 mg/ml. Preferivelmente os diluentes são meios tamponados de solvatação a pH fisiológico com uma osmolaridade adequada.

A parte experimental fornecida aqui consiste em uma caracterização das propriedades físicas (isto é, reologia) das amostras de HA selecionadas comercialmente disponíveis e de suas misturas binárias (parte A) e em um estudo clínico em pacientes com osteoartrite realizado com produtos farmacêuticos de HA também comercialmente disponíveis e empregados para questões de regulamentação (parte B.

De maneira a se caracterizar e avaliar o comportamento reológico das misturas de ácido hialurônico da invenção nos experimentos realizados, a resposta ao esforço é determinada e a contribuição elástica é determinada ao mesmo tempo que a contribuição viscosa como função da pulsação (rad/s) ou freqüência (Hz) (ω).

De fato, a viscosidade intrínseca pode ser obtida à taxa zero de cisalhamento e concentração zero do polímero e é bem conhecido que existe uma relação empírica entre a viscosidade intrínseca em um dado solvente e uma dada temperatura e o peso molecular (relação de Mark-Houwink [η] (ml/g)= 0,0336M°'79 para HA em NaCl 0,15M). Além disto, a viscosidade de uma solução depende também diretamente desta viscosidade intrínseca e da concentração do polímero a taxa de cisalhamento baixa. Em uma dada concentração de polímero crítica (dependendo destes dois fatores), as cadeias se sobrepõem e se obtém um comportamento não newtoniano em experimento de. Desta forma, a característica técnica mais importante para se avaliar uma solução de polímero, e em particular para soluções do ácido hialurônico, é a viscoelasticidade que caracteriza a solução do polímero (obtida em experimentos reológicos dinâmicos em que a freqüência ou pulsação impostas para o esforço aplicado sobre as soluções variam quando as condições lineares são respeitadas).

PARTE EXPERIMENTAL

PARTE A: Comportamento reológico das misturas binárias de HA

Materiais e métodos. Para o estudo, diferentes amostras de ácido hialurônico foram empregadas: amostra ARD (lote n° 03167) produzida por ARD apresentando um PM declarado pelo produtor de IO6 (amostra 1); amostra HyluMed (Genzyme, lote 690113) apresentando um PM conforme declarado pelo produtor de 2,59 χ IO6 (amostra 2); Hylan GF2 0 ou Synvisc (Genzyme) contendo 2 0% de HA reticulado e 80% de HA linear HA apresentando um PM conforme declarado pelo produtor de 6 χ IO6 (amostra 3); Suplasyn (Bioniche) um HA linear de fonte bacteriana apresentando um PM conforme declarado pelo produtor de 500.000 - 1.000.000 Da (amostra 4) ; misturas das amostras ARD e HyluMed de 80/20 (amostra 5) ; misturas de 60/40 (amostra 6) ; misturas de Hylan GF20 ou Synvisc e Suplasyn de 50:50 (amostra 7).

A vi s cos idade das amostras de HA, não sendo declaradas pelos produtores, foram medidas em determinadas condições de temperatura, solvente, taxa de cisalhamento.

Nestas amostras a concentração de 10 mg/ml em NaCl 0,15M em solução aquosa a temperaturas de 25°C, o comportamento reológico foi analisado com um reômetro TA Instrument equipado com uma geometria plano-cônica; o cone tinha 4 cm de diâmetro e ângulo de 3,59 graus. Este equipamento permite a realização de: (1) experimento de fluxo (determinação da viscosidade em Pa.s como função da taxa de cisalhamento expressa em s"1) e (2) experimentos dinâmicos, determinado o módulo de armazenamento (G') e o módulo de perda (G'') expressos in Pa. Como função da freqüência de deformação (ω em Herz); G' representa o comportamento elástico da solução sob esforço (caráter semelhante a sólido) e G'' , o caráter viscoso. Para uma solução viscoelástica, se tem G''>G' a baixa freqüência então G' e G' ' se cruzam a CDo e G' se torna maior que G' ' em freqüência alta. A viscosidade complexa |η*| (em Pa.s) é também calculada e combina G' e G'. De maneira a restaurar a viscoelasticidade do fluido sinovial, é necessário se preparar uma solução apresentando ω0 menor que 0,5 Hz (correspondendo à freqüência de passo tal como dada por Balazs (Balazs E.A., Gibbs D.A. nThe rheological properties and function of ácido hialurônico. In Chemistry e molecular biology of the intracellular matrix", , edit. Balazs E.A., Academic Press, Londres e NY, 1970, 1241-1254)) .

