KR20110017826A

KR20110017826A - 염증성 장질환 치료 및 예방을 위한 히알루론산 혼합물

Info

Publication number: KR20110017826A
Application number: KR1020100077176A
Authority: KR
Inventors: 트성-청 우
Original assignee: 홀리스톤 헬스케어 코포레이션 리미티드
Priority date: 2009-08-14
Filing date: 2010-08-11
Publication date: 2011-02-22
Also published as: EP3842046A1; EP2292243A1; BRPI1004418A2; AU2010212350A1; TWI516269B; KR101476802B1; AU2010212350B2; JP2011037853A; JP5636225B2; TW201105340A

Abstract

본 발명은 다른 분자량, 수양액으로서 다른 레올로지, 조직 지지체, 인슈레이션 및 분해 성질을 가진 히알루론산의 혼합물을 가진 히알루론산 형성체에 관한 것으로서, 히알루론산 혼합물은 궤양성 대장염, 크론병과 같은 IBD(inflammatory bowel disease)의 치료 및 예방에 있어 점착, 조직 지지체, 인슈레이션 및 치료 시간 사이에 적합한 균형을 나타내고, 따라서 본 발명의 형성체는 십이지장, 소화성 궤양 및 출혈에 매우 유용한 치료 및 예방에 빠르고 지속적인 효과를 나타낸다.

Description

염증성 장질환 치료 및 예방을 위한 히알루론산 혼합물{MIXTURE OF HYALURONIC ACID FOR TREATING AND PREVENTING INFLAMMATORY BOWEL DISEASE}

본 발명은 염증성 장질환(IBD) 치료 및 예방을 위한 히알루론산 혼합물에 관한 것이다. 보다 상세히는 본 발명은 적어도 2 또는 2 이상의 다른 평균 히알루론산 분자량(Mw)으로 구성된 혼합물과, 궤양성 대장염, 크론병, 또는 장과 위에서 상처를 포함하는 IBD(염증성 장질환) 치료 및 예방을 위하여 적절한 점도 성질, 조직 지지체와 인슈레이션, 치료 기간 기능을 가진 히알루론산을 얻도록 다른 레올로지(rheology)를 가진 히알루론산에 관한 것이며, 신속한 치료와 효과 지속을 달성할 수 있다.

히알루론안(hyaluronan), 히알루로네이트(hyaluronate), 소듐 히알루로네이트 그리고 HA 로 일반적으로 칭해지는 히알루론산은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-클루쿠론산 부분(glucuronic acid moiety)을 포함하는 내추럴 글리코사미노글리칸(natural glycosaminoglycan)이다.

나트륨 형태의 히알루론산 고분자는 50년 이상 동안 존재한 혼합물이다. 메이어 앤 애트 알(Meyer and et al) 저, J. Biol Chem. 107,629(1934)를 참조하면, 히알루론산은 본질적으로 β1-3 글리쿠로닉산(glycuronic acid)과 β 1-글리코사민(glycosamine)를 선택적으로 가진 고점도 글리코사민을 함유하고, 고점도 글리코사민의 Mw는 50,000 달톤(Da)과 몇백만 달톤 사이이다.

포유동물 몸체의 소프트 결합조직에서 히알루론산을 발견할 수 있고, 피부, 눈의 유리액, 관절액, 탯줄 및 연골 조직은 더 큰 부피의 히알루론산을 함유한다.

히알루론산은 신축성을 가진 체액이며, 교원섬유(collagenous fiber)와 세포 사이에 충진되고, 표피조직 위로 카바되며, 콜라겐 네트워크가 기계적 손상을 받지 않도록 그리고 안정되도록 정규 T 세포를 운송하기 위하여 플랫폼을 제공하여 세포에 윤활과 보호를 하게 한다. 히알루론산은 윤활 특징과 높은 충격 흡수로 인하여 관절막(Synovial Membrane)의 표면상에 그리고 건초(tendon sheath)와 건(tendon)에서 윤활제이고, 조직 레올로지 메카닉스, 모션 및 세포 증식(Delpech,B.,Girard,N., Bertrand,P., Courel, M.-N., Chauzy,C., Delpech,A.,1997. Hyaluronan:fundamental principles and applications in cancer. J.Intern.Med.242,41-48, Rooney,P., Kumar,S., Ponting,J., Wang,M.,1995. The role of hyaluronan in tumour neovascularization. Int.J.Cancer 60,632-36, Entwistle J, Hall CL, Turley EA Receptors: regulators of signaling to the cytoskeleton. J Cell Biochem 1996;61:569-77 참조)에 유용하며, 그리고 소정의 세포의 표면상에 수용체 특히 CD44의 주요 수용체 신호전달(receptor interaction)을 한다. CD44의 일반 기능은 활성화 림프구의 마크로서 넓게 인식된다(Teder P, Vandivier RW, Jiang D, Liang J, Crohn L, Pure E, Henson PM, Noble PW. Resolution of lung inflammation by CD44. Science 2002; 296; 155-158, Sheehan KM, DeLott LB, Day SM, DeHeer DH, Hyalgan has a dose-dependent differential effect on macrophage proliferation and cell death. J Orthop Res 2003;21:744-51 참조).