Foi utilizada cromatografia por exclusão estérica (Waters GPCV Alliance 2000) equipada com 3 detectores em linha (refratômetro, viscosímetro Wyatt MALLS de dispersão luminosa,) para se determinar na ausência de calibração o peso molecular médio ponderai e toda a distribuição de peso molecular, sendo esta a única técnica válida para se determinar o peso molecular no opinião dos inventores. As amostras foram preparadas a 0,5 g/L em eluente NaNC>3 0,1M e filtradas através de uma membrana (poro de 0,2 micrômetros) antes da injeção de 108 microlitros. Diferentes misturas podem ser preparadas pela mistura de uma quantidade controlada de cada uma das amostras de HA de forma a preservar a concentração total de polímero a 10 g/L. HMHA impõe a posição de CO0 a um valor relativamente baixo a um valor crítico de 0,5 Hz; LMHA permite se preservar a quantidade total de HA na injeção, mas também supõe-se interaja melhor com a cartilagem para formar uma zona de interface rica em HA.

Os resultados obtidos são mostrados na tabela 1 para as amostras ARD e Genzymes e as misturas binárias destas e na tabela 2 para as amostras Synvisc e Suplasyn e misturas destas empregadas no ensaio clínico descrito acima.

Tabela 1. Influência da mistura sobre as propriedades. Solução 10 g/L em NaCl 0,15M, T = 25°C. (ARD LMHA/Genzyme HMHA)

<table>table see original document page 19</column></row><table> Os mesmos resultados são mostrados nas figs. 1-2. Na figura 1, é mostrado que a amostra Genzyme é muito viscoelástica enquanto que a amostra ARD é menos emaranhada. A freqüência a>o para a transição em G', G'' é localizada em um valor muito maior para ARD (3,7 Hz > 0,064 Hz para Genzyme), no entanto no mesmo valor de módulo G' = 20 Pa. Na figura 2, a viscosidade complexa como função da taxa de cisalhamento é dada para a mesma solução; mostra a redução normal com a taxa de cisalhamento crescente para soluções emaranhadas viscoelásticas.

Tabela 2. Influência da mistura sobre propriedades. Solução 10 g/L em NaCl 0,15M, T = 25°C. (Synvisc HMHA/Suplasyn LMHA)

<table>table see original document page 20</column></row><table>

Os mesmos resultados são mostrados nas figs. 3-5. Na figura 3, os módulos dinâmicos são dados para as soluções iniciais e para a mistura 50/50% a 10 g/L. Synvisc é elástica em todos os domínios de freqüências cobertos; Suplasyn é principalmente viscosa em relação ao peso molecular relativamente baixo sem ponto de cruzamento dos módulos. A mistura 50/50% apresenta um comportamento muito interessante, sendo principalmente elástica em uma faixa de freqüências ampla com um ponto de cruzamento a COo = 0,075 Hz muito mais baixo que a freqüência de passo de 0,5Hz. Nas figuras 4 e 5, a viscosidade complexa |η*| e a viscosidade η são dadas como função da taxa de cisalhamento. Suplasyn mostra um platô newtoniano devido ao seu peso molecular relativamente baixo.

PARTE B: Misturas (binárias) de ácido híalurônico intra-articulares em pacientes com osteoartrite do joelho.

Com o propósito de se estabelecer a vantagem das misturas de HA da invenção no que diz respeito aos vários produtos variando de peso molecular mais baixo a mais alto utilizados na presente invenção sem qualquer diferença clara na eficácia, foi conduzido um estudo clinico em pacientes com osteoartrite do joelho.