히알루론산은 세포외기질의 조직 및 변형으로 인하여 생성과 필링의 능력을 가지고, 나이와 빛으로 피부 노후화를 억제하도록 소프트 조직을 채우는데 널리 적용되고, 얼굴에 지질 신진대사의 장애를 조정할 수 있고, 피부상에 회귀성 상처 또는 상처 형성을 방지하게 된다.

더욱이, 히알루론산은 안구 운동용 보조제로서 적용될 수 있고, 골관절염 환자의 무릎 또는 관절의 운동 동안의 고통을 감소시킨다.

최근에, 히알루론산은 화장품, 동맥 치료, 외과, 피부, 안과 치료에 염화나트륨 형태로 임상 치료에 적용된다. 알카리 금속 이온, 알카리 토류 금속 이온(예를들어 마그네슘 이온), 알루미늄 이온, 암모늄 이온 및 암모늄 이온의 대체용 염형태를 가진 히알루론산은 의약 흡수를 돕는 매개체일 수 있다(벨기에 특허 904,547호 참조). 히알루론산의 중금속염 가운데, 은염류는 살진균제(Mycocide)로서 사용되고, 금염류는 류머티즘성 관절염을 치료하도록 사용된다(월드 특허 WO 87/05517 참조).

주기율표의 제4그룹에서 히알루론산과 금속 이온의 혼합물(착물)에 의해서 욕창과 힙소올(hipsore)을 치료하는 효과, 예를들어 아연 히알루로네이트와 코발트 염은 헝그리 특허 203,372호로 치료 입증되었다.

캐나다 회사인 비오니체(Bioniche)는 미국특허 5,888,986호에서 방광염을 치료하도록 효과적인 농축으로 히알루론산을 사용하는 관련 구조와 방법을 개시하고 있고, 히알루론산의 Mw는 200,000 Da 이상이다. 소정의 Mw을 가진 히알루론산이 적용된 예가 있는데, 그것은 방광염을 치료하도록 650kDa 또는 1,900kDa를 가진 히알루론산을 사용한 것이고, 그러나 히알루론산의 단분자는 신속한 치료와 지속적인 효과에 사용될 수 없다.

캐나다인인 로버트 피터 페트일라(Robert Peter Petrella)의 미국특허출원 2005/0080037(A1)호는 소프트 조직의 반응과 심한 뼈의 삐임을 치료하는데 히알루론산이 사용되는 것을 개시하고 있고, 여기서 히알루론산의 Mw는 90,000 Da에서 120 Da이고, 히알루론산의 단일 분자량은 신속하고 즉각적인 치료와 장기 효과를 달성할 수 없다.

일본 회사인 세이카가쿠 코교는 2008년 4월 4일에 미국특허 7,354,910호를 출원하였고, 명칭은 "염증성 장질환 치료제의 용도"이며, 600kDA와 1,200kDa 사이의 히알루로네이트와 히알루론산이 IBD를 치료하는데 적용되는 것이 알려져 있다. 그러나, 환자에게 주입한 후에 분해가 너무 빨라 오랜 기간 동안 약효과를 유지할 수 없고, 따라서 진료중인 환자에게는 불편하였다.

본 발명은 IBD(염증성 장질환)를 치료하도록 서로 다른 Mw를 가진 조제가능한 염류에 적어도 2 또는 2 이상의 평균 분자량의 히알루론산의 생물학적 활성도를 이용하는데 있다. 저평균분자량 히알루론산(LMWHA)과 고평균분자량 히알루론산(HMWHA)은 다른 점도, 절연율 및 분해 비율을 가지기 때문에, 평균 Mw 가 150만DA 이하이면 LMWHA이고, 150만 DA와 500만 Da 사이이면 HMWHA이다. LMWHA와 HMWHA의 혼합물을 얻고, 그러면 LMWHA는 IBD(예를들어 궤양성 대장염, 급성장염, 만성 장염, 크론병, 또는 장과 위에서 상처)를 치료하기 위하여 염증 표면을 신속히 카바할 수 있고, HMWHA는 장기간의 효력 기간을 달성하도록 분해를 연장시킬 수 있다. 따라서, 빠르고 긴 효과의 치료를 수행하게 한다.

본 발명에 따른 LMWHA와 HMWHA의 히알루론산 혼합물의 일예로서, 히알루론산의 분자량은 고평균분자량 히알루론산(HMWHA)이 150만 내지 350만 Da 사이이고, 바람직하기로는 고평균분자량 히알루론산(HMWHA)의 Mw는 200만 Da이다. 본 발명에 따른 히알루론산의 분자량은 저평균분자량 히알루론산(LMWHA)이 50만 내지 150만 Da 사이이고, 바람직하기로는 저평균분자량 히알루론산(LMWHA)의 Mw는 100만 Da이다.

본 발명에 따른 히알루론산 혼합물은 효과를 지속시키기 위해서 스테로이드, 면역 억제제 또는 염증 치료제와 결합되는 LMWHA와 HMWHA로 구성된다.

본 발명에 따른 히알루론산 혼합물은 알약(예: 장용 알약(Enteric coated tablet)), 좌약(직장 좌약), 관류액(직장 또는 결장용)으로 형성되는 첨가제(예를들어 젤라틴, 콜라겐, 키토산, 콘드로이틴, 카보폴(carbopol), 아가르(agar), 카복시메틸셀룰로오스(Carboxymethyl cellulose(CMC)) 또는 인산완충용액(phosphate buffered saline(PBS)), 또는 이들의 하나 이상 또는 혼합)과 혼합된 주요 활성 성분을 가진 LMWHA와 HMWHA로 구성된다.

LMWHA와 HMWHA로 구성되고 의학적으로 수용가능한 염류로 구성된 본 발명에 따른 히알루론산 혼합물의 농도는 0.5mg/mL 내지 50mg/mL 이고, 바람직한 농도는 0.5mg/mL 내지 5mg/mL 이고, 용액 형태의 농도는 0.05% 내지 5%(w/v)이고 바람직한 농도는 0.05%(w/v) 내지 0.5%(w/v)이다.

본 발명에서 구강 치료 또는 예방 약제의 바람직한 투약은 투여당 적어도 10 내지 1000mg이고, 바람직한 투약은 투여당 10 내지 500 mg 이다.

본 발명은 여러가지 Mw(분자량)을 염류형태로 적어도 2 또는 2 이상의 의학적 수용가능한 히알루론산으로 구성된 히알루론산 혼합물에 적용되며, 여러가지 Mw 가운데 여러가지 분해률은 LMWHA이 낮은 Mw를 가지게 하여 높은 Mw를 가진 HMWHA에 빨리 퍼져서 더 나은 릴리스 효과를 가지도록 분해율을 유지하여 신속한 치료와 효과의 지속을 달성할 수 있다.

여기에서 설명한 것은 본 발명에 따른 염증성 장질환 치료 및 예방을 위한 히알루론산 혼합물을 실시하기 위한 하나의 실시예에 불과한 것으로서, 본 발명은 본 실시예에 한정되지 않고, 이하의 특허청구의 범위에서 청구하는 바와 같이 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변경 실시가 가능한 범위까지 본 발명의 기술적 정신이 있다고 할 것이다.

본 발명에 따른 IBD 치료 및 예방을 위한 히알루론산 혼합물은 저평균분자량 히알루론산(LMWHA)과 고평균분자량 히알루론산(HMWHA)이 혼합된 적어도 2 또는 2이상의 평균 분자량의 히알루론산으로 구성된다. HMWHA와 LMWHA는 리니어 HA(linear HA), 크로스 링크형 HA, 또는 이들 중 적어도 하나가 포함된 결합 형태일 수 있다. 서로 다른 Mw는 다른 레올로지(rheology), 용액에서 조직 지지체와 격리 및 분해의 기능을 가지므로, 히알루론산 혼합물은 보다 나은 점착, 격리 및 조직 지지 기능을 가져서 치료 효과와 분해율의 균형이 이루어지고 IBD(예를들어 궤양성 대장염, 급성장염, 만성 장염, 크론병, 또는 장과 위에서 상처) 치료 및 예방이 이루어지고 더욱이 적절한 치료 효과와 긴 치료 효과를 달성하게 된다.