Método. Vinte e três pacientes (idade de 68 ± 8anos; com duração média dos sintomas de 7,4 ± 4,1 anos) selecionados para tratamento de osteoartrite do joelho, os quais não eram novos em terapia intra-articular com ácido hialurônico e atendiam aos critérios de participação incluindo escala visual analógica de dor (VAS) em repouso > 45 mm, confirmação radiográfica de osteoartrite de joelho unilateral de grau 1-3 e concordância em receber terapia intra-articular com ácido hialurônico com uma faixa única ou combinada de peso molecular, foram inscritos em um grupo naturalístico randomizado, prospectivo, simples-cego acompanhado por um estudo de 12 semanas. Os pacientes foram selecionados randomicamente no inicio para receberem uma série de injeções intra-articulares com um entre Suplasyn (10 mg/ml; 2 ml/injeção, PM 500000-1000000 Da a seguir identificado como LMW) , Synvisc (8 mg ± 2/1 mL; 2 ml/injeção, PM 6 milhões Da a seguir identificado como HMW), ou Suplasyn-Synvisc combinados (15 mg/1,5 mL + 12 mg ± 3/1,5 ml; 3 ml/injeção a seguir identificado como L-HMW) durante 3 semanas. Os pacientes foram liberados para utilizar medicações concomitantes ou fisioterapia à sua escolha.

Os pacientes completaram o acesso à linha de base de dor VAS em repouso e andando (variável primária de eficácia), a coleta de uma classificação de satisfação global categórica de 5 pontos e o registro de eventos adversos e uso da modalidade terapêutica concomitante em cada visita do estudo e uma semana após a última injeção.

Os pacientes foram instruídos para retornar para medidas repetidas incluindo eventos adversos em 12 semanas.

Resultados. Os pacientes foram randomizados em um dos três grupos [LMW = 9; HMW = 6; L-HMW = 8]. Não foram observadas diferenças entre os grupos na demografia da linha de base, grau de sintomas de osteoartrite, antes da utilização ou do produto de PM mais baixo ou do produto de PM mais alto ou resultados da linha de base de eficácia. Dois indivíduos (LMW; L-HMW) deixaram o estudo por razões não relacionadas com o estudo. Nas semanas 4 e 12, não ocorreram quaisquer diferenças entre os grupos em eventos adversos (total < 1,3%) limitados a dor e inchação local. Nas semanas 4 e 12, respectivamente, a alteração na dor de andamento VAS foi significativamente aumentada em relação à linha de base em todos os três grupos: LMW (81,3%, ρ < 0,001; 63,6%, ρ < 0,001); HMW (78,1%, ρ < 0,001; 59,1%, ρ < 0,001) e L-HMW (mistura 50/50) (89,3%, ρ < 0,001; 79,6%, ρ < 0,001). Os pacientes no grupo L-HMW apresentaram um aumento significativamente maior tanto na semana 4 quanto na semana 12 (p < 0,007) em comparação com os outros grupos que não diferiram entre si. Similarmente, a dor em repouso VAS foi significativamente reduzida em todos os 3 grupos a em relação à linha de base nas semanas 4 e 12, entretanto, não houve diferenças significativas entre os grupos. A utilização de modalidades terapêuticas concomitantes em 4 semanas não foi diferente ente os grupos, entretanto, significativamente mais pacientes LMW utilizaram modalidades terapêuticas concomitantes em 12 semanas em comparação com os outros 2 grupos (p < 0,05). A satisfação global foi significativamente mais alta para o grupo L-HMW em comparação com os outros grupos em 12 semanas (p < 0,005).

Conclusões. Injeções intra-articulares de ácido hialurônico utilizando PM baixo, alto ou combinado foram altamente efetivas em melhorar a dor em repouso e ainda mais em andamento em pacientes com osteoartrite do joelho. Melhora maior tanto nos resultados em repouso quanto em atividade em pacientes que receberam o grupo L-HMW combinado, com satisfação do paciente maior concomitante e a utilização por poucos das modalidades terapêuticas concomitantes em 12 semanas sugere que a combinação de uma faixa de PM de ácido hialurônico pode ser vantajosa, particularmente entre pacientes ativos com osteoartrite.