150만 Da보다 작은 평균 Mw는 LMWHA로 분류되고, 바람직한 LMWHA의 범위는 50만 내지 150만 Da이다. 150만 Da 보다 큰 평균 Mw는 HMWHA로 분류되고, 그 Mw는 150만 Da 내지 500만 Da 범위이다. LMWHA와 HMWHA의 혼합물의 구성으로, LMWHA는 염증 부분을 신속하게 카바하여 IBD를 치료 및 예방하고, HMWHA는 치료 효과를 유지하게 된다. 따라서, 신속한 치료와 지속적인 릴리스 효과를 달성하게 된다.

본 발명에서 적용된 히알루론산의 Mw는 고평균분자량 히알루론산(HMWHA)이 150만 Da와 350만 Da 사이에 있고, 보다 바람직하기로는 200만 Da의 고평균분자량 히알루론산(HMWHA)이다. 본 발명에서 적용된 히알루론산의 Mw는 저평균분자량 히알루론산(LMWHA)이 50만 Da와 150만 Da 사이에 있고, 보다 바람직하기로는 100만 Da의 저평균분자량 히알루론산(LMWHA)이다.

히알루로난의 일반적 화학식 구조는 다음과 같다.

본 발명의 다른 바람직한 실시예는 히알루론산의 LMWHA와 HMWHA가 1:1 혼합으로 제공되고, 그 비율 또는 염 형성은 진료 목적에 따라서 20:80과 80:20 사이의 혼합 비율로 조정할 수 있다. LMWHA의 높은 비율을 가진 히알루론산 혼합물은 치료에서 더 신속하게 될 수 있다; 반대로, HMWHA의 높은 비율은 치료 효과를 지속하기 위한 더 긴 분해 효과를 가질 수 있다.

본 발명의 다른 실시예는 치료 효과를 증대시키기 위해서 스테로이드, 면역억제제 또는 다른 항염증제와 함께 LMWHA와 HMWHA를 포함하는 히알루론산 혼합물을 포함한다.

본 발명의 다른 바람직한 실시예는 LMWHA와 HMWHA를 포함하는 히알루론산 혼합물로서, 주요 활성 성분은 구강 고체 조제 형태(예를들어 장용코팅(enteric coating)), 좌약(직장용 좌약), 관류액(직장용 또는 결장용)을 형성하기 위한 적절한 첨가제를 가진다.

구강 형식(예를들어 장용 알약(Enteric coated tablet))을 위하여, 장용은 위에서 분해 및 소화를 억제하게 하고, 장과 결장에 도달한 후에, 장용은 분해되고 히알루론산은 풀어져서 염증성 결장(오름잘룩창자(Ascending Colon) 또는 가로잘룩창자(Transverse Colon) 위 구역)에서 보호막을 형성하여 염증 부분 치료를 가속시키고 오랜 분해율로 오랜 치료 효과를 유지할 수 있게 된다.

좌약 형식으로서, 히알루론산을 함유하는 좌약은 항문내로 삽입될 수 있고 히알루론산은 직장에서 풀어져서 다른 구역의 결장(예를들어 하행 구역)으로 퍼지고 염증성 결장에서 보호막을 형성하여 염증성 구역의 치료를 가속시키고 지속적인 효과를 달성할 수 있다.

관류(perfusion) 형식(예를들어 관장)으로서, 상기 히알루론산 혼합물은 결장으로 주입되기 위한 소프트 튜브에서 또는 직접 사용되는 첨가제(예를들어 젤라틴, 콜라겐, 키토산, 콘드로이틴, 카보폴(carbopol), 아가르(agar), 카복시메틸셀룰로오스(Carboxymethyl cellulose(CMC)) 또는 인산완충용액(phosphate buffered saline(PBS)), 또는 이들의 하나 이상 또는 혼합)과 혼합된 주요 활성 성분이다. 히알루론산 혼합물은 결장에서 충진되어 다른 결장 구역(예를들어 하행 구역)으로 퍼지게 되어 염증 결장에서 보호막을 형성하여 염증 구역의 치료를 가속화시키고 효력 지속 기간을 연장시킨다.