Desta forma, as misturas binárias da presente invenção podem ser úteis administradas por aplicação intra- articular para o tratamento de condições patológicas específicas das articulações e em particular de doenças articulares traumáticas e/ou inflamatórias selecionadas do grupo consistindo em osteoartrite, artrose, bem como em tratamento adjuvante durante artroscopia para várias indicações incluindo ruptura do menisco. Uma outra aplicação das misturas de HA da invenção é a aplicação extra-articular em distúrbios dos tecidos moles tais como ligamentos, tais distúrbios sendo principalmente luxação, distensão e trauma.

As misturas binárias de HA, de acordo com sua utilização na visco-suplementação de fluido sinovial e condroproteção da cartilagem matriz, podem ser administradas via administração intra-articular em composições farmacêuticas em combinação com excipientes, dispersantes e diluentes compatíveis com o uso farmacêutico previsto conhecido ou mesmo novo tal como de conhecimento de um especialista na técnica. Em uma realização, as misturas da invenção podem ser dissolvíveis ou dissolvidas em soluções aquosas isotônicas fisiológicas, preferivelmente solução salina, não excluindo, no entanto, soluções isotônicas aquosas não eletrolíticas. As dosagens são dependentes da gravidade da patologia, bem como do estado do paciente (idade, peso corporal, condição geral de saúde). Para propósitos ilustrativos, mas não limitativos, as dosagens das misturas de acordo com a invenção podem variar entre 10 e 20 mg/ml, volume de injeção de 2 a 6 ml em administração única ou semanal por um período variando de 1 a 3 semanas.

Claims

1. Mistura binária compreendendo duas amostras de ácido hialurônico na forma de sal, caracterizada pelo fato das características reológicas da dita mistura binária a xima concentração de 10 mg/ml em solução aquosa e a uma temperatura de 259C serem: - uma viscosidade de fluxo com um valor de pelo menos Pa/segundo a uma taxa de cisalhamento de 1 segundo; - uma viscoelasticidade por reologia dinâmica com G' de pelo menos 7,5 Pa e G'' de pelo menos 7,0 Pa a 1 Hz; e onde as ditas amostras de ácido hialurônico contêm: a) a primeira amostra um peso molecular médio ponderai abaixo de 1.000.000 Da; b) a segunda amostra um peso molecular médio ponderai acima de 1.500.000 Da.

2. Mistura binária de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato das características reológicas a uma concentração de 10 mg/ml em solução aquosa e a uma temperatura de 25fiC serem: - uma viscosidade de fluxo com um valor em uma faixa compreendida entre 5 e 2 5 Pa/segundo a uma taxa de cisalhamento de 1 segundo; - uma viscoelasticidade por reologia dinâmica com G' em uma faixa compreendida entre 7,5 e 30 Pa e G'' em uma faixa compreendida entre 7,0 e 20 Pa a 1 Hz.

3. Mistura binária de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato das características reológicas a uma concentração de 10 mg/ml em solução aquosa e a uma temperatura de 252C serem: - uma viscosidade de fluxo com um valor em uma faixa compreendida entre 10 e 15 Pa/segundo a uma taxa de cisalhamento de 1 segundo; - uma viscoelasticidade por reologia dinâmica com G' em uma faixa compreendida entre 10 e 15 Pa e G'' em uma faixa compreendida entre 7,0 e 10 Pa a 1 Hz.

4. Mistura binária de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato das ditas amostras de ácido hialurônico conterem: a) a primeira amostra um peso molecular médio ponderai em uma faixa compreendida entre 3 00.000 até 1.000.000 Da; b) a segunda amostra um peso molecular médio ponderai em uma faixa compreendida entre 1.500.000 até 6.000.000 Da.

5. Mistura binária de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato das ditas amostras de ácido hialurônico conterem: a) a primeira amostra um peso molecular médio ponderai em uma faixa compreendida entre 500.000 até 900.000 Da; b) a segunda amostra um peso molecular médio ponderai em uma faixa compreendida entre 1.800.000 até 3.500.000 Da.