LMWHA와 HMWHA의 히알루론산 혼합물 비율 또는 의약적으로 수용가능한 염의 바람직한 농도는 0.5mg/ml 내지 5mg/ml 범위이고, 액제에서 바람직한 농도는 0.05% 내지 0.5%(w/v)이다. 농도는 0.5mg/ml 내지 50mg/ml 사이이고, 바람직한 농도는 0.5mg/ml 내지 5mg/ml 이다. 용액은 0.05 내지 5%(w/v)의 농도로 형성됨이 바람직하고, 보다 바람직한 용액의 농도는 0.05 내지 0.5%(w/v)이다. 더욱이, 예방과 개선을 위한 구강 투여로서, 바람직한 복용량은 각각의 투여시마다 적어도 10 내지 500mg 이고, 의약적으로 수용가능한 히알루론산 혼합물의 염은 소듐 히알루로난과 아연 히알루로난이다.

더욱이, 본 발명의 LMWHA와 HMWHA의 Mw는 더 나은 치료 효과를 위하여 스테로이드, 면역 억제제 또는 염증 치료제와 함께 수반될 수 있다.

본 발명에서 히알루론산 혼합물의 효과를 입증하기 위하여, 전문 연구실에서 수행된 동물 테스트의 결과는 다음과 같다:

실시예 1

1-1 요약: 테스트의 목적은 IBD를 가진 동물 몸체에 샘플 IBD98의 효과를 평가하는 것이다. IBD98은 예방 그룹의 생쥐의 직장내로 삽입되고, 트리니트로벤젠설포닉 산(TNBS: trinitrobenzenesulphonic acid)이 장염을 유도하도록 투여되고, 3일 동안 직장을 통하여 샘플 IBD98을 연속적으로 투여한다. IBD를 유도하도록 콘트롤 그룹에 TNBS만 투여한다. 3일 동안 관찰한 후, 모든 생쥐는 4일째에 해부되어 임상 병리적 변화와 약 투여 전과 테스트 마감 후의 혈액 샘플의 인덱스를 검사한다. 결과는 예방그룹과 콘트롤 그룹의 전체 염증 범위의 평균이 3.9cm 와 4.3cm으로 나타내고 이는 큰 차이를 나타내지 못하는 것이다. 예방 그룹과 콘트롤 그룹의 생쥐는 실질 유도된 염증을 나타내는 TNF-α(Tumor Necrosis Factor-alfa)와 IL-1β(Interleukin-1β)의 농도에서 큰 차이를 가진다: 테스트 후에 예방 그룹의 TNF-α의 농도는 콘트롤 그룹 보다 상당히 낮고, 그 차이는 명백하다. 그러나, IL-β의 농도에서 상당한 차이가 없었다. 이 테스트는 이러한 패턴이 동물 몸체에서 IBD를 유도할 수 있고, 임상 병리적 변화에서 큰 차이가 없다. 그러므로, 샘플에서의 효과는 IBD98 샘플을 투여한 후에 회복 상태를 관찰함으로써 평가될 수 있다. 테스트 결과는 예방과 콘트롤 그룹 수행에서 TNF-α에서 상당한 차이가 있다는 것을 보여준다. 그러므로, 결과는 IBD98 샘플은 IBD를 예방하기 위하여 염증 반응을 감소하는데 상당히 효과적이라는 것을 입증한다.

1-2 테스트 절차

A. 테스트 목적 : IBD를 치료하거나 예방하도록 효과를 평가하고 또는 염증을 감소시키도록 TNBS를 가진 생쥐에 IBD를 유도함.

B. 테스트 목표: LMWHA와 HMWHA로 구성되며, HMWHA는 200만 Da 범위이고 LMWHA는 100만 Da 범위이며, 1:1 비율로 혼합되며, 0.5% 농도를 발생하도록 PBS 용액에서 용해되는 IBD98.

C. 방법:

1. 테스트 타겟: 8주된 SPF급 스프라구 도리(Sprague Dawley) 숫 생쥐 30마리를 선택하고, 이를 2그룹으로 분류하고, 각각의 그룹은 15 마리씩 포함하고, 실험실의 관찰룸에 하나의 케이지 세트에 2마리의 생쥐를 유지하게 한다.

2. 동물 테스트:

예방 그룹의 생쥐는 24시간 이상 단식된다; 테스트 데이 1일차, 직장을 통하여 1 ml의 IBD98를 생쥐에 투여하도록 마취시키고, 직장을 통하여 1 ml의 TNBS(50 mg/mL)를 투여한다; 테스트 데이 2 내지 4일차, 직장을 통하여 1 ml의 IBD98를 투여한다; 테스트 데이 5일차, 결장에서 임상 병리적 변화를 관찰하도록 모든 생쥐를 죽인다.

콘트롤 그룹의 생쥐를 24 시간 이상 단식시킨다; 테스트 데이 1일차, 직장을 통하여 1 ml의 TNBS(50 mg/mL)를 투여하도록 생쥐를 마취시킨다; 테스트 데이 2 내지 4일차, 직장을 통하여 1 ml의 PBS를 투여한다; 테스트 데이 5일차, 결장에서 임상 병리적 변화를 관찰하도록 모든 생쥐를 죽인다.

3. 염증 인덱스 테스트

테스트를 시작하기 1일 전에 예방 그룹과 콘트롤 그룹 양자에 생쥐의 꼬리의 정맥으로부터 혈액 샘플을 체취하고, 테스트 종료 후에 심장으로부터 혈액 샘플을 체취한다; 그리고 원심분리 후 혈청을 모으고 ELISA(enzyme-linked immunosuppressant assay)에 의해서 TNF-α와 IL-1β의 혈청을 검사한다.

1-3. 테스트 자료

챠트 1: 예방 그룹과 콘트롤 그룹의 생쥐의 결장의 임상 병리학적 변화

챠트 2: 예방 그룹과 콘트롤 그룹 양자에 투입 첫째날(D1)과 4일 후 5일째(D5)에 생쥐의 혈청에서 TNF-α와 IL-1β의 변화

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**: D5와 D1에서 예방그룹의 혈청에서 TNF-α의 농도는 큰 차이(P＜0.01)가 있고, 콘트롤 그룹도 마찬가지이다(P＜0.01).

*: D5와 D1에서 예방그룹의 혈청에서 IL-β의 농도는 큰 차이(P＜0.05)가 있고, 콘트롤 그룹도 마찬가지이다(P＜0.05).

#: D5와 D1에서 예방그룹 및 콘트롤 그룹의 혈청에서 TNF-α의 농도는 큰 차이가 있다(P＜0.05).

1-4 테스트 결과

30 마리의 생쥐가 테스트 수행을 위하여 선택되고, 예방 그룹과 콘트롤 그룹으로서 2그룹으로 분리되고, 각각의 그룹은 15마리의 생쥐를 포함하고, 테스트를 시작하기 전에 24 시간 이상 단식시키며, 약제를 투여하기 전에 페시즈(faeces)를 소모시키도록 관장시킨다. 첫째날(D1)에 콘트롤 그룹에 1 mL의 TNBS를 투여하고 다음 3일(D2-D4)간에 PBS를 투여하고; 첫째날(D1)에 예방 그룹에 1 mL의 TNBS를 투여하고 한시간 후에 1 mL의 IBD98을 투여하고 다음 3일(D2-D4)간에 IBD98을 투여시킨다. 5일째(D5)에 양그룹의 생쥐를 죽이고, 해부하여 창자 손상과 염증 범위를 검사한다. 테스트 중에 죽은 생쥐는 테스크의 결과로 되지 않는다. 테스트 끝에 예방 그룹에서 13마리, 콘트롤 그룹에서 12마리가 남았다. 예방 그룹과 콘트롤 그룹의 평균 염증 범위는 각각 3.9cm 및 4.3cm이고, 이는 큰 차이가 있는 것이다(챠트 1 참조).

D1과 D5에서 염증 인덱스 TNF-α의 평균 농도(pg/mL)는 예방 그룹에서 21.3에서 759.3으로 상승되고, 콘트롤 그룹에서 12.3에서 1349.6으로 상승되어, 큰 차이(P＜0.01)가 나고; D1과 D5에서 염증 인덱스 IL-1β의 평균 농도(pg/mL)는 예방 그룹에서 3.3에서 275.8으로 상승하고, 콘트롤 그룹에서 14.1에서 469.4로 상승되어큰 차이(P＜0.05)가 난다. 이 지표는 TNBS를 유도하기 전에, 테스트의 생쥐는 사실상 염증 반응을 나타낸다. 3일 연속 진행 후 5일째(D5)에 2 그룹의 염증 인덱스를 비교하면, 예방 그룹에서 TNF-α의 평균 농도는 759.3이고 콘트롤 그룹에서 1349.6 이고, 이 두 그룹간에는 큰 차이가 있다(P＜0.05); 그리고 예방 그룹의 혈청에서 TNF-α의 농도는 콘트롤 그룹 보다 휠씬 낮다. 달리 말하면, IBD98로 취급된 생쥐는 취급되지 않은 생쥐보다 염증이 작다(챠트 2 참조).