6. Mistura binária de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato do ácido hialurônico na forma da amostra de sal (a) e o ácido hialurônico na forma da amostra de sal (b) estarem em proporções em peso em faixas compreendidas entre 80:20 e 20:80.

7. Mistura binária de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato da amostra de ácido hialurônico (a) e a amostra de ácido hialurônico (b) estarem em proporções em peso em faixas compreendidas entre 40:60 e 60:40.

8. Mistura binária de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato da amostra de ácido hialurônico (a) e a amostra de ácido hialurônico (b) estarem em uma proporção em peso de 50:50.

9. Mistura binária compreendendo duas amostras de ácido hialurônico na forma de sal, caracterizada pelo fato das características reológicas da dita mistura binária a uma concentração de 10 mg/ml em solução aquosa e a uma temperatura de 252C serem: - uma viscosidade de fluxo com um valor em uma faixa compreendida entre 5 e 25 Pa/segundo a uma taxa de cisalhamento de 1 segundo; - uma viscoelasticidade por reologia dinâmica com G' em uma faixa compreendida entre 7,5 e 30 Pa e G'' em uma faixa compreendida entre 7,0 e 2Q Pa a 1 Hz; e onde as ditas amostras de ácido hialurônico contêm: a) a primeira amostra um peso molecular médio ponderai em uma faixa compreendida entre 300.000 até -1.000.000 Da; b) a segunda amostra um peso molecular médio ponderai em uma faixa compreendida entre 1.500.000 até 6.000.000 Da; sendo a dita mistura binária obtenível por mistura do ácido hialurônico na forma da amostra do sal (a) e ácido hialurônico na forma de amostra do sal (b) em proporções em peso em faixas compreendidas ente 80:20 e 20:80.

10. Mistura binária de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato das ditas duas amostras de ácido hialurônico conterem: a) a primeira amostra um peso molecular médio ponderai em uma faixa compreendida entre 500.000 até -900.000 Da; b) a segunda amostra um peso molecular médio ponderai em uma faixa compreendida entre 1.800.000 até 3.500.000 Da.

11. Mistura binária de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato da amostra de ácido hialurônico (a) e a amostra de ácido hialurônico (b) estarem em proporções em peso em faixas compreendidas entre 40:60 e 60:40.

12. Mistura binária de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato da amostra de ácido hialurônico (a) e a amostra de ácido hialurônico (b) estarem em uma proporção em peso de 50:50.

13. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de ser preparada com diluentes ou excipientes adequados e misturas binárias de duas amostras de ácido hialurônico na forma de sal conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

14. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato das misturas binárias de duas amostras de ácido hialurônico na forma de sal estarem em uma concentração na faixa compreendida entre -10 e 20 mg/ml.

15. Uso das misturas binárias de duas amostras de ácido hialurônico na forma de sal conforme definidas em qualquer uma das reivindicações precedentes de 1 a 12, caracterizado pelo fato de ser na preparação de composições farmacêuticas para o tratamento de doenças articulares inflamatórias e/ou traumáticas por aplicação intra- articular.

16. Uso das misturas binárias de duas amostras de ácido hialurônico na forma de sal conforme definidas em qualquer uma das reivindicações precedentes de 1 a 12, caracterizado pelo fato de ser na preparação de composições farmacêuticas para tratamento adjuvante durante artroscopia por aplicação intra-articular.

17. Uso das misturas binárias de duas amostras de ácido hialurônico na forma de sal de acordo com as reivindicações 15 e 16, caracterizado pelo fato das ditas doenças articulares inflamatórias e/ou traumáticas serem selecionadas do grupo consistindo em osteoartrite, artrose ou ruptura do menisco.

18. Uso das misturas binárias de duas amostras de ácido hialurônico na forma de sal conforme definidas em qualquer uma das reivindicações precedentes de 1 a 12, caracterizado pelo fato de ser na preparação de composições farmacêuticas para aplicação extra-articular em distúrbios dos tecidos moles.

19. Uso das misturas binárias de duas amostras de ácido hialurônico na forma de sal de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato dos ditos distúrbios serem selecionadas do grupo consistindo em luxação, distensão e trauma.