1-5 결론

IBD는 양 그룹에서 유도되고, 다음 3일에, 콘트롤 그룹은 어떠한 의약적 취급을 받지 않고, 예방 그룹은 IBD98로 투여받은 후에 TNBS로 투여받고, 양 그룹에서 염증 인덱스의 TNF-α과 IL-1β는 상당히 상승되어 염증이 생쥐에 유도되었다는 것을 나타낸다. 예방 그룹의 TNF-α 농도는 콘트롤 그룹 보다 상당히 작고 이것은 IBD98로 투여받은 후 생쥐에 염증 반응을 감소하는 상당한 효과가 있음을 의미한다.

실시예 2

2-1 요약: 테스트되는 IBD를 가진 동물 몸체에 샘플 IBD98의 효과를 평가하는 것이다. TNBS가 생쥐의 직장에 투여되어 장염을 유도하고, 3일 후에 직장을 통하여 IBD98 샘플이 치료 그룹의 생쥐 내로 투입되고, PBS(phosphate buffered saline)가 콘트롤 그룹에 투입된다. 생쥐는 연속 투여의 7일 후에 죽이고 임상적 손상을 검사한다. 결과는 결장의 염증 범위는 IBD98 샘플로 치료받은 치료 그룹에서 평균 1.25cm이고, PBS로 치료받은 콘트롤 그룹에서는 1.875cm이다. 치료 그룹과 콘트롤 그룹을 비교하면 33%의 회복 차이가 있다. 즉, IBD98로 치료받은 생쥐에서의 IBD는 창자 조직의 회복에서 상당히 유리하다.

2-2 테스트 절차

A. 테스트 목적:

TNBS를 투여하여 생쥐에 IBD를 유도하여 IBD98이 IBD를 치료하고 예방하는데 유리한지 또는 생쥐에서 염증을 감소시키는지 평가하기 위함.

B. 테스트 객체

LMWHA와 HMWHA로 구성되고, HMWHA는 200만 DA이고 LMHWA는 100만 DA이고 7:3의 비율로 혼합되며, 0.5%의 농도를 얻도록 PBS 용액에 용해된다.

D. 방법

4. 테스트 타겟: 8주된 SPF급 스프라구 도리(Sprague Dawley) 숫 생쥐 36마리를 선택하고, 이를 2그룹으로 분류하고, 각각의 그룹은 18 마리씩 포함하고, 실험실의 관찰룸에 하나의 케이지 세트에 2마리의 생쥐를 유지하게 한다.

5. 동물 테스트:

생쥐는 24시간 이상 단식된다; 테스트 데이 1일차, 직장을 통하여 1 ml의 TNBS(tri-nitro-benzene sulphonic acid) 50 mg/mL를 직장을 통하여 투여하여 마취시키고, 3일 동안 관찰하고, 3일째에 소프트한 스툴로 설사 증상의 생쥐를 골라낸다.

치료 그룹의 생쥐는 4일차 내지 10일차에 1mL의 IBD98(5mg/mL)을 투여하여 마취시킨다. 콘트롤 그룹의 생쥐는 4일차 내지 10일차에 1mL의 PBS를 투여하여 마취시키고, 모든 생쥐는 11일차에 죽이고 결장의 임상 손상을 관찰한다.

2-3 테스트 자료

챠트 1. 콘트롤 그룹의 생쥐의 임상 창자 손상

챠트 2. 치료 그룹의 생쥐의 임상 손상 및 대응 회복 비율

치료 그룹에서 염증 범위 - 콘트롤 그룹에서 염증 범위의 평균/치료 그룹에서 염증 범위의 평균

그림 1 : 콘트롤 그룹과 비교한 치료 그룹의 생쥐에서 임상적 손상의 회복

2-4 테스트 결과

36마리의 생쥐가 테스트를 수행하도록 선택되고 18마리씩 각각 치료 그룹과 콘트롤 그룹으로 분리된다. 생쥐는 테스트 전에 24시간 이상 단식된다. 페시즈(faeces)를 소모시키도록 관장시키고 약제를 투여하기 전에 TNBS를 투여한다. 3일 동안 관찰한 후에, 2마리의 생쥐가 죽었고, 해부에 의해 5마리가 IBD를 가졌다는 것이 확인되었다. 정상 스툴(stool) 상태의 생쥐는 제외되고, 4일째에 소프트 스툴과 설사를 하는 생쥐는 고려된다. 7일(D4 내지 D10) 동안 IBD98이 치료 그룹의 10마리의 생쥐의 직장을 통하여 계속 투여되고, 콘트롤 그룹의 7마리의 생쥐에 PBS를 투여한다. 각각의 그룹은 테스트 동안 한마리를 잃고, 모든 생쥐는 창자 손상과 염증 범위를 검사하도록 11일째에 죽인다.

콘트롤 그룹에서, 한마리의 생쥐는 손상이 없었고, 3마리의 생쥐는 국부적인 0.3 내지 1cm의 염증 그리고 1등급 손상을 가지고, 2마리의 생쥐는 국부적인 2 내지 2.5cm의 염증 그리고 2 등급 손상을 가진다(챠트 1 참조). 치료 그룹에서, 7마리의 생쥐는 국부적인 0.3 내지 1.5cm의 염증 그리고 1등급 손상을 가지고, 2마리의 생쥐는 국부적인 2cm의 염증 그리고 2등급 손상을 가진다(챠트 2 참조). 통계학적 분석 후에, 콘트롤 그룹의 생쥐에서 평균 염증 부위는 1.875cm 이고, 치료 그룹의 생쥐에서 1.25cm이고, 회복 비율은 2그룹을 비교할 때 33%이다(챠트 2 및 그림 1 참조).

Claims

저평균분자량(Mw) 히알루론산(LMWHA)과 고평균분자량 히알루론산(HMWHA)을 가진 적어도 2 또는 2 이상의 히알루론산으로 구성되고, 상기 LMWHA의 Mw는 50만 내지 150만 Da이며, 상기 HMWHA의 Mw는 150만 내지 500만 Da 이며, LMWHA와 HMWHA의 혼합비는 20:80 내지 80:20 인 것을 특징으로 하는 염증성 장질환(IBD) 치료 및 예방을 위한 히알루론산 혼합물.
제1항에 있어서,
상기 HMWHA의 Mw는 150만 내지 350만 Da 인 것을 특징으로 하는 염증성 장질환 치료 및 예방을 위한 히알루론산 혼합물.
제1항에 있어서,
상기 HMWHA의 Mw는 200만 Da 인 것을 특징으로 하는 염증성 장질환 치료 및 예방을 위한 히알루론산 혼합물.
제1항에 있어서,
상기 LMWHA의 Mw는 100만 Da 인 것을 특징으로 하는 염증성 장질환 치료 및 예방을 위한 히알루론산 혼합물.
제1항에 있어서,
상기 LMWHA와 상기 HMWHA의 Mw 혼합비는 1:1 인 것을 특징으로 하는 염증성 장질환 치료 및 예방을 위한 히알루론산 혼합물.
제1항에 있어서,
상기 LMWHA와 상기 HMWHA의 혼합비의 농도는 0.5mg/mL 내지 50mg/mL 인 것을 특징으로 하는 염증성 장질환 치료 및 예방을 위한 히알루론산 혼합물.
제6항에 있어서,
상기 LMWHA와 상기 HMWHA의 혼합의 농도 비율은 0.5mg/mL 내지 5mg/mL 인 것을 특징으로 하는 염증성 장질환 치료 및 예방을 위한 히알루론산 혼합물.
제1항에 있어서,
상기 히알루론산 혼합물은 구강 고형 투약 형태를 형성하기 위한 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 장질환 치료 및 예방을 위한 히알루론산 혼합물.
제1항에 있어서,
상기 히알루론산 혼합물은 직장용 좌약 또는 관류액을 형성하기 위한 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 장질환 치료 및 예방을 위한 히알루론산 혼합물.
제1항에 있어서,
상기 히알루론산 혼합물은 스테로이드, 면역 억제제 또는 염증 치료제와 혼합되는 것을 특징으로 하는 염증성 장질환 치료 및 예방을 위한 히알루론산 혼합물.
제1항에 있어서,
상기 히알루론산 혼합물은 궤양성 대장염, 급성장염, 만성 장염 또는 크론병 을 치료하고 예방하며, 그리고 위와 장 상처를 치료하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 염증성 장질환 치료 및 예방을 위한 히알루론산 혼합물.
제1항에 있어서,
상기 히알루론산 혼합물은 염증성 장질환(IBD)과 과민성 장증후군(IBS)을 치료하고 예방하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 염증성 장질환 치료 및 예방을 위한 히알루론산 혼합물